Aula de enzimas em conversão de
biomassas
Tema
Produção de enzimas de origem
extrativa e microbiana
Prof. Adriane M. F. Milagres
Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
Sumário:
1) Extratos vegetais
2) Extratos animais
3) Enzimas microbianas
Enzimas de microrganismos extremófilos
4) Processos microbianos para produção de enzimas
– cultivo submerso
– cultivo no estado sólido
5) Cinética do crescimento e produção de enzimas
Introdução:
As células constituem-se, até hoje, o único meio para
obtenção de biocatalisadores, visto que ainda não é
possível destacar-se sua fabricação por síntese química.
As enzimas podem ser provenientes de:
• tecidos de organismos diferenciados (células animais e
vegetais)
renina usada na elaboração de queijos,
proteases vegetais usadas em anti-inflamatórios,
amilases para a preparação de mostos de cerveja
papaína, extraída do latéx do papaya,
bromelina, obtida do talo da pinha
• microrganismos.
Enzimas de origem animal
1) Pancreatina: apresenta atividade amilolítica, proteolítica e lipolítica
Pâncreas de porco
Antigamente: realçar sabor de queijos
Atualmente: Auxiliar digestivo
2) Renina: usada na elaboração de queijos
Estomago de bezerro
quimosina
3) Pepsina:
• Origem: Mucosa do estômago de porco
• Auxiliar digestivo
Enzimas de origem vegetal
1) Papaína: Enzima proteolítica
Origem: latex do fruto verde do mamão
Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo
Extraída como suco prensado deste componente e posteriormente purificada
A adição de água e cloreto de sódio perfazem um preparado chamado de papaína
bruta
2) Bromelina: Enzima proteolítica
Origem: talo e fruto do abacaxi
Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo
Obtida do caule do abacaxi após moagem, prensagem, filtração e precipitação
(sulfato de amônio, metanol isopropanol ou acetona) do suco deste talo.
Enzimas de origem vegetal
3) Malte:
Proteases, lipases e hemicelulases, oxiredutases e amilases (alfa-amilases:no grão
durante a germinação; beta-amilase presente no grão antes da germinação)
Origem: malte de cevada
Após germinação é feita secagem: paralisação da atividade biológica do grão e
reduzir teor de umidade
Enzimas microbianas
Enzimas de fungos
Fungos: São organismos heterotróficos que obtêm nutrientes por absorção, ou
seja, lançam enzimas aos substratos onde colonizam e absorvem os nutrientes
através da parede e membrana celular
hifas
Micélio - agrupamento intenso
de hifas constituem o micélio
Enzimas microbianas
• Microrganismos:
1) Temperatura de crescimento:
Psicrófilos - crescem abaixo de 20 oC
Mesófilos - 20 a 50 oC
Termófilos - crescem acima de 55 oC
Hipertermófilos – crescem acima de 80 oC
2) pH
Acidófilos
Neutrófilos
Alcalófilos
3) O2
Aeróbicos obrigatórios (a)
Anaeróbicos
obrigatórios(b)
Anaeróbicos
facultativos(c)
Microaerófilos (d)
Aerotolerantes (e)
4) Pressão osmótica
(NaCl):
Halotolerantes
Halófilos
Halófilos extremos
Enzimas de microrganismos extremófilos
Processos Industriais
Enzimas psicrófilas
•Extremozimas – Taq
polimerase
•Alta atividade catalitica e estabilidade em
baixas temperaturas
•Alta salinidade
•Maior flexibilidade – menos pontes dissulfeto
e de hidrogênio
•pH inferior a 2 ou superior a 10
•Estresse nutricional
Enzimas termoestáveis
•Archae: temperaturas elevadas (~ 100 oC)
Processo típico de cultivo microbiano
Engenharia de Bioprocessos: propagação de células microbianas
Aplicação comercial: bactérias, fungos filamentosos e leveduras;
Produção de enzimas extracelulares industriais: Bacillus e Aspergillus (80-85% do
mercado de enzimas extracelulares)
Cultivo submerso : batelada
Cinética de produção de celulases de Trichoderma reesei em
batelada, mostrando a instabilidade após o pico de produção
Produção industrial de enzimas
•Cultivo semi-sólido
e
Cultivo submerso
Por que do interesse em SSF?
A maioria dos processos submersos dão melhores
rendimentos que SSF e é muito mais fácil de operar.
Contudo, em casos específicos há razões para se operar
em SSF:
-Quando o produto pode apenas ser produzido por SSF
(alimentos fermentados – Koji (A. orysae em soja),
Tempe (Rhizopus oligosporus em soja)
-Quando o rendimento é significantemente maior em SSF
(é o caso das enzimas de fungos)
-Quando se deseja utilizar um determinado substrato
sólido
Fermentação em estado sólido: valorização dos
resíduos lignocelulósicos
O que é?
O termo fermentação em estado sólido, ou
fermentação semi-sólida, ou fermentação em
meio semi-sólido
aplica-se ao processo de crescimento de microrganismos
sobre substratos sólidos sem a presença de água livre.
A água presente nesses sistemas encontra-se ligada à
fase sólida, formando uma fina camada na superfície
das partículas.
(Raimbault, 1998)
FSS – Vantagens:
-
Meios de baixo custo
Elevado rendimento em produto
Menor esforço em etapas de downstream
Produto com melhor qualidade
Tecnologia simples
Menor gasto energético
FSS – Desvantagens:
- Ampliação de escala e controle dos biorreatores é mais difícil
- Baixa homogeneidade
- Problemas com temperatura
- As diferenças encontradas nos rendimentos e na qualidade ainda
não são totalmente compreendidas – não sendo possível tirar
partido destas condições
Cinética do crescimento e produção de enzimas
Em processos biotecnológicos, parâmetros como velocidade
específica de crescimento, consumo de substrato,e fatores de
conversão são importantes por diversas razões:
•Otimização ou comparação entre processos
•Otimização ou comparação entre linhagens
•Identificação do estado fisiológico das células
•Controle do processo
•Obtenção de dados necessários à análise técnico-economica e
viabilidade de processos
Parâmetros de transformação
A cinética de um processo consiste na análise da evolução dos valores
de concentração de um ou mais componentes do sistema em função do
tempo.
Podemos avaliar por exemplo:
- biomassa (X);
- metabólitos (P);
- substrato (S).
-Fator de conversão: Substrato em produto
-Produtividade
• A fase exponencial é de primeira ordem:
• A taxa de crescimento  ao tamanho da
população
•Entrão lnX vs. t é linear, inclinação = m
• m unidade é 1/t (i.e. h-1)
dX
 X
dt
Medidas do crescimento microbiano
Medidas diretas : massa seca; contagem celular
(Câmaras
de
Petroff-Hausser
e
Contagem dos viáveis)
de
Neubauer;
Medidas indiretas:
a) Turbidimetria
b) Medida de um constituinte celular (quitina, ergosterol, ácidos
nucleicos, proteína)
c) Medida da atividade biológica (ATP, atividade enzimática, taxa
respiração, atividade imunológica)
d) Consumo de nutriente
Para representar o crescimento , o indicador deve ser constante
durante o desenvolvimento fúngico e deve ser o mesmo
independente do meio de cultivo
Correlação entre teor de
ergosterol e biomassa fúngica
Crescimento de L. edodes
em meio líquido
400
90
350
70
300
y = 4,09594 x - 3,34879
250
R = 0,8682
2
Ergosterol (ug)
Biomassa fúngica(mg)
80
60
50
40
30
20
200
150
100
50
10
0
0
0
5
10
15
Tempo (dias)
20
25
0
20
40
60
Biomassa Fúngica (mg)
80
100
Cinética da Produção de Enzimas
• As enzimas como agentes metabólicos terão o caráter de
metabólitos primários ou secundários dependendo da sua função
metabólica;
• Maioria das enzimas comerciais: enzimas degradativas
(catabolismo) e têm as características dos metabólitos primários.
Isto não é absoluto!
• Modelo de Ludecking & Piret para a cinética de produção de
metabólitos por fermentação:
Metabólitos primários:
Metabólitos secundários:
• Situações intermediárias são freqüentes na
prática.
Ex.: a-amilase de Bacillus subtilis, glucoamilase de
Aspergillus niger e lactase de Escherichia coli
Por que os fungos produzem mais enzima
em SSF que em SmF?
•Cultivos em SSF ocorrem em finas camadas com uma grande
área superficial para troca de gases
•SmF com agitação os fungos formam pellets com grande
diâmetro e pequena área superficial para trocas gasosas
•SmF sem agitação formam micélios dispersos mais sujeitos a
repressão catabólica
•SSF apresenta melhor condição fisiológica e produz menos
enzimas proteolíticas que na SmF
Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 157–167
Advantages of fungal enzyme production in solid state over liquid fermentation systems
G. Viniegra-González, E. Favela-Torres, C.Aguilar,S.Rómero-Gomeza, G. D´ıaz-God´ınez , C.
Augur
Parâmetros de transformação
O estudo cinético de um processo consiste inicialmente na análise de
evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do
sistema de cultivo em função do tempo de fermentação.
a) Velocidades instantâneas de transformação:
rx = dX
dt
rs = dS
dt
rp=dP
dt
rx- velocidade de crescimento celular
X – concentração de células viáveis
t-tempo
rs – velocidade de consumo de substrato
rp = Velocidade de síntese de produto
Produtividade: Px = Xm – X0
Pp = Pm – Po
tf
tfp
Velocidades específicas de transformação:
μ X = 1 . dX
X dt
; μS = 1. (-dS)
X dt
μP = 1. dP
X dt
Fatores de conversão:
YX/S = X-X0
S0 –S
YX/P = X-X0
P-P0
YP/S = P-P0
S0-S
YX/S = Xm-X0
S
Considerar os valores instantâneos:
YX/S = dX
-dS
YX/P = dX
dP
YP/S = dP
-dS
Um determinado consumo
de substrato (S0-S) não
produzirá
sempre
um
aumento proporcional de
biomassa (X-X0), sendo
que uma parcela de
energia, é destinada a
manutenção das condições
vitais
Aplicações biotecnológicas
• Produção de xarope de frutose a partir do amido:
Extração
Liquefação
amilase – Bacillus licheniformis
T > 90 oC e pH ~ 6,5
Pululanase – B. coagulans,
B. circulans
Gomificação
Sacarificação
Enzima
Isomerização
Atividade catalítica
α-amilase
Hidrólise de ligações glicosídicas α(1→4)
β-amilase
Hidrólise de ligações glicosídicas α(1→4)
Glicoamilase
Hidrólise de ligações glicosídicas α(1→4)
Pululanase
Hidrólise de ligações glicosídicas α(1→6)
Enzima bacterianas usadas na produção de HFCS
CH2OH
glicoisomerase
O
O
OH
CH2OH
OH
OH
HO
OH
α-D-glicopiranose
alfa-D-glicose
OH
HO
OH
β-D-frutopiranose
alfa-Dfructopiranose
• O xarope que deixa a coluna é composto por cerca de 42-45 % de
frutose e 55-58 % de glicose (ponto de equilíbrio da reação).
Isomerase – Streptomyces rubiginosis, Actinoplanes missouriensis e
Ampullariella spp
Isomerização
• Em
Produção de HFCS
base mássica, a glicose apresenta poder de
edulcoração 30 % inferior à sacarose. Soluções
concentradas cristalizam à temperatura ambiente,
enquanto soluções diluídas favorecem o crescimento de
microrganismos.
• A frutose é 30% mais doce que a glicose. É muito solúvel
em água (até 2 vezes mais solúvel que a glicose). Soluções
concentradas não cristalizam à temperatura ambiente
Produção de HFCS
Poder edulcorante da sacarose: 1.0
Poder edulcorante da glicose: 0.7
Poder edulcorante da frutose: 1.3
Qual o poder edulcorante de um xarope constituído por
55% de frutose e 45% de glicose?
E1T1 + E2T2 = E
1.3 x 0.55 + 0.7 x 0.45 = E
0.7 + 0.3 = E
E = 1,0
HFCS - 55
Em base mássica, o xarope apresenta poder adoçante igual ao da sacarose,
entretanto é mais solúvel e mais barato que a sacarose!
Produção de HFCS
Enzima imobilizada
Zeólitas
58 %
42 %
10 %
90 %
Qual o poder edulcorante de um xarope constituído por
90% de frutose e 10% de glicose?
E1T1 + E2T2 = E
1.3 x 0.90 + 0.7 x 0.10 = E
1.170 + 0.07 = E
E = 1,240
HFCS - 90
Em base mássica, o xarope apresenta poder adoçante superior ao da sacarose ($$$$)!
Enzimas bacterianas usadas na formulação de
detergentes
• Proteases:
- Mais utilizadas em detergentes
- Removem manchas de ovo, sangue, suor, extratos vegetais,...
- Detergentes sem enzimas: ineficiente para remover manchas de
proteinas
• - Proteases Alcalinas:
• Possuem pH ótimo alcalino e atuam em T elevada (Europa)
• - Ex.: savinase (B. clausii), alcalase (B. licheniformis), subtilisin novo
(B. amiloliquefaciens)
Lipases:
- Lavagem de roupas em T baixa: difícil remoção de óleo e gorduras
- Primeira lipase em detergente: produzida por Humicola lanuginosa
- lipases bacterianas: Pseudomonas alcaligenes atividade em pH
compativel com detergentes (lipomax)
- LIPOLASE (Novo Nordisk) - 1988
Remove manchas de batom, frituras, azeite, molhos, etc
lipases
TG
Ácidos graxos, mono, di- glicerídeos e glicerol
- Estáveis em pH alcalino
Material para leitura:
1) Cold-Adapted Enzymes
Khawar Sohail Siddiqui and Ricardo Cavicchioli Annu. Rev. Biochem.
2006. 75:403–33
2) ENZIMAS TERMOESTÁVEIS: FONTES, PRODUÇÃO E APLICAÇÃO
INDUSTRIAL
Eleni Gomes*, Marcelo Andrés Umsza Guez, Natalia Martin e Roberto da
Silva Quim. Nova, Vol. 30, No. 1, 136-145, 2007