Universidade Estadual de São Paulo
Escola de Engenharia de Lorena
Separação e recuperação de
bioprodutos
Prof. Dr. Arnaldo Marcio Ramalho Prata
Rompimento Celular
Produtos associados às células requerem o rompimento ou a permeabilização.
Deve-se considerar alguns fatores:
Tamanho da célula
Resistência a tensão de
cisalhamento
Necessidade de controle de
temperatura
Rendimento do processo
Gasto de energia
Capital de investimento
Rompimento celular
O equipamento de rompimento é selecionado com base no tipo
de microrganismo, pois cada um apresenta uma resistência
específica ao rompimento.
A escolha da técnica de rompimento determina o tamanho dos
fragmentos celulares, que por sua vez irão influenciar nas
operações utilizadas para sua separação.
A separação dos fragmentos celulares em solução deve ser
iniciada assim que as células forem rompidas.
Como resultado desta etapa o produto estará em uma solução
com proteínas e outros compnentes solúveis.
Rompimento Celular
Características da Parede celular de microorganismos
•
10 % da parede
Peptideoglicano.
•
Membrana externa: proteínas,
fosfolipideos e LPS.
•
Membrana interna: fosfolipideos
e Peptideoglicano.
•
90 % da parede
Peptideoglicano.
•
Alguns com ácido teicóico.
celular:
celular:
Rompimento Celular
Características da Parede celular de microorganismos
•
18 – 60% glucana
•
20 – 23% manoproteínas
•
0,6 – 2,7% quitina
Rompimento Mecânico
Homogeneizador a alta pressão
•
Constituído
por
pistões
projetados para a aplicação de
altas pressões, forçando a
passagem da suspensão celular
por um orifício estreito seguida
de
colisão
contra
uma
superfície em uma câmara de
baixa pressão.
•
A redução instantânea da
pressão associada ao impacto
provoca rompimento celular
sem danificar as biomoléculas.
•
Rompimento celular ocorre por
cavitação,
turbulência
e
cisalhamento.
•
•
•
•
A quantidade de células
rompidas é proporcional à
pressão empregada.
Utiliza-se pressões de 5.000 a
20.000 psi
Velocidades de alimentação de
180 a 280 m/s
Concentrações celulares de 450
a 750 g/L (massa úmida)
Rompimento Mecânico
Homogeneizador a alta pressão
•
Células maiores se rompem mais facilmente.
•
O material pode ser recirculado, porém gera fragmentos menores.
•
O meio de cultivo pode influenciar no rompimento celular.
•
Amplamente utilizado na indústria
• Exceto para fungos filamentosos
Rompimento Mecânico
Moinho de bolas
•
Originalmente desenvolvidos para reduzir
partículas de pigmentos para indústrias de
tintas.
•
Foram realizados testes para rompimento
celular de fungos filamentosos
•
Projetou-se
novos
equipamentos
adaptados para rompimento celular de
fungo
filamentosos,
leveduras
e
microalgas
Rompimento Mecânico
Moinho de bolas
•
Câmara cilíndrica fechada, vertical ou horizontal .
•
Possui sistema de refrigeração e um eixo que gira em alta rotação
•
Internamente existe esferas de vidro e um ou mais discos ou hastes que giram
em alta velocidade.
•
Rompimento ocorre pela força de cisalhamento
Rompimento Mecânico
Moinho de bolas
•
Eficiência do processo depende de:
•
Geometria da câmara de rompimento
(Horizontais)
•
Velocidade (depende do microrganismo)
•
Tipo do agitador
•
Tamanho e composição das esferas
(vidro, inox e cerâmica)
•
Carga de esferas (80-85% câmara
horizontal e 50-60% câmara vertical)
Rompimento Mecânico
Moinho de bolas
•
Eficiência do processo depende de:
•
Concentração celular (30 a 50%
v/v)
•
Velocidade
da
alimentação
(depende da velocidade do
agitador, da carga de esferas, da
geometria do equipamento e das
propriedades do microorganismo)
•
Temperatura (Controlada entre 5 e
15°C)
Rompimento Mecânico
Moinho de bolas
• No aumento de escala conservar:
• Tamanho das esferas.
• Proporção entre volume da suspensão celular e das esferas.
• Velocidade de rotação do eixo ou velocidade periférica das pás do
agitador.
https://www.youtube.com/watch?v=hSgpx9KWiwU
https://www.youtube.com/watch?v=O2-gg0C2Asw
Rompimento Mecânico
Ultra-som
•
Ocorre por ondas sonoras, convertidas em
vibrações em um meio líquido que
causam o efeito de Cavitação.
•
Com o tempo e as vibrações, as bolhas
entram em colapso, gerando uma onda de
choques que circundam pelo meio líquido,
produzindo uma tensão de cisalhamento.
•
Deve-se controlar a temperatura.
•
Utilizado em escala laboratorial
•
Inviável em grande escala.
Rompimento não mecânico
Choque osmótico
•
Células são mantidas em solução de sacarose (20%) por 30 min.
•
A suspenção é centrifugada e ressuspendida em água destilada a 4 °C.
•
Proporciona permeabilização seletiva (Proteínas).
•
Indicado para bactérias gram negativas (parede celular mais sensível)
Rompimento não mecânico
Congelamento e Descongelamento
•
Realizam-se ciclos de congelamento e
descongelamento.
•
Formam-se cristais de gelo que perfuram
a célula ou a lesionam.
•
Fatores que influenciam:
• Idade da célula
• Temperatura
• Velocidade de congelamento e descongelamento
•
Processo demorado e de custo elevado.
•
Não indicado para biomoléculas sensíveis
à variações de temperatura.
•
Inviável em grande escala.
Rompimento não mecânico
Termólise
•
Elevação da temperatura da suspensão
celular.
•
Indicado para larga escala.
•
Amplamente utilizado para algas, fungos
filamentosos, leveduras e bactérias.
•
Gera fragmentos celulares relativamente
grandes, que são mais facilmente
removidos com filtração ou centrifugação.
Rompimento não mecânico
Termólise
•
Autólise de Kluyvermyces fragilis para liberação de inulinase intracelular.
•
Incubação a 50%, pH 5,0-6,0, por 12-14h
•
Proporciona liberação de 100%
• Produção de frutose pela hidrólise enzimática da inulina
• Produção de frutooligossacarideos: Prébiótico
Rompimento não mecânico
Álcalis
•
Utilizado quando a biomolécula for
estável a pH maior que 11
•
Método simples e barato, adequado para
larga escala.
•
Álcalis utilizados: Amônia e hidróxido de
sódio.
•
Inativam
patógenos
rompimento celular.
•
Desvantagem: Geração de poluentes
durante
o
Rompimento não mecânico
Álcalis
Extração de L-asparaginase de Erwinia carotovona
Aplicação na indústria
de alimentos e
farmacêutica
• Ajuste do pH para 11,5 por 30 min
• Redução do pH para 6,5 com ácido acético
• Centrifugação
Rompimento não mecânico
Lise enzimática
•
Enzimas hidrolisam a PC microbiana.
•
Adequado
para
biomoléculas
sensíveis à tensão de cisalhamento.
•
Deve-se considerar:
• Inibidores
• Possibilidade de
enzima
•
Pode sofrer influencia de:
• pH
• Temperatura
• Substrato
• Enzima
reciclo
da
Rompimento não mecânico
Lise enzimática
Modo de ação:
Quando parte da parede é rompida a pressão osmótica interna rompe a
MP, extravasando o conteúdo intracelular.
Rompimento não mecânico
Lise enzimática
Lisozima comercial
• Obtida da clara do ovo
• Eficiente para Gram positiva (ligações glicosídicas β- 1,4)
• Gram negativa necessita de pré-tratamento para desestabilizar a
membrana externa
Rompimento não mecânico
Lise enzimática
•
Vantagens:
• Fácil controle de pH e temperatura
• Alta especificidade para degradação
da parede celular
• Pode ser associada a outros métodos
• Desvantagem:
Alto preço da enzima
Rompimento não mecânico
Solventes
Invertase:
Catalisa a hidrólise da
sacarose em frutose e glicose
Produção de xarope invertido
Aplicação na indústria de
alimentos
•
Liberação de enzimas intracelulares
ou
localizadas
no
espaço
periplasmático
•
Invertase – Leveduras
•
•
•
Suspensão com 60% células
(massa úmida) a 40°C
Tolueno 0,1 M
Precipita a invertase
com
etanol 95% (v/v)
Rompimento não mecânico
Detergentes
Extração de colesterol oxidase presentes em células de Nocardia sp
em larga escala
Detecção de colesterol
• Triton 0,5%
Rompimento não mecânico
Detergentes
•
Dissociam proteínas e lipoproteínas das
paredes celulares, formando poros.
•
A célula pode ser totalmente rompida.
•
Detergentes utilizados:
• Lauril sulfato de sódio.
• Dodecil sulfato de sódio (SDS).
• Triton.
•
Desvantagens:
• Formam espuma.
• Desnaturam ou precipitam proteínas.
Purificação de baixa resolução
Precipitação
• Operação muito adotada em escala de laboratório e industrial
• Empregada nas etapas iniciais do processo de purificação
• Aplicado na purificação de proteínas
• A precipitação altera as propriedades químicas ou fisicas da molécula,
causando a formação de partículas insolúveis que podem ser
posteriormente recuperadas.
• É considerado um método de concentração, reduz o volume inicial.
• Viável quando a conformação da biomolécula não é alterada.
Rompimento não mecânico
Solventes
•
Utilizados
como
químicos das células.
•
Indicado para biomoléculas que não
sejam desnaturadas na presença do
solvente empregado.
•
Solventes utilizados:
• Etanol
• Metanol
• Tolueno
• Acetona
desidratantes
Purificação de baixa resolução
Precipitação
• Vantagens:
• Facilidade na operação
• Processo contínuo
• Equipamentos simples
• Agentes precipitantes possuem baixo custo
• Técnicas:
• 1° Solubilidade é reduzida por alteração no solvente, pela adição
de sais ou solventes orgânicos.
• 2° Diminiução da solubilidade por alteração da própria proteína,
com mudança de carga pela adição de ácidos e bases, ou
precipitantes catiônicos ou aniônicos, ou interações com íons
metálicos.
Purificação de baixa resolução
Salting-out
• Reduz o volume inicial e aumenta a concentração do bioproduto.
• Ocorre em concentrações salinas de 1,5 a 3,0 mol/L.
• Sais utilizados:
• Citrato de sódio
• Sulfato de sódio
• Sulfato de amônio
• Princípio:
• Reduz a disponibilidade de água, devido a hidratação dos íons
adicionados.
• Reduz a disponibilidade de moléculas de água que circundam as
zonas hidrofóbicas da superfície das proteínas.
• Precipitação por interação entre as zonas hidrofóbicas de
moléculas de proteínas.
Purificação de baixa resolução
Salting-out
• Aumento da temperatura pode favorecer a precipitação das proteínas,
porém aumenta o risco de desnaturação.
• Sulfato de amônio
• Ação estabilizante sobre a proteína.
• Pode promover estabilidade por anos.
• Protege contra proteólise e ação bacteriana.
• Desvantagens:
• Material corrosivo
• Difícil disposição final
• Em produtos alimentícios pode causar gosto
• São tóxicos em uso clínico, devem ser removidos.
Precipitação
Salting-out
• Larga escala é difícil reproduzir a mesma eficiência
• Controle de lotes deve ser rigoroso
• É difícil manter a homogeneidade do sistema
Ultrafiltração
Purificação de protéínas
Filtração em membranas com poros
de diâmetros de 0,001 a 0,1 µm,
sob pressão transmembrana;
Usado para concentrar proteínas ou
polissacarídeos.
Água e pequenas moléculas são
filtradas
Poros da membrana não são
uniformes.
O tamanho do poro deve ser 20%
menor que a molécula alvo
Resolução da técnica é baixa
Extração em sistema de duas fases
Ocorre em duas fases líquidas imiscíveis:
Fase aquosa e solvente
Aplicado em proteínas sensíveis à desnaturação
Molécula alvo e as impurezas são separadas pelas diferentes
solubilidades nas fases líquidas.
Aplicada de acordo com carga elétrica, hidrofobicidade e
massa molecular.
Purificação de proteínas e partículas de células
Extração em sistema de duas fases
Ocorre em duas fases líquidas imiscíveis:
Fase aquosa e solvente
Sistemas utilizados:
polietilenoglicol (PEG)/Dextrana (Dx)
polipropilenoglicol (PPG)/Sulfato de dextrana de sódio (PPG)
PEG/Fosfato de potássio
PEG/Sulfato de Magnésio
PEG/Citrato de sódio
Extração em sistema de duas fases
• Pode ser aplicado na
remoção de células e
fragmentos
• Podem reduzir o número de
operações unitárias do
processo, porque pode
clarificar o meio e fracionar
proteínas.
• Completa separação requer
de 5 a 30 min, dependendo
da concentração e massa
molecular do polímero
Extração em sistema de duas fases
Exemplo:
• Extração de amiloglicosidase
extracelular
produzida
por
Aspergillus awamori.
• Fases PEG/fosfato
• Maior parte dos contaminantes
foram extraídos na parte
superior
• Enzima permaneceu na fase
salina, totalmente recuperada.
Extração em sistema de duas fases
Vantagens:
• Possibilidade de operação contínua
temperatura ambiente.
em
larga escala à
• Manutenção de proteínas em solução em meio a polímeros ou
sais protegem da desnaturação.
• Possibilidade de eliminação de algumas etapas do processo de
purificação para moléculas intracelulares, devido à extração de
células e seus fragmentos simultaneamente ao fracionamento de
proteínas e outras moléculas.
Purificação de alta resolução: Cromatografia
• Solutos (Metabólitos celulares) presentes no
meio líquido são retidos em um leito de
material poroso, por adsorção (química ou
física) ou partição e removidos por uma fase
líquida móvel (eluente).
• Fase estacionária
pode ser polímeros
orgânicos sintéticos, sílica porosa ou
polímeros de carboidratos.
• A remoção ocorre pela passagem de um
eluente ou fase móvel por migração.
Purificação de alta resolução: Cromatografia
• Fase estacionária é empacotada em uma coluna
• Fase móvel é bombeada na fase estacionária
• O volume que passa pela coluna até o instante da saída da molécula é
o volume de retenção
Cromatografia
Processos Cromatográficos mais utilizados:
Gel de filtração ou exclusão
molecular:
Baseada na separação de
moléculas em função de seu
volume efetivo na solução.
Cromatografia de troca iônica:
Baseado na afinidade que
componentes de uma amostra
têm com sítios iônicos em uma
matriz sólida.
Cromatografia Exclusão Molecular
Moléculas sofrem partição
em virtude das diferenças de
tamanho das espécies.
Solução de proteínas flui por
gravidade ou auxílio de
bombas, por uma coluna
preenchidas por esferas
microscópicas, equilibrado
com tampão.
Moléculas menores
penetram em todos os
porors e movem-se
lentamente
Cromatografia Exclusão Molecular
• Método mais simples e suave
• Matrizes utilizadas nas colunas:
• Dextrana
• Agarose
• Poliacrilamida
• Sílica
• Devem ser considerados:
• pH
• Eluente compatível com o produto
• Seleção do gel com base na sua porosidade e compatibilidade
com o pH a ser adotado.
Cromatografia Troca iônica
Ocorre uma adsorção reversivel de
moléculas de solutos eletricamente
carregados a grupos com cargas opostas,
imobilizados em matriz sólida.
Os solutos adsorvidos são
subsequentemente eluídos aopós serem
trocados por outros íons com o mesmo
tipo de carga, porém com maior
afinidade pela fase estacionária.
Os diferentes graus de afinidade
eletrostática entre a fase estacionária e
os íons da fase móvel que regem esse
tipo de cromatografia
Cromatografia Troca iônica
Matrizes empregadas:
Materiais porosos, naturais
ou sintéticos, inerte,
insolúvel em água e
solventes orgânicos,
apresentando ligações
covalentes a grupos
trocadores iônicos
• Celulose
• Agarose
• Dextrana
• Poliacrilamida
Tratamentos finais
Liofilização
Remoção do solvente por
sublimação.
Material é congelado e
submetido à baixa pressão para
sublimação da água livre.
No congelamento a água é
transformada em gelo com alto
grau de pureza e os solutos são
concentrados.
Materiais liofilizados estão em
forma de pó e a atividade
biológica se mantem por maior
tempo.
Tratamentos finais
Cristalização
Agregação de cristais de moléculas presentes em soluções homogêneas
supersaturadas
Purificação de proteínas e enzimas
Devem ter elevado grau de pureza
Compostos cristalizados são estáveis