VANESSA DE OLIVEIRA SCHREINER
IDENTIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DOS GENES ESTRUTURAIS DO
SISTEMA DE SECREÇÃO DO TIPO III DE Herbaspirillum rubrisubalbicans
Dissertação apresentada como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre, em CiênciasBioquímica, Curso de Pós-Graduação em
Ciências-Bioquímica,
Setor de Ciências
Biológicas da Universidade Federal do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza
Co-orientadora: Prof. Dra. Rose Adele Monteiro
CURITIBA
2007
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À minha família, principalmente a
minha MÃE Ana Glaci e ao Ricardo
pelo apoio, incentivo, dedicação,
paciência e carinho SEMPRE.
ii
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela saúde para desenvolver este trabalho e por ter cruzado o
caminho de pessoas tão queridas e competentes que tornaram meu trabalho muito mais
fácil e prazeroso.
Ao meu orientador Emanuel Maltempi de Souza pela paciência, dedicação,
compreensão, repreensão, pelas idéias, pelo apoio, direcionamento e pelo tempo enorme
dedicado as atividades da minha dissertação. Você é um excelente profissional e porisso
um admirável orientador.
A minha co orientadora Rose Adele pelo auxílio na bancada, pela paciência,
pelas idéias, pelo incentivo.
A todos os amigos e aos funcionários do laboratório muito obrigada pelo
companheirismo, apoio, incentivo, ajuda e atenção.
A todos os professores do Núcleo de Fixação Biológica de Nitrogênio que me
aceitaram com muito respeito e atenção.
Ao CNPq pelo suporte financeiro, fundamental para o desenvolvimento deste
trabalho.
iii
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SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS......................................................................................................... vi
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ vii
LISTA DE ABREVIATURAS .......................................................................................... viii
RESUMO ............................................................................................................................ ix
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1 A BACTÉRIA Herbaspirillum rubrisubalbicans. ................................................. 1
1.2 DOENÇA DA ESTRIA-MOSQUEADA .............................................................. 1
1.3 SISTEMA DE SECREÇÃO DO TIPO III ............................................................. 3
1 3 1 Estrutura do Sistema de Secreção do Tipo III. ........................................ 4
1.3.2 Translocação de Proteínas ....................................................................... 7
1.4 ILHAS GENÔMICAS .......................................................................................... 9
1.4.1 Ilhas de Patogenicidade .......................................................................... 9
1.4.1.2 Aquisição da ilha de patogenicidade ................................................. 12
1.4.1.3 Regulação da expressão de genes da ilha de patogenicidade .............. 13
2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 14
3 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 15
3.1 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS ......................................................................... 15
3.3 MEIOS DE CULTURA ...................................................................................... 17
3.5 ENZIMAS .......................................................................................................... 19
3.6 ARMAZENAGEM DAS BACTÉRIAS .............................................................. 20
3.7 PURIFICAÇÃO DE DNA .................................................................................. 20
3.7.1 Purificação de DNA Plasmidial de E. coli ............................................ 20
3.7.2 Purificação do DNA Genômico de Herbaspirillum spp. ........................ 20
3.7.3 Purificação do DNA de gel de agarose .................................................. 21
3.8 MÉTODOS ANALÍTICOS................................................................................. 21
3.8.1 Quantificação de DNA por espectrofotometria ...................................... 21
3.9 TÉCNICAS DE MANIPULAÇÃO DO DNA ..................................................... 21
3.9.1 Eletroforese em gel de Agarose ou ágar ................................................ 21
3.9.2 Digestão de DNA com endonucleases de restrição ................................ 22
3.10 HIBRIDIZAÇÃO DNA/DNA ........................................................................... 22
3.10.1 Transferência do DNA genômico digerido do gel de agarose para
membrana de náilon ...................................................................................... 22
3.10.2 Marcação da sonda com Fluoresceína-11-desóxi-Uridila-TriFosfato (dUTP) ............................................................................................. 22
3.10.3 Pré-hibridização .................................................................................. 23
3.10.4 Hibridização ....................................................................................... 23
3.11 Sequenciamento dos genes hrp, hrc e pil de H. rubrisubalbicans ...................... 24
3.11.1 Inserção do Transposon EZ-Tn5™ <TET-1> in vitro .......................... 24
3.11.2 Preparo de células eletrocompetentes .................................................. 24
3.11.2.1 Eletro-Transformação bacteriana ..................................................... 24
3.11.3 Seqüenciamento do DNA plasmidial................................................... 25
iv
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3.12 ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS DE DNA ........................................................ 25
3.12.1 Montagem das seqüências consenso .................................................... 25
3.12.2 Análise das Seqüências de DNA nos programas FRAMEPLOT,
BLAST e CLUSTALW ................................................................................. 27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 29
4.1 IDENTIFICAÇÃO DO GENE hrcV DE H. rubrisubalbicans POR
HIBRIDIZAÇÃO ..................................................................................................... 29
4.2 SEQÜENCIAMENTO DOS GENES DO SISTEMA DE SECREÇÃO DO
TIPO TRÊS DE H. rubrisubalbicans ........................................................................ 31
4.3 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DOS SEQÜÊNCIA CONSENSO
OBTIDOS ................................................................................................................ 33
4.4 ORGANIZAÇÃO DOS GENES hrp/hrc DE H. seropedicae e H.
rubrisubalbicans. ...................................................................................................... 36
4.5 ANÁLISE DAS PROTEÍNAS Hrp, Hrc, e Pil de H. rubrisubalbicans ................ 39
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................ 42
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 43
APÊNDICE ........................................................................................................................ 51
v
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 TABELA 4 TABELA 5 -
FATORES DE VIRULÊNCIA ENCONTRADOS EM ILHAS DE
PATOGENICIDADE
ESTIRPES BACTERIANAS UTILIZADAS
LISTA DE PLASMÍDEOS UTILIZADOS
MONTAGEM DOS contigs
IDENTIDADE E SIMILARIDADE ENTRE PROTEÍNAS Hrp, Hrc e Pil
DE H. rubrisubalbicans estirpe M1, H. seropedicae estirpe SMR1,
Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv syringae e Pseudomonas
syringae pv tomato
vi
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10
15
16
33
40
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA 6 -
FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 -
SINTOMAS TÍPICOS DA DOENÇA DA ESTRIA MOSQUEADA
ESTRUTURA DO FLAGELO E DOS INJECTISOMOS
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA GENERALIZADA DA ILHA
DE PATOGENICIDADE
ESTÁGIOS DE EVOLUÇÃO DA ILHA DE PATOGENICIDADE
FLUXOGRAMA DA MONTAGEM DE CONTIGS UTLIZANDO O
PACOTE PHRED/PHRAP/CONSED
HIBRIDIZAÇÃO DO DNA GENÔMICO DE ESTIRPES DE H.
seropedicae e H. rubrisubalbicans COM O GENE hrcV
2
5
11
12
27
30
ESQUEMA DE OBTENÇÃO DE MUTANTES COM TRANSPOSON 32
EZ-Tn5™ <TET-1> in vitro E SEQUENCIAMENTO
COMPARAÇÃO DO AGRUPAMENTO pil/hrc/hrp de H. 36
rubrisubalbicans e H. seropedicae
COMPARAÇÃO DO AGRUPAMENTO pil/hrc/hrp de H. 38
rubrisubalbicans, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora e Ralstonia
solanacearum
vii
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LISTA DE ABREVIATURAS
Amp R
atm
C
DNA
D.O.600
EDTA
g
h
Hrc
Hrp
Kb
kDa
L
g
L
M
min
mL
mmol
m
ng
nm
ORF
pH
p.I
pv.
RNA
rpm
SmR
spp.
SSC
TBE
TcR
TxEy
Tris
tRNA
U
UV
=
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resistente a ampicilina
atmosferas, unidade de pressão
graus Celsius
ácido desoxirribonucléico
densidade ótica a 600nm
ácido etilenodiamino-tetra-acético
grama
horas
conservado e resposta hipersensitiva
patogenicidade e resposta hipersensitiva
kilobase, 1000 pares de base
kilo Daltons, 1000 daltons
litro
micrograma
microlitro
molar
minutos
mililitros
milimol
micrômetro
nanograma
nanômetros
“ open reading frame” fase aberta de leitura
- log (concentração de íons H3O+
ponto isoelétrico
pathovar
ácido ribonucléico
rotações por minuto
resistente a estreptomicina
espécies
tampão-citrato-NaCl
tampão Tris-borato-EDTA
resistente a tetraciclina
tampão Tris-HCl x mM, EDTA ymM (pH 8,0)
tris (hidroximetil-aminometano)
RNA transportador
unidade
ultravioleta
viii
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RESUMO
Herbaspirillum
rubrisubalbicans
é
uma
-Proteobacteria
endofítica
e
diazotrófica. Este organismo é capaz de causar a doença da estria mosqueada na
variedade de cana-de-açúcar B-4362 de Barbados. O sintoma típico da doença é o
aparecimento de uma estria vermelha com fundo esbranquiçado, desde o ponto de
inoculação até o topo das folhas de cana de açúcar. O sequenciamento parcial do
genoma desta bactéria revelou a presença dos genes pilN, pilO, hrcC, hrpE, hrcJ, hrcU,
hrpX, hrpQ, hrcN, hrpO e hrcV. Em bactérias fitopatogênicas, como Pseudomonas
syringae, estes genes estão agrupados em regiões denominadas Ilhas de Patogenicidade
e codificam para proteínas do Sistema de Secreção do Tipo Três (TTSS). Este sistema
possibilita a translocação de proteínas efetoras da bactéria para o citoplasma da célula
vegetal e as proteínas translocadas podem tanto inibir quanto ativar a resposta de defesa
do hospedeiro. A identificação de genes hrp/hrc/pil no genoma do Herbaspirillum
rubrisubalbicans sugere que o Sistema de Secreção do Tipo Três está envolvido no
mecanismo de patogenicidade.
Palavras-chave: Herbaspirillum rubrisubalbicans, Ilha de Patogenicidade,
Sistema de Secreção do Tipo Três.
ix
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1 INTRODUÇÃO
1.1 A BACTÉRIA Herbaspirillum rubrisubalbicans.
Herbaspirillum rubrisubalbicans pertence ao gênero Herbaspirillum que faz
parte da subclasse β das Proteobactérias. O nome da espécie deriva de ruber, vermelho,
e subalbicans, esbranquiçado, ou seja, vermelho-esbranquiçado referindo-se aos
sintomas da doença estria mosqueada provocada por este organismo em algumas
variedades de cana-de-açúcar. O organismo aparece como bacilo curvo e móvel devido
aos múltiplos flagelos em um dos pólos. A temperatura ótima de crescimento é 30oC,
mas pode ser cultivado até 40 oC, podendo crescer em meio semi-sólido livre de
nitrogênio formando uma película em forma de véu, assim como o Herbaspirillum
seropedicae. A atividade de nitrogenase e a capacidade de crescer diazotroficamente são
similares as do Herbaspirillum seropedicae (BALDANI, et al., 1996).
O diâmetro celular do Herbaspirillum rubrisubalbicans varia entre 0,6 e 0,7m e
o comprimento celular médio entre 1,5 e 5m. Este organismo apresenta metabolismo
microaeróbico típico e não fermenta açúcares. Ácidos orgânicos são as principais fontes
de carbono para crescimento (BALDANI, et al., 1996).
O H. rubrisubalbicans é considerado fitopatogênico, pois causa a doença da
estria-mosqueada na variedade B-4362 de cana-de-açúcar, desenvolvida para regiões
onde são aplicados fertilizantes com altas concentrações de nitrogênio (BALDANI, et
al.,1996).
1.2 DOENÇA DA ESTRIA-MOSQUEADA
A doença da estria mosqueada, causada pelo H. rubrisubalbicans, foi descrita
primeiramente no estado da Lousiana (EUA) em 1932 e é caracterizada pelo
desenvolvimento de estrias vermelhas com manchas brancas nas folhas de cana-deaçúcar. É uma doença de pouca importância econômica e afeta somente algumas
variedades de cana-de-açúcar (CHRISTOPHER & EDGERTON, 1932).
A variedade de cana-de-açúcar B-4362, de Barbados, é susceptível a esta doença
(OLIVARES, et al., 1997). A inoculação do H. rubrisubalbicans nesta variedade
provoca sintomas típicos da doença. O ponto de inoculação torna-se vermelho e
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necrótico (Figura 1a) e ao sétimo dia ocorre a formação de estrias vermelhas ao longo
dos vasos perto do ponto de inoculação nas folhas, acompanhado de clorose (Figura 1a).
Neste estágio a bactéria é encontrada preenchendo completamente o protoxilema e
parcialmente o xilema da região com estrias vermelhas. No vigésimo dia a doença da
estria mosqueada alcança o seu pico com a bactéria bloqueando os vasos do meta e
protoxilema, e extensa necrose ao redor do ponto de inoculação (Figura 1b). A estria
mosqueada aumenta desde o ponto de inoculação em direção ao topo da folha, à medida
que a bactéria avança no interior dos vasos da folha (OLIVARES, et al., 1997).
FIGURA 1 - SINTOMAS TÍPICOS DA DOENÇA DA ESTRIA MOSQUEADA
A
B
A)Ponto de inoculação necrótico após 1 dia de inoculação e estrias vermelhas após 7
dias de inoculação.
B)Necrose Tecidual após 21 dias de inoculação.
FONTE: OLIVARES, F. L., et al. Infection of mottled stripe disease-susceptible and
resistant sugar cane varieties by the endophytic diazotroph Herbaspirillum. New
Phytologist. v.135, p. 723-737, 1997.
A extensa colonização bacteriana resulta na expansão dos espaços intercelulares
e subseqüente compressão das células do hospedeiro (OLIVARES, et al., 1997). A
planta hospedeira responde com produção de compostos fenólicos intercelulares e de
goma, os quais restringem o crescimento bacteriano dentro dos vasos e confinam as
bactérias em determinados locais do vaso, formando grandes colônias. Além disso,
ocorre morte localizada de células da folha do hospedeiro, um processo denominado de
Resposta Hipersensitiva (RH) (OLIVARES, et al., 1997).
As células bacterianas multiplicam-se, preenchem os vasos e eventualmente
escapam para dentro do mesófilo circundante. As bactérias também podem ser
2
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encontradas no exterior dos estômatos, sugerindo que podem entrar nas folhas ou
emergir do mesófilo via estômato para colonizar a superfície da folha. Esta doença não
mata as plantas da variedade B-4362, mas reduz o tempo de vida das folhas em
aproximadamente 75 dias (OLIVARES, et al., 1997)
1.3 SISTEMA DE SECREÇÃO DO TIPO III
Várias espécies de bactérias gram-negativas que interagem patogenicamente ou
simbioticamente com células eucarióticas, possuem um sistema de exportação de
proteínas para o citoplasma da célula hospedeira. Este aparelho é chamado de Sistema
de Secreção do Tipo III (SST3) ou injectisome. (CORNELIS, et al., 2006). Este sistema
é responsável pela translocação de proteínas através de três membranas biológicas: a
membrana bacteriana interna, a membrana bacteriana externa e a membrana plasmática
do hospedeiro, inclusive a parede celular de células vegetais, sem processo proteolítico
(GHOSH, 2004; BLOCKER, et al., 2003). Através deste sistema é possível manipular
as células hospedeiras durante a infecção pela translocação de proteínas bacterianas para
o citoplasma das células hospedeiras (BLOCKER, et al., 2003).
O SST3 foi identificado em muitos patógenos de animais, tais como Yersinia
spp., Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli entero-hemorrágica e
enteropatogênica, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus, Bordatella spp.
e Chlamydia spp. Em algumas bactérias foram observados mais de um conjunto de
genes codificando para SST3, por exemplo, Salmonella enterica serovar Typhimurium,
Yersinia pestis e Y. enterocolitica. Em fitopatógenos do gênero Pseudomonas,
Ralstonia, Erwinia e Pantoea também foi identificado o SST3 (GHOSH, 2004).
Aproximadamente 25 proteínas são necessárias para construção do sistema de
secreção. As proteínas são codificadas pelos genes hrp e hrc (BOGDANOVE, et al.,
1996). As proteínas codificadas por estes genes formam uma via de passagem dos
substratos através da parede celular bacteriana e têm seqüência de aminoácidos
similares àquelas do corpo basal do aparato flagelar (AIZAWA, 2001). Isto sugere um
compartilhamento da história evolucionária destes sistemas e, portanto, o SST3 e o
aparato flagelar compartilham um mesmo ancestral (GOPHNA, RON, GRAUR, 2003).
3
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1 3 1 Estrutura do Sistema de Secreção do Tipo III.
Os componentes extracelulares do aparelho de secreção do tipo III são variáveis
devido à interação com as diferentes barreiras celulares do hospedeiro. Estes
componentes são divididos em: fatores de estrutura superficial e fatores tanslocadores
(formam um poro de entrega do SST3 na membrana plasmática hospedeira)
(BUTTNER & BONAS, 2003).
A estrutura superficial do SST3 assemelha-se a uma agulha ou a um filamento
nos patógenos de animais e a um pilus que se projeta da célula bacteriana em
fitopatógenos (CORNELIS, et al., 2006). O SST3 pode ser dividido em três partes: a
estrutura basal, a agulha e o complexo de translocação. A estrutura basal e a agulha
compõem o complexo da agulha que em uma estrutura cilíndrica com dois pares de
anéis concêntricos que se estendem da membrana bacteriana interna à externa e unidos
por uma haste protéica (FIGURA 2) (CORNELIS, et al., 2006). Estas estruturas são
muito semelhantes ao aparato flagelar (Figura 2a) (AIZAWA, 2001).
4
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FIGURA 2 - ESTRUTURA DO FLAGELO E DO SISTEMA DE SECREÇÃO DO
TIPO 3 DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
FONTE: CORNELIS, G. R. The type III secretion injectisome. Nature Reviews in
Microbiology. v . 4, p. 811-825, 2006.
A agulha (Figura 2b) é uma estrutura reta, rígida e oca, e muito menor que os
flagelos. O comprimento da agulha em Salmonella chega 80nm (KUBORI, et al., 1998),
45 nm em Shigella (TAMANO, et al., 2000) e 58 nm em Yersinia (HOICZYK &
BLOBEL, 2001). Em Escherichia coli foi observado uma variação da estrutura de
agulha: um filamento na sua extremidade (Figura 2c). O filamento pode ter um
comprimento de até 700 nm, mas comprimento médio foi de 40 a 140 nm (DANIELL,
et al., 2001). A estrutura homóloga dos fitopatógenos, denominada de pilus Hrp, é
flexível com comprimento de até 2µm (Figura 2d), pois atravessa a espessa parede
celular das células vegetais além da membrana citoplasmática (ROINE, et al., 1997).
As proteínas da estrutura basal localizadas na membrana interna pertecem as
famílias YscV, YscU e YscRST (proteínas HrcV, HrcU, HrcR, HrcS e HrcT,
respectivamente, em fitopatógenos). As proteínas da família YscV e YscU apresentam
domínio amino-terminal que hidrofóbico altamente conservado, localizado na
membrana interna e um domínio carboxi-terminal localizado na face citoplasmática.
Este domínio citoplasmático pode interagir com as proteínas efetoras no citoplasma e
5
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atuar como receptor para reconhecimento do sinal de secreção (GOSH, 2004). Na
membrana interna ainda encontra-se associada uma ATPase, a proteína HrcN, que
fornece energia para o sistema de secreção através da hidrólise de ATP (POZIDIS, et
al., 2003). Outra atividade da ATPase InvC da Salmonella enterica é a separação das
proteínas exportadas e chaperonas antes da translocação, processo dependente de ATP
(AKEDA & GALAN, 2005).
As proteínas da estrutura basal localizadas no espaço periplasmático são
membros da família YscJ (HrcJ em fitopatógenos), apresentam domínio C-terminal, que
contém um sinal de parada de transferência e ancora este domínio na membrana interna,
uma extensão de aproximadamente 200 resíduos periplasmáticos e uma cisteína Nterminal que sofre acilação, formando uma ponte de fixação da proteína à camada
lipídica da membrana externa (ALLAOUI, SANSONETTI, PARSOT, 1992)
As proteínas da estrutural basal associadas à membrana bacteriana externa são
membros da família das secretinas. Em Yersinia estas proteínas são denominadas YscC
(BURGHOUT, et al., 2004) e em fitopatógenos HrcC. Secretinas são capazes de
formar poros na membrana externa e também são encontradas em outros sistemas de
secreção, por exemplo, nos sistemas de secreção do tipo II e do tipo IV (CHAMI, et al.,
2005). Uma mutação na secretina HrcC de P. syringae pv syringae resulta no acúmulo
de uma proteína ativadora da resposta hipersensitiva HrpZ, no periplasma, sugerindo
que esta proteína está envolvida no transporte dos efetores através da membrana externa
(CHARKOWSKI, HUANG, COLLMER, 1997).
O complexo de translocação está localizado na extremidade da agulha e é
montado ao contato com a membrana da célula do hospedeiro, formando um poro na
membrana plasmática eucariótica. Em geral, a formação deste complexo requer a
interação de 3 proteínas (em Yersinia YopB, YopD e LcrV),YopB e YopD proteínas
com domínio hidrofílicos e são secretadas pelo SST3; após sua secreção, são inseridas
na camada bilipídica da membrana da célula hospedeira. A proteína LcrV apresenta
domínio hidrofílico e está localizada no topo da agulha do sistema de secreção de
Yersinia (SARKER, et al., 1998). Após a formação do poro é possível a translocação
das proteínas.
6
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1.3.2 Translocação de Proteínas
Os substratos do SST3 são chamados de efetores devido às suas diversas
funções, tais como reguladores da secreção, facilitadores da injeção de outros substratos
e modificadores da estrutura e das funções de proteínas do hospedeiro (GREENBERG
& VINATZER, 2003). Os efetores que atravessam a membrana via SST3 são chamados
de Hop em Pseudomonas (ALFANO & COLLMER, 1997), Xop em Xanthomonas
(NOEL, et al., 2001) ou Pop em Ralstonia (ARLAT, et al., 1994).
As proteínas efetoras contêm um sinal de secreção localizado aproximadamente
nos primeiros 100 resíduos de aminoácidos (SCHECHTER, et al., 2004; MUDGETT, et
al., 2000). Entretanto, este sinal de secreção não apresenta um padrão de seqüência
facilmente reconhecido.
A translocação de efetores também pode depender da atividade de chaperonas
específicas. Estas proteínas apresentam baixa similaridade entre si, mas possuem
algumas características gerais comuns, tais como: são pequenas e acídicas (pI<6,0), a
região C-terminal é anfipática e os genes codificadores da chaperona e do efetor alvo
geralmente estão próximos (WATTIAU, WOESTYN, CORNELIS, 1996). Estas
proteínas atuam no citoplasma para estabilizar ou prevenir a associação de efetores
antes da translocação (PAGE & PARSOT, 2002), manter os efetores no estado não
globular (STEBBINS & GALAN, 2001) ou, em alguns casos, para regular a secreção
pelo SST3 (FRANCIS, WOLF-WATZ, FORSBERG, 2002). As chaperonas interagem
com um domínio das proteínas efetoras alvo que constitui um segundo sinal de secreção
(CHENG , ANDERSON , SCHNEEWIND, 1997), independente do sinal de secreção
N-terminal (ANDERSON & SCHNEEWIND, 1997).
As chaperonas podem promover a translocação de um ou mais efetores. Por
exemplo, em Yersinia a chaperona SycE promove a translocação de YopE, mas não de
outros efetores (WATTIAU, et al., 1994), enquanto que SycT é necessária para a
translocação de YopT (IRIARTE & CORNELIS, 1998). Por outro lado, SycH promove
o transporte de YopH (SMITH, et al., 2001; WATTIAU, et al., 1994) e de LcrQ
(CAMBRONNE, CHENG, SCHNEEWIND, 2000)
Atualmente mais de 100 proteínas efetoras foram descobertas. Bactérias
patogênicas animais pode secretar de 6 a mais de 20 diferentes proteínas efetoras. A
interação dos efetores com proteínas da célula alvo pode levar a invasão de células não
7
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fagocíticas, inibição da fagocitose, regulação negativa da resposta inflamatória, indução
da apoptose ou modulação do tráfico intracelular (CORNELIS, et al., 2006).
Em células de plantas, a ação das proteínas efetoras compreende desde a
supressão da defesa do hospedeiro e até ativação de respostas de defesa do hospedeiro
contra o fitopatógeno (ALFANO & COLLMER, 2004). Os efetores promovem o
crescimento bacteriano no apoplasto (espaço intercelular) eliminando os mecanismos de
defesa do hospedeiro e de liberação de nutrientes das células vegetais, e garantindo ao
fitopatógeno capacidade de se defender dos mecanismos de defesa basal e da resposta
hipersentiva do hospedeiro. A resposta basal é disparada do lado de fora da célula da
planta contra qualquer organismo, patogênico ou não, e moléculas microbianas
associadas com patogenicidade (PAMPs) (NURNBERGER & BRUNNER, 2002), tais
como lipopolissacarídeos (DOW, NEWMAN, VON ROEPENACK, 2000), flagelinas
(GOMEZ-GOMEZ & BOLLER, 2002) e proteínas do choque térmico (FELIX &
BOLLER, 2003). Este tipo de reação do vegetal leva a formação de um depósito de
beta-1,3-glucana, chamado de calose na parede celular das células em contato com a
bactéria, produção de espécies reativas de oxigênio e de compostos fenólicos e
expressão de outros genes de defesa (JONES & TAKEMOTO, 2004).
Em fitopatógenos, as primeiras proteínas que tiveram a translocação pelo SST3
demonstrada foram as chamadas hairpin proteins, tais como a HrpN de Erwinia spp.,
HrpW de Erwinia amylovora (KIM & BEER, 1998) e P. syringae (CHARKOWSKI,
1998), HrpZ de P. syringae (STROBEL, et al., 1996) e PopA de Rasltonia
solanacearum (ARLAT, et al., 1994). Estas proteínas são ricas em glicina,
termoestáveis, ácidas e não contém cisteínas. Quando infiltradas nas folhas das plantas
promovem uma resposta hipersensitiva (CORNELIS & VAN GIJSEGEM, 2000)
As proteínas de avirulência representam outra classe das proteínas secretadas
pelo SST3. São responsáveis pela especificidade patógeno-hospedeiro. As proteínas Avr
podem interagir com proteínas de resistência do hospedeiro e ativar o mecanismo de
defesa da planta. A resposta do vegetal hospedeiro resulta de uma interação “genegene” envolvendo a interação dos genes de avirulência (avr) da bactéria e de resistência
(R) da planta (KEEN, 1990). O gene de resistência reconhece o gene secretado pelo
fitopatógeno iniciando uma cascata de eventos que levam a ativação de uma via de
transdução de sinal de defesa que limita o crescimento bacteriano, morte de células
vegetais localizada, ou seja, uma resposta hipersensitiva (MARTIN, BOGDANOVE,
SESSA, 2003).
8
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Em P. syringae pv tomato DC300 o efetor AvrPtoB é capaz de suprimir a morte
celular programada em plantas que não possuem o gene Pto de resistência. A proteína
AvrPtoB possui um domínio N-terminal que promove a resposta hipersensitiva (RH) em
plantas susceptíveis e um domínio C-terminal que suprime a RH disparada pelo domínio
N-terminal. Este e outros efetores atuam como agentes duplos e as atividades de
supressão ou ativação dependendo da complementação com as proteínas R do
hospedeiro (ABRAMOVITCH, et al., 2003).
Os genes hrp/hrc que codificam as proteínas do SST3 de bactérias estão
agrupados em plasmídios (Yersinia spp., Shigella flexneri e Ralstonia solanacearum) ou
localizados no genoma (Salmonella tiphimurium, Pseudomonas syringae, Erwinia
maylovora e Xanthomonas campestris) em regiões com características diferenciadas do
restante do genoma, chamadas de ilhas genômicas (HUECK, 1998).
1.4 ILHAS GENÔMICAS
A análise bioinformática mostra que os genomas bacterianos consistem de uma
seqüência principal com conteúdo de G+C uniforme e freqüência homogênea de uso de
códons. Esta região possui genes cujos produtos estão envolvidos em funções essenciais
para o microrganismo. (HACKER & KAPER, 2000).
Além destas seqüências essenciais, existem regiões que diferem do restante do
genoma tanto no conteúdo G+C quanto na freqüência de uso de códons, fato que sugere
uma transferência gênica horizontal. Essas regiões que codificam funções acessórias
fornecem vantagens ao microrganismo, tais como resistência a antibióticos e
propriedades envolvendo simbiose ou patogenicidade (HACKER & KAPER, 2000).
Estas regiões são denominadas de ilhas gênicas e são classificadas de acordo com as
funções dos genes que possuem em Ilhas de Simbiose, Ilhas Metabólicas, Ilhas de
Resistência ou Ilhas de Patogenicidade (GAL-MOR, & FINLAY, 2006; HACKER &
KAPER, 2000).
1.4.1 Ilhas de Patogenicidade
As Ilhas de Patogenicidade ou PAI podem ser encontradas em microrganismos
gram-negativos (Helicobacter pylori, diferentes estirpes de E. coli, Salmonellas spp.,
Shigella spp., Yersinia spp., Citrobacter rodentium, Legionella pneumophila, P.
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aeruginosa, P. syringae, Vibrio cholerae, Erwinia amylovora, Bacteroides fragilis e
Porphyromonas gingivalis), ou
gram-positivos (Listeria spp, Staphylococcus aureus,
Streptococcus spp., Enterococcus faecalis e Clostridium difficile), que podem ser
patógenos humanos, animais ou vegetais (GAL-MOR, & FINLAY, 2006)
As ilhas de Patogenicidade possuem genes de virulência e ocupam regiões entre
10 a 100 Kb do DNA. Algumas estirpes possuem pequenos segmentos (1-10 Kb) de
DNA na vizinhança da PAI chamadas de “ilhotas de patogenicidade” (GAL-MOR, &
FINLAY, 2006).
Os genes de virulência localizados próximos ou dentro das ilhas de patogenicidade
podem ser divididos em grupos e os mais comuns estão listados na Tabela 1.
TABELA 1 - FATORES DE VIRULÊNCIA ENCONTRADOS EM ILHAS DE
PATOGENICIDADE
Genes de Virulência
Fatores de aderência
Microrganismos
Escherichia coli enteropatogênicas
E. coli uropatogênicas
Vibrio cholerae
Listeria spp.
Toxinas
E. coli uropatogênica
Staphylococcus aureus
Sistemas de captação de ferro
E. coli uropatogênica
Shigella flexneri
Yersinia spp.
Invasão, modulinas, efetores
E. coli enteropatogênicas
Salmonella spp.
Shigella spp.
Listeria spp.
Sistema de secreção do tipo III
E. coli enteropatogênicas
Pseudomonas syringae
Erwinia spp.
Yersinia spp.
Salmonella spp.
Shigella spp.
Sistema de secreção do tipo IV
Helicobacter pylori
Agrobacterium tumefaciens
FONTE: HACKER, J.; KAPER, J. Pathogenicity Islands and the Evolution of
Microbes. Annual Review in Microbiology. v.54, p. 641-679, 2000.
Além de possuírem conteúdo de G+C e freqüência do uso de códons diferentes
do resto do genoma, as Ilhas de Patogenicidade são flanqueadas em um dos lados por
genes de tRNA para asparagina e por seqüências repetidas diretas (DR) e elementos de
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inserção (IS) (GAL-MOR & FINLAY, 2006). Presumivelmente, os genes de tRNA´s
para asparagina são os pontos de inserção de DNA externo, pois os nucleotídeos finais
3’ do tRNA são idênticos aos nucleotídeos do sítio de inserção de DNA de
bacteriófagos, permitindo portanto a integração de DNA plasmidial e viral (REITER, et
al., 1989). No caso do gênero Yersinia a ilha pode estar integrada em qualquer uma das
três cópias do gene de tRNA para asparagina (CARNIEL ,et al., 1996).
As seqüências repetitivas diretas (DR) flanqueiam as ilhas de patogenicidade e
são seqüências entre 16 a 20 pares de base homólogas aos sítios de inserção de
bacteriófagos, portanto atuam como sítios de reconhecimento para enzimas envolvidas
na excisão dos elementos genéticos móveis e contribuem para instabilidade genômica
da ilha. Estas seqüências são geradas durante a integração do DNA externo no genoma
do hospedeiro via recombinação sítio específica, resultando na duplicação da seqüência
(HACKER, et al., 1997).
Os elementos de inserção (IS) são pequenos elementos genéticos móveis capazes
de transposição inter e intra genomas, fornecem seqüências invertidas repetidas, onde
pode ocorrer recombinação homóloga e, portanto pode mediar a incorporação de
elementos genéticos móveis dentro do genoma e contribuir para a instabilidade ou
excisão da ilha de patogenicidade (HACKER, et al., 1997).
Genes que codificam fatores envolvidos na mobilidade genética, tal como
integrases (int), transposases, genes de fagos e origens de replicação podem estar
presentes em uma Ilha de Patogenicidade (GAL-MOR. & BRETT, 2006). Os
componentes de uma ilha de patogenicidade estão representados na figura 3.
FIGURA 3 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA GENERALIZADA DA ILHA
DE PATOGENICIDADE
Elementos IS
Genes associados à virulência
FONTE: BINNEWIES, T. T. et al. Ten years of bacterial genome sequencing:
comparative- genomics-based discoveries. Functional and Integrative Genomics. v.6,
p.165–185, 2006.
11
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1.4.1.2 Aquisição da ilha de patogenicidade
A aquisição da PAI envolve cinco passos (HACKER & CARNIEL, 2001), os
quais estão representados na figura 4: 1) aquisição dos genes de virulência por
transferência horizontal; 2) integração do DNA externo no genoma (ou plasmídeo)
hospedeiro por recombinação sítio específica mediada por uma integrase ou
recombinase ou outros mecanismos. Este evento pode ocorrer múltiplas vezes,
envolvendo genes de diferentes organismos e resultando em uma ilha com estrutura de
mosaico; 3) o elemento genético móvel pode promover rearranjos genéticos tais como
perda ou aquisição de genes; 4) expressão dos genes adquiridos e contribuição para o
desempenho bacteriano (por exemplo, patogenicidade), o que favorece a seleção
positiva destas variantes; 5) recombinações consecutivas e eventos de excisão e inserção
resultando em perda ou ganho de informações genéticas.
FIGURA 4 - ESTÁGIOS DE EVOLUÇÃO DA ILHA DE PATOGENICIDADE
Rearranjo
Seleção
Perda ou ganho de genes
Captação
Recombinação
FONTE: GAL-MOR, O., BRETT F. B. Pathogenicity islands: a molecular toolbox for
bacterial virulence. Cellular Microbiology. v. 8,. n.11, p.1707–1719, 2006.
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1.4.1.3 Regulação da expressão de genes da ilha de patogenicidade
Os genes que codificam reguladores de genes de virulência estão localizados
dentro ou fora da ilha. Os reguladores em organismos patogênicos podem controlar a
expressão de fatores de virulência e de outras proteínas reguladoras. As duas principais
classes de reguladores são as proteínas da família AraC e reguladores do sistemas de
dois componentes. Outras classes de reguladores incluem fatores sigmas alternativos e
proteínas semelhantes a histonas (HACKER & KAPER, 2000). Sinais ambientais como
pH, osmolaridade, oxigênio, concentração de Mg++ (GALAN & COLLMER,1999;
COTTER & MILLER, 1998), temperatura (CORNELIS & WOLF-WATZ, 1997) e
sensoriamento populacional em estirpes de E. coli (SPERANDIO, et al., 1999)
controlam a atividade dos reguladores dos genes das PAI.
Em P. syringae um fator sigma alternativo está envolvido na regulação do grupo
de genes hrp/hrc (XIAO, et al.,1994). Este grupo de genes está localizado numa PAI e
codifica o sistema de secreção do tipo III que é regulado por quatro proteínas
codificadas por genes da própria ilha. A proteína HrpL é um fator sigma alternativo que
é essencial para a transcrição de todos os genes do regulon exceto hrpR, hrpS e hrpL
(XIAO, et al.,1994). O fator sigma HrpL é similar ao 28, que controla o expressão dos
genes envolvidos na biossíntese flagelar. A transcrição de hrpL é dependente do fator
sigma 54 e é positivamente regulado pelas proteínas HrpR e HrpS. Estas proteínas
constituem um sistema de dois componentes (HACKER & KAPER, 2000).
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2 OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo a identificação e seqüenciamento dos genes de
H. rubrisubalbicans estirpe M1 relacionados com o sistema de secreção do tipo 3. Parte
destes genes provavelmente faz parte de uma ilha de patogenicidade e sua
caracterização estrutural é o primeiro passo para compreensão dos mecanismos
envolvidos no desenvolvimento da relação patogênica desta bactéria com plantas
hospedeiras.
Este trabalho faz parte do projeto de Seqüenciamento Genômico do
Herbaspirillum rubrisubalbicans (Projeto CNPq 50.6421/2004-0).
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3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 BACTÉRIAS E PLASMÍDEOS
As estirpes de bactérias e os plasmídeos utilizados estão listados nas tabelas 2 e 3, respectivamente.
TABELA 2 - ESTIRPES BACTERIANAS UTILIZADAS
H. seropedicae
Estirpes
SmR1
ZM152
ZA95
HRC54
Genótipo/Fenótipo
Derivada da estirpe Z78, estirpe selvagem SmR Nif+
Estirpe selvagem
Estirpe selvagem
Estirpe selvcagem
Referência/Fonte
SOUZA, et al.,1995
BALDANI, et al.,1986
BALDANI, et al.,1986
EMBRAPA
H. rubrisubalbicans
Estirpes
M1
HCC103
Genótipo/Fenótipo
Estirpe selvagem
Estirpe selvagem
Referência/Fonte
EMBRAPA
EMBRAPA
Genótipo/Fenótipo
Referência/Fonte
INVITROGEN
Escherichia coli
Estirpes
TOP10
F- mcrA Δ(mrr-hsd RMS-mcrBC) φ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 araD139
Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG
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TABELA 3 - LISTA DE PLASMÍDEOS UTILIZADOS
Plasmídeos
pUC18/19
Genótipo/Fenótipo
AmpR lacZα+
Referência/Fonte
INVITROGEN
HR03-FP-00-000-003-A06.TET AmpR, TcR. pUC19 .Clones da montagem 19/08/2006 que contem sequência parcial do gene pilN de H.
HR03-FP-00-000-008-H07. TET
rubrisubalbincans
HR03-FP-00-000-010-H02.TET
Este trabalho
HR03-MF-00-000-052-H10.TET
AmpR, TcR. pUC19 .Clone da montagem 19/08/2006 que contém sequência parcial do gene hrcC de H.
rubrisubalbincans .
Este trabalho
HR02-FP-00-000-009-C05.TET
HR02-MF-00-000-057-H09.TET
AmpR, TcR. pUC19 .Clones da montagem 19/08/2006 que contém a seqüência parcial do gene hrcJ de
H. rubrisubalbincans.
Este trabalho
HR03-MF-00-000-049-A08.TET
AmpR, TcR. pUC19 .Clone da montagem 19/08/2006 que contém a seqüência parcial dos genes
hrcT,hrcX e hrcU de H. rubrisubalbincans.
Este trabalho
HR02-MF-00-000-052-H11.TET
HR02-MF-00-000-052-A02.TET
AmpR, TcR. pUC19 .Clones da montagem 19/08/2006 que contém sequência parcial do gene hrcU.
Este trabalho
HR03-FP-00-000-013-B07.TET
HR02-MF-00-000-053-F11.TET
AmpR, TcR. pUC19 .Clones da montagem 19/08/2006 que contém sequência parcial do gene hrpQ de H.
rubrisubalbincans.
Este trabalho
HS09-MH-00-000-059-E07
AmpR, pUC18 contendo gene hrcV de H. seropedicae
nfn.genopar.org
Os plasmídeos selecionados do Programa GENOPAR foram nomeados baseados na nomenclatura do plasmídeo de origem acrescida das
letras TET, pois foram obtidos pós reação de transposição com transposon EZ-Tn5™ <TET-1> conforme descrito no item 3.11.2. O
plasmídeo HS09-MH-00-000-059-E07 foi utilizado como sonda para hibridização DNA-DNA conforme descrito no item 3.10.
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3.2 CONDIÇÕES DE CULTIVO
As estirpes de H. seropedicae e H. rubrisubalbicans foram cultivadas em meio
NFbHP-malato (KLASSEN, et al.,1997). No momento do uso, o meio foi suplementado com
20 mmol/L cloreto de amônio e 50 mL/L da mistura de fosfatos (K2HPO4 17,8 g/L e KH2PO4
159,5 g/L), fornecendo pH final de 6,0. O meio NFbHP contendo íons amônio foi
denominado NFbHPN. As culturas foram crescidas sob agitação (120 rpm) a 30C por 18 a
24h.
A estirpe TOP10 de E. coli foi cultivada em meios líquidos Terrific Broth (TARTOF
& HOBBS, 1987), Luria-Bertani Broth (LB), SOC ou SOB (SAMBROOK, et al., 1989). O
meio sólido foi utilizado o meio Luria-Bertani Agar (LA) (SAMBROOK, et al., 1989).
3.3 MEIOS DE CULTURA
Composição do meio NFbHP-malato (KLASSEN, et al., 1997) é a seguinte:
Gramas/litro
MgSO4.7H2O
0,2
NaCl
0,1
CaCl2
2,0 X 10 -2
Ácido nitrilo triacético
5,6 X 10 -2
FeSO4.7H2O
2,0 X 10 -2
Biotina
1,0 x 10 -4
Ácido málico
5,0
Solução de Oligoelementos
10 mL
Água destilada q.s.p.
1000 mL
Solução de Oligoelementos
Gramas/litro
Na2Mo 4.2H2O
1
MnSO4.H2O
1,175
H3BO3
1,4
CuSO4.5H2O
0,04
ZnSO4.7H2O
0,12
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Após o preparo o meio foi autoclavado por 20 min a 1 atm. Para o preparo de NFbHP
sólido acrescentou-se ao meio 15 g/L de ágar.
Composição do meio Terrific Broth (TARTOF & HOBBS, 1987) é a seguinte:
Gramas/litro
Bacto triptona
12
Extrato de levedura
24
K2HPO4
12,54
KH2PO4
2,32
Glicerol
4 mL
Água q.s.p.
1000 mL
Após o preparo o meio foi autoclavado por 20 min a 1 atmosfera.
Composição do meio LB (SAMBROOK, et al., 1989) é a seguinte:
Gramas/litro
Extrato de levedura
5
Triptona
10
NaCl
10
Água q.s.p.
1000 mL
O meio LA tem a mesma composição do meio LB, mas é acrescido de
15g/L de ágar.
Composição do meio SOB (SAMBROOK, et al., 1989)
Gramas/litro
Triptona
20
Extrato de levedura
5
NaCl
0,5
KCl
0,186
Água q.s.p
1000mL
Após o preparo o meio foi autoclavado por 20 min a 1 atm.
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Composição do meio SOC, conforme manual do eletroporador Cell-porator 1600 (Gibco
BRL), é a seguinte:
Gramas/litro
Triptona
20
Extrato de levedura
5
NaCl
0,5
KCl
0,186
MgCl2
0,95
MgSO4
1,2
Glucose
3,6
Água q.s.p
1000mL
Após o preparo o meio foi autoclavado por 20 min a 1 atm.
3.4 ANTIBIÓTICOS
Os antibióticos utilizados e as respectivas concentrações para seleção de
transformantes da estirpe TOP10 de E. coli foram: ampicilina (Amp), 200g/mL e tetraciclina
(Tc), 10g/mL. Para seleção das estirpes do Herbaspirillum seropedicae foi utilizado
estreptomicina 80 g/mL.
Ampicilina e a estreptomicina foram preparadas com água ultra-pura grau reagente
Tipo I, esterilizadas por filtração (filtro Millipore 0,22 m) e estocadas a -20C. A tetraciclina
foi preparada em etanol 96% e também estocada a -20º C.
3.5 ENZIMAS
A enzima pronase foi preparada com água ultrapura numa concentração de 20mg/ml,
incubada por 1h a 37ºC, aliquotada e armazenado a -20ºC.
A RNAse foi preparada numa concentração de 10mg/mL em acetato de sódio 0,01
mol/L (pH5,2). A solução foi aquecida a 100ºC por 15 minutos e em seguida resfriada a
temperatura ambiente. O pH foi ajustado com a adição de 0,1 volume de Tris-HCl (pH 7,5)
(SAMBROOK, et al., 1989).
19
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3.6 ARMAZENAGEM DAS BACTÉRIAS
Para armazenagem das estirpes de E. coli, H. seropedicae e H. rubrisubalbicans 1,5
mL de cultura em meio líquido em tubo tipo eppendorf de 1,5 mL foi centrifugado e o
sedimento de células foi ressuspenso em 1 mL de glicerol 50%. A suspensão de células foi
então armazenada a -20°C.
3.7 PURIFICAÇÃO DE DNA
3.7.1 Purificação de DNA Plasmidial de E. coli
A purificação dos plasmídeos citados na Tabela 3 foi realizada utilizando o método de
lise alcalina modificado daquele descrito por SAMBROOK (1989).
As colônias transformantes da estirpe TOP10 de E. coli foram cultivadas a 37°C sob
agitação durante a noite em meio LB ou Terrific-Broth contendo os antibióticos necessários.
As células foram coletadas por centrifugação de 13.000 rpm por 1 minuto, ressuspensas em
150 µL da solução GET (Tris-HCl 25 mmol/L pH 8,0; glucose 50 mmol/L e EDTA 10
mmol/L) e lisadas com 150 µL da solução contendo NaOH 0,2 mmol/L e SDS 1% (p/v).
Após homogeneização foi adicionado 150 µL da solução Kacf (acetato de potássio 3 mol/L e
ácido fórmico 1,8 mol/L, pH 4,8) e o sistema foi mantido no gelo por 10 minutos. Ao
sobrenadante foi adicionada RNase 10µg/mL e a amostra foi incubada em estufa a 37°C Em
seguida foi adicionado 50µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). Após centrifugação por
30 min a 13.000 rpm, a fase aquosa foi removida e o DNA precipitado com 2 volumes de
etanol absoluto por centrifugação por 10 min a 13.000 rpm. O precipitado foi lavado com
etanol 80%, seco a vácuo e dissolvido em água ultra pura grau reagente Tipo I.
3.7.2 Purificação do DNA Genômico de Herbaspirillum spp.
A extração do DNA genômico de Herbaspirillum foi realizada por procedimento
modificado daquele descrito por SOUZA (1990).
O DNA genômico das estirpes de H. seropedicae e H. rubrisubalbicans foi purificado
a partir de uma cultura (D.O.600  2,0) crescida em meio NFbHPN contendo os antibióticos
necessários. Uma alíquota de 1,5mL da cultura foi centrifugada por 1 min a 13.000 rpm. As
células foram ressuspensas em 500 µL de tampão GET (Tris-HCl 25 mmol/L, pH 8,0; glucose
50 mmol/L e EDTA 10 mmol/L) contendo 1% de SDS e incubadas a 30 °C. Pronase foi
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adicionada (200 g/mL concentração final) e a mistura incubada a 37C por 24 horas. As
proteínas restantes foram removidas por extração com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico
(25:24:1) seguida de extração com clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). O DNA foi então
precipitado com 2 volumes de etanol absoluto, lavado com etanol 80%, seco a vácuo e
solubilizado em água ultra pura grau reagente Tipo I.
3.7.3 Purificação do DNA de gel de agarose
Após eletroforese o gel foi corado com brometo de etídio (0,5 g/mL), lavado
em água destilada e as bandas de DNA foram visualizadas em transiluminador UV (312nm) e
as imagens registradas com um sistema de fotodocumentação Biochemi (UVP). A banda de
interesse foi retirada do gel e colocada em um tubo plástico de 1,5 mL. A extração do DNA
foi realizada utilizando o kit QUIAQuick Gel Extration Kit (QUIAGEN).
3.8 MÉTODOS ANALÍTICOS
3.8.1 Quantificação de DNA por espectrofotometria
A concentração de ácido nucléico foi determinada espectrofotometricamente
empregando a seguinte relação: uma solução contendo de 50 g/mL de DNA dupla fita possui
absorbância a 260nm igual a 1 (SAMBROOK, et al., 1989). As preparações de DNA foram
consideradas puras quando a razão da absorbância a 260nm pela absorbância 280 nm foi igual
a 1,8-2,0.
3.9 TÉCNICAS DE MANIPULAÇÃO DO DNA
3.9.1 Eletroforese em gel de Agarose ou ágar
Os géis foram feitos com ágar (1%) ou agarose (0,7-1%) em tampão TBE 1X (Trisbase 89 mmol/L, ácido bórico 89 mmol/L, EDTA 2 mmol/L pH 8,0) em sistema horizontal
Hoeffer. O tampão de aplicação FSUDS (azul de bromofenol 0,25%, SDS 0,1%, Ficoll 20%
em T10E1) foi adicionado às amostras de DNA na proporção de 1:5 (FSUDS: amostra) antes
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da aplicação no gel. As corridas eletroforéticas foram realizada com voltagem e tempo
variáveis.
O gel de agarose foi corado com brometo de etídio (0,5 g/mL) e lavado em água
destilada. As bandas de DNA foram visualizadas em transiluminador UV (312 nm) acoplado
a um sistema de fotodocumentação Biochemi (UVP). O marcador de tamanho molecular
utilizado foi 1Kb.
3.9.2 Digestão de DNA com endonucleases de restrição
A digestão de DNA com endonucleases foi realizada conforme as condições
especificadas pelo fabricante.
3.10 HIBRIDIZAÇÃO DNA/DNA
3.10.1 Transferência do DNA genômico digerido do gel de agarose para membrana de
náilon
O DNA genômico das estirpes SMR1, ZM152, ZA95 e HRC54 de H. seropedicae e
M1 e HCC103 de H. rubrisubalbicans foi digerido com as endonucleases de restrição EcoRI,
BglII e PstI. Os fragmentos de DNA resultantes da digestão enzimática foram separados por
eletroforese em gel de agarose. O DNA do gel de agarose foi transferido por vácuo para
membrana de náilon HybondTMN+ (GE Health Care) utilizando o sistema Vaccum Blot (GE
Health Care). Inicialmente o gel foi tratado com solução de depurinização (HCL 0,25
mmol/L) por 5 minutos, seguido pela solução de desnaturação (NaCl 1,5 mmol/L, NaOH 0,5
mol/L) e em seguida o gel foi tratado com solução de neutralização (Tris-HCl pH 7,5, NaCl
1,5mol/L) por 10 minutos. Por fim aplicou-se a solução de transferência (NaCl 3 mol/L,
citrato trissódico 0,3mol/L pH 7,0 por 1hora.
A membrana foi seca a temperatura ambiente e o DNA foi fixado através da exposição
à luz ultravioleta (312nm) durante 4 minutos.
3.10.2 Marcação da sonda com Fluoresceína-11-desóxi-Uridila-Tri-Fosfato (dUTP)
O plasmídeo contendo os genes hrcV de H. seropedicae estirpe SMR1
(http://nfn.genopar.org) foi digerido com a enzimas de restrição PstI para liberação do inserto.
22
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O fragmento de DNA foi extraído e purificado do gel de agarose, após eletroforese, conforme
item 3.7.3. Em seguida foi determinada a concentração do DNA purificado por densitometria
utilizando o transiluminador UVP.
O fragmento de DNA foi marcado utilizando o Kit Gene ImagesTM Random Prime (GE
Health Care). Cerca de 50 ng de DNA foi desnaturado em banho-maria fervente (5 minutos)
em um volume final de 20µL. O DNA foi colocado em banho de gelo e foram adicionados
5µL da mistura de nucleotídeos, 2,5µL de oligonucleotídeos com seqüências aleatórias, 1µL
de enzima Klenow (5U/L) e água para um volume final de 50µL. A mistura foi
homogeneizada, centrifugada rapidamente e incubada a 37°C por 1h.
3.10.3 Pré-hibridização
A membrana de náilon contendo o DNA genômico foi incubada em tampão de pré
hibridização (SSC 5x, líquido de bloqueio diluído 20x e SDS 0,1% ) 60°C por 15 minutos.
Em seguida foram adicionados 20 ng de DNA de timo e incubou-se por mais 30 minutos.
3.10.4 Hibridização
A sonda de DNA preparada conforme item 3.10.2 foi adicionada ao tampão de préhibridização e o sistema foi incubado sob agitação a 60°C durante 24 horas.
Para detecção de hibridização foi utilizando o kit de detecção Gene-Images CDP-Star
(GE Health Care). Após hibridização a membrana foi incubada com uma solução de bloqueio
( líquido de bloqueio diluído10x em tampão A (100 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl (pH 9,5)) à
temperatura ambiente por 1h. Posteriomente, a membrana foi incubada com tampão A (100
mM Tris-HCl; 300 mM NaCl pH 9,5) contendo 0,5% de albumina bovina e anticorpo antiflouresceina-conjugado com fosfatase alcalina (diluído 500 vezes), e incubada sob agitação a
temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida a membrana foi lavada 3 vezes com tampão A
contendo TweenTM 20 0,3% por 10 minutos sob agitação a temperatura ambiente. O excesso
de tampão de lavagem foi removido, o reativo de revelação de fosfatase alcalina foi
adicionado e as bandas de hibridização DNA/DNA foram visualizadas com o sistema de fotodocumentação Biochemi (UVP).
23
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3.11 Sequenciamento dos genes hrp, hrc e pil de H. rubrisubalbicans
Os plasmídeos selecionados do
Herbaspirillum
rubrisubalbicans
projeto de sequenciamento
genômico
(http://aramis.genopar.org/bacteria/HR)
de
foram
mutagenizados por inserção aleatória in vitro do transposon EZ-Tn5™ <TET-1> utilizando-se
um kit de inserção EPICENTRE. Os produtos de inserção podem ser seqüenciados utilizando
oligonucleotídeos iniciadores que hibridizam com as extremidades do transposon.
3.11.1 Inserção do Transposon EZ-Tn5™ <TET-1> in vitro
A reação de inserção foi realizada como descrito pelo fabricante do Kit de Inserção
EZ-Tn5™ <TET-1> (EPICENTRE). O produto de reação foi eletro-transformado em E. coli
estirpe TOP10.
3.11.2 Preparo de células eletrocompetentes
A estirpe TOP10 de E. coli foi cultivada em 200 mL de meio SOB até D.O600 de 0,60,8. Em seguida a suspensão de células foi incubada em banho de gelo por 30 minutos e as
células foram coletadas por centrifugação a 5.000 rpm por 5 minutos a 4°C em centrífuga
Eppendorf 5804R , rotor A-4-44 (Eppendorf). O precipitado de células foi lavado 3 vezes com
glicerol 10% gelado e, ao final, ressuspenso em 100µL da mesma solução.
3.11.2.1 Eletro-Transformação bacteriana
Alíquotas de 40µL de células eletrocompetentes foram misturadas com 1 µL do
sistema de transposição. A mistura foi transferida para uma cubeta de eletroporação BioRad
de 0,2 cm previamente resfriada. As amostras foram submetidas a um choque elétrico de
2,5kV utilizando-se o aparelho Gene Pulser II (BioRad). As células de Escherichia coli foram
recuperadas em 1mL de meio SOC por 30 minutos sob agitação a 37°C. Após este período as
culturas foram plaqueadas em meio sólido LA contendo os antibióticos ampicilina 250 µg/mL
e tetraciclina 10 µg/mL. Em seguida, as placas foram incubadas na estufa a 37°C por 16
horas.
24
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3.11.3 Seqüenciamento do DNA plasmidial
A reação de seqüenciamento foi realizada utilizando 100-400 ng de DNA fita dupla
purificado, 3,25 pmol de oligonucleotídeo iniciador, 3 µL de reativo ET terminator mix (GE
HealthCare) e água ultra pura grau reagente tipo I suficiente para 7,5 µL. A reação de
seqüenciamento foi conduzida em termociclador Eppendorf Master Cycler Gradient 5331
com as seguintes condições: aquecimento a 95°C por 1 minuto, seguido por 34 ciclos de 94°C
por 20 segundos e 62°C por 2 minutos.
O produto de reação foi purificado adicionando a cada amostra 12,5L de água ultra
pura grau reagente tipo I, 2 L de acetato de amônio 7,5M e 2 volumes de etanol 96%,
seguido de centrifugação por 30 minutos. O precipitado foi lavado com 150L e etanol 70%,
centrifugado por mais 15 minutos e seco a vácuo. O seqüenciamento foi realizado no
seqüenciador automático ABI377 (Applied Biosystem).
3.12 ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS DE DNA
3.12.1 Montagem das seqüências consenso
Os
eletroforetogramas
obtidos
das
reações
de
seqüenciamento
com
os
oligonucleotídeos iniciadores das extremidades do transposon EZ-Tn5™ <TET-1> foram
processados pelo programa Phred (EWING, et al., 1998a; EWING, et al., 1998b). Este
programa faz a identificação das bases nucleotídicas levando em conta a intensidade do sinal,
espaçamento entre picos e o espectro de emissão de cada fluoróforo. Também atribui
qualidade a cada base da seqüência. Em seguida, o programa Cross_Match (desenvolvido por
Phil Green) realiza o alinhamento das seqüências no formato FASTA com a seqüências do
arquivo do vetor vector.seq que mascara as seqüências do vetor, trocando o nucleotídeo pela
letra X. As seqüência filtradas pelo programa Cross_Match são utilizadas no programa CAP3
para montagem das seqüências consenso.
O programa CAP3 (HUANG & MADAN, 1999) realiza a montagem das seqüências
em seqüência consenso. A montagem das seqüências nas direções 5’ e 3’ sobrepostos utiliza
valores de qualidade produzidos pelo programa Phred (EWING, et al., 1998a, EWING, et al.,
1998b) para a construção do alinhamento das seqüências e criação da seqüência consenso. A
montagem apresenta três fases: na primeira as regiões dos reads nas direções 5’ e 3’ de baixa
25
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qualidade são identificadas e as regiões de sobreposição são alinhadas. Na segunda fase, as
seqüências são reunidas para a formação da seqüência consenso na ordem decrescente de
porções sobrepostas e as seqüências “reversas e universais” são usadas para as montagens das
seqüências consenso. Na terceira fase o alinhamento das seqüências é construído e a
seqüência consenso tem seu valor (E value) computado tanto para cada base quanto para cada
contig.
O programa PHRAP não foi utilizado, pois, apesar de produzir seqüências consenso
maiores, o programa CAP3 produziu seqüências consenso com melhor qualidade (HUANG &
MADAN, 1999).
A montagem foi visualizada através do programa Consed (GORDON, ABAJIAN,
GREEN, 1998)
26
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FIGURA 5 - FLUXOGRAMA DA MONTAGEM DE SEQÜÊNCIA CONSENSO
UTILIZANDO O PACOTE PHRED/PHRAP/CONSED
Eeletroforetrogramas das Seqüências
Atribuição de valores de qualidade pelo Programa Phred
Arquivos phdConversão dos arquivos phd para fasta
phd2fasta.pl
Sequências de nucleotídeos – seqs_fasta
Valores de qualidade- seqs_fasta.screen.qual
Mascaramento de sequências do vetor
Cross_Match (programa de alinhamento local) x vector.seq
Arquivos com seqüências mascaradas- seqs_fasta.screen
CAP3
Seqüência consenso montadosseqs_fasta.screen.seqüência consenso
Arquivo da montagem- eqs_fasta.screen.ace
Visualização da montagem/edição
no programa Consed
3.12.2 Análise das Seqüências de DNA nos programas FRAMEPLOT, BLAST e
CLUSTALW
As seqüências consenso obtidas foram analisados no programa FRAMEPLOT
(ISHIKAWA & HOTTA, 1999). Este programa permite a identificação de prováveis regiões
codificadoras de proteínas (ORFs) no DNA bacteriano. A análise é baseada no conteúdo
médio de (G+C) da terceira base do códon: bactérias com alto conteúdo genômico de (G+C)
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tendem a apresentar valores maiores do que a media na terceira posição do códon em regiões
codificadoras de proteínas (ISHIKAWA & HOTTA, 1999).
O programa BLAST (YE, MCGINNIS, MADDEN, 2006; ALTSCHUL, et al., 1990)
foi utilizado para busca de proteínas similares no banco de dados Genbank. O programa
Clustal W (THOMPSON, et al.,1994) foi utilizado para produzir alinhamentos das seqüências
primárias das proteínas.
28
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 IDENTIFICAÇÃO DO GENE hrcV DE H. rubrisubalbicans POR HIBRIDIZAÇÃO
O plasmídeo HS09-00-000-059-E07 foi obtido do Programa GENOPAR contém um
inserto de 1456 pb contendo o gene hrcV de H seropedicae. O fragmento EcoRI/HindIII deste
plasmídeo foi purificado e utilizado como sonda na hibridização com o DNA genômico das
estirpes M1 e HRCC103 de H. rubrisubalbicans e das estirpes ZA95, ZM152 e HRC54 de H.
seropedicae digerido com a enzima de restrição PstI.
A figura 6 mostra que todas as estirpes de Herbaspirillum utilizadas apresentaram um
sinal de hibridização com o gene hrcV. Entretanto o padrão de hibridização foi distinto entre
as duas espécies: as estirpes de H. seropedicae apresentaram um fragmento PstI de
aproximadamente 10 Kb hibridizando com a sonda hrcV, enquanto que as de H.
rubrisubalbicans apresentaram um sinal de aproximadamente 4 Kb. Estes resultados mostram
que todas as estirpes testadas provavelmente possuem um sistema de secreção do tipo 3 e
sugerem que as regiões genômicas que contêm o gene hrcV são similares entre as estirpes da
mesma espécie, mas são diferentes nas duas espécies de Herbaspirillum.
29
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FIGURA 6 - HIBRIDIZAÇÃO DO DNA GENÔMICO DE ESTIRPES DE H.
seropedicae e H. rubrisubalbicans COM O GENE hrcV.
1
2
A
3 4
B
5
6
7
2
3
4
5
6
7
10Kb
8Kb
4Kb
O DNA genômico das estirpes de H. seropedicae e H. rubrisubalbicans foi digerido com
enzima de restrição PstI, submetido a eletroforese em gel de agarose 0,7% e os fragmentos
foram hibridizados com o fragmento EcoRI/HindIII de 1,456 Kb do plasmídeo HS09-00-000059-E07 (GENOPAR) marcado com dUTP-fluoresceína.
Painel A. Perfil eletroforético
1- 1 kb ladder (FERMENTAS)
2- DNA total de H. seropedicae estirpe SMR1 digerido com PstI.
3- DNA total de H. seropedicae estirpe HRC54 digerido com PstI
4- DNA total de H. seropedicae estirpe ZA94 digerido com PstI
5- DNA total de H. seropedicae estirpe ZM152 digerido com PstI
6- DNA total de H. rubrisubalbicans estirpe M1digerido com PstI
7- DNA total de H. rubrisubalbicans estirpe HCC103 digerido com PstI
Painel B. Hibridização de A com o fragmento EcoRI/HindIII do plasmídeo HS09-00-000059-E07 contendo o gene hrcV marcado com dUTP-fluoresceína.
30
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4.2 SEQÜENCIAMENTO DOS GENES DO SISTEMA DE SECREÇÃO DO TIPO
TRÊS DE H. rubrisubalbicans
O banco de dados do Projeto de Seqüenciamento Genômico Parcial de H.
rubrisubalbicans (http://aramis.genopar.org/bacteria/HR) foi utilizado para identificação de
possíveis genes do sistema de secreção do tipo 3 (SST3) utilizando o programa BlastX
(BIRO, 2002) e o banco de dados nr do GenBanK. Os prováveis genes do sistema SST3
identificados foram: pilN, pilO, hrcC, hrpE, hrcJ, hrcU, hrpX, hrpQ, hrcN, hrpO e hrcV. A
identificação destes genes na seqüência genômica parcial de H. rubrisubalbicans M1
confirma a presença do sistema de secreção do tipo 3 nesta espécie e está de acordo com os
resultados de hibridização
Os genes do SST3 foram encontrados em seqüências de 11 plasmídeos do banco
aleatório de H. rubrisubalbicans no vetor pUC19 (http://aramis.genopar.org/bacteria/HR). A
tabela 3 mostra os clones e os prováveis genes relacionados ao sistema de secreção do tipo 3
presentes.
Os plasmídeos selecionados foram submetidos à mutagênese aleatória utilizando-se
um sistema de inserção in vitro do transposon EZ-Tn5™ <TET-1> (EPICENTRE
Biotechnologies—Enzyme Systems for RNA and DNA Research). Os produtos de inserção
podem ser seqüenciados a partir de iniciadores que hibridizam nas extremidades do
transposon.
O processo de inserção do transposon EZ-Tn5™ <TET-1> está esquematizado na
figura 7.
31
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FIGURA 7 - ESQUEMA DE OBTENÇÃO DE MUTANTES COM TRANSPOSON
EZ-Tn5™ <TET-1> in vitro E SEQUENCIAMENTO
Incubar 37 ºC por 2h
Transformar em E. coli TOP10
Selecionar clones TET resistentes
Extrair DNA plasmidial
Sequenciamento bidirecional
O DNA plasmidial foi extraído conforme descrito no item 3.7.1 e submetido à reação
de transposição in vitro (item 3.11.1) e o produto da reação foi transformado em E.coli TOP
10.
As colônias de E. coli TOP10 transformantes foram selecionadas em meio LA
contendo ampicilina (250 µL/ml) e tetraciclina (10 µl/mL). Doze colônias transformantes
derivadas de cada um dos clones HR03-MF-00-000-052-H10, HR02-FP-00-000-009-C05,
HR02-MF-00-000-052-H11, HR02-MF-00-000-053-F11 e quatro colônias de cada um dos
clones HR02-MF-00-000-052-H1 e HR02-MF-00-000-057-H09 foram coletadas e cultivadas.
O DNA plasmidial foi extraído e submetido à reação de seqüenciamento utilizando os
oligonucleotídeos TET-1 FP-1 (5' - GGGTGCGCATGATCCTCTAGAGT - 3') e TET-1 RP-1
(5' - TAAATTGCACTGAAATCTAGAAATA - 3') que permitem o seqüenciamento a partir
das extremidade direita e esquerda, respectivamente, do transposon EZ-Tn5™ <TET-1>. Não
foram obtidas colônias transformantes dos clones restantes. Os clones foram também
seqüenciados utilizando os oligonucleotídeos universal e reverso que hibridizam com o vetor.
As seqüências obtidas foram utilizadas juntamente com aquelas recuperadas do banco
Projeto
de
Sequenciamento
Genômico
Parcial
de
H.
rubrisubalbicans
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(http://aramis.genopar.org/bacteria/HR) e montadas em seqüência consenso utilizando o
programa CAP3 (Item 3.12.1).
4.3 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DOS SEQÜÊNCIA CONSENSO OBTIDOS
Todas as seqüências obtidas foram utililizadas para montagem da ilha de
patogenicidade com o programa CAP3. Foram obtidas treze seqüências consenso, as quais
foram analisadas utilizando os programas FRAMEPLOT (ISHIKAWA & HOTTA, 1999) e
BLAST. A Tabela 4 mostra o resumo da montagem das seqüências.
TABELA 4 – RESUMO DA MONTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS DA REGIÃO
CONTENTO GENES hrp/hrc DE H. rubrisubalbicans
Contig
Número
Clones e orientação do
Tamanho
Erro
Genes
de leituras
seqüenciamento
Contig provável/10Kb identificados
Contig 1
7
HR02MF00000052H11.b
1071
131,35
HrcU e
HR02MF00000052A02.b
hrpX
HR02MF00000052A02.TET
HR03FP00000015A08.g
HR03FP00000015A08.TET
Contig 2
11
HR02MF00000057H09.b
1209
HR02MF00000057H09.TET
HR02MF00000057H10.b
HR02MF00000057H10.TET
HR02FP00000009C05.b
HR02FP00000009C05.TET
28,73
HrpE
Contig 3
3
HR02FP00000009C05.g
714
HR02FP00000009C05.TET
88,56
hrcJ
Contig 4
4
HR03FP00000001C01.g
HR02MF00000050F12.b
64,47
Fosfatase
alcalina
Contig 5
7
HR03FP00000010H02.b
697
HR03FP00000010H02.TET
HR03FP00000003A06.b
HR03FP00000008H07.b
91,69
pilN
1105
33
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TABELA 4 - RESUMO DA MONTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS DA REGIÃO
CONTENTO GENES hrp/hrc DE H. rubrisubalbicans.
Conclusão
Contig Número
de
leituras
Contig 6
5
Clones e orientação do
seqüenciamento
HR03FP00000008C01.g
HR03FP00000008C01.b
HR02MF00000058F12.g
HR03MF00000056F09.b
Tamanho
Erro
Genes
Contig provável/10Kb identificados
1810
43,80
Fosfatase
alcalina
secretada,
Provável
Lipoproteína
e
Proteína
hipotética
hrpQ
hrcN
Contig 7
10
HR03FP00000013B07.b
1459
HR02MF00000053F11.g
HR02MF00000053F11.TET
50,66
Contig 8
8
HR02MF00000052H11.g
738
HR02MF00000052H11.TET
HR03FP00000015A08.b
HR03FP00000015A08.TET
21,15
-
Contig 9
7
HR02MF00000053F11.b
HR03FP00000023G09.b
847
93,91
hrpO
Contig
10
2
HR03FP00000049A08.b
746
HR03FP00000049A08.TET
85,06
hrcV
Contig
11
5
HR03FP00000003A06.g
HR03FP00000008H07.g
HR03MF00000052B08.b
HR03MF00000052B08.b1
743
77,59
pilO
pilN
Contig
12
4
HR03MF00000052H10.g
921
HR02MF00000057H09.g
HR02MF00000057H09.TET
97,91
hrcC
Contig
13
3
HR03MF00000053D10.g
HR03FP00000023G09.b
85,29
1099
Proteína de
Resistência a
acriflavina
As seqüências *.g foram obtidos utilizando oligonucleotídeo reverso do pUC19 (M13 – 5’ –
AGGAAACAGCTATGACCAT - 3’), as seqüências *.b foram seqüenciados com o
oligonucleotídeo universal do pUC19 (M13- 5’- GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA - 3’).
Os clones *.TET foram seqüenciados com os oligonucleotídeos do transposon EZ-Tn5™
<TET-1>.
34
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O comprimento médio das seqüências obtido foi de aproximadamente de 1Kb e a
qualidade média de 74 (aproximadamente 1 erro em 10Kb) seqüência na montagem final.
Para determinação de prováveis regiões codificadoras de proteínas foi utilizado o
programa FRAMEPLOT (ISHIKAWA & HOTTA, 1999). As fases abertas de leitura (ORF)
com maior probabilidade de corresponderem a produtos real de tradução foram comparadas
com o banco de dados GenBank utilizando o programa BlastP. Esta comparação revelou a
presença dos genes hrcU e hrpX (contig 1), hrpE (contig 2), hrcJ (contig 3), hrcC (contig
12). Estes resultados indicam também que as seqüências consenso 1, 3 e 12 estão fisicamente
unidas no genoma de H. rubrisubalbicans. Esta conclusão se deve ao fato de que seqüências
obtidas com o oligonucleotídeo M13-UNIVERSAL, que hibridiza com o vetor pUC19 dos
plasmídios HR02FP00000009C05 e HR02MF00000057H10, fazem parte do contig 2
(APÊNDICE I). Por outro lado, as seqüências dos plasmídeos HR02FP00000009C05 e
HR02MF00000057H10 obtidas com o oligonucleotídeo M13-REVERSO, que hibridiza com
o vetor pUC19 na extremidade oposta dos insertos, formam as seqüências consenso 3
(APÊNDICE II) e 12 (APÊNDICE III). A ligação física destes seqüência consenso implica
que os genes hrpE, hrcC e hrcJ provavelmente estão próximos no genoma do Herbaspirillum
rubrisubalbicans.
O gene pilN está presente em duas seqüência consenso: no contig 5 (APÊNDICE IV)
está a porção inicial do gene e no contig 11 a porção final. Este último contig contém também
parte do gene pilO a jusante de pilN (APÊNDICE V). Os contigs 5 e 11 são compostos por
sequências dos plasmídeos HR03FO00000003A06 e HR03FP00000008H07 obtidas com os
oligonucleotídeos M-13 UNIVERSAL E REVERSO, respectivamente.
Os genes hrpX e hrcU estão adjacentes no contig 1 (APÊNDICE VI), assim como os
genes hrpQ e hrcN no contig 7 (APÊNDICE VII). O contig 7 contém a seqüência do
plasmídeo HR02MF00000053F11 obtida como oligonucleotídeo M13-REVERSO e o contig
9 contém a seqüência deste mesmo plasmídeo com o oligonucleotídeo M13-UNIVERSAL;
assim o gene hrpO provavelmente está próximo dos genes hrpQ e hrcN. O gene hrcV foi
encontrado no contig 10 (APÊNDICE VIII).
O contig 4 contém a seqüência parcial de uma proteína similar a fosfatase alcalina
secretada de Xanthomonas campestris pv vesicatoria (E-value =1e-161) e de Xanthomonas
axonopodis pv citri str. 306 (E-value = 5e-161).
O contig 6 contém uma seqüência final de uma fosfatase alcalina secretada
deBurkholderia phytofirmans PsJN (ZP_01508656; E value de 3e-07).
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O contig 8 apresenta 9 fases abertas de leitura: 4 destas ORFS não apresentam
similaridade significativa com seqüências de proteína do GenBank, enquanto as outras
apresentam baixa similaridades com proteínas hipotéticas. Esta região provavelmente
corresponde a um segmento intergênico.
Uma provável proteína similar à proteína de resistência a acriflavina de Ralstonia
metallidurans CH 34 (E-value= 2e-37) foi encontrada no contig 13. Este contig contém a
seqüência
obtida
com
o
oligonucleotídeo
M13-UNIVERSAL
do
plasmídeo
HR03FP00000023G09; a seqüência obtida do mesmo plasmídeo com o M13-REVERSO
forma parte do contig 9 (APÊNDICE IX), que contém o gene hrpO. Portanto, estes resultados
sugerem que o gene que provavelmente confere resistência a acriflavina está adjacente ao
gene hrpO. A acriflavina (cloreto de 3,6-diamino-10-metilacridínio e 3,6-acridinodiamina) é
um corante fluorescente usado como antisséptico local e também como corante biológico e
tem a capacidade de se intercalar entre as bases dos ácidos nucléicos inibindo a replicação
bacteriana.
4.4 ORGANIZAÇÃO DOS GENES hrp/hrc DE H. seropedicae e H. rubrisubalbicans.
A disposição dos genes hrp/hrc e pil de H. rubrisubalbicans e H. seropedicae está na
figura 8.
FIGURA 8 - COMPARAÇÃO DO AGRUPAMENTO pil/hrc/hrp de H. rubrisubalbicans
e H. seropedicae
pilO e pilN
cC ,
pE
cJ
pX
cU
pO
cN pQ,
cV
Herbaspirillum rubrisubalbicans
FONTE: DEDECEK, A. S. Análise dos genes hrp/hrc de Herbaspirillum seropedicae e
caracterização parcial dos genes hrcC, hrcV e hrpG. Tese de Mestrado. Programa de PósGraduação em Ciências-Bioquímica. Departamento de Bioquímica - Universidade Federal do
Paraná, Curitiba, p. 90, 2006.
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O grupo de genes hrc/hrp de H. seropedicae compreende uma região de
aproximadamente 28kb do seu genoma e contém 31 prováveis genes ou orfs. Quartoze destes
codificam para proteínas que compõem o Sistema de Secreção do Tipo III (SST3),
denominadas proteínas Hrp ou Hrc; 2 genes possuem similaridade com genes codificadores
de proteínas componentes do sistema de secreção do Tipo IV (pilN e pilO)e os outros 15 são
orfs consideradas hipotéticas conservadas ou hipotéticas. Um gene homólogo a hrpG, cujo
produto é um provável regulador da expressão dos genes presentes na ilha, foi encontrado fora
da ilha de patogenicidade (DEDECEK, et al. 2006).
A organização parcial dos genes pil/hrc/hrp no genoma do H. rubrisubalbicans
deduzida neste trabalho é semelhante aquela de H. seropedicae (Figura 8). Entretanto, em H.
seropedicae não foi identificado um gene semelhante ao hrpO, localizado a montante de hrcN
de H. rubrisubalbicans.
Os genes pilO e pilN (APÊNDICE V), hrpX e hrcU (APÊNDICE VI), hrpQ e hrcN
(APÊNDICE VII) estão muito próximos no genoma e apresentam região intergênica curta,
sugerindo que estes genes formam os operon pilOpilN, hrpXhrcU e hrpQhrcN.
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FIGURA 9 - COMPARAÇÃO DO AGRUPAMENTO pil/hrc/hrp de H. rubrisubalbicans,
Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora e Ralstonia solanacearum.
pilO e pilN
cC , pE
cJ
cU
pX
pO
cN
pQ
cV
Herbaspirillum rubrisubalbicans
Pseudomonas syringae
Erwinia amylovora
Ralstonia solanacearum
FONTE: HUECK, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals
and plants. Microbiol. and Molecular Biol. Rev. v. 62, p. 379-433, 1998.
O agrupamento hrp/hrc de Pseudomonas syringae pv phaseolicola compreende 28
genes em uma região de aproximadamente 24Kb. Dois genes codificam as proteínas tipo
hairpins HrpA e HrpZ (CHARKOWSKI, HUANG, COLLMER. 1997). As proteínas HrpS e
HrpR são proteínas reguladoras de resposta de um sistema de dois componentes e HrpL é um
fator sigma alternativo (XIAO, et al.,1994). Os genes que codificam o sistema de secreção são
organizados em quatro unidades transcricionais (CHARKOWSKI, HUANG, COLLMER.
1997): hrpJcVpQcNpO (LIDELL & HUTCHESON, 1994), hrpPcQABRSTU (LIDELL &
HUTCHESON, 1994), hrpFGcCpTV (HUANG, et al., 1992) e hrpAZBcJpDE (HUANG et
al., 1995).
O sistema de secreção do tipo III de Erwinia amylovora compreende uma região de
25Kb contendo 22 genes organizados em três operons: hrpJ-hrcU (BOGDANOVE, et al.,
1996) , hrpA-hrpE e hrpF –hrpV (KIM,WEI, BEER, 1997). A proteína secretada HrpN
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(hairpin) é codificada por um operon diferente localizado no final do agrupamento gênico, do
lado esquerdo como é visto na figura 9 (WEI, et al., 1992).
Em Ralstonia solanacearum os genes hrp/hrc estão localizado em um megaplasmídeo
e compreende uma região de aproximadamente 27 kb com 18 genes. Os genes estão
organizados em quatro unidades transcricionais: hrpBA, hrpK-hrpC, hrpNO-hrpaP e hrpQhrpX (ARLAT, et al., 1992). Estes genes são necessários para a secreção da proteína PopA1,
a qual promove a resposta hipersensitiva (ARLAT, et al., 1992). O gene hrpB codifica um
ativador transcricional global dos genes hrp (GENIN, et al., 1992).
A comparação do agrupamento pil/hrc/hrp de H. rubrisubalbicans e de bactérias fitopatogênicas mostra que a organização dos genes hrpQ, hrcN e hrpO e hrcC, hrpE e hrpJ nos
genomas de H. rubrisubalbicans, Pseudomonas syringae e Erwinia amylovora parece ser
parcialmente conservada (figura 9). Por outro lado, não há muita semelhança na organização
destes genes entre H. rubrisubalbicans e Ralstonia solanacearum (figura 9).
4.5 ANÁLISE DAS PROTEÍNAS Hrp, Hrc, e Pil de H. rubrisubalbicans
O programa BLASTp foi utilizado para identificar no banco de dados de seqüências
do GenBank e GENOPAR proteínas similares àquelas codificadas pelos genes hrp, hrc e pil
de H. rubrisubalbicans. As seqüências de proteínas homólogas de Herbaspirillum
seropedicae, Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv syringae e Pseudomonas
syringae pv. tomato foram então alinhadas com as de H. rubrisubalbicans utilizando o
programa ClustalW (THOMPSON, et al.,1994).
O alinhamento foi realizado com a seqüência parcial de aminoácidos para os genes
incompletos pilN, hrcC, hrcU, hrpX, hrcN, hrpQ, hrcV e com a seqüência total de
aminoácidos para os genes completos hrpE, hrcJ e hrpO. Não foi realizado alinhamento de
aminoácidos da proteína PilO, pois a região seqüenciado continha um fragmento muito
reduzido deste gene.
A identidade e similaridade destas proteínas estão mostradas na tabela 5. As proteínas
de H. rubrisubalbicans apresentam maior identidade e similaridade com as proteínas de
Herbaspirillum seropedicae, exceto a proteína HrpO.
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TABELA 5 – IDENTIDADE E SIMILARIDADE ENTRE PROTEÍNAS Hrp, Hrc e Pil DE H. rubrisubalbicans estirpe M1
(H.r.), H. seropedicae estirpe SMR1 (H.s), Erwinia amylovora (E.a.), Pseudomonas syringae pv syringae (P.s. pvs) e Pseudomonas
syringae pv tomato (P.s. pvt).
Identidade
Região da proteína
Similaridade
de H.r. comparada
PilN
208 aminoácidos
da região N-terminal
( APÊNDICE X)
HrcC
159 aminoácidos
da região N-terminal
( APÊNDICE XI)
HrpE
Proteína Completa
( APÊNDICE XII)
HrcJ
HrcU
HrpX
HrpQ
HrcN
HrpO
HrcV
Proteína Completa
( APÊNDICE XIII)
199 aminoácidos
da região N-terminal
( APÊNDICE XIV)
93 aminoácidos
da região C-terminal
( APÊNDICE XV)
282 aminoácidos
da região C-terminal
( APÊNDICE XVI)
200 aminoácidos
da região N-terminal
( APÊNDICE XVII)
Proteína completa
( APÊNDICE XVIII)
80 aminoácidos
da região N-terminal
( APÊNDICE XIX)
Função da proteína
H.s.
E.a.
P.s pvs
P.s. pvt
-
17,6%1
18,1%
-
Formação do complexo multimérico em forma de anel na 76,7%
membrana externa. (DENG & HUANG, 1999)
88,7%
42,6%2
60,5%
36,5%3
53,5%
40,1%4
55,1%
Formação de um canal interno que permite sua própria
passagem, da HrpF e mais outras 20 proteínas efetoras
diferentes. (HU, et al., 2001. WEBER & KOEBNIK, 2005).
Formação da estrutura central no periplasma (DENG &
HUANG. 1999).
Proteína estrutural do corpo basal e envolvimento no controle da
secreção de substratos do SST3.(ALLALOUI, et al., 1994)
34,3%
48,1%
23,7%5
41,7%
18,4%6
30,6%
27,2%7
41,5%
48,1%
62,4%
30,8%
41,9%
24,6%8
42,5%
22,5%11
34,7%
25,4%9
46,3%
21,1%12
37,1%
27,7%10
43,8%
-
Proteína estrutural do corpo basal e envolvimento na montagem 77,9%
do Hrp-pilus. (VAN GIJSEGEM, et al., 2002)
89,5%
24,8%13
45,0%
36,8%14
56,8%
34,7%15
54,7%
Proteína estrutural do corpo basal, componente da família YscD 36,8%
(HUECK, 1998)
47,3%
22,5%16
37,3%
23,2%17
35,5%
23,5%18
35,5%
É uma ATPase e realiza transdução de energia através da
hidrólise de ATP para o SST3 e promove separação da proteína
efetora e chaperona (AKEDA & GALAN, 2005)
Possível função estrutural devido a baixa similaridade com FliJ,
uma proteína periplasmática do aparato flagelar. (HE, 1998)
Proteína estrutural do corpo basal interage com chaperonas e
facilita entrada de efetores no SST3. (ALEGRIA, et al., 2004).
51,6%
56,6%
34,5%19
48,3%
30,6%20
41,9%
27,1%21
37,3%
-
23,5%22
44,3%
47,5%25
73,2%
19,2%23
32,6%
48,8%26
72,5%
19,9%24
35,5%
48,8%27
72,5%
Formação do pili Tipo IV (ROINE, et al.,1996)
48,6%
56,8%
75,0%
86,2%
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As sequências dos genes hrp/hrc do Herbaspirillum seropedicae estão disponíveis no sítio
http:/nfn.genopar.org. Os superscritos 1 a 26 correspondem ao número de acesso da seqüência de
aminoácidos no Genbank:
1
6
refYP_234605.1,
2
gbAAB49179.1,3 refYP_234292.1,4gbAAO54911.2,5 gb|AAB49176.1,
refYP_234289.1,7 refNP_791213.1,
11
8
gbAAB49174.1,9 gbAAY36249.1,10 gbAAO54906.1,
gbAAB06008.1,12refYP_234297.1,13gbAAB06007.1,14refYP_234298.1,15refNP_791220.1,16
gbAAB06000.2,17 refYP_234306.1,18 refNP_791228.1,19 refNP_791227.1,20refYP_234 305.1,21
refNP_791227.1,
22
gbAAB06002.1,23
gi66044463refYP_234304.1,24
gi28868607
refNP_791226.1,25 gbAAB05999.2,26 refYP_234307.1,27 refNP_791229.1.
A sequência de aminoácidos da proteína HrcC apresentou domínio conservado
semelhanto ao da proteína PulD. Estas proteínas estão presentes na membranas externa e são
formadoras do poro do sistema de secreção e são chamadas de secretinas. (HUECK, 1998).
A proteína HrcN apresentou os domínios cd01136 e pfam02874. Estes domínios são
característicos de ATPases do aparato de Secreção do Tipo III/flagelar e ATPsintase,
respectivamente. A presença destes domínios sugere que a HrcN de H. rubrisubalbicans utiliza a
hidrólise de ATP como fonte de energia para o sistema de secreção do tipo III.
A proteína HrcU apresentou domínio semelhante ao da proteína homóloga do aparato
flagelar FlhB (domínio PRK05702) e o domínio pfam 01312 da família de proteínas FlhB, HrpN,
YscU, SpaS, HrcU SsaU e YopU, que está envolvido com a exportação de peptídeos. Estes fato
reforça a idéia que a proteína HrcU de H. rubrisubalbicans pode ter a mesma função que em
outras bactérias fitopatogênicas.
A proteína HrcV apresentou os seguintes domínios conservados COG4789 e PRK06012.
O primeiro é um domínio semelhante ao da proteína EscV. Esta proteína está presente na bactéria
Escherichia coli e é homóloga a proteína HrcV de fitopatógenos (HUECK, 1998). O domínio
PRK06012 é semelhanto ao da proteína FlhA do aparato flagelar.
Os resultados obtidos indicam que, com exceção da proteína HrcJ, as proteínas Hrc de H.
rubrisubalbicans encontradas até agora são conservadas entre as bactérias e são homólogas as
proteínas do aparato flagelar.
Em contraste, as proteínas Hrp não apresentaram domínios
conservados.
41
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5 CONCLUSÃO
1. Foram encontradas as seqüências parciais dos genes pilN, pilO, hrcC, hrpE, hrcJ, hrcU,
hrpX, hrpQ, hrcN, hrpO e hrcV no genoma da bactéria Herbaspirillum rubrisubalbicans.
Estes genes estão agrupados em genomas de outros fitopatógenos, tais como Erwinia
amylovora, Pseudomonas syringae, e compõem uma região chamada de Ilha de
Patogenicidade.
2. Os genes hrp/hrc codificam as proteínas do Sistema de Secreção do Tipo Três (SST3).
Este sistema catalisa a translocação de proteínas da bactéria diretamente no citoplasma do
hospedeiro eucariótico. A descoberta de genes deste sistema no genoma do Herbaspirillum
rubrisubalbicans sugere que proteínas secretadas por este sistema podem ser responsáveis
pelo desenvolvimento da doença da estria mosqueada em algumas variedades de cana-deaçúcar.
3. A organização e a seqüência de proteínas codificadas pelos genes hrp/hrc de H.
rubrisubalbicans é similar a de H. seropedicae, sugerindo que a divergência entre as duas
espécies deve ter ocorrido após a aquisição dos genes do sistema SST3.
4. Gene codificando uma fosfatase alcalina secretada por fitopatógenos do gênero
Xanthomonas foram identificados em H. rubrisubalbicans, sugerindo que a participação do
SST3 na interação patogênica com variedades susceptíveis.
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6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABRAMOVITCH, R. B.; KIM, Y. J.; CHEN, S.; DICKMAN, M. B.; MARTIN, G. B.
Pseudomonas type III effector AvrPtoB induces plant disease susceptibility by inhibition of host
programmed cell death. EMBO Journal.v.22, p.60–69, 2003.
AIZAWA, S. I. Bacterial flagella and type III secretion systems. FEMS Microbiology Letters.
v.202, p.157-164, 2001.
AKEDA, Y.; GALAN, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.
Nature. v.437, p.911–915, 2005.
ALEGRIA, M.C.; DOCENA C.; KHATER L.; RAMOS ,C. H. I.; SILVA A. C. R.; FARAH C.
S. New Protein-Protein Interactions Identified for the Regulatory and Structural Components and
Substrates of the Type III Secretion System of the Phytopathogen Xanthomonas axonopodis
Pathovar citri. Journal of Bacteriology. v. 186, p. 6186-6197, 2004.
ALTSCHUL, S. F.; GISH,W.; MILLER,W.; MYERS, E.W.; LIPMAN, D.J. Basic local
alignment search tool. Journal of Molecular Biology, v. 215, p.403–410, 1990
ALFANO, J. R.; COLLMER, A. Type III secretion system effector proteins: doubles agents in
bacterial disease and plant defense. Annual Review Phytopathology. v.42, p.385-414, 2004.
ALFANO J.R.; COLLMER A.The type III (Hrp) secretion pathway of plant pathogenic bacteria:
trafficking harpins, Avr proteins, and death. Journal of Bacteriology.v.179, p.5655–62, 1997.
ALLOUI, A.; SANSONETTI, P. J.; PARSOT, C. MxiJ, a lipoprotein involved in secretion of
Shigella Ipa invasins, is homologous to YscJ, a secretion factor of the Yersinia Yop proteins.
Journal of Bacteriology. v.174, p.7661-7669, 1992.
ANDERSON,D. M.; FOUTS D. E.; COLLMER, A.; SCHNEEWIND, O. Reciprocal secretion of
proteins by the bacterial type III machines of plant and animal pathogens suggests universal
recognition of mRNA targeting signals. PNAS. v.96, p.12839–43, 1999.
ANDERSON D.M.; SCHNEEWIND, O. A mRNAsignal for the type III secretion of Yop
proteins by Yersinia enterocolitica. Science. v.278, p.1140–43, 1997.
ARLAT, M.; VAN GIJSEGEM, F.; HUET, J. C.; PERNOLLET, J. C.; BOUCHER, C. A.
PopA1, a protein which induces a hypersensitive like response on specific Petunia genotypes, is
secreted via the Hrp pathway of Pseudomonas solanacearum. EMBO Journal. v.13, p.543–53,
1994.
43
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
BALDANI, J.I.; et al.,. Emended description of Herbaspirillum; inclusion of [Pseudomonas]
rubrisubalbicans, a milk plant pathogen, as Herbaspirillum rubrisubalbicans comb. nov.; and
classification of a group of clinical isolates (EF group 1) as Herbaspirillum species
3.International Journal of Systematic Bateriology. v.46, p.802-10, 1996.
BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D.; SELDIN, L.; DOEBEREINER, J. Characterization of
Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a root-associated nitrogen-fixing bacterium.
International Journal of Systematic Bacteriology.v.36, n.1, p.86-93, 1986.
BARNY, M. A. Erwinia amylovora hrpN mutants, blocked in harpin synthesis, express a reduced
virulence on host plants and elicit variable hypersensitive reactions on tobacco. European
Journal of Plant Pathology. v.101, p.333–40, 1995.
BLOCKER A.; KOMORIYA, K.; AIZAWA, S. Type III secretion systems and bacterial flagella:
insights into their function from structural similarities. Review. PNAS. v.100, n.6, p.3027-30,
2003.
BOGDANOVE, A. J. ; BEER, S. V.; BONAS, U.; BOUCHER C. A.; COLLMER A. Unified
nomenclature for broadly conserved hrp genes of phytopathogenic bacteria. Molecular
Microbiology. v.20, p.681–83, 1996.
BURGHOUT, P. et al. Structure and electrophysiological properties of the YscC secretin from
the type III secretion system of Yersinia enterocolitica Journal of Bacteriology. v.186, p.4645–
4654, 2004.
BUTTNER, D.; BONAS, U.. Common infection strategies of plant and animal pathogenic
bacteria. Current Opinion in Plant Biology. v.6, p.312–19, 2003.
CHAMI, M. et al. Structural insights into the secretin PulD and its trypsin-resistant core. Journal
of Biological Chemistry. v. 280, p.37732–37741, 2005.
CAMBRONNE, E. D., L. W. CHENG, AND O. SCHNEEWIND. LcrQ/YscM1, regulators of the
Yersinia yop virulon, are injected into host cells by a chaperone-dependent mechanism.
Molecular Microbiology. v.37, p.263-273, 2000.
CARNIEL, E.; GUILVOUT, I.; PRENTICE, M. Characterization of a large chromosomal “highpathogenicity island” in biotype 1B Yersinia enterocolitica. Journal of Bacteriology. v.178,
p.6743–6751, 1996.
CHANGSIK O.; SUNGGI, H.; JAE-YONG, Y.;YONGSUP C. An hrcU-Homologous Gene
Mutant of Xanthomonas campestris pv. glycines 8ra That Lost Pathogenicity on the Host Plant
but Was Able to Elicit the Hypersensitive Response on Nonhosts. MPMI .v. 12, p. 633–639,
1999.
44
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
CHARKOWSKI, A. O.; ALFANO, J.R.; PRESTON, G.; YUAN, J.; HE, S. Y. The
Pseudomonas syringae pv. tomato HrpW protein has domains similar to harpins and pectate
lyases and can elicit the plant hypersensitive response and bind to pectate. Journal of
Bacteriology. v.180, p.5211–17, 1998.
CHARKOWSKI, A. O.; HUANG, H. C.; COLLMER, A. Altered localization of HrpZ in
Pseudomonas syringae pv. syringae hrp mutants suggests that different components of the type
III secretion pathway control protein translocation across the inner and outer membranes of gramnegative bacteria. Journal of Bacteriology. v.179, p.3866-3874, 1997.
CHENG, L. W.; ANDERSON, D. M.; SCHNEEWIND, O. Two independent type III secretion
mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Molecular Microbiology. v.24, p.757–65,
1997.
CHRISTOPHER, W.N.; EDGERTON, C.W. Bacterial stripe diseases of sugarcane in Louisiana.
Journal of Agricultural Research. v.41, p.259, 1932.
CORNELIS, G. R. The type III Secretion Injctisome. Nature Reviews in Microbiology. v.4, p.
811-825, 2006.
CORNELIS, G. R ; VAN GIJSEGEM F. Assembly an function of type III secretory systems.
Annual. Review in Microbiology. v.54, p.735–74, 2000.
CORNELIS, G.R.; WOLF-WATZ, H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for
subverting eukaryotic cells. Molecular. Microbiology. v.2, p.861–67, 1997.
COTTER, P. A.; MILLER J. F. In vivo and ex vivo regulation of bacterial virulence gene
expression. Current Opinion in Microbiology. v.1, p.17–26, 1998.
DANIELL, S. J.; TAKAHASHI, N.; WILSON, R.; FRIEDBERG, D.; ROSENSHINE, I.;
BOOY, F. P.; SHAW, R. K.; KNUTTON, S.; FRANKEL, G.; AIZAWA. S. The filamentous
type III secretion translocon of enteropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. v.3,
p.865-871, 2001.
DEDECEK, A. S. Análise da Ilha Genômica hrp/hrc de Herbaspirillum seropedicae e
Caracterização Parcial dos genes hrcC, hrcV e hrpG. Tese de Mestrado. Programa de PósGraduação em Ciências-Bioquímica. Departamento de Bioquímica - Universidade Federal do
Paraná, Curitiba, 90 p., 2006.
DOW, M. NEWMAN, M. A.; VON ROEPENACK, E. The induction and modulation of plant
defense responses by bacterial lipopolysaccharides. Annual Review in Phytopathology. v.38,
p.241–61, 2000.
45
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
DENG W.-L.; HUANG H.-C. Cellular Locations of Pseudomonas syringae pv. syringae HrcC
and HrcJ Proteins, Required for Harpin Secretion via the Type III Pathway. Journal of
Bacteriology. v.181, p. 2298-2301, 1999.
EWING, B.; GREEN, P. Base-Calling of Automated Sequencer Traces Using Phred. II.
Error Probabilities. Genome Research. v.8, p.186-194, 1998.
EWING, B.; HILLIER, L.D.; WENDL M.C.; GREEN, P. Base-Calling of Automated Sequencer
Traces Using Phred.I. Accuracy. Assessment. Genome Research.v.8, p.175-185, 1998.
FELIX G, BOLLER T. Molecular sensing of bacteria in plants. The highly conserved RNAbinding motif RNP-1 of bacterial cold shock proteins is recognized as an elicitor signal in
tobacco. Journal of Biological Chemistry. v.278, p.6201–8, 2003.
FRANCIS, M.S.; WOLF-WATZ, H.; FORSBERG, A. Regulation of type III secretion systems.
Current Opinion in Microbiology. v.5, p.166–72, 2002.
GAL-MOR, O.; FINLAY, B. B. Pathogenicity islands: a molecular toolbox for bacterial
virulence. Cellular Microbiology. v.8, n.11, p.1707-1719, 2006.
GALAN, J.E.; COLLMER, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery
into host cells. Science. v. 284, p.1322–28, 1999.
GENIN, S.; GOUGH, C. L.; ZISCHEK, C.; BOUCHER. C. A. Evidence that the hrpB gene
encodes a positive regulator of pathogenicity genes from Pseudomonas solanacearum.
Molecular Microbiology. v.6, p.3065-3076, 1992.
GHOSH, P. Process of Protein Transport by the Type III Secretion System. Microbiology and
Molecular Biology Reviews. p.771-795, 2004.
GOMEZ-GOMEZ L.; BOLLER, T. Flagellin perception: a paradigm for innate immunity.
Trends Plant Science. v.7, p.251–56, 2002.
GOPHNA, U.; RON, E. Z.; GRAUR, D. Bacterial Type III secretion systems are ancient and
evolved by multiple horizontal-transfer events. Gene. v.312, p.151-163, 2003.
GORDON, D.; ABAJIAN,C.; GREEN, P. Consed: a graphical tool for sequence finishing.
Genome Research. v. 8, p.195-202, 1998.
HACKER, J.; KAPER, J. B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annual
Review Microbiology. v. 54, p.641-679, 2000.
HACKER, J.; CARNIEL, E. Ecological fitness, genomic islands and bacterial pathogenicity. A
Darwinian view of the evolution of microbes. EMBO Reports. v.2, p.376–381, 2001.
46
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
HACKER, J.; BLUM-OEHLER, G.; MUHLDORFER, I.; TSCHAPE, H. Pathogenicity islands
of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Molecular
Microbiology. v. 23, p.1089–1097, 1997.
HOICZYK, E.; BLOBEL, G. Polymerization of a single protein of the pathogen Yersinia
enterocolitica into needles punctures eukaryotic cells. PNAS. v.98, p.4669-4674, 2001.
HUANG, H.C.; LIN, R.H.; CHANG, C.J.; COLLMER, A.; DENG. W.L. The complete hrp gene
cluster of Pseudomonas syringae pv. syringae 61 includes two blocks of genes required for
harpinPss secretion that are arranged colinearly with Yersinia ysc homologs. MPMI . v.8, p.733746, 1995.
HUANG, H.C.; HE, S.; BAUER, Y. D. W.; COLLMER, A. The Pseudomonas syringae pv.
syringae 61 hrpH product, an envelope protein required for elicitation of the hypersensitive
response in plants. J ournal of Bacteriology. v.174, p.6878-6885, 1992.
HUANG, X.; MADAN, A. CAP3: A DNA Sequence Assembly Program. Genome Research.
v.9, p.868-877, 1999.
HUECK, C. J. Type III Protein Secretion Systems in Bacterial Pathogens of Animals and Plants.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. v. 62, p.379-433, 1998.
IRIARTE, M.; CORNELIS, G. R.. YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the
cytoskeleton of host cells. Molecular Microbiology. v.29, p.915-929, 1998.
ISHIKAWA. J; HOTTA, K. FramePlot: a new implementation of the Frame analysis for
predicting protein-coding regions in bacterial DNA with a high G+C content. FEMS
Microbiology Letters. v.174, p.251-253, 1999.
JONES, D.A.; TAKEMOTO, D. Plant innate immunity—direct and indirect recognition of
general and specific pathogen-associated molecules. Current Opinion in Immunology.v.16,
p.48–62, 2004.
KIM, J. F.; WEI, Z. M.; BEER. S. V. The hrpA and hrpC operons of Erwinia amylovora encode
components of a type III pathway that secretes harpin. Journal of Bacteriology. v.179, p.16901697, 1997.
KLASSEN G.; PEDROSA F. O.; SOUZA E. M.; FUNAYAMA S.; RIGO L. U. ; Effect of
nitrogen compounds on nitrogenase activity in Herbaspirillum seropedicae SMR1. Canadian
Journal of Microbiology. v. 43, p. 887-891, 1997.
KEEN,N.T; TAMAKI, S.; KOBAYASHI, D.; GERHOLD, D.; STAYTON, M. Bacteria
expressing avirulence gene D produce a specific elicitor of the soybean hypersensitive reaction.
MPMI. v.3, p.112–21, 1990.
47
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
KIM, J. F.; BEER, S. V. HrpW of Erwinia amylovora, a new harpin that contains a domain
homologous to pectate lyases of a distinct class. Journal of Bacteriology. v.180, p.5203–10,
1998.
KUBORI, T.; MATSUSHIMA, Y.; NAKAMURA, D.; URALIL, J.; LARA-TEJERO, M. ;
SUKHAN, A.; GALÁN, J. E.; AIZAWA, S. I. Supramolecular structure of the Salmonella
typhimurium type III protein secretion system. Science. v.280, p.602-605, 1998.
LIDELL, M. C.; HUTCHESON S. W. Characterization of the hrpJ and hrpU operons of
Pseudomonas syringae pv. syringae Pss61: similarity with components of enteric bacteria
involved in flagellar biogenesis and demonstration of their role in HairpinPSS secretion. MPMI.
v.7, p.488-497, 1994.
MARTIN, G. B.; BOGDANOVE, A. J.; SESSA, G. Understanding the functions of plant disease
resistance proteins. Annual Review in Plant Biology. v.54, p.23–61, 2003.
MUDGETT, M. B.; CHESNOKOVA, O.; DAHLBECK, D.; CLARK, E. T.; ROSSIER ,O.
Molecular signals required for type III secretion and translocation of the Xanthomonas
campestris AvrBs2 protein to pepper plants. PNAS. USA. v.97, p.13324–29, 2000.
NOEL L; THIEME, F.; NENNSTIE, D.; BONAS, U.. cDNA-AFLP analysis unravels a genomewide hrpG-regulon in the plant pathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Molecular
Microbiology. v.41, p.1271–81, 2001.
NURNBERGER, T.; BRUNNER, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels
between the recognition of general elicitors and pathogenassociated molecular patterns. Current
Opinion in Plant Biology. v.5, p.318–24, 2002.
OLIVARES, F. L.; JAMES, E. K.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J. Infection of mottled
stripe disease-susceptible and resistant sugar cane varieties by the endophytic diazotroph
Herbaspirillum. New Phytolologist. v.135, p.723-737, 1997.
PAGE, A.L.; PARSOT, C. Chaperones of the type III secretion pathway: jacks of all trades.
Molecular Microbiology. v.46, p.1–11, 2002.
POZIDIS, C.; CHALKIADAKI, A. ; GOMEZ-SERRANO, A.; STAHLBERG, H.; BROWN, I.;
TAMPAKAKI, A. P.; LUSTIG, A.; SIANIDIS, G.; POLITOU, A. S.; ENGEL, A.;
PANOPOULOS, N. J.; MANSFIELD, J.; PUGSLEY, A. P.; KARAMANOU, S.; ECONOMOU,
A. Type III protein translocase: HrcN is a peripheral ATPase that is activated by oligomerization.
Journal of Biological Chemistry. v.278, p.25816–25824, 2003.
REITER, W.D.; PALM, P.; YEATS, S. Transfer RNA genes frequently serve as integration sites
for prokaryotic genetic elements. Nucleic Acids Research. v.17, p.1907–1914, 1989.
48
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
ROINE, E., SAARINEN, J.; KALKKINEN, N.; ROMANTSCHUK, M. Purified HrpA of
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 reassembles into pili. FEBS Letters. v.417, p.1681721, 1997.
ROINE, E.; NUNN, D. N.; PAULIN, L.; ROMANTSCHUK. M. Characterization of genes
required for pilus expression in Pseudomonas syringae pathovar phaseolicola. Journal of
Bacteriology. v.178, p.410-417, 1996.
SAMBROOK, J.P; FRITSCH, E. F; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual.
2ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
SARKER, M. R.; NEYT, C.; STAINIER, I. ; CORNELIS, G. R. The Yersinia Yop virulon: LcrV
is required for extrusion of the translocators YopB and YopD. Journal of Bacteriology. v. 180,
p.1207–1214, 1998.
SCHECHTER, L. M.; ROBERTS, K.A.; JAMIR Y.; ALFANO J.R.; COLLMER, A.
Pseudomonas syringae type III secretion system targeting signals and novel effectors studied
with a Cya translocation reporter. Journal of Bacteriology. v.86, p.543–55, 2004.
SCHUBERT, S.; RAKIN, A.; KARCH, H.; CARNIEL, E.; HEESEMANN, J. Prevalence of the
‘high-pathogenicity island’ of Yersinia species among Escherichia coli strains that are pathogenic
to humans. Infection and Immunity. v.66, p.480–485, 1998.
SMITH, C. L.; KHANDELWAL, P.; KELIIKULI, K.; ZUIDERWEG, R.; SAPER. M.A.
Structure of the type III secretion and substrate-binding domain of Yersinia YopH phosphatase.
Molecular Microbiology.v. 42, p.967-979, 2001.
SOUZA, E. M. Clonagem, caracterização e sequenciamento dos genes nifA e nifB de
Herbaspirillum seropedicae. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em CiênciasBioquímica. Departamento de Bioquímica - Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 264 p.,
1990.
SPERANDIO, V.; MELLIES, J. L.; NGUYEN, W.; SHIN, S.; KAPER, J. B. Quorum sensing
controls expression of the type III secretion gene transcription and protein secretion in
enterohemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli. PNAS. v.96, p.15196–201, 1999.
STEBBINS, C.E.; GALAN, J. E. Maintenance of an unfolded polypeptide by a cognate
chaperone in bacterial type III secretion. Nature. v.414, p.77–81, 2001.
STROBEL, N. E.; JI, C.; GOPALAN, S.; KUC, J. A.; HE, S. Y. Induction os systemic acquired
resistence in cucumber by Pseudomonas syringae pv syringae 61 HrpZPss protein. The Plant
Journal. v.9, p.431-439, 1996.
49
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TAMANO, K.; AIZAWA, S.; KATAYAMA, E.; NONAKA, T.; IMAJOH-OHMI, S.; KUWAE,
A.; NAGAI, S.; SASAKAWA. C. Supramolecular structure of the Shigella type III secretion
machinery: the needle part is changeable in length and essential for delivery of effectors. EMBO
Jounal. v.19, p.3876-3887, 2000.
TARTOF, K. D.; HOBBS, C. A. Improved media for growing plasmid and cosmid clones.
Bethesda Research Laboratory Focus. v.9. p.12, 1987.
THOMPSON, J. D.; HIGGINS D.G.; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap
penalties and weight matrix choice. Germany: European Molecular Biology Laboratory. Nucleic
Acids Research. v. 22 p, 4673–4680, 1994
VAN GIJSEGEM, F.; VASSE, J.; RYCKE, R.; CASTELLO, P.; BOUCHER, C. Genetic
dissection of the Ralstonia solanacearum hrp gene cluster reveals that the HrpV and HrpX
proteins are required for Hrp pilus assembly. Molecular Microbiology. v. 44, p.935-946, 2002.
WATTIAU, P.; WOESTYN, S.; CORNELIS, G. R. Customized secretion chaperones in
pathogenic bacteria. Molecular Microbiology.v.20, p.255–62, 1996.
WATTIAU, P.; BERNIER, B.; DESLÉE, P.; MICHIELS, T.; CORNELIS, G. R. Individual
chaperones required for Yop secretion by Yersinia. PNAS. v.91, p.10493-10497, 1994.
WEBER, E.; KOEBNIK, R. Domain Structure of HrpE, the Hrp Pilus Subunit of Xanthomonas
campestris pv. Vesicatoria. Journal of Bacteriology. v.187, p.6175-6186, 2005
WEI, Z. M.; LABY, R. J.; ZUMOFF, C. H.; BAUER, D. W.; HE, S. Y.; COLLMER, A.; BEER,
S. V. Harpin, elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia
amylovora. Science. v.257, p.85-88, 1992.
XIAO, Y.; HEU, S.; YI; LU, J. Y.; HUTCHESON, S. W. Identification of a putative alternate
sigma factor and characterization of a multicomponent regulatory cascade controlling the
expression of Pseudomonas syringae pv. syringae Pss6l hip and hrmA genes. Journal of
Bacteriology. v.176, p.1025-1036, 1994.
YE J.; MCGINNIS, S.; MADDEN T.L. BLAST: improvements for better sequence analysis.
Nucleic Acids Research. v.34, p.w6-w9, 2006.
50
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APÊNDICE
51
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APÊNDICE I – SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DO GENE hrpE DE H.
rubrisubalbicans
10
20
30
40
50
60
GTACCCGACATCGGTAGTACGGATAGCGCACAGGCAGACGCTGTCGTGGTCGGCCTGGCC
70
80
90
100
110
120
GAATTGGCGTGGCGGCTGGAGCAGGATTTTCCTGGGATGTGGGCGCGCTTGCGCGGTTTG
130
140
150
160
170
180
CTGGATATGTCCGAACGAACCCGCATCGATGACGCGCTACCCGCTGCTCGCCGTCGTCCA
190
200
210
220
230
240
GTGAGCGAATCATCGGCCGCCGCCCGGCGCGCCCTGCGTTGCTGGCAGTTCTGTTGCACC
250
260
270
280
290
300
CGTGCGCAACAGGGCTGATTTCTCCCAACGTTTTGAGGAAAGTAAAGAACCCATGAGCGA
hrpE
310
320
330
340
350
360
CTTTGCCGTGCAGAGAGTGACCCTGCCCGACCATCTGCGTCCAGCCAATGGTGTGTTGCG
370
380
390
400
410
420
CTTGACTGGGCTGACTGTGACCAGCGATGCGGAACAACTGGCTGCACAGATGCTGGCCCA
430
440
450
460
470
480
GGCCCGCGAAGAAGCTGCGCAAGTACGTAAGCAGGCCGAAGAGGAGGCCGGGCACGTCGT
490
500
510
520
530
540
CATGCGACAGCAGCAGGAGGTCGCGCAGCAGGGCGCTGTATTGCTGGAAGGGCTGCGGCA
550
560
570
580
590
600
AGCGCAGGACGACATGCTTGAGCGCATCGAGGAAGTGGTGGTGGACCTCGCGCAGGAAGT
610
620
630
640
650
660
TATGGAACGCCTGCTGTTGGAGCTCACGCCACGCGAACGCATTACTGCCATGCTCCGTAG
670
680
690
700
710
720
GATACGCCAGGAGGCGCCGCCCAAGCTGCATGAGGCGGTGCTGTGGGTACACCCCGACGA
730
740
750
760
770
780
TCAGCCTCTGCTGCCGGCCTCATCCTGGGAAATGCAGACCGATTCCGCGCTAGCTCCTGG
790
800
810
820
830
840
CAGCTGCCGGCTGGAAGCCGCCAGCGGAGAGTGGCGCAGCGATTTTGCGCTGGCGGTGCA
850
860
870
880
890
900
GGCCTTGCGTGATGGCTTGGCGGGGGCAAGCGCTCGCCTCAAAGAGCAGGCGCCGTCCTG
*
910
920
930
940
950
960
AACGGGAAGGTACAGACTTTCCAAAAAATCCGAACCGAATCCCGTGTCGCTGCCACCTAC
970
980
990
1000
1010
1020
CTGCCGTAAGCCCCCTGTCATCCACATGAGGAGATGAGCGACATGTCGAGCAATCCGGTA
1030
1040
1050
1060
1070
1080
TTGCAGAATCTGCGTCACATGGACAAGAAGTTCGATGAGATCAGCCAGAAGATCAACGAC
1090
1100
1110
1120
1130
1140
TTTAACCGCCAGCAGGCCGACGGCGAGATGCCCGATCCGGCTGCCTTCATGGATCTGCTG
1150
1160
1170
1180
1190
1200
CAAAAGCAATCTGTCACCAAGAGCGCTATGAGCGCCCAATTCAATCTGCTGCAAAAGCCG
TTGAAGACG
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APÊNDICE II – SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DO GENE hrcJ DE
H. rubrisubalbicans
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GGTTATCTAAGGATCCCCCAGGGCTGTCTGAGGAACTGGAATCGACACTCCAGCAGTTCG
70
80
90
100
110
120
ATCATGTATTTCTGCCCGCGTGCATGTGGTACTTCCGGAGCGCATTGCGCCGGGTGAACC
130
140
150
160
170
180
GATTCAGCCGTCATCTGCCGCAGTGTTCGTCAAATACCGACCACCGATGGACGAGGACAT
hrcJ
190
200
210
220
230
240
GGTCATGCCGCGCATCCGCAAGCTCGTGGCCTCCAGTATTCCCGGCCTGAGCGGCGAGGA
250
260
270
280
290
300
GGGGCGGGCCAAGGTAACGGTGGTGATGATGCCGGGTGAAGTCCCCACGGCGGGAATCGA
310
320
330
340
350
360
ATGGACTACGCTGGGGCCCTTCGTGGTGGCCGTGTCATCGGTGAGAGCACTCGGCTTTAC
370
380
390
400
410
420
CTTGCTGGGGCTGGGCTTGCTGATCCTGCTGGCAGGTGGCTGGCTACTGGTTCTGAATGT
430
440
450
460
470
480
CCAGCGCAACCCCAAGCTCATGTTGATGATCGCCCGTCTGTCGATGCGTAAGGCCAAAGC
490
500
510
520
530
540
CGGCGATCCGAGTGAATCTGCGCCTGCTGCCGCGACCGCAGCCCCAGCGGCGAATAAGCC
550
560
570
580
590
600
AGCCCAGGCCAAATCGTGAAGAACTTCCATTCTGAGCACGAGCCGCTCATCCTGAGCCAG
*
610
620
630
640
650
660
GCATTCCTCGACTGGTGGTTCGCACCATGGCAATACATCGAAACTCCGGCCTTGCCGGGA
670
680
690
700
710
ATGAGCGATACGCTCGTGGCGCGGCGTGACAGCTATCGGGCCTGGTGCGAGCAG
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APÊNDICE III - SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DO GENE hrcC DE
H. rubrisubalbicans
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GGTACTCAACGAAACCAAGTAACACCATGTCCATGGAAAGCCCAGACCACTGTCTGCAGA
70
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90
100
110
120
CACTGCCGCTGGATGAACCTGTCGTCATCGATGGTGAAACGGTATTTCTTCGAGTCAAGC
130
140
150
160
170
180
CAGAGGGCGCCGAGCTAGGCGTCTACCTGGCCGGCCAGCCCACCGACAGTGCACTGGCCG
190
200
210
220
230
240
ACGCCATGCGCGTGAGTTTTCAGAGTGCCAGGGAATTTGAGGCTGGCCTTGGCTGGGAGC
250
260
270
280
290
300
AGGATGCGGGACTGGTGCTGTCGCGCTGGATTGCCGGTGCGAGTGGCTGGCATGACCTGG
310
320
330
340
350
360
CTGAGCCATTGGAACAGATCCTCAACCAGCTCGCCCTATGGCGCGCCGCGATGTCCCGCA
370
380
390
400
410
420
CGCACTCCAGCCAGGATAAACATGCCAAGCGCGACGAAGAACGCTTCTACAAACTGTTGT
430
440
450
460
470
480
CTCAGTCCGGGGGAATGAAATGAATATCCGCGAGTTGATCAAATCGTGGGGTATGGGCGT
hrcC
490
500
510
520
530
540
GTTGCTGGCCGCGCTGCTGCTGTGGGGGACGACGCTGCATGCAGCAGTGCCGGCAGCATG
550
560
570
580
590
600
GAAGGACAGCGGATTCTCCATCAATGCCAATGGCATGACGCTCAATGGCGTGCTGGAGGA
610
620
630
640
650
660
TTTTTCCCGTACCTATGGGGTACGGCTGTCGATGAGCGGTGAGGGCGAGCGCCTGGTGAA
670
680
690
700
710
720
AGGGCGGCTCAAAGCCGACAACGGCATTGAGTTTCTCAACCGGCTCGGTGCGACCTACAA
730
740
750
760
770
780
GTTTCGCTGGTTCGTCTACAACAACACCCTTTACGTGGCATCGGCTAGTGACAACACCTC
790
800
810
820
830
840
CGAGCGACTAGAGGTGGGCGAGGATGCGGTGCAGGATGCCAAGGCGGCCCTAGTCGGGCT
850
860
870
880
890
900
GGGTCTGTATGACGAGCGTTTCGGTTGGGGTGAGCTGCCTGATGAGGGCGTGGTCATCAT
910
920
CAGTGGCCCGCGGGGATCCTC
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APÊNDICE IV - SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DO GENE pilN DE
H. rubrisubalbicans
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TACCGACGGGCGACGATTGACTGGTAGCCTCGTCAAGGCAAGTGGGGCGCACGGCCCCGG
70
80
90
100
110
120
GGGCGGTGATGCCCTCGGCGCCGCTGGTGACCCACGACACGGGGATCTGGTTGGGCAAGA
pilN
130
140
150
160
170
180
ATGTGGTCAAGCTGGGGCAGCCGGCATTACCGCCCATCTTTTACGAACCCACCACGTTCG
190
200
210
220
230
240
ACCGCACCCTCTTTTCGCTGAGCGAACTGGCCGAGCGCATCACCTTGCGTACCGGTATCC
250
260
270
280
290
300
CCAGCAGGGTTACCGCCGACACTCAGGAAGTGGCCGGCATGGCGTTTCGTAATCGCCCGG
310
320
330
340
350
360
GGCTGACAGGGTTCAATGCCACCCAGCCGCTGCCCCCTGGATTGCCTGGCGAGAATACAC
370
380
390
400
410
420
CGGCTGCCACACCTGGTACGCCTGCCGCTAGTGCCGCTCGCCTACCGTTACCGGCCGCAC
430
440
450
460
470
480
CGACGCCGCAACTGCTGTCCCTGCCGGGGGATGCCTCCACGGGCGTACGGATCTCCTATG
490
500
510
520
530
540
CCAATGGTTCGCTCAAGGGCTTGCTCGATACCGCAGCTGCGCGTTTCGGCGTCTCCTGGA
550
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570
580
590
600
AATACGTTGACGGGACGATTCAGTTCTTCCACACCGAATCGCGTAACTTCCAGATCAATG
610
620
630
640
650
660
CCATTCCGGGCGACTCCACTTTCACGGCCACCGTGACCAGTGGCGCAACATCCACCGGTG
670
680
690
GTGTCTCCGGTGGAGGCAGCAGCGGCGGTGGCAGCAG
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APÊNDICE V - SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DO GENE pilN e pilO
DE H. rubrisubalbicans
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60
GTCGAAGTTCTCCGGGACCACGGCGGTGAATCGATGCCTTGTCTGAACAAGGCAAGGTGC
70
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100
110
120
GCCGCCAGACCACCGCTTCGGTGGTGACCCTGAACAATCAGCCAGTACCGGTGCAGGTGG
130
140
150
160
170
180
CGCGCCAGACCAGTTACCTGCAATCCTCGCAGACTTCGATCGTGGCCCAGGTCGGTACCA
190
200
210
220
230
240
CGACCACCCTGATTCCAGGGGTGGTGACGGCAGGCTTCAATATGAGCATCCTGCCGCACG
pilN
250
260
270
280
290
300
TGCTGACCAACGGCACGGTGATGCTGCAGTTCTCTACCGACATCTCCACCCTGCGCGGCA
310
320
330
340
350
360
TCAGGCAGATCGAAAGCAATGGCAGCCGTATTGAATCCCCAGAGCTCGATACCCGCAATT
370
380
390
400
410
420
TCCTGCAGCGCGTGGCAATGAAGTCCAACGAGACACTCATCATCAGCGGCTTTGAACAGA
430
440
450
460
470
480
CCGATGACAACCTCGATTACAAAGGGGTAGGGACGCCCCGGAATTTCCTGCTCGGTGGTG
490
500
510
520
530
540
GCGTCAATGGCCAGAATAACAAGGAGATCATCGTCGTGCTCATTACGCCGGTGGCCATGG
*
550
560
570
580
590
600
CTGCGATCTGAGGAATAGGAACCGAGCCATGGCGAGCTATGTTACCCAGATAGAAAAGCA
pilO
610
620
630
640
650
660
CAGGTTCGTCTGTGGGCTTTTCTGGCAATCCCTGTCGCGTCCGCGCGAACTGAAGAAGGA
670
680
690
700
710
720
GGCCATTGATCTCGGCCGCAAGATCGATTCCGATCTGCTGGTTATCCGCATGGACCATTC
730
740
750
760
CAACGCCCAGGCTGGTATTGCGCATAGTCGGGAGGGCGGGCGT
56
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APÊNDICE VI – SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DOS GENES hrpX e
hrcU DE H. rubrisubalbicans
10
20
30
40
50
60
CGCCTACACTTTGCTACCGCCTTTCGAACCAGGGCATTTCGAAGTGCTGGTCAAGCGTTT
hrpX
70
80
90
100
110
120
CGGCGAATTCCTGTGGTACGTCGTAGTCTATGGCGCGCCCGTCATCATTCCCCTGATGCT
130
140
150
160
170
180
GATCGAATTCGCCTTTGCCATCATTGGTGTATTCGCCTCCAACCTACAGGTCTCCTTCGC
190
200
210
220
230
240
CTCGGCACCCATCAAGAGCTTGGTCGGACTGCTGATTCTGCTGATGTACTGGGCCACTTT
250
260
270
280
290
300
TTCGCATCACGTGACCGGCGATTTTGCCCATTTGCTGGACCTGCTGGCCAGCCTGACGGA
hrcU
310
320
330
340
350
360
TGCGGGGAAGCGATGAGCGAAGAAAAGAACGAAGAACCCACCCACAAGAAGATCGAGGAT
*
370
380
390
400
410
420
GCCAGAAAGAAGGGCCAGATCGCCGTCAGTCGCGACCTGGCGCGTCTGGCGATGCTGGTG
430
440
450
460
470
480
GCGGTAGCCGAACTGGCCATGGCGACCGAATCGCTCTGGCGCGGTGCGATTTCCAATCTG
490
500
510
520
530
540
ATGGAGGCGGTATCCATGGCGTGGGACAGGACTTCATACCAGTGGCCATGACCATCCTCA
550
560
570
580
590
600
GTTCGGCCGGGATCTTCGTGGCTATCGTCATCGCCATTTGCTTCGTGGTCTGCATCGTCA
610
620
630
640
650
660
TCGGCGTAGCCGCACACTGGGGCCAGTTCGGAATGCTGGTGGCGACCGAGGCGCTTACGC
670
680
690
700
710
720
CCAAGTTCGACAAGCTCAATCCGGTCAACGGTCTCAAGCAGATCATCTCCAAGAAGAAGC
730
740
750
760
770
780
TGGTGGAGCTGATGACCACCGTGGGCAAGGCCTTGTTGATCGGCTGGATCGTCTATGTGC
790
800
810
820
830
840
TGGTGCGCGGCAAGTTGGCCAATATTGTTTCCCTCTCCTGTGGTGATCCAAAGGAGAGCG
850
860
870
880
890
900
TATTACGGGTTTCTGACCATTCTGCGCGCGATCTTCCCCGTCATCATCGTGGTCTGCCTG
T
57
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APÊNDICE VII – SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DOS GENES hrpQ e
hrcN DE H. rubrisubalbicans
10
20
30
40
50
60
CTCAACGCTGATGACAACCACAAGCGTGATTTCCTCCAGCTGAAGATCGACGATTTCGCG
70
80
90
100
110
120
CGCCTCGGTTCGATCTGGCTGACCGTTACCGAAGAGGGCAGTGCCTGGCGCGACCCACCC
130
140
150
160
170
180
CCGGAGCCAGCCGACAGCATGGCCGAGGCGCAAGATATTGTGGCACCTGCGACGCCTGAA
190
200
210
220
230
240
GGCAGTAGCGCCGACGGCGCGGTGCCGCACGATACCGTGGTAACGTCCGATGCTGCTACG
250
260
270
280
290
300
GCCACTCCGTCGGCTGACATCTTGCAGCCCATGCCAGTCAGAGCCAGGCGCAATCGCCGC
310
320
330
340
350
360
CTGCTCCTGCTACCGTTGTCACTGATAGCTCTGCTTTCGGCCGCAGCAGCCTATGCCATC
370
380
390
400
410
420
ACGCGCCATTATCCGGCAGGCGGCGAGGAAAGCCTGTCCGCCAATGAGTCACTGCTGGCG
430
440
450
460
470
480
CCGCTCGGTGCCAAGGCAGCCATTGAGCCGCCTGCCGCCAAGATGAGTCCCGAGCAGTTG
490
500
510
520
530
540
CGTGCCGCATTTCGCAAGCGACTGGCTGAGGTGGATCTGCTCAAGCGTTTCAATCTACAA
550
560
570
580
590
600
CTGGAGGATCGTGAGTGGATACTGCAAGCGGCCCTGGATGAGGAAGAGAGCGAACGTTTC
610
620
630
640
650
660
CAACGAATGCTTGGCAGCTTCGTACGCACCCATGACATCGACTTTCCAGTCAAGGTCAAG
670
680
690
700
710
720
ATCGGCAGCGCTGAATCGATGTTGCCGTTCCGCATACAGCAGGTCATTTCCGGCAGCAAT
730
740
750
760
770
780
GCCAGCATCGTCACCGACGATGGCCGTCGTCTCTACATCGGAGACGAATATCGTGGCGTC
790
800
810
820
830
840
GTGCTGGCCGGTATCGACGGCAACCAGGTCAGCTTCACCGGTCGCCACAACATCAACGTT
850
860
870
880
890
900
AGGTGGTGAACGCGATGGCGACAATGACTGTAGCCATCGAGGGTAGCGATCCACTGGAGC
hrpQ * hrcN
910
920
930
940
950
960
TGAAACTGCAGTACATGCGTCGGCAGCTGGGCGCATGGCGACAGAGCCTGAACCCGCGCC
970
980
990
1000
1010
1020
CGGGTTTCGTCAGTTTCGGCAAAGTATCTCAGGTCTTGGGCACGCTGGTGGAAGCCCACA
1030
1040
1050
1060
1070
1080
TGCCCCCGGTGCAGATCGGTGAGCTCTGCCATCTGCGCGACCCGCACGTGGAGGGACCGC
1090
1100
1110
1120
1130
1140
CCATCCTGGCCGAAGTGGTAGGCTTCACTGACAAGGCCGCGATCCTCTCGGCGCTCAGCC
1150
1160
1170
1180
1190
1200
CGCTGGAGGGGGTCTCCAGCAGTACCATCATCGAACCCTTGCGGCGCGCCCACAGCATCG
1210
1220
1230
1240
1250
1260
AGGTCGGTGATCACCTGTTTGGTTGCGTTCTGGATGGATTTGGACGCTGGATGTTCCGTG
58
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1270
1280
1290
1300
1310
1320
CGCCGGCAGCAGCCGAGAACGTGGCGACATGGCGCGCCATGTCGCCGGTGATGCGCGACG
1330
1340
1350
1360
1370
1380
CTCCCAAGGCCACTGACCGGCCGCGCATCTCAGTGCCGCTGGCCACGGGCGTGCGGGCCA
1390
1400
1410
1420
1430
1440
TCGATGGTCTGCTGACCATGGGGTACCGGGCAGCGCATCGGCGTATTTGCCGGCCCTGGA
1450
TGCTGTCTCTTATACACAT
59
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APÊNDICE VIII - SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DO GENE hrcV DE
H. rubrisubalbicans
10
20
30
40
50
60
CACGAATGCGCGAGCTGCAAACGGGCTCATCGCGCACTCGCTGCAACTGCCCGAAGAATT
70
80
90
100
110
120
GCGCGGCCCTGCCTGGCCGCGGTCCGTAGGGTCAATGACAACATTGACTGGCGCTTGCGC
130
140
150
160
170
180
CTGCAACAGATGCGTCGCAGTCACGCCGAAGGTCCGTCCAATCAGCAAGACCAGGAAGAT
190
200
210
220
230
240
GATGAGAAGAAAGAGACCGCATGACGCCATGCCCGATGAACTGCTCATGGCCATCGGTCT
250
260
270
280
290
300
GGTATGGGGCTACTTCAGCGCCTACCAGTACGAAGCTGCCCATGAGCTGGCCCAAGGTTG
310
320
330
340
350
360
CCTGCAAGTCTGGCCGGACGATCCGAAACTGTTCCTGATGGCCTCCTATGCCGCGGCCGA
370
380
390
400
410
420
ATTACTGGAGCCAGTGGACCGGCAGCGTCTTGAGGCTATGCGCAACAAGGAAAACGAAGC
430
440
450
460
470
480
CTGGATCGACTTGATCATTTCCAGGCTCGATGCTGGCGAGGCGTCCCAGGCGCTTTCCGC
490
500
510
520
530
540
TACCACTCGCTAGGGGGCGGCATGCAAGGAATCGGGATACTGATGGCGCTCAACAAGTTT
hrcV
550
560
570
580
590
600
GCTGCCAAACTTGCTCAGCGCGCTGAATTGATCGTCGCCGCCTTCGTCATCGGCATCGTG
610
620
630
640
650
660
TTCATGCTGGTGCTGCCCATGCCGGTATGGCTACTGGACATGCTCATCGCCTTGAGTCTG
670
680
690
700
710
720
TGTATTTCCGGCCTGATTGTGATCGTGGNCATGTATATGCCCGGTCCGACGGCCTTTTCC
730
740
ACCTTCCCGGCAGTACTACTGCTGAC
60
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APÊNDICE IX – SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA REGIÃO DO GENE hrpO DE
H. rubrisubalbicans
10
20
30
40
50
60
GCGCGCTGAACAACTAGCTTTCCTGCGCCAGGACACTAGCACCAGTGCCCCATTCCAGCC
70
80
90
100
110
120
CACGCTGGACAAGCTCATGGAACTGCAGGCATGACGATCGGACAGCAGTCGGCGGGTGGG
hrpO
130
140
150
160
170
180
ATGGGGCGCCGCCCCCGCCGCGAGGTCATTGATGTCCCCGAACGCAAGCGCGAGGACCGT
190
200
210
220
230
240
CGGCTCGATCAGTTGCTCCATGTGCGCAAGCAACGTCTGGGACGTCTGGAGCGCGAACGC
250
260
270
280
290
300
AACGAAGCCCGCCAAGCCTGGCGCGCGTCACGCAACCAATTGCAGCAGGCCCGGCAACTC
310
320
330
340
350
360
TGGCGCGACATGCTTGCCCGCACGCAGGAGCAATGGCAGCAGTCACGCCGCGAGTTCATG
370
380
390
400
410
420
CAGATGACGCTAACGACCGGTCAATTCAATCGGGCCAAGGCGCTCTACAAGCGTATGCAA
430
440
450
460
470
480
GCTGAAAGCGCTCAACAGTATCTACGATGTCAGGAATGGGTCGAGCGCTGCCGTCAGGCG
490
500
510
520
530
540
CGTGCGGTTTTTTTTGAGGCCCGACGCAAAGTGCTGGAAGCTAACCGGCAGCAAGAAAAA
550
560
570
580
590
600
CTGAGCGTGTTGCGCGATCAGATGCGTGCTCAGGAACAGATCATGGAGCAATGAACGATG
*
610
620
630
640
650
660
CCACCTCAACCTATCTCCTCGCTCGTGGACACCTTCTACGGCGAGACCATGCCTGTGCGG
670
680
690
700
710
720
CGGCCACCCGCCAAACGCGTACCGCCATTCACTGCGCACTTGCCGCCCATGCCGCCGGCG
730
740
750
760
770
780
GCTCCATCCCATAGTCAGACAAGCCCTCAGATGAATGCGCGTGCACGTACTGCAGCGGCT
790
800
810
820
830
840
CCTAGACGTGTGGCCCAGGAGCGATCCTCCATCTCGAGCAGCAGCGAACGGGTGCCTGCG
AATCCCA
61
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APÊNDICE X - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA PilN DE H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
10
20
30
40
50
MSMPFMRQTA LSLAVLTASA CS--VQRVDE AAARAEATAD SAGRYAAIQR
MNLASMKLPI LLPLVVVMAG CSALADRIEG NVNQEGDRAT RLSRDVGRTA
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
60
70
80
90
100
NKQQQERRDT VIFSDKPWVS TQPVVARRGI PTKYDCEVAY RPAGSVGIAE
PGSVLPSTPL VKHESGIWLG KTAIKLGQPS LPPIFYEPTT FDRTINSLTE
----MPSAPL VTHDTGIWLG KNVVKLGQPA LPPIFYEPTT FDRTLFSLSE
* ..
*:. . :
:
.
* :
.::*
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
110
120
130
140
150
IAQYISRQCG IPVLVSPDAL NPGLLNANAP AQ------GN NAPPISTAPN
LAERITLRSG LPSKVTPDAL EVSSAAFRLR GGGMPLRPGM MGAGPAPAGG
LAERITLRTG IPSRVTADTQ EVAGMAFRNR PG----LTGF NATQPLPPG:*: *: : * :* *:.*: : .
.
*
..
..
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
160
170
180
190
200
PDSLAGLLPA GITGGSNLAQ ASQG----RS SDFASMLTPN LVSGLRFT-APVAMLPLPL GAPGEGQSSP VQPGRGPAAS TGQTQPTFTD LPNGVRIAYN
--LPGENTPA ATPGTPAASA ARLP-LPAAP TPQLLSLPGD ASTGVRISYA
* . .*
: .
. :
:
.*:*::
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
210
220
230
240
250
-GKASGLLDE VTARLGLTYR FNPTSRSVQV SYFDTKVFDV YAFGDVQEIK
SGSLKGLLDT AAARFGVSWK FSEG--VIQF FHTESRNFQI SAIPGDSTFS
NGSLKGLLDT AAARFGVSWK YVDG--TIQF FHTESRNFQI NAIPGDSTFT
*. .**** .:**:*:::: :
:*. : ::: *:: *: . . :.
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
260
270
280
290
300
STVRSGMTTS SGSGSGSSSG SSSGSSSSGV SGDSGSNQST TVTLNTSILT
ATVTSGATST GGTAGTNGGG GSGGGSGGAG SGGGGVNANN TQNTAVASKL
ATVTSGATST G---GVSGGG SSGGG----- ---------- ---------:** ** *:: .
. ...* .*.*.
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
310
320
330
340
350
DIQSNVRAML STS--PPGRM YLSPSTGTLT VTDRPDVLSN VETYLAKTNH
SVYTGIESAI KVMLSPYGKV LASPATGSIT VVDTPDSLDR IATYIDGENK
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
360
370
380
390
400
AITQQVLFNV KVFEATLTDT DQLALNWAAV YNSLSTKWGL SLSNTVPGIS
SLSRQIAINV TVLSVTLSDD DQYGINWNAV YRSLNSTFGI ANAYEGA-LS
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
62
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Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
410
420
430
440
450
SSAISGSVGI VDTANSAWAG SNAIIQAIAE QARISNVRSP SVTTLNLQPA
TGLVSFTAGI PSSGTSGFSG SQAVIQALSQ QGKVRRQTTA SVVTLNNQPV
---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
460
470
480
490
500
PLQIGNVQGY IPSVQTNTTA SVGSSTAITP GTITSGFNMT LQPRLMDDDE
PVQVARQTTY LQSLQSSLVA QVGTTTSLTP GVVTAGFNMS ILPHMLTNGT
---------- ---------- ---------- --------MS ILPHVLTNGT
*: : *::: :.
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
510
520
530
540
550
MLLMVSINMS SKPTFEPFTS NGSS------ -VQIPNYDAK SLSPKVKLRS
VMLQFSTDIS TLRRIRQITA STDSSGRATA LIESPELDTR NFLQRVAMKS
VMLQFSTDIS TLRGIRQIES NGSR------ -IESPELDTR NFLQRVAMKS
::* .* ::* :
:. : : . .
:: *: *:: .: :* ::*
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
560
570
580
590
600
GQTLILSGFE ELSDNTDKIG TGSPGFFGLG GGRKRTSSKS VLVVLITPIV
NETLIISGFE QTDENLGRSG VGDPKNLLLG GGVSAATNKE VIVVLITPVA
NETLIISGFE QTDDNLDYKG VGTPRNFLLG GGVNGQNNKE IIVVLITPVA
.:***:**** : .:* . * .* * : ** ** . ..*. ::******:.
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
TN--MGSAS
MAAI-
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizados
espaços. Estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína PilN de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
refYP_234605.1 (Pseudomonas syringae pv. syringae).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
63
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APÊNDICE XI - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA HrcC DE H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
hrbrisubal
Clustal Co
10
20
30
40
50
MVEKRELRCR LLGALLMLCA TLPAG--AQT PADWKEQSYA YSADRTPLST
------MRKA LMWLPLLLIG VIPATW-AVT PEAWKHTAYA YDARQTELST
------MRKA LMWLPLLLIG LSPATW-AVT PEAWKHTAYA YDARQTELAT
MNAREIIKSW GMGLLLAGLL LWGTTLHAAV PPAWKDGGFS ISANGMTVRG
MNIRELIKSW GMGVLLAALL LWGTTLHAAV PAAWKDSGFS INANGMTLNG
::
:
*
:
* . * **. .:: .*
:
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
hrbrisubal
Clustal Co
60
70
80
90
100
VLQDFADGHS VDLHLGNVED TEVTAKIRAE NASAFLDRLA LEHHFQWFVY
ALADFAREFG MSLDMSPVQG -KLDGRIRAQ NPEEFLERLS QEYHFQWFVY
ALADFAKEFG MALDMPPIPG -VLDDRIRAQ SPEEFLDRLG QEYHFQWFVY
VLEEFSRTYG VRLNLSADGA QIVKGRLKAD NGVEFLNRLT GAHRMRWFVY
VLEDFSRTYG VRLSMSGEGE RLVKGRLKAD NGIEFLNRLG ATYKFRWFVY
.* :*: .. : * :
: :::*: .
**:**
::::****
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
hrbrisubal
Clustal Co
110
120
130
140
150
NNTLYVSPQD EQSSERLEIS PDAAPDIKQA LSGIGLLDPR FGWGELPDDG
NDTLYVSPSS EHTSARIEVS PDAVDDLQTA LTDVGLLDKR FGWGSLPDEG
NDTLYVSPSS EHTSARIEVS SDAVDDLQTA LTDVGLLDKR FGWGVLPNEG
NDTLYVTPAA DNTSSRMQVG EDAVMDAKAA LVGLGLFDER FGWGELPDEG
NNTLYVASAS DNTSERLEVG EDAVQDAKAA LVGLGLYDER FGWGELPDEG
*:****:.
:::* *:::. **. * : * * .:** * * **** **::*
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
hrbrisubal
Clustal Co
VVLVTG--VVLVRG--VVLVRG--VVIVSG--VVIISGPRG
**:: *
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrcC de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gbAAB49179.1 (Erwinia amylovora), refYP_234292.1 (Pseudomonas syringae pv syringae),
gbAAO54911.2 (Pseudomonas syringae pv tomato).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
64
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APÊNDICE XII - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA HrpE DE H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisbal
Clustal Co
10
20
30
40
50
---------- ---------- ---------- ---------- -MLTRRRITL
---------- ---------- ---------- ---------- -MLAKRSIAL
MSSSNKESAS DLIRAKDAAL LDIWALPSFD PHVEPEPEPE PELVDEPAEM
-----LAPCQ ARRCCRLDPY PYFLPLPEAS SYVAP---AT SSFLAAELCL
---------- ---------- ---------- ---------M SDFAVQRVTL
:
:
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisbal
Clustal Co
60
70
80
90
100
LNAEADLAPV VSQAQLCIQQ QGQDILEQAR QQAQAMLEEA ERQAEVEMLN
TAATLLREPI LRREDIADSL LARDILADAR QQATQILALE QEKAE----H
EEVPLDEVQP LTLEELESIR -QEAWNEGFA TGEKEGFHST QLKVRQEAEV
PPSLRPRHGV VSSVDFRVTE DARLAAAQLV QQAQAEAAGI REQARADALA
PDHLRPANGV LRLTGLTVTS DAEQLAAQML AQAREEAAQV RKQAEEEAGH
:
:
.
. :..
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisbal
Clustal Co
110
120
130
140
150
AQQRAEQAFW QQADTLLQSW QQQYQQLEAQ VLEVMDSVLT QALDQLLTDV
LQQQALAQFW ENANAFLGEL QVQREALQEQ AMTAVEELLS ESLRHLLDDT
VLAAKVASLE QLMGNLLAPI AEQDTQIEKA VIYLVEHIAR KVIQRELVTD
ALHDEERRIA HEAGQLLARL REREASMLEG VAGLAVDLAH SIFDRLLVDT
VVMRQQQEVA QQGAVLLEGL RQAQDDMLER IEEVVVDLAQ EVMERLLLEL
. .
:*
:
:
. : : *
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisbal
Clustal Co
160
170
180
190
200
PQTQRLAAIL RQLLRAKTLT EQGSLYCHPA QHLEIADWLR -SHDHLAWQL
TLAERARALA RNLAASQLNE AVATLSVHPQ IADAVAEWLA DSRFSEHWQL
S--AQIASVL RDALKLLPMG AQNVRIFINP QDFLLVKAMR -ERHEESWKI
TARERVMAAC RRVREEAPPK LTEAVAWLHP EDAASLAQED ----ALPWEL
TPRERITAML RRIRQEAPPK LHEAVLWVHP DDQPLLP--- ----ASSWEM
.
: :
*
*::
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisbal
Clustal Co
210
220
230
240
250
QPDESLAQDS LKLVTANGEL SLDWQQAVRQ LLP------- ---------KRDATIASDS LRLSDANGAF DIAWADLRKG LLG------- ---------VEDEDLLPGG CRIETEHSRI DASVETRIAL AISKMHDQLH EQVTHPAAAD
RTDARLAQGS CRLEAASGEW RADFSLAAEA LRATVQQWNA PGGGATEDAC
QTDSALAPGS CRLEAASGEW RSDFALAVQA LR-------- ---------* : .. ::
.
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisbal
Clustal Co
260
270
---------- -----PQTAS --------------- -----VEPAA -----LSVDLDVSPG KASNAEESDA DTLDAP
GVGQDDELDD DPDQEEEDGE QS--------DGLAG ASARLKEQAP S----:
65
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Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrpE de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gb|AAB49176.1 (Erwinia amylovora), refYP_234289.1 (Pseudomonas syringae pv syringae) e
refNP_791213.1 (Pseudomonas syringae pv tomato).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
66
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APÊNDICE XIII - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA HrcJ DE H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
H seropedi
H rubrisub
Clustal Co
10
20
30
40
50
-LDPDVIEPR IRRMVASSLP GLAGRSD--K DLAIVFVPAE SYQDKPPQVS
ALDPDSVRGR IQQMVASSIP GMSTQSAESK KFSIVFVPAT EFQETTQWVS
ALDPDSVRGR IQQMVASSIP GMSTQSVDSK KFSIVFVPAA EFQETTQWVS
PLDEDAVMPR IRRLVASSIP GLASEDG-RS KVSVVMMPGE PPTPGIEWTM
-MDEDMVMPR IRKLVASSIP GLSGEEG-RA KVTVVMMPGE VPTAGIEWTT
:* * : * *:::****:* *:: ..
..::*::*.
.
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
H seropedi
H rubrisub
Clustal Co
60
70
80
90
100
FGPFLVTPER S--AQLSWLS GMIGVL---- ---------- --ILMVVAGV
FGPFKLDSAN LPFWNLMLWL VPVGLA---- ---------- --VLLLIIAL
FGPFKLDSTN LPFWNLMLWV APVGLA---- ---------- --LVLLIGAL
LGPFTVAVSS AGGLALTMSA LLLTTLSSLG YIGLQRALRH PRVARMVAEF
LGPFVVAVSS VRALGFTLLG LGLLILLAGG WLLVLNVQRN PKLMLMIARL
:*** :
:
:
: :: .
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
H seropedi
H rubrisub
Clustal Co
110
120
130
LGWPHWQR-- -----YRQRQ QPPPPGQNNE --LLRSDWRASV LGRIGLAGRS RSTVPARA-- --LVRSDWRASL LRRIGFGSRG RSTLPARA-- --AARRIKKAQD KAQAKAQGQA KPQAPEPTAG RGT
SMRKAKAGDP SESAPAAATA APAANKPAQA KS.
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrcJ de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gbAAB49174.1 (Erwinia amylovora), gbAAY36249.1 (Pseudomonas syringae pv syringae) e
gbAAO54906.1 (Pseudomonas syringae pv tomato).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
67
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APÊNDICE XIV – ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA HrcU DE H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Erwinia am
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
Erwinia am
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
Erwinia am
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
Erwinia am
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
Erwinia am
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
10
-MAEKTEKPT
-MSEKTEKAT
MSDDKNEEPT
-MRGSDERRK
. *. .
20
AKKLQDARRK
PKQLRDAREK
DKKIEDAKKK
ERRTHPQEDR
:: . . :
30
GQVPQSQDVP
GQVGQSQDLG
GQIAVSRDLA
GCQKEGPDRR
*
. *
40
KLLICAGVVE
KLLVLMAVSE
RLVTLVAVME
QSRPGASGDA
:
.
50
TVLALDDVGM
ITLALADESV
AALAADSLWR
GGGSRTGHGD
: .
60
QKLQALMMLP
NRLEALLSLS
GAVFNLMEGG
RIALARCDFQ
70
80
90
100
-----LARIG QPFELALSEV VSSAIILVAT FCGLTVAIAA
-----FQGID RSFAASVELI ASEGLSVLLS FTLCSVGIAM
-----VLGVG QDFQTAMNNQ LTAALILLAV AFFAVLVICP
SDGGGIHGVG QDFIPVAMTI LSSAGIFVAI VIAICFVVCI
. :. : *
: . .:
. :.
110
120
130
140
150
LLRIIGGWIQ YGPLFAPEAL QPDFNRLNPI NQFKQMFSVK KLSEMLNSIV
LMRLISSWMQ IGFLFAPKAL KIDPNKINPF SHAKQMFSGQ NLLNLLLSVL
LAAVVGHWGQ FGMLIATEAL EPKLDKLNPV NGIKQIFSKK KLVELFITVG
VIGVAAHWGQ FGMLVATEAL TPKFDKLNPV NGLKQIISKK KLVELMTTVG
: : . * * * *.*.:**
. :::**. . **::* : :* ::: ::
160
170
180
190
200
KAVAICTIFY LVLTPDLESL SRLAYGDLDS FWPAVETLLI HVSRQTLLTL
KAIAIGATLY VQVKPVLGTL VLLANSDLTT YWHALVELFR HILRVILGLL
KAALIAGMMY SAIHSQLGAI FTLAGGEPKD VYEAFVTLLR NIFHLIIVVC
KALLIGWIVY VLVRGKLANI VSLSCGDPK- ---------- ---------** *
.*
:
* :
*: .:
210
220
230
LVLTLLDFGL QKYFFIKQQR MSHQDIRDEH KQSEGD
LAIAMIDFAM QKYFHAKKLR MSHEDIKKEY KQSEGD
LVLGVIDYAV QKYFHKKDLM MDQEEIKREF KESEGD
---------- -----ESVLR VSDHSARDLP RHHRGL
.
:.... :
:. .*
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrcU de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gbAAB06008.1 (Erwinia amylovora) e refYP_234297.1 (Pseudomonas syringae pv syringae).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
68
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APÊNDICE XV - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA HrpX DE H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
H.seropedi
H.rubrisub
Clustal Co
10
20
30
40
50
-GLDVFLEQL NQTMQHMLLY AAPFIALLLL IEAAFAIIGL YAQQLNVSIL
EGLDVFLGQL NQTLQHMMLY AAPFIALLLL IEAALAIIGL YAQQLNVSIL
EGFKQYLALL ADTFTHIIIY AGPLVALLLL LDFSIAILSL YSPQLQVFVL
GHFDVLVKRF GELLWYIVVY GAPVLIPLVL IEFGFAIVGV FASNLQVSFA
GHFEVLVKRF GEFLWYVVVY GAPVIIPLML IEFAFAIIGV FASNLQVSFA
:. : : : : ::::* ..*.: *:* :: .:**:.: :: :*:* .
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
H.seropedi
H.rubrisub
Clustal Co
60
70
80
90
AMPAKSMAGL AFLLIYLPTL LELGTGQLLK LVDLKSLLTL LVQVP
AMPAKSMAGI AFLLVYLPTL LELGTGELSK LADLKSILGF VVQVP
SVPAKCLVGL LFFVLYIPTL NALGEDRILQ LRDLSKLLPL ILGGH
SAPVKSLVGL LIMLLYWSTF SHYVAGDFAH LLDLLTVLMA QR--SAPIKSLVGL LILLMYWATF SHHVTGDFAH LLDLLASLTD AGKR: * *.:.*: ::::* .*:
. : : * **
*
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrpX de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gbAAB06007.1 (Erwinia amylovora), refYP_234298.1(Pseudomonas syringae pv syringae) e
refNP_791220.1 (Pseudomonas syringae pv tomato).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
69
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APÊNDICE XVI - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA HrpO DE H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
H.rubrisub
Clustal Co
10
20
30
40
50
------MDEP LEDDP----- ---QQVALQQ VIGLLTPLRQ HRQASAERAH
------MDET LEEDP----- ---QREALEQ VISLLTPLRQ HRQASAERAH
---MPLIDHE LDHQPD---- --VQRQNLQQ ALNVLMPIRR QRMNRAQRQL
MTIGQQSAGG MGRRPRREVI DVPERKREDR RLDQLLHVRK QRLGRLERER
:
*
::
:: :. * :*: :*
:*
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
H.rubrisub
Clustal Co
60
70
80
90
100
RQAQLELKSM LDHLAETRAS LNQERDNHKR RRESLSHAHL QKTLSLTDVD
RQAQVELKSM LDHLSETRAS LDQERDNHKR RRESLSQDHL QKTISLNDVD
RQQQMQVEQA RQHQLAQQQQ LTQYQQDYQQ QRD----QFQ QRQPSREKLT
NEARQAWRAS RNQLQQARQL WRDMLARTQE QWQQSRREFM QMTLTTGQFN
.: :
.
::
:
:
:. : :
. *
: ..
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
H.rubrisub
Clustal Co
110
120
130
140
150
GWHEKERTML DRLACIRQDV EQQQMRVAEQ QALLEQKRLQ AKASQRAVEK
RWHEKEKNML DRLAFIRQDV QQQQLRVAEQ QTLLEHKRLQ AKASQRAVEK
QRLASEQQAL QAVGLQQQQC QQAQQACEEA ASELEQAAQR ARQQQKAVEK
RAKALYKRMQ AESAQQYLRC QEWVERCRQA RAVFFEARRK VLEANRQQEK
:
.
::
:
: : .
: .
:: **
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
H.rubrisub
Clustal Co
160
LACMEETLNE EG----LACMEETLNE EG----LEYLSEHLEE A-----LSVLRDQMRA QEQIMEQ
* : : :.
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como: * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrpO de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gbAAB06002.1 (Erwinia amylovora), gi66044463refYP_234304.1 (Pseudomonas syringae pv
syringae) e gi28868607 (Pseudomonas syringae pv tomato).
70
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APÊNDICE XVII - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA hrpQ de H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
10
20
30
40
50
MFELRVLNGQ HQGAALPLIG E-QWSIGSAQ QQDLALDDSG VESLHCRLQR
MFELRVLNGQ HQGAALPLIG E-QWSIGSAG QHDLALDDAG VESLHCRLQR
MHELRVLTGL HRGAALPLSG Q-QWWIGAAQ DADLALFDPG IKDRHCRLSK
MQELRILNGY HRGATLPLAD SGERILGAEE DADVVLADPG IAGQHARLAL
------LN-- ---------- ---------- ---------- ---------*.
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
60
70
80
90
100
LDDSWTLNAE EGAVCDEEGH -SQASVDLTL NTAFMLGSVW LCVSPAGDEW
VDDNWTLNAE QGAVCDEQGN -ARPSIDLTL NNAFMLGSVW LCVSPAGDEW
TDLGWEVTAL EGPLNDNEGQ RCEQLTDLQP GTAFALGHIW LSIVSASMPW
TPEGWTLTAM DGCLRRADSN RPESALQLAF GELARADRIW LTVVDQDAPW
---------- ------ADDN HKRDFLQLKI DDFARLGSIW LTVTEEGSAW
:.:
.
:*
.
. :* * :
. *
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
110
120
130
140
150
PSVPAVIPKQ PQAEAEPARH EAPLEKVKSR SQFLNRTTGI IAGLLVGVIG
PSVPAVIPKQ PEAESGQARN DVPLEKVKSR SQFLNRTTGI IAGLLVGVIG
P--------- EENDEPMQEE EIPLAGAAAV AVATDDKPAA VAATLE---TDPPPEPVDT PHSSGDQEGP PADQETAYSD ALPLPATDED EPQQQAPAPT
RDPPPEPADS MAEAQDIVAP ATPEGSSADG AVPH---DTV VTSDAATATP
:
.
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
160
170
180
190
200
SAWSLTRPAA IVLDQG---P AHIASAMTTA PGMPNAAPKT SQPAAKPAGP
SAWSLTRPPA IAMDQS---P AHLAAATTEA S------PDT PKAPARAANP
-----KRPLP LWAKAV---Y LLLSLLLVMM LG----GWLL QDSIASPSAP
PDDATAAEPA LARRGRGYRM VLLPFFMATA LTGAAAYALS SH-PAPADEQ
SADILQPMPV RARRNR--RL LLLPLSLIAL LSAAAAYAIT RHYPAGGEES
:.
. *
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
210
220
230
240
250
ATDKRVRLA- ---------- ----SMEAVR HQLTTMLSDR -MLTDVSVAE
VTDNRIRLS- ---------- ----SADAVR HQLSTMLSDR -LLTDVSVEE
PAPGKPLLS- ---------- ----SVERTR QVVTSMLLDR GLDRSVTLSS
ARARAEELKR LAALP----- -RKLPAAELE AALRKRLAEV DLLSRMTLDL
LSANESLLAP LGAKAAIEPP AAKMSPEQLR AAFRKRLAEV DLLKRFNLQL
*
.
.
. . * :
:
..:
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
260
270
280
290
300
TPEGLMLNGH LKEESLVVYQ RMLQRFKDRY DSPVTVLDNV ASARNTLPFV
TPDGLILNGD LKEESLLVYQ RMLQRFKALY DSPVTVLDNV GSNRNTLPFV
DSNSLTLSGS INSEDNQRLE RMLANLYQHF DVKLPIHNRA TTVSMRLPFT
REGAWTLRGA MGEDDAERLQ RMLRDFAKAY VIDFPIDVKI GSPESMLPFR
EDREWILQAA LDEEESERFQ RMLGSFVRTH DIDFPVKVKI GSAESMLPFR
* . : .:.
: *** :
.
..: .
:
***
71
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Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
310
320
330
340
350
VVQIMTGPHA HLVTADGRRM YVGDEKDGLR LTKIDDQRLQ FDGDRHIEVT
VVQIMTGPHA HLVTADGRRV YVGDEVDGLR LTRIDNQRLQ FDGNRHIEVN
IVQISSGPHA NIVTADGQRI FIGDEIDRLR LVAINADSLE FAGRENIRVK
IVQVLNGSDP SIVTDDGRRL YVGDEYRGVR LAAVAGNQIR FTGKQALNVS
IQQVISGSNA SIVTDDGRRL YIGDEYRGVV LAGIDGNQVS FTGRHNINVR
: *: .*... :** **:*: ::***
: *. : : : * * . :.*
Pseudomona
Pseudomona
Erwinia am
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
W
W
W
W
W
*
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrpQ de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gbAAB06000.2 (Erwinia amylovora), refYP_234306.1(Pseudomonas syringae pv syringae) e
refNP_791228.1(Pseudomonas syringae pv tomato).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
72
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APÊNDICE XVIII - ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA hrcN de H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
10
20
30
40
50
---MVMSALQ QRLTQWAQQH QRR------- -LERYAPVSR YGRVTGISGI
---------- ---------- ---------- ---------- ------MRGI
--------MN AALNLWKDAH ARR------- -LSEYCAVRV IGRVSAVRGI
---------- ---------- ---------- ---------- ---------MATMTVAIEG SDPLELKLQY MRRQLGAWRQ SLNPRPGFVS FGKVSQVLGT
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
60
70
80
90
100
LIECILPGAR IGDLCRIQRS --DGGSVLSE IVGFSPEKIL LSALGALDGI
LLECKIPAAK VGDLCEVSKA --DGSFLLAE IVGFTQECTL LSALGAPDGI
LLECKIPSAK VGDLCEVSKA --DGSLLLAE IVGFTQECTL LSALGPPDGI
-----MPPVQ IGELCNLFNP EQPGKTMLAE VVGFTDKASI LSALSPLEGV
LVEAHMPPVQ IGELCHLRDP HVEGPPILAE VVGFTDKAAI LSALSPLEGV
:* .: :*:**.: .
* :*:* :***: : : ****.. :*:
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
110
120
130
140
150
SQGATIVPLY LPHSICVSEQ LLGSVLDGFG RALEPGGHSA FAEPGTQVRA
QVGAPIRPLG IAHRIGVDDT LLGCVLDGFG RPLLGDCLGA FAGPDDRRDT
QVGAPIRPLG VAHRIGVDDS LLGCVLDGFG RPLMGDCLGA FAGPEDRRTT
STRTVIEPLR RSHSIEVGDH LFGCVLDGFG RWMFR-APAA QENVATWRAM
SSSTIIEPLR RAHSIEVGDH LFGCVLDGFG RWMFR-APAA AENVATWRAM
. : * **
.* * *.: *:*.****** * :
.*
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
160
170
180
190
200
VPVLNDAPPP TERPRITTPL PTGLRAIDGL LTIGNGQRVG IFAGAGCGKT
LPVIADALPP TQRPRITRSL PTGIRAIDSA ILLGEGQRVG LFAGAGCGKT
LPVIADALPP TQRPRITRAL PTGIRAIDSA ILLGEGQRVG LFAGAGCGKT
SPVIRDAPPA TSRPRIATPL PTGVRAIDGL LTMGMGQRIG VFAGPGCGKT
SPVMRDAPKA TDRPRISVPL ATGVRAIDGL LTMGY----- ---------**: ** . *.****: .* .**:****. : :*
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hseropedic
Hrubrisuba
Clustal Co
210
220
TLLAELARNT PCDAIVFGLI
TLMAELARNM DCDVIVFGLI
TLMAELARNM DCDVIVFGLI
TLMAAIARGC QAEAIVFGLI
--RAAHRRIC R--PWMLSLI
*
*
::.**
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
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

Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das seqüências.
O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrcN de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
refNP_791227.1 (Erwinia amylovora), refYP_234 305.1 (Pseudomonas syringae pv syringae) e
refNP_791227.1 (Pseudomonas syringae pv tomato).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
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APÊNDICE XIX- ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA
PROTEÍNA hrcV de H. rubrisubalbicans E OUTRAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS
Hseropedic
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hrubrisuba
Clustal Co
10
20
30
40
50
---MGIVMLL NKFAIQLGKR AELLAAALVI GIVFMLVLPM PIWLLDILIA
--MSSLFVWL NRLAISAMQR SEVVGAAIVM SIVFMMIIPL PTGLIDVLIA
--MNQIINFL NMVALSAMRR SEVVGAFFVI AIVFMMITPL PTGLVDVLIA
--MNRVINFL NMVALSAMRR SELVGAFFVI AIVFMMITPL PTGLIDVLIA
MQGIGILMAL NKFAAKLAQR AELIVAAFVI GIVFMLVLPM PVWLLDMLIA
:. * * .* . :* :*:: * :*: .****:: *: * *:*:***
Hseropedic
Erwinia am
Pseudomona
Pseudomona
Hrubrisuba
Clustal Co
60
70
80
MSLCASGLIV VVAMYMAGPT AFSTFPAVLL
LNICISSLLI VLAMYLPKPL AFSTFPSVLL
VNICISCLLI MLAMHLPRPL AFSTFPAVLL
VNICISCLLI MLAMHLPRPL AFSTFPAVLL
LSLCISGLIV IVXMYMPGPT AFSTFPAVLL
:.:* * *:: :: *::. * ******:***
Entre as seqüências de aminoácidos é possível observar traços, os quais são simbolizam espaços,
estes espaços são inseridos pelo programa para melhorar o alinhamento das seqüências.
O resultado do alinhamento das seqüências de aminoácidos é representado pela linha Clustal Co,
a qual apresenta sinais indicativos como : * ( asterisco) , : (dois pontos) e – (traço) .
 O asterisco (*) inidica aminoácido conservado.
 Os dois pontos (:) indica que há prevalência de um aminoácido na maioria das
seqüências.
 O traço indica que os aminoácidos alinhados diferenciam por um nucleotídeo no códon
que os codificam.
As seqüências de aminoácidos das proteínas homológas a proteína HrcV de H. rubrisubalbicans
foram retiradas do banco GenBank. Os números de acesso das proteínas homólogas são:
gbAAB05999.2 (Erwinia amylovora), refYP_234307.1 (Pseudomonas syringae pv syringae) e
refNP_791229.1 (Pseudomonas syringae pv tomato).
As seqüências de aminoácidos das proteínas da bactéria Herbaspirillum seropedicae foram
retirada do Banco de dados GENOPAR.
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