ROMPIMENTO CELULAR
1. Introdução
Os avanços das tecnologias de DNA recombinante e de
cultura de tecidos aumentaram a variedade de produtos
obtidos em grande escala.
Alguns produtos: interferons, antibióticos, vacinas (saúde)
enzimas (aplicações comerciais)
A maioria dos produtos da tecnologia do DNA recombinante
são produtos INTRACELULARES, sintetizados por organismos
procariotos e eucariotos.
Para o isolamento e a purificação destes produtos é necessário
um processo eficiente de ROMPIMENTO CELULAR
Normalmente tais processos são aplicados após a separação
e a lavagem das células, para eliminar resíduos de meio de
cultura.
Para células que possuem apenas MEMBRANA celular,
como células animais e hibridomas, o rompimento é
facilmente conseguido com baixa força de cisalhamento, e,
assim, requerem pouca energia para o rompimento.
Além disso, estas células podem ser rompidas por simples
variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes
ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade.
(Na realidade, manter a integridade de tais células durante o
processo já constitui um problema)
Porém, células que apresentam uma estrutura de
PAREDE celular polimérica, como as células microbianas, são
difíceis de se romper.
Várias técnicas de rompimento foram desenvolvidas para
a recuperação de proteínas intracelulares em escala de
laboratório, e vários destes métodos foram então ADAPTADOS
para uso em grande escala.
Após o rompimento celular obtém-se um homogeneizado
celular constituído por molécula alvo, biomoléculas
contaminantes e fragmentos celulares.
Métodos de Rompimento
Mecânicos
Homogeneização a alta pressão
Agitação em moinho de bolas
Ultrassom (?)
Não Mecânicos
Choque osmótico
Congelamento/descongelamento
Aquecimento
Secagem
Químicos
Álcalis
Solventes
Enzimáticos
Lise enzimática
Ácidos
Detergentes
Os mais empregados são Homogeneização a alta pressão
e Agitação em moinho de bolas.
Se o produto não for extremamente sensível ao calor* ou
à ação mecânica**, estes são os métodos a se considerar.
Atenção para os Critérios de escolha
Custo da operação unitária
Facilidade de aumento de escala
Possibilidade de dano ao produto/perda da atividade
biológica
Disponibilidade e custo do agente químico (sobretudo
enzima)
Tipo de organismo
Rendimento
Necessidade de controle de temperatura
Exemplo
Facilidade de aumento de escala
Bom!
Métodos químicos
Ruim!
Possibilidade de dano ao produto
?
Disponibilidade/custo do agente químico
As etapas até o término da fermentação (linha
ascendente) influenciam o rompimento, ou seja, a
susceptibilidade ao rompimento varia:
de um organismo para outro
Ex. C. utilis é mais difícil de romper que S. cereviseae
(tanto em alta pressão como em moinho de bolas)
com o estado fisiológico do organismo
Ex. - células crescidas em meio complexo são mais
resistentes que as crescidas em meio simples
- organismos recombinantes são mais facilmente
rompidos que os não recombinantes
- células crescidas em meio com limitação de nutrientes
ou condições desfavoráveis apresentam a parede celular
reforçada, dificultando o rompimento.
As etapas da linha descendente devem levar em
conta a remoção dos debris celulares, a contaminação do
produto com outras proteínas e a possível desnaturação do
produto.
debris: fragmentos de parede celular, organelas
celulares, ácidos nucléicos, etc.
2. Técnicas
Ultrassom
Um aparelho utiliza ondas sonoras de altíssima frequência
(~ 20 kHz), criando zonas de cavitação, isto é, áreas de
vácuo e compressão que se revezam; quando as bolhas de
colapsam são formadas as ondas de choque.
Não se deve aplicar este método a suspensões muito
concentradas de células (maiores que 108/mL).
Cerca de 170 W, a 20 kHz são aplicados em pulsos de
30ss, ou menos, com a suspensão mantida a 4 oC em gelo.
 É o método mais empregado para rompimento em
laboratório.
Choque osmótico
As células recolhidas são ressuspensas em solução
tamponada contendo 20% (m/v) de sacarose.
Após equilíbrio (~30 minutos) centrifuga-se novamente
e ressuspende-se o pellet em água pura a 4 oC.
Método inadequado para bactérias Gram positivas, pois
as mesmas apresentam alta pressão osmótica interna.
Mesmo não rompendo integralmente a célula, propicia
permeabilização seletiva, permitindo a saída da molécula
alvo.
Congelamento – Descongelamento
Consiste em se congelar e descongelar as células de forma
repetida, em velocidade e temperaturas adequadas. A
ruptura* total ou parcial da parede celular se dá pela ação
dos cristais de água formados.
* Possibilita a saída da molécula-alvo.
Os fatores de importância a se considerar são: tipo de
célula, sua idade, temperatura final de congelamento e
velocidades de congelamento e aquecimento.
 Método demorado e de difícil implantação em grande escala
 Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas
Termólise
Aquecimento da suspensão celular em banho
termostatizado, com injeção direta de vapor, tambor
rotativo ou em spray-drier.
 Mais adequado para rompimentos em larga escala,
devido à sua simplicidade.
 Amplamente empregado para o rompimento de algas,
fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à
produção de proteína microbiana.
Kluyveromyces fragilis inulinase 50 oC
Escherichia coli
enzima
90 oC
12-14 horas
15 min.
Lise enzimática
As enzimas são capazes de hidrolisar paredes celulares
de células microbianas.
Quando uma certa quantidade de parede é removida, a
pressão osmótica interna rompe a membrana
citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular
seja liberado para o meio externo.
As paredes celulares de leveduras possuem duas camadas
principias, sendo uma camada externa do complexo
proteina-manana e uma interna, de glucana.
O sistema enzimático para o seu rompimento é composto,
portanto, de diferentes enzimas como glucanases,
proteases e mananases.
Bactérias Gram negativas e Gram positivas apresentam
paredes celulares com composição diferentes, o que implica a
necessidade de enzimas diferenciadas no processo.
As principais enzimas bacteriolíticas são: glicosidases,
acetilmuramilalanina amidases, neuroaminidase, endopeptidades
e proteases.
As paredes celulares de leveduras são muito diferentes das
de bactérias, e, portanto, os sistemas líticos são específicos para
cada grupo particular de microrganismo.
Métodos enzimáticos de rompimento de células são
adequados para a recuperação de biomoléculas sensíveis à
tensão de cisalhamento ou pressão de trabalho, geradas pelos
métodos mecânicos.
Fatores que devem ser considerados:
- Presença de inibidores
- Possibilidade de reciclo da enzima

Vantagens:
Facilidade do controle de pH e temperatura, baixo
investimento de capital, alta especificidade e possibilidade
de associação com métodos mecânicos ou não mecânicos.

Desvantagens: alto custo das enzimas e variação da
eficiência da lise enzimática em função do estado
fisiológico do microrganismo.
Micrococcus lysodeikticus
lisozima
catalase
Rompimento químico (com álcali)
Adequado quando a biomolécula-alvo é estável em
pH maior que 11
Vantagens: O método é simples, de baixo custo e
de fácil ampliação de escala.
Desvantagem: geração de poluentes
Erwinia carotovora
pH 11,5 – 6,5
L-asparaginase
Homogeneização a alta pressão
Consiste da passagem forçada da suspensão celular (a
alta pressão) através de um orifício estreito seguida de
colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa
pressão. A queda instantânea da pressão associada ao
impacto provoca o efetivo rompimento celular sem
danificar proteínas.
Fatores importantes:
- tamanho das células (maior => rompimento mais fácil)
- pressão (maior => maior eficiência)
- número de passagens (múltiplas etapas aumenta o rendimento)
https://www.youtube.com/watch?v=44_V7awVUJE
-
Temperatura
Fase de crescimento do microrganismo
Tipo de célula
Concentração celular
Condições de cultivo
Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento,
que neste caso é de 1a ordem em relação ao número de
passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:
Rm
log
=
k . N . Pa
(Rm – R)
(1)
onde: Rm é a concentração máxima de proteina disponível
para ser liberada (g/L)
R é a concentração de proteina liberada (g/L)
k é a constante de velocidade que depende de T, X
e do tipo de célula
N é o número de passagens
P é a pressão
a é constante que depende do tipo de
microrganismo e das condições de crescimento
(varia de 0,86 a 2,9) (tabela)
Parâmetros típicos para a equação (1) para alguns microrganismos.
Microrganismo
a
S. cerevisiae
2,90
E. coli (fase estacionária)
1,71
E. coli (fase exponencial)
0,64
E. coli (células contendo corpos de inclusão)
1,65
A. eutrophus
1,70
- A energia é dissipada como calor, logo o controle de
temperatura é fator muito importante
- Existem equipamentos (sistema tipo válvula) para escala
de produção de até 4500 L/h a 70 MPa
Leveduras rompidas em homogeneizador de alta pressão
Agitação em moinho de bolas
Consiste em passar a suspensão de células por uma
câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de
um eixo com discos de agitação e preenchida com pérolas
de vidro. Operação contínua ou descontínua.
O rompimento neste caso pode ser descrito como um
processo de primeira ordem:
ln (1 – R) = - k . t
onde:
- k é uma constante que depende de
parâmetros operacionais como velocidade de agitação e
desenho da câmara, carga de pérolas, tamanho das pérolas
e concentração celular.
- t é o tempo de batelada
Para processo contínuo, tem-se:
1
(1 – R)
= 1 +
k.t
j
j
onde:
t é o tempo médio de residência (volume
total dividido pela vazão, V/Q)
j é o número de câmaras em série (valor
obtido experimentalmente)
Controle de temperatura é fator muito importante
Cisalhamento pode inativar enzimas
Existem equipamentos com câmaras de até 250 L,
podendo-se operar com vazões de até 2000 L/h
Moinho de bolas
•
Originalmente
desenvolvidos
para
reduzir partículas de pigmentos para
indústrias de tintas.
•
Foram
realizados
rompimento
celular
filamentosos
•
Projetou-se
novos
equipamentos
adaptados para rompimento celular de
fungo
filamentosos,
leveduras
e
microalgas
testes
de
para
fungos
Moinho de bolas
•
Câmara cilíndrica fechada, vertical ou horizontal .
•
Possui sistema de refrigeração e um eixo que gira em alta rotação
•
Internamente existe esferas de vidro e um ou mais discos ou hastes que
giram em alta velocidade.
•
Rompimento ocorre pela força de cisalhamento
Moinho de bolas
•
Eficiência do processo depende de:
•
Geometria da câmara de rompimento
(Horizontais)
•
Velocidade
microrganismo)
•
Tipo do agitador
•
Tamanho e composição das esferas
(vidro, inox e cerâmica)
•
Carga de esferas (80-85% câmara
horizontal e 50-60% câmara vertical)
(depende
do
Moinho de bolas
•
Eficiência do processo depende de:
•
Concentração celular (30 a 50%
v/v)
•
Velocidade
da
alimentação
(depende da velocidade do
agitador, da carga de esferas, da
geometria do equipamento e das
propriedades do microorganismo)
•
Temperatura (Controlada entre 5
e 15°C)
Moinho de bolas
• No aumento de escala conservar:
• Tamanho das esferas.
• Proporção entre volume da suspensão celular e das esferas.
• Velocidade de rotação do eixo ou velocidade periférica das pás do
agitador.
https://www.youtube.com/watch?v=hSgpx9KWiwU
https://www.youtube.com/watch?v=O2-gg0C2Asw
Avaliação do processo
Objetivo: maior rendimento possível da biomoléculaalvo em sua forma ativa
Empregar método específico para dosagem
Pode-se também dosar a viabilidade celular
antes e depois do rompimento
ESQUEMA SIMPLIFICADO DE DIFERENTES
ENVOLTÓRIOS CELULARES
Bactéria Gram (+)
Peptidoglicano
Membrana
citoplasmática
Bactéria Gram ( - )
Membrana externa
Peptidoglicano
Membrana
citoplasmática
Leveduras
Fungos
Manana com pontes de
fosfodiéster
Glicano com proteina
Membrana
citoplasmática
Alfa e beta-glicanos
Camada glicoproteica
Quitina/microfibrilas
Membrana
citoplasmática
HOMOGENEIZADOR DE ALTA PRESSÃO
Corpo fixo
Suspensão
de células
pressão
Anel de impacto
ESQUEMA DE UM HOMOGENEIZADOR A ALTA PRESSÃO