CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE
GOIÁS
ÁREA DE QUÍMICA
ESTUDO DO USO DE FIBRAS
SILICÁTICAS DE AMIANTO (CRISOTILA 5S)
COMO SUPORTE DE CRESCIMENTO DO
FUNGO Ganoderma apllanatum
por
JOSELY BATISTA RABELO
GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA QUÍMICA
AGROINDUSTRIAL
GOIÂNIA - GO
2007
CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE
GOIÁS
ÁREA DE QUÍMICA
ESTUDO DO USO DE FIBRAS
SILICÁTICAS DE AMIANTO (CRISOTILA 5S)
COMO SUPORTE DE CRESCIMENTO DO
FUNGO Ganoderma apllanatum
por
JOSELY BATISTA RABELO
GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA QUÍMICA
AGROINDUSTRIAL
GOIÂNIA - GO
2007
FICHA CATALOGRÁFICA
BATISTA RABELO, JOSELY
Estudo do Uso de Fibras Silicáticas de Amianto (Crisotila 5S) como Suporte de Crescimento
do Fungo Ganoderma applanatum.
[Goiânia, Goiás] 2007, 64p.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado no CEFET-GO/Área de Química para a
obtenção do grau Tecnólogo em Química Agroindustrial.
1. Estudo
2. Fibras Silicáticas
3. Crisotila 5S
I. Química/ CEFET-GO
4. Suporte
5. Crescimento do Fungo
6. Ganoderma applanatum
II. Título
CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE GOIÁS
ÁREA DE QUÍMICA
ESTUDO DO USO DE FIBRAS SILICÁTICAS DE
AMIANTO (CRISOTILA 5S) COMO SUPORTE DE
CRESCIMENTO DO FUNGO Ganoderma
apllanatum
POR
JOSELY BATISTA RABELO
Monografia de Trabalho de Conclusão de Curso submetida à Banca Examinadora
designada pelo Colegiado do Curso de Graduação em Tecnologia em Química
Agroindustrial como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Tecnólogo
em Química Agroindustrial.
Banca Examinadora:
___________________________________________________
Profº. Msc. Paulo de Tarso Ferreira Sales
Orientador
___________________________________________________
Profº. Dr. Fernando Schimidt
Co-Orientador
___________________________________________________
Profª. Drª. Warde A. de Fonseca-Zang
Examinadora
____________________________________________________
Profª. Maria Margareth Gonçalves Lopes
Examinadora
Goiânia, 19 de Novembro de 2007.
Aos meus pais, Jorivê e Sueli, um
agradecimento muito especial
pelo carinho, disposição, apoio
em toda a trajetória e pela eterna
confiança em minhas escolhas.
Aos meus irmãos, Josuênio e
Jocelane, pelos momentos de
felicidade.
“Pessoas sábias falam sobre idéias;
Pessoas comuns falam sobre coisas;
Pessoas medíocres
pessoas.”
falam
sobre
Dick Corrigan
AGRADECIMENTOS
Todos nós precisamos acreditar que algo só é possível se é feito com amor,
dedicação e força de espírito. Essas forças vêm de muitas fontes. E é a elas que este trabalho é
inteiramente dedicado.
Em primeiro lugar ao apoio do Orientador Prof. Msc. Paulo de Tarso, pela
orientação deste trabalho com tanta competência e estímulo e também ao apoio do CoOrientador Profº. Dr. Fernando Schimidt.
Aos professores, Drª. Warde A. da Fonseca-Zang e Profª. Maria Margareth por
terem aceitado analisar meu trabalho.
Ao Alessandro da Faculdade de Engenharia Civil da UFG pela disponibilidade de
meios físicos e técnicos indispensáveis à elaboração deste trabalho.
Á professora, Drª. Mariângela Fontes Santiago pela disponibilidade do laboratório
de Enzimologia da Faculdade de Farmácia.
Ao Sr. Hélio Helio Elias da Silva por ter cedido a crisotila 5S, o que possibilitou a
realização desse trabalho.
Agradeço a meus amados pais, Jorivê e Sueli, um casal fantástico que tem me
fornecido muito carinho, compreensão e apoio para que eu busque minha felicidade. Por mais
que eu procure por belas palavras para expressar toda minha admiração e amor, não seriam
suficientes para agradecerem por terem me ensinado, muito bem, a viver. Aos senhores, meus
votos de agradecimento por todo acompanhamento durante essa trajetória. São meus bens
mais preciosos, juntamente com meus irmãos, Jocelane e Josuênio, a quem também dedico
este momento de realização, reconhecendo nossa união, mútuo respeito e compreensão.
Também, à minha cunhada Simone e ao meu sobrinho Josuênio Júnior. Dedico, ainda, um
agradecimento especial a todos de minha grande família.
Ao meu namorado, Lucas, pelo carinho, apoio e compreensão nas horas em que o
privei da minha companhia.
Aos meus amigos que estiveram sempre ao meu lado para amparar, incentivar
com suas palavras, suas contribuições com minhas dificuldades e com minhas angústias.
Á equipe de meu trabalho, Bioquímica, que me apoiaram nesta fase de minha
vida.
Enfim, a todos aqueles que de algum modo estão nas entrelinhas dessa pesquisa,
que fizeram e fazem parte de meus projetos, registro o eterno agradecimento pela
compreensão e pelo amor dedicado.
A todos vocês, muito obrigada!
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS --------------------------------------------------------------------------------- i
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS---------------------------------------------------------- ii
LISTA DE FIGURAS-----------------------------------------------------------------------------------iii
LISTA DE TABELAS E QUADROS----------------------------------------------------------------iv
RESUMO ------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------- 13
INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------------------- 14
2. EMBASAMENTO TEÓRICO-------------------------------------------------------------------- 16
2.1 Amianto -------------------------------------------------------------------------------------------- 16
2.1.1 Fibras Silicáticas do Amianto Crisotila-------------------------------------------------- 18
2.2 Os corantes: definição, causa da cor e classificação. ---------------------------------------- 20
2.2.1 Os azo corantes ------------------------------------------------------------------------------ 21
2.2.1.1 Corante Food Blue nº. 1 -------------------------------------------------------------- 23
2.3 Fungos Basidiomicetos Ligninolíticos--------------------------------------------------------- 24
2.3.1 Fungo Ganoderma applanatum ----------------------------------------------------------- 27
2.4 Enzimas Lignolíticas ----------------------------------------------------------------------------- 28
2.4.1 Lacase----------------------------------------------------------------------------------------- 29
2.4.2 Lignina Peroxidase-------------------------------------------------------------------------- 33
2.4.3 A Manganês peroxidase -------------------------------------------------------------------- 34
3. PARTE EXPERIMENTAL ----------------------------------------------------------------------- 37
3.1 Preparações das soluções das amostras de corante ------------------------------------------ 37
3.2 Microrganismo ------------------------------------------------------------------------------------ 37
3.3 Preparações da Fibra Silicática – Crisotila 5S------------------------------------------------ 37
3.4 Meio de cultura------------------------------------------------------------------------------------ 38
3.4.1-Meio ágar batata (BGA) ------------------------------------------------------------------- 38
3.4.- Condições de crescimento da cultura----------------------------------------------------- 38
3.5-Equipamentos e Métodos Analíticos usados ------------------------------------------------- 38
3.5.1 Métodos para Determinação das Atividades Enzimáticas Antes e Após O
Tratamento das soluções com Fungo.----------------------------------------------------------- 39
3.6 Realização dos tratamentos---------------------------------------------------------------------- 40
3.7 Preparação e manutenção das Amostras------------------------------------------------------- 40
3.8 Espectros no UV-vis ----------------------------------------------------------------------------- 40
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO------------------------------------------------------------------ 42
4.1 Tratamento das Soluções em estudo ----------------------------------------------------------- 42
CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ------------------------------------------------ 53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------------------- 54
ANEXO 1 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 62
i
LISTA DE SÍMBOLOS
Kg
Kilograma
t
Tonelada
m2/g
Área superficial específica
mV
Milivolt
mm
Milímetro
µmol
Micromol
kDa
Kilodalton
g.L-1
Massa/ Volume = Concentração
ºC
Grau Celsius
g
Grama
mL
Mililitro
cm
Centímetro
nm
Nanômetro
ε
Coeficiente de absortividade molar
min
Minuto
µL
Microlitros
h
Hora
rpm
Rotações por minuto
µm
Micrômetro
ii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
pH
Potencial de Hidrogênio
FAO
Food and Agriculture Organization
WHO
World Health Organization
FD&C
Food, Drug ; Cosmetic
C.I.
Color Index
LD
Lethal Dose (Dose Letal)
DNA
Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico)
LiP
Lignina-Peroxidase
WRF
White Rot Fungi (Fungo de Decomposição Branca)
MnP
Manganês Peroxidase ou Peroxidase dependente do manganês
EPR
Electron Paramagnetic Resonance (Ressonância Paramagnética do
Elétron)
ABTS
2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) [Ácido 2,2azino-bis-(3-etilbenzotiazol-6-sulfônico)]
AV
Acetovanilona
AS
Acetoseringona
HBT
N-hydroxybenzotriazole (N-hidroxibenzotriazol)
IBAMA
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis.
BGA
Billiant Green Agar (Ágar Verde Brilhante)
DQO
Demanda Química de Oxigênio
COD
Chemical Oxygen Demand (Demanda Química de Oxigênio)
PMS
Produtos Microbianos Solúveis
UV-vis
Ultravioleta visível
OMW
Olive Mill Wastewater (Efluente de Indústria de Azeite de Oliva)
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura da Crisotila ------------------------------------------------------------------------19
Figura 2 – Fibras no interior da rocha serpentinito -------------------------------------------------19
Figura 3: Fórmula estrutural do corante Food Blue nº. 1 ------------------------------------------23
Figura 4: Fungo Ganoderma Applanatum -----------------------------------------------------------27
Figura 5: Ciclo catalítico da lacase --------------------------------------------------------------------31
Figura 6: Ciclo catalítico da lignina peroxidase -----------------------------------------------------34
Figura 7: Ciclo catalítico da manganês peroxidase -------------------------------------------------36
Figura 8: Fungo G. applanatum crescido em meio de cultura sólido, com adição de corante
food blue nº 1 (a) 1 dia após a inoculação, (b) 12 dias após inoculação e (c) 16 dias após
inoculação.------------------------------------------------------------------------------------------------37
Figura 9: Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,032 g.L -1 sem crisotila,
(b) concentração de 0,032 g.L -1 com crisotila ------------------------------------------------------43
Figura 10: Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,062 g.L -1 sem
crisotila, (b) concentração de 0,062 g.L -1 com crisotila -------------------------------------------44
Figura 11: Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,125 g.L -1 sem
crisotila, (b) concentração de 0,062 g.L -1 com crisotila -------------------------------------------45
Figura 12: Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,250 g.L -1 sem
crisotila, (b) concentração de 0,062 g.L -1 com crisotila -------------------------------------------46
Figura 13: Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,500 g.L -1 sem
crisotila, (b) concentração de 0,062 g.L -1 com crisotila -------------------------------------------48
Figura 14: Determinação da atividade de lignina-peroxidase dos caldos filtrados da amostra,
em pH 3,0 e álcool veratrílico como substrato, em 310nm ----------------------------------------49
Figura 15: Relação entre a DQO final e a DQO inicial --------------------------------------------50
Figura 16: Variação do pH durante o tratamento das soluções com corante azul brilhante sem
o uso da crisotila e com o uso da crisotila ------------------------------------------------------------51
iv
LISTA DE TABELAS E QUADROS
TABELAS
Tabela 1: Propriedades físico-químicas e toxicológicas do azo corante Food Blue ------------24
Tabela 2: Características das enzimas lignolíticas --------------------------------------------------28
QUADRO
Quadro 1: Característica e tipos de análises realizadas ---------------------------------------------38
12
RESUMO
O presente projeto teve como objetivo geral estudar a interferência das fibras silicáticas de
amianto (Crisotila 5S) como suporte de cultura dos fungos, tendo como parâmetros de
determinações as atividades enzimáticas de Lacase, Lignina Peroxidase e Manganês
Peroxidase como produtos microbianos e a descoloração do corante Food Blue nº. 1 por meio
da espectrofotometria do visível. Foi utilizado o microorganismo Ganoderma applanatum,
soluções de corante azul brilhante nº. 1, apresentados nas concentrações de 0,031; 0,062;
0,125; 0,250 e 0,500 g.L-1 e a crisotila 1,000g. O tratamento biológico foi efetuado em uma
mesa agitadora refrigerada (New Brunswick Scientific) à temperatura de 28º C e 180 rpm na
ausência de luz, sendo que foram colocados 100,00 mL de efluente em um erlenmeyer de 250
mL e acrescentado os conteúdos das placas (meio de cultura + fungo) e a crisotila. Após o
tratamento de 24, 48, 72 e 96 h, a solução em estudo foi filtrada em papel de filtro Whatman
1,3 mm e o caldo filtrado foi guardado sob refrigeração. Todas as amostras foram filtradas
posteriormente em membrana Millipore® 0,45 µm e imediatamente refrigeradas a 4º C. Para
as medições enzimáticas, as amostras foram centrifugadas durante 20 min a 8000 rpm e
ambas identificadas por espectros UV-vis. Foi observado pelas varreduras no UV-Vis que
para concentrações como 0,125 g.L-1 notou-se a degradação do corante pelo fungo e a
adsorção da crisotila nas paredes do fungo, havendo a produção de biocompostos fúngicos.
Um fator é a produção de lignina peroxidase que foi determinada em 310 nm e a maior
produção desta enzima se deu em 96 h de tratamento, com as concentrações de 0,500 g.L-1,
com as soluções de com e sem o uso da crisotila, o que indica que o fator predominante para a
síntese enzimática de lignina peroxidase é a concentração do substrato, que tem como fonte de
nitrogênio o próprio corante. Não foi detectada lacase a 525 nm, usando-se a seringaldazina
como substrato. Como o comprimento de onda do produto da oxidação do vermelho de fenol
(610 nm) ser muito próximo ao comprimento de onda máximo do corante, bem como à alta
absorbância das soluções do corante azul brilhante, não foi possível medir a atividade
enzimática, mesmo diluindo-se a amostra, pois em concentrações mais baixas dessa enzima,
mostrou-se indetectável. Portanto, neste trabalho, o uso de crisotila como suporte para
crescimento de fungos em meio líquido, aumentou significativamente a produção enzimática
de lignina peroxidase, concomitante com a diminuição da absorbância em 630 nm, indicando
boas perspectivas no processo degradativo desse corante, utilizando-se a biorremediação e a
crisotila como suporte do microrganismo.
Palavras-chave: Crisotila 5S; corante azul brilhante nº. 1; fungo Ganoderma applanatum.
13
ABSTRACT
This paper intended to assess the main objective to study the interference of silicatics asbestos
fibers (Chrysotile 5S) as support of culture of the fungi, having as determination parameter
the enzymatic activity of Laccase, Lignine Peroxidase and Manganese Peroxidase as
microbial products and discolouration of the dyes Food Blue nº 1 through the visible
spectrophotometry. It was used the microorganism Ganoderma applanatum, solutions of dyes
presented in the concentrations of 0,031; 0,062; 0,125; 0,250 and 0,500 g.L-1 and chrysotile
1,000g. The biologic process was done with the use of a Shaker (New Brunswick Scientific)
at 28ºC and 180 rpm in the absence of light. It contained a 250mL-Erlenmeyer filled with
100mL of the effluent and the contents of the dishes (culture medium + fungi). and chrysotile.
After the treatment of 24, 48, 72 and 96 h, the solution in study were filtered in paper of filter
Whatman 1,3 mm and the filtered broth was kept under refrigeration. All the samples had
been filtered later in membrane Millipore® 0,45 µm and immediately cooled 4º C. For the
enzymatic measurements, the samples had been centrifuged during 20 min the 8000 rpm and
both identified by UV-vile specters. It was observed by the sweepings in UV-Vis that stops
concentrations as 0,125 g.L-1 noticed it degradation of the dye for fungi and the adsorption of
chrysotile in the walls of fungi, having the production of fungal biocompounds. A factor is the
production of lignine peroxidase that was determined in 310 nm and the highest production of
this enzyme was in 96 h of treatment, with the 0,500 g L-1concentrations, with the solutions of
with and without the use of chrysotile, which indicates that the predominant factor for the
enzymatic synthesis of lignine peroxidase is the concentration of the substrate, that has as
nitrogen source the proper dye. Laccase was not detected in 525 nm, using seringaldazina it as
substrate. As the wave length of the product of the oxidation of the phenol red (610 nm) to be
very next to the maximum wave length to the dye, as well as the high a absorbance of the
solutions of the shining blue dye, was not possible to measure the enzymatic activity, exactly
dissolving it sample, therefore in lower concentrations of this enzyme, it revealed
indetectável. Therefore, in our study, the use of chrysotile as support for growth of fungi in
half liquid, significantly increased the enzymatic production of lignin peroxidase, concomitant
with the reduction of the absorbance in 630 nm, indicating good perspectives in the
degradative process of this dye, using itself it biorremediation and chrysotile as support of
microorganisms.
Key words: Chrysotile; Food Blue nº 1 dye; Fungi Ganoderma applanatum.
14
INTRODUÇÃO
A Química é um importante instrumento para o desenvolvimento sócioeconômico de um país e partindo desse pressuposto, a síntese de novos produtos que
atendessem à demanda industrial foi incrementada a fim de atender às necessidades da
indústria moderna. Mas com a industrialização, a geração de rejeitos tomou outra conotação
no meio ambiente, pois, por exemplo, para a indústria farmacêutica especializada em síntese
orgânica para produzir 1 kg produto final, gera-se de 25 a 100 kg de lixo químico (CORREIA;
COSTA; FERREIRA, 2002).
Com a evolução dos processos industriais e o conseqüente surgimento de
inúmeros produtos que rapidamente tornaram-se de primeira necessidade, a atividade
industrial adquiriu um caráter essencial na sociedade contemporânea. Embora sua importância
seja indiscutível, a atividade industrial costuma ser responsabilizada, muitas vezes com justa
razão, pelo fenômeno de contaminação ambiental, principalmente graças a dois fatores de
extrema importância: o acúmulo de matérias-primas e insumos, que envolve sérios riscos de
contaminação por transporte e disposição inadequada e ineficiência dos processos de
conversão, o que necessariamente implica na geração de resíduos (FREIRE et al., 2000).
Embora exista a preocupação universal em se evitar episódios de contaminação
ambiental, esses eventos prejudiciais continuam acontecendo, principalmente porque, em
função dos fatores acima comentados, grande parte dos processos produtivos são
intrinsecamente poluentes. Ao longo das décadas, a atividade industrial tem produzido rejeitos
gasosos, líquidos e sólidos nocivos ao meio ambiente (FREIRE et al., 2000).
Por outro lado, existe uma pesquisa global mundial para métodos alternativos na
produção de energia por fontes renováveis. O Brasil é pioneiro na produção em larga escala
de combustível etanol através da fermentação do melaço de cana-de-açúcar por leveduras.
Entretanto, 30% das indústrias substituíram a produção em batelada por processos de
fermentação contínuos porque isto apresentou diversas vantagens. Para melhorar a
produtividade e o rendimento do etanol e para evitar a utilização das centrífugas, que são
processos caros, contínuos com células imobilizadas nos diferentes suportes como vidro,
polímeros sintéticos como poliacrilamida, gels de polipropileno têm sido sugerido, embora
alguns portadores apresentassem dificuldades em escala industrial (MONTE ALEGRE;
RIGO; JOEKES, 2003).
A produção industrial brasileira de etanol é aproximadamente 12 bilhões de litros
por ano, usando a cana-de-açúcar como matéria-prima. Melhorias de processos têm sido feitos
15
nos últimos anos, principalmente relacionados à seleção da tensão. Entretanto, mesmo hoje
em dia a produção atual é baseada em batelada ou em processos semi-contínuos (CASSIOLA,
et al., 2001).
Nas pesquisas tem sido mostrado que Saccharomyces Cerevisiae suportada em
crisotila tem um aumento de 130% na velocidade de fermentação e que o rendimento de
etanol pode ser tanto quanto 26% mais elevado do que para células livres. Então este sistema
poderia ser usado em um processo de fermentação contínuo (CASSIOLA, et al., 2001).
A crisotila é um silicato fibroso de magnésio abundante no Brasil. Os minérios
neste país não são contaminados por formas perigosas do asbesto como crocidolita, tremolita
e amosita1. A interação entre a crisotila e materiais biológicos podem ser utilizados desde que
tenham conhecimento que estas fibras podem causar doenças de pulmão. Entre todos os
materiais naturais do asbesto que incluem os anfibólios crocidolita, o tremolita, o amosita, o
antofilita e o actinolita, e as serpentinas antigorita, picrolita e crisotila, o câncer de pulmão é
associado com crocidolita (asbesto azul), tremolita e amosita (asbesto marrom), visto que as
outras fibras variam no grau de perigo na saúde. Crisotila é menos biopersistente que os
anfibólios (CASSIOLA, et al., 2001).
O presente projeto visa o estudo da interferência das fibras silicáticas de amianto
(Crisotila 5S) como suporte de cultura dos fungos, tendo como parâmetros de determinações
as atividades enzimáticas de Lacase, Lignina Peroxidase e Manganês Peroxidase como
produtos microbianos e a descoloração do corante Food Blue nº. 1 por meio da
espectrofotometria do visível.
1
Crocidolita, tremolita e amosita – Minerais fibrosos do grupo dos anfibólios (MENDES, 2001).
16
2. EMBASAMENTO TEÓRICO
2.1 Amianto
Com o desenvolvimento da mineração de amianto em Goiás, a produção nacional
passou de 2.145 t/ano em 1965 para a auto-suficiência em 1985, com 165.062 t/ano,
respondendo este estado com 99% da produção. Atualmente, a produção gira em torno de
200.000 t/ano de fibra de amianto, extraída totalmente na mina situada no Município de
Minaçu no Estado de Goiás. A mina de Cana Brava é a céu aberto, possui uma capacidade
instalada de 240 mil toneladas/ano de fibra tratada, com recuperação de aproximadamente
88% das fibras no processo de tratamento. A extração e o beneficiamento é todo mecanizado,
sendo produzidos quase todos os tipos de fibras. O Brasil é o quarto maior produtor mundial
de amianto, exportando cerca de 30% de sua produção (FERRACIOLI, 2001).
Amianto é a denominação dada a silicatos fibrosos abundantemente encontrados na
natureza. Existem cerca de trinta minerais que se enquadram nessa terminologia, porém,
comercialmente são explorados atualmente as variedades crisotila (amianto branco), que
corresponde a 97% do consumo mundial, seguida da amosita (amianto marrom), e da
crosidalita (amianto azul) (FERRACIOLI, 2001).
Asbesto e amianto são nomes comerciais de um grupo heterogêneo de minerais
facilmente separáveis em fibras. Apresentando composições químicas e cristalográficas
diversas, essas fibras têm usos e classificações comerciais que variam muito de um mineral
para outro. Listam-se mais de 350 minerais com estrutura fibrosa, encontrados como minerais
essenciais ou acessórios nas rochas magmáticas e metamórficas (MENDES, 2001).
Os amiantos ou asbestos pertencem a dois grupos de minerais: a crisotila (asbesto
branco), representando a variedade fibrosa do grupo das serpentinas, e os minerais fibrosos do
grupo dos anfibólios: crocidolita (asbesto azul), amosita (asbesto marrom), antofilita,
actinolita e tremolita. A distinção que se faz entre eles é que as fibras da crisotila são sedosas
e crespas, já os anfibólios possuem fibras retas e cilíndricas (MENDES, 2001).
A produção mundial de asbesto é atualmente representada, em mais de 98%, pela
variedade crisotila, a qual, no Brasil, representa 100% do amianto atualmente minerado. Entre
1964 e 1973, a produção mundial de asbesto aumentou cerca de 50%, tendo alcançado o pico
de cinco milhões de toneladas/ano em meados da década de 70. Desde então passou a cair, até
atingir um nível estimado hoje na ordem de 2,6 milhões de toneladas/ano. O declínio que
permanece e propende a acentuar-se está diretamente associado à cronologia das crescentes
17
restrições de extração e importação do amianto, que tendem a ampliar-se, no mundo em
função de sua nocividade (MENDES, 2001).
As características físico-químicas peculiares do amianto são: elevada resistência
mecânica à abrasão, flexibilidade, insulação térmica e elétrica, alta tensão à tração, resistência
a ácidos e aos álcalis, fiabilidade e elevado poder filtrante (FERRACIOLI, 2001).
O Estado de Goiás detém quase 100% das reservas nacionais de amianto crisotila.
Existem ainda inúmeros depósitos de amianto do tipo anfibólios, predominantemente da
variedade antofilita. O crescimento nas reservas em Goiás foi conseqüência de reavaliações
ocorridas em 1992 e 1997, na mina de Cana Brava, no município de Minaçu. Esta é a única
mina em operação no País atualmente, o teor de fibra contida no minério é em média de 6%.
Considerando-se apenas as reservas da mina de Cana Brava, nos atuais níveis de produção, a
mesma pode ser explorada por mais de 70 anos. As fibras são agrupadas em dois tipos, cross e
slip. As fibras têm brilho sedoso, o comprimento é variável, indo de um a quarenta
milímetros, com média em torno de seis milímetros (FERRACIOLI, 2001).
A produção comercial de amianto no Brasil teve início em 1938, no Estado da Bahia,
indo até 1967, com a exaustão da mina, através da empresa SAMA – Mineração de Amianto
Ltda. A partir desta data, a empresa intensificou investimentos no Estado de Goiás, onde
foram descobertas as atuais jazidas, por volta de 1962. Ocorreu produção em pequena escala
nos Estados de Alagoas, Minas Gerais, Piauí e São Paulo, até 1995 (FERRACIOLI, 2001).
Embora não exista nenhuma determinação quanto ao banimento do amianto no Brasil,
alguns Estados e Municípios o estão adotando sem nenhum critério, proibindo o seu uso como
também dos produtos que o contenham, o que pode comprometer o nível de atividade da
indústria do amianto, conforme o ímpeto ecológico da época. Existe uma confusão entre os
defensores do banimento do amianto, onde consideram o amianto crisotila com o mesmo
nível de periculosidade que os anfibólios, este sim, com risco à saúde humana, sendo seu uso
proibido no Brasil pela Lei n° 9.055. O potencial de risco que a crisotila tem é muito menor
que os dos anfibólios, mesmo assim, a Lei regulamenta da extração ao produto acabado, o que
permite que o amianto seja utilizado sem provocar riscos à saúde dos trabalhadores e do
consumidor final (FERRACIOLI, 2001).
Conforme a Lei n° 9.055 de 01/06/1995 Disciplina a extração, industrialização,
utilização, comercialização e transporte do asbesto/amianto e dos produtos que o
contenham, bem como das fibras naturais e artificiais, de qualquer origem, utilizadas
para o mesmo fim e dá outras providências (MENDES, 2004), conforme anexo 1.
18
2.1.1 Fibras Silicáticas do Amianto Crisotila
Crisotila é um mineral constituído de silicato de magnésio de hábito fibroso
abundante no Brasil e pode ser usado como suporte mineral para células de levedura em
fermentação alcoólica com células imobilizadas (MONTE ALEGRE; RIGO; JOEKES, 2003).
A crisotila apresenta-se na forma de fibras flexíveis, finas e sedosas. Resiste ao
calor e caracteriza-se por ser facilmente tecida. Um quilograma de fibra pode produzir até 20
mil metros de fio. Dos cerca de quarenta países que têm reservas naturais de crisotila, 25
extraem-na e cerca de sete são atualmente responsáveis por cerca de 95% da produção
mundial: Canadá (Quebec, British Columbia e Newfoundland), Rússia (Montes Urais), Brasil
(Canabrava, Goiás), Casaquistão, China (Província de Szchwan), Zimbábue e África do Sul
(MENDES, 2001).
No Brasil – quinto produtor mundial de crisotila – há jazidas de amianto (crisotila
e anfibólios) nos estados de Goiás, Minas Gerais, Bahia e Piauí. A primeira mineração de
asbesto/crisotila no país, utilizando técnicas modernas, foi desenvolvida pela SAMA – S.A.
Mineração de Amianto, na Mina de São Félix, no Município de Poções, na Bahia, a partir de
1940, permanecendo ativa até 1967, quando suas reservas se esgotaram. Atualmente, a
totalidade do amianto crisotila é minerada e processada na Mina de Cana Brava, em Minaçu,
Goiás (MENDES, 2001).
A Crisotila tem uma capacidade excepcional para imobilizar células de leveduras
por adsorção, com algumas vantagens quando comparados com alguns suportes (TiCl4 ou
aminopropiltrietóxilase), como tem uma excelente estabilidade que permite seu uso por um
longo período e também o reuso, resistência por tratamentos térmicos, suporta as condições
operacionais da fermentação alcoólica e é mais barato, mas a vantagem principal deste
mineral é a estimulação da produção de etanol através de leveduras, aumentando a
produtividade específica dos processos (MONTE ALEGRE; RIGO; JOEKES, 2003).
Estruturalmente, apresenta a célula unitária [Mg3 Si2 O5 (OH)4] com uma estrutura
única e altamente organizada, constituída de bicamadas de brucita Mg(OH)2 e silicato (SiO2),
enroladas coaxialmente, as quais formam uma fibrila (Figura 1). As fibras de crisotila são
constituídas naturalmente por fibrilas cilíndricas agrupadas paralelamente e preenchidas por
material não cristalino. Apresenta uma área superficial específica após tratada e ativada, de 14
m2/g. Apresenta potencial zeta positivo entre pH 3 e 12 da ordem de 100 mV e ponto
isoelétrico em pH 11,8. A superfície da crisotila é constituída por grande massa de sítios
doadores, Mg(OH)2, possuindo atividade catalítica (WENDHAUSEN, 2005).
19
Figura 1 - Estrutura da crisotila (WENDHAUSEN, 1998).
A fórmula química é [Mg3 Si2 O5 (OH)4] , apresentando a forma de um silicato
lamelar (JESUS, 1998; WENDHAUSEN, 1998). A estrutura consiste de bicamadas de sílica
tetraédrica (tridimita) com bicamadas de hidróxido de magnésio (brucita) enroladas
coaxialmente as quais formam uma fibrila. Ocorre na forma de veios compactos de fibras no
interior da rocha serpentinito (Figura 2). As fibras geralmente estão dispostas
perpendicularmente às paredes dos veios, com comprimento de 1 a 25 mm ou,
excepcionalmente, maior.
Figura 2 – Fibras no interior da rocha serpentinito.
Fonte: http://www.sama.com.br/amianto/apreset.htm
20
A crisotila apresenta-se como suporte, pois tem um excepcional poder de
adsorção; não é combustível, é um excelente isolante térmico, possui resistência mecânica
superior à do aço, é resistente ao ataque de microrganismos, tem grande durabilidade e
flexibilidade. É uma substância natural, disponível em abundância e com alto grau de pureza
no Brasil, além de possuir baixo custo pode ser reaproveitada. Nos últimos anos, seu emprego
principal é na produção de compósitos de cimento-amianto, correspondendo a 90% de todo
amianto consumido. Outras aplicações são em produtos de fricção, têxteis, filtros, papéis e
papelões, produtos de vedação, isolantes térmicos e revestimento de piso.
Estudos recentes mostram que a imobilização de biocatalisadores em suporte
apropriado proporciona um melhor desempenho do biocatalisador bem como possibilita a sua
reutilização (VIEIRA, 2003).
A imobilização das células de levedura em suportes sólidos é conhecida para
incrementar estabilidade da célula e do metabolismo. As células de levedura de padeiro
imobilizada em crisotila foram usadas com sucesso na produção de álcool, desde 1996.
Levedura suportada em crisotila tem 140% de aumento na velocidade de fermentação e o
rendimento de etanol passa a ser 26% maior do que para as células livres (CASSIOLA et al.,
2004).
Além da eficiência incrementada na fermentação, uma das perguntas mais
importantes a serem respondida é que são os modos pelo os quais as fibras de crisotila
modificam o metabolismo da célula (CASSIOLA et al., 2004).
A interação entre as células de Saccharomyces cerevisiae e a crisotila foi estudado
primeiro pelo microscópio eletrônico, como descreve Cassiola e Colaboradores (2004):
... nossos resultados mostraram que as células aderem às fibras de crisotila de um
modo incomum, assemelhando-se a uma seda-ninho. Nós temos mostrado que o
grau de interação depende do tempo de interação: quanto maior é o período de
contato, maior é a interação entre as células e as fibras de crisotila.
2.2 Os corantes: definição, causa da cor e classificação.
Usualmente, o fundamento básico dos corantes orgânicos está numa certa
insaturação de suas moléculas, que tem pelo menos uma parte em anéis aromáticos,
combinada com uma estrutura quinóide de complexidade mínima. Existe muita relação entre
estrutura química e cor. Pode-se escrever a equação:
Corante = cromógeno + auxocromo
21
Cromógeno é um corpo aromático que contém um grupo chamado de cromóforo.
Cromóforo quer dizer portador de cor, e é um radical químico como os seguintes:
a) O grupo nitroso: == N  OH
b) O grupo nitro: ==NO.OH
c) O grupo azo:  N == N 
d) O grupo etileno:  C==C 
/
\
e) O grupo Carbonila:  C==O
/
f) Os grupos Carbono-Nitrogênio:  C==NH e  CH == N 
/
\
\
/
g) Os grupos enxofre:  C== S e  C  S  S  C
/
/
\
Estes grupos atribuem coloração aos corpos aromáticos mais simples graças ao
deslocamento de bandas de absorção no espectro visível ou ao aparecimento destas bandas,
são justamente as duplas ligações (bem como as ressonâncias observadas) e as bandas de
absorção na região do espectro visível é quem são as responsáveis pela coloração dos
compostos com os grupos supra citados (SHREVE; BRINK JR., 1997).
2.2.1 Os azo corantes
Quimicamente, corantes são geralmente substâncias orgânicas e os azo corantes
são os que apresentam grupo –N N– em sua estrutura, geralmente contêm duplas conjugadas,
capazes de absorverem luz visível e desse modo, podem conferir cor à tecidos, cosméticos,
couro, papel, alimentos, etc. Azo corantes são sintéticos e bastante utilizados nas indústrias de
alimentos. São caracterizados por um azo grupo em associação com um ou mais sistemas
aromáticos (MARMION, 1991)
Os azo corantes representam aproximadamente a metade de todos os corantes em
uso e é empregado como um agente colorante na indústria têxtil, alimentícia e farmacêutica. É
estimado que 15% dos corantes são lançados no esgoto durante o processamento têxtil, com
os corantes azo estes têm sido o corante sintético mais comum lançado no meio ambiente. Os
produtos destes compostos e suas formas de degradação são tóxicos e carcinogênicos.
Corantes azo sulfonados caracteriza-se através de grupos ácidos sulfônicos na estrutura
química, são extensamente utilizados como agentes colorantes e são de considerável interesse.
22
Corantes sintéticos são designados por serem resistentes à luz, água e agentes oxidantes, no
entanto, é difícil removê-los, uma vez que são lançados no meio ambiente. Os efluentes
contendo corantes somente são ligeiramente descoloridos através dos tratamentos de esgotos
biológicos convencionais (ZHAO et al., 2006).
O uso de azo corantes pela raça humana é de difícil datação, mas sabe-se que os
antigos egípcios foram os primeiros a usar o índigo para tingir tecidos. Nas atividades
humanas em que se utiliza o corante para uso direto do homem (indústria alimentícia,
farmacêutica, cosmética, etc.), o uso de corantes naturais vem ganhando força, principalmente
devido à onda “natureba” que surgiu na Europa (FURTADO, 2003).
Mas o uso dos corantes sintéticos ainda continua a ser o de maior expressão, pois
a facilidade de se sintetizar corantes lipossolúveis é maior do que a possibilidade de se
encontrar e produzir em escala industrial tais corantes (FURTADO, 2003).
O grande número de corantes, naturais ou sintéticos, usados em alimentos tem
atraído à atenção de muitos pesquisadores. Os corantes correspondem a um grupo numeroso
dentre os aditivos alimentares. Evidências arqueológicas indicam que os antigos egípcios
usavam hena, carmim e outros corantes na pele e nos cabelos, cerca de 5000 a.C. Os corantes
começaram a serem usados em alimentos na China, Índia e Egito cerca de 1500 a.C. (GIRI,
1991).
Aproximadamente 10.000
diferentes corantes
e pigmentos são usados
industrialmente, o que representa um consumo anual de cerca de 7 x 105 tons no mundo
(SPADARO; GOLD; RENGANATHAN, 1992; NIGAM; MARCHANT, 1995; NIGAM, et
al., 1996) e 26.500 tons somente no Brasil (GUARATINI; ZANONI, 2000).
Tudo isto tem motivado as indústrias de engenharia e tecnologia de alimentos a
utilizarem agentes químicos para conservar, colorir ou aromatizar os alimentos, com o
objetivo de atrair cada vez mais os consumidores.
Aditivo para alimentos é definido pela Food and Agriculture Organization /
World Health Organization (FAO / WHO) como sendo:
Toda substância, que não apresenta valor nutritivo, adicionada ao alimento com a
finalidade de impedir alterações, manter, conferir ou intensificar seu aroma, cor e
sabor; modificar ou manter seu estado físico geral, ou exercer qualquer ação exigida
para uma boa tecnologia de fabricação do alimento (FOOD AND AGRICULTURE
ORGANIZATION, 1974).
A poluição de corpos d´água com estes compostos provocam, além da poluição
visual, alterações em ciclos biológicos afetando principalmente processos de fotossíntese.
Além deste fato, estudos têm mostrado que algumas classes de corantes, principalmente
23
azocorantes, e seus subprodutos, podem ser carcinogênicos e/ou mutagênicos (BROWN;
DeVITO, 1993; METCALF ; EDDY, 1991; KUNZ, et al., 2002).
2.2.1.1 Corante Food Blue nº. 1
O corante alimentício Azul Brilhante nº. 1 é caracterizado como solução traçadora,
no qual este deve ser sensível à detecção; possibilitar o uso em análise quantitativa com
rapidez; ser solúvel quando misturado à calda, com efeitos físicos mínimos na pulverização e
menor evaporação das gotas; ter propriedades distintas para se diferenciar de outras
substâncias; e ser estáveis, atóxicas e de baixo custo. Os corantes alimentícios Azul Brilhante
são catalogados internacionalmente pela “Food, Drug & Cosmetic” (FD&C) como FD&C
Blue nº. 1, pois atendem a todas as exigências requeridas de um traçador citadas
anteriormente (MARCHI et al., 2005). A figura 3 mostra a fórmula estrutural do corante em
estudo: Food Blue nº. 1.
Figura 3 - Fórmula estrutural do corante Food Blue nº. 1.
No Brasil, os estudos referentes à estabilidade dos corantes, às características
físicas das caldas e ao desenvolvimento da metodologia de análise quantitativa envolvendo os
corantes FD&C Blue nº. 1 foram inicialmente realizados por Palladini (2000).
A partir desta data, a quase totalidade dos pesquisadores tem se utilizado desta
técnica para estudar a quantidade de calda depositada pelas pulverizações realizadas em alvos
naturais ou artificiais (MARCHI et al., 2005).
A tabela 1 relaciona o corante e suas principais características físico-químicas e
toxicológicas,
de
acordo
(www.rohachemical.com).
com
dados
fornecidos
por
Roha
Chemical
Índia
24
Tabela 1 – Propriedades físico-químicas e toxicológicas do azo corante Food Blue.
Características
Food Blue nº 1
Sinônimos
Brilliant blue FCF, Food blue 2
Fórmula molecular
Peso molecular g.mol-1
C37H34N2Na3O9S3
pH
6-7
792,84
-1
Solubilidade g. L
C. I. - Color index nº.
180,00
42090
-1
Metais pesados mg . Kg
LD oral mg .Kg-1 peso corporal
6000-10000
Família Química
Triarilmetano
40,00
Fonte: www.rohachemical.com
A utilização deste corante oferece uma série de vantagens em relação ao substrato
convencional porque são estáveis, solúveis e substratos baratos com elevadas taxas de
extinção molares e baixa toxicidade. Esses corantes podem ser aplicados em ensaios
quantitativos espectrométricos simples e rápidos (MACHADO; MATHEUS; BONONI,
2005).
2.3 Fungos Basidiomicetos Ligninolíticos
Os fungos são organismos complexos morfologicamente nos quais diferem na
estrutura nos diferentes tempos em seu ciclo de vida, diferem na forma entre a superfície e o
meio submerso, e difere também na natureza do meio de cultivo, ambientes físicos e
condições de culturas físicas (temperaturas, pH, forças mecânicas, etc.) (PRASAD et al.,
2005).
O grupo dos basidiomicetos inclui os fungos que produzem esporos
(basidiósporos) de origem sexuada em uma estrutura especializada denominada de basídio e
popularmente chamados de cogumelos e orelhas-de-pau. A fase vegetativa dos basidiomicetos
é denominada micélio, que por sua vez é formado por muitos filamentos septados chamados
hifas. O septo das hifas pode ser simples ou possuir ansas, que é uma estrutura característica
do grupo e são conhecidos como septo dolipórico em função da estrutura complexa que
apresentam. Os basidiomicetos também são caracterizados por possuírem dois tipos básicos
de basidiósporos. Os denominados balistosporos, que são liberados violentamente dos
basídios e os denominados estatismosporos, que são liberados passivamente (GUGLIOTTA ;
CAPELARI, 1998).
25
Os basidiomicetos ligninolíticos secretam enzimas que convertem os polímeros
externos em moléculas menores, que são assimiladas e utilizadas como nutrientes. A secreção
de proteínas parece ocorrer durante o crescimento apical das hifas, sendo liberadas pela
parede celular recém sintetizada (WESSELS, 2002). Os fungos decompositores da madeira
podem ser classificados em grupos ecofisiológicos: causadores de podridão branca, de
podridão parda e de podridão mole. Ao lado de outros microrganismos, os basidiomicetos
ligninolíticos atuam na decomposição da matéria orgânica, dinamizando a ciclagem de
nutrientes e regulando o equilíbrio energético dos ecossistemas terrestres (TUOMELA et al.,
2000). Além disso, estes organismos parecem ser os únicos capazes de mineralizar a molécula
de lignina presente na madeira (KIRK; FARRELL, 1987; LEONOWICZ et al., 1999; SHAN;
NERUD, 2002).
O sistema ligninolítico responsável pela biodegradação da lignina é o mesmo
envolvido na degradação de poluentes orgânicos por basidiomicetos ligninolíticos e apresenta
algumas vantagens de aplicação na biorremediação de solos. Este sistema é extracelular, pode
atuar em substâncias insolúveis ou complexadas ao solo. A inespecificidade do sistema
enzimático permite a sua utilização para uma ampla variedade de poluentes orgânicos. Além
disso, o sistema não precisa ser induzido e a degradação pode ocorrer até níveis não
detectáveis, com mineralização (BARR; AUST, 1994). Devido à baixa especificidade e
elevado potencial de oxidação do sistema enzimático, os basidiomicetos ligninolíticos são
também capazes de degradar uma variedade de compostos recalcitrantes (FRAGOEIRO;
MAGAN, 2005).
Os caminhos atuais da biotecnologia indicam os fungos basidiomicetos,
degradadores de lignina, como eficientes na degradação de grande variedade de compostos e
corantes, com alto potencial de ação na recuperação de ambientes contaminados (BALAN,
1999). Pode-se citar como exemplo, a diversidade de estudos desenvolvidos com o objetivo
de purificar o efluente têxtil, os estudos elaborados por Agathos e seus colaboradores (2003)
que testou o fungo de decomposição branca com este objetivo. Este fungo produz várias
isoformas de oxidases extracelulares incluindo lacase, manganês peroxidase e lignina
peroxidase (LiP), as quais estão envolvidas na degradação da lignina nos seus substratos
naturais de lignocelulose. O sistema lignolítico do fungo de decomposição branca (WRF) está
diretamente envolvido na degradação de vários compostos. Pode-se citar como exemplo, a
diversidade de estudos desenvolvidos com xenobióticos e corantes. Este autor disse que o
referido fungo tem potencial para a descoloração de resíduos e que pode ser, portanto, usado
graças ao conhecimento da fisiologia desses organismos.
26
A classe de microrganismos mais eficiente em demolir os corantes sintéticos são
os fungos de putrefação branca. A natureza não específica dos sistemas degradantes de lignina
dos fungos de putrefação branca é uma vantagem para o biotratamento de efluentes têxteis,
desde a mistura de corantes, surfactantes e outros compostos que existem na água do poço.
Outra vantagem importante para degradação dos corantes azo usando fungos de putrefação
branca é que enzimas lignolíticas degradam os corantes azo por oxidação, ao contrário da
redução por via metabólica bacteriana que produz aminas aromáticas mais perigosas, geradas
a partir da degradação fúngica (ZHAO et al., 2006).
A identificação do papel fundamental da morfologia fúngica em determinar o
desempenho na fermentação micelial conduziu a uma pesquisa por alternativas para projetar a
estrutura destes microrganismos para formas mais desejáveis, por exemplo, a imobilização de
células utilizando várias metodologias, e a aplicação de técnicas de imobilização de células
para tais benefícios microbianos parece valioso para o uso na biotecnologia (PRASAD et al.,
2005). O uso de fungos capazes de degradar compostos orgânicos parece ser um método
bastante promissor para o tratamento de efluente, em particular, os fungos de decomposição
branca que possuem um sistema enzimático extracelular capaz de tolerar altas concentrações
de poluentes tóxicos (BARR; AUST, 1994). Entretanto, em organismos eucariotos, os
xenobióticos podem promover a alteração de sistemas enzimáticos responsáveis por processos
vitais, como citado por Jonsson (2005):
•
Aumento da atividade enzimática no meio extracelular por extravasamento da
proteína para este meio, com conseqüente diminuição desta atividade no meio
intracelular;
•
Aumento da atividade enzimática no meio extracelular ou intracelular por ativação
enzimática, através da interação direta do agente químico com a enzima;
•
Aumento da atividade enzimática intracelular por indução na síntese da proteína;
•
Diminuição da atividade no meio extracelular ou intracelular por inibição, através
da interação direta do agente químico com a proteína.
Os fungos de decomposição branca parecem ser os únicos microrganismos nos
quais mostram capacidade de degradação e mineralização de lignina e uma série de
compostos poluentes orgânicos, altamente tóxicos e recalcitrantes. Esta capacidade é, no
mínimo em alguma extensão, causada pelo sistema enzimático não-específico produzido por
estes fungos durante a degradação de lignina, inclui diversas isoenzimas de LigninaPeroxidase (LiP, EC 1.11.1.14), Manganês-Peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13), Lacase (EC
27
1.10.3.2) bem como H2O2 produzindo oxidases. O sistema multienzimático envolvido na
degradação e mineralização da lignina é constituído de diferentes combinações de enzimas
lignolíticas, sendo a ocorrência de MnP e Lacase maior que LiP. Entretanto, há uma
diversidade grande de basidiomicetos com diferentes modelos de enzimas lignolíticas, nos
quais tem também diferenças grandes em suas habilidades na degradação xenobiótica
(MACHADO; MATHEUS; BONONI, 2005).
2.3.1 Fungo Ganoderma applanatum
Ganoderma applanatum têm sido usados na medicina tradicional chinesa e
japonesa para o tratamento de vários tipos de doenças, embora pesquisas sistemáticas dos
efeitos farmacológicos começaram somente à vinte e cinco anos atrás (D.MING et.al., 2002).
O fungo Ganoderma applanatum já foi utilizado para tratar efluente da indústria
papeleira (ligninacelulose) (LANG; ELLER; ZADRAZIL, 1997) e no tratamento de corante
reativo, conforme estudos de Vaithiyanathan e colaboradores (2005). A figura 4 mostra o
fungo Ganoderma applanatum encontrado na natureza.
Figura 4 - Fungo Ganoderma Applanatum
Fonte: commons.wikimedia.org/wiki/Image:Ganoderma_applanatum_JPG01.jpg
Matos e colaboradores (2007) demonstraram que este fungo, classificado como
fungo basidiomiceto, especialmente do tipo de decompositores branca, emergem como
candidatos potenciais para biorremediação de efluentes de indústria de azeite de oliva
(OMW). Realmente, sabe-se bem que eles são os degradadores mais eficientes de lignina e
têm também um grande potencial para a remoção de compostos fenólicos e outros compostos
poluentes, incluindo os xenobióticos.
28
2.4 Enzimas Lignolíticas
A atividade das enzimas lignolíticas produzidas por estes fungos podem ser
determinadas qualitativamente a quantitativamente através de espectrofotometria UV/VIS, em
reação onde se acompanha a formação de produto oxidado pela enzima. Os resultados são
expressos pela Lei de Lambert-Beer em unidades enzimáticas (U), onde 1U é a quantidade de
enzima que catalisa a formação de 1µmol de produto por minuto sob condições definidas. Os
substratos enzimáticos mais utilizados para a determinação das atividades de lacases, lignina
peroxidases (LiP) e manganês peroxidases (MnP) são o ABTS, o álcool veratrílico e o
vermelho de fenol, respectivamente (KUMAHARA et al., 1984, TIEN; KIRK, 1984,
BOURBONNAIS; PAICE, 1988). Estes métodos são simples, versáteis, muito sensíveis e de
baixo custo.
A Tabela 2 relaciona as principais características físico-químicas das enzimas
manganês peroxidase, lignina peroxidase e lacase.
Tabela 2 - Características das enzimas lignolíticas (WESENBERG; KYRIAKIDES; AGATHOS, 2003).
EC
MnP (1.11.1.13)
LiP (1.11.1.14)
Lacase (1.10.3.2)
Mn (II): H2O2
oxidoredutases
diarilpropano O2,
Oxidoredutases
p-benzenodiol O2
H2O2
oxidoredutases
1Cobre tipo I, 1
Tipo II e 2
cobres
pareados tipo III
59-110
(tetrâmeros≤390)
Ntetrâmeros,vários
acima de 15
2,6-4,5
2,0-8,5
500-800
não
+++
3-HAA
ampla,
incluindo não
fenólicos
ABTS, HBT e
seringaldazina
Grupo prostético
Heme
Heme
MM (kDa)
32-62,5 (122)
38-47
Nmonômeros;
mono-, di-,
pI
2,8-7,2
Faixa de pH
2,6-4,5
Eo (mV)
1510
Requer H2O2
sim
Estabilidade
+++
Mediadores naturais Mn2+, Mn3+
Especificidade
Mn2+
Glicosilação
Isoformas
Mediadores
Sintéticos
ácidos graxos
insaturados e Tióis
Secundários
+ - pouco estável +++ - muito estável
Nmonômeros;
acima de 11
3,2-4,7
2,0-5,0
1450
sim
+
AV, 2Cl-1,4DMB
ampla, aromáticos,
fenólicos
não
29
Há duas maneiras já reconhecida de utilização de enzimas lignolíticas para a
degradação de compostos recalcitrantes: a transformação direta de poluentes por culturas
ativas de basidiomicetos lignolíticos e o uso de enzimas extraídas do meio de cultura
específico. Entretanto, a escolha da melhor estratégia irá depender dos objetivos e das
condições ambientais empregadas durante o processo de tratamento biorremediativo
(TRUPKIN et al., 2003).
Entretanto, grande variedade de parâmetros de cultivo afeta a produção e a
atividade das enzimas ligninolíticas por fungos basidiomicetos como: a disponibilidade de
oxigênio, fonte e concentração de carbono e nitrogênio, microelementos, pH e temperatura
(VAN DER MERWE, 2002). Tal característica mostra que meios de culturas tem grande
influência no processo de biorremediação e o uso de inibidores também podem vir a ser um
ponto importante no processo de tratamento de poluentes (GARCIA, 2006).
2.4.1 Lacase
Lacases são proteínas globulares contendo entre 10-25% de carboidrato N-ligado
e elas podem ter estruturas monoméricas, diméricas ou multiméricas, produzidas
principalmente por basidiomicetos de degradação branca, mas são também detectadas em
fungos de degradação parda e em fungos de degradação mole (DURÁN; ESPOSITO, 1997).
As massas molares estão na região de 60-100 kDa. As lacases catalisam oxidação por
extração de um elétron de um substrato fenólico gerando um radical fenoxila (HIGUCHI,
1990).
Por causa da capacidade de catalisar a oxidação de fenóis e outros compostos
aromáticos, lacases fúngicas vem ganhando atenção para o uso em várias aplicações
industriais como deslignificação, produção de etanol, modificação de fibras da madeira,
clareamento de corantes, síntese de produtos químico-medicinais e remediação de solos e
águas contaminadas. Pesquisas recentes têm sido intensas e muito tem sido elucidado sobre a
diversidade de lacases e suas utilidades (SCHNEIDER et al., 1999, DURÁN et al., 2002,
MAYER; STAPLES, 2002).
Lacases são membros da família de proteínas multi-cobres, que incluem ascorbato
oxidase, ceruloplasmina e bilirrubina oxidases. A expressão de genes que codificam a síntese
dessa enzima indica que ela pode ser constitutiva ou indutiva. Portanto, em diferentes fungos,
a produção da lacase pode ser incrementada sob condições de cultura apropriadas
(KLONOWSKA et al. 2002; MAYER; STAPLES, 2002; CLAUS, 2004). Geralmente, a
enzima origina-se no citoplasma, mas muitos exemplos de secreção têm sido descritos na
30
literatura, entretanto, pouca atenção tem sido dada a localização sub-celular desta enzima e ao
mecanismo de secreção (MAYER; STAPLES, 2002). A produção de lacase é afetada por
muitos fatores durante o seu desenvolvimento do fungo, como a composição do meio de
cultura (relação C/N), pH, temperatura, taxa de aeração, etc. (KAHRAMAN; GURDAL,
2002).
Por muitos anos, a visão convencional foi a de que P. chrysosporium produzia
unicamente LiP e MnP. Entretanto, tem sido determinada baixa atividade de lacase produzida
por P. chrysosporium sob condições de cultivo com altas concentrações de nitrogênio e cobre,
o uso de celulose ao invés de glicose como fonte de carbono e o crescimento em cultivo semisólido. Entretanto, tem sido sugerido que a identificação de lacase baseada na oxidação do
ABTS pode ser um artefato técnico causado por Mn3+ presente nas culturas de P.
chrysosporium (LARRONDO et al., 2003).
Um modelo do ciclo catalítico de lacases, consistente com os dados disponíveis
sobre a dinâmica e a espectroscopia da enzima foi proposto (Figura 5). A maior dúvida
permanece na parte redutiva do ciclo, onde o mecanismo do agrupamento trinuclear é
reduzido. Começando do estado nativo da enzima, uma molécula de substrato reduz o sítio
T1. A partir deste ponto, dois mecanismos diferentes podem proceder: (A) o sítio T1 transfere
seus elétrons ao sítio T2 e o sítio T1 é reduzido novamente por uma segunda molécula de
substrato; os sítios T1 e T2 transferem seus elétrons aos sítios T3. O sítio T1 é reduzido por
uma terceira molécula de substrato e um elétron é outra vez transferido ao sítio T2. Este
processo re-oxida o sítio T1, que é então reduzido por uma quarta molécula de substrato.
Como resultado, uma forma completamente reduzida da enzima é obtida; (B) o agrupamento
trinuclear é seqüencialmente reduzido durante três passos de transferência de elétrons do sítio
T1, que é seqüencialmente reduzido por uma molécula de substrato, finalizando no mesmo
estado reduzido da enzima (TORRES; BUSTOS-JAIMES; BORGNE, 2003).
A lacase, como uma oxidase multicobre (p-difenil: dioxigênio oxidoreductase, EC
1.10.3.2), catalisa uma redução de quatro elétrons de dioxigênio a água. Lacase contém quatro
átomos de Cobre os quais têm sido classificados de acordo com seu aspecto no EPR: Tipo 1
ou azul, tipo 2 ou normal e tipo 3 ou sítio de acoplamento de cobre binuclear onde os cobres
estão antiferromagneticamente acoplados por meio de uma ponte de ligação (não detectado
por EPR) (SUNDARAN et al., 1997). A espectroscopia combinada com cristalografia e
dicroísmo circular magnético e raios-X têm dado uma descrição detalhada do sítio ativo da
lacase (COLE et al. 1990; SUNDARAN et al., 1997).
31
Figura 5 - Ciclo catalítico da lacase (TORRES; BUSTOS-JAIMES; BORGNE, 2003).
A produção de lacases depende das condições da cultura de um microrganismo e
podem ser produzidas em forma constitutiva ou induzidas, extra ou intracelularmente, sendo
que as formas induzidas em geral possuem maior atividade (BUSWELL; CAI; CHANG,
1995). A indução por adição de xilidina ao meio de cultura, fez com que o fungo Trametes
versicolor produzisse 3 isoenzimas que continham 30 aminoácidos que alteravam a
constituição da enzima,
mas com trocas deles no
sequenciamento da enzima
(BOURBONNAIS et al., 1995). Outra consideração a ser feita é que a adição de mediadores,
como o ABTS, também é responsável pela taxa igualitária da atividade enzimática das duas
principais isoenzimas (BOURBONNAIS et al., 1995). A lacase é responsável por 55% da
oxidação da lignina presente no efluente da indústria papeleira, o que faz com que o estudo
dessa enzima tão importante no processo de biorremediação (BOURBONNAIS et al., 1997).
32
A especificidade pelos substratos varia, dependendo da origem da lacase; assim,
lacases de diferentes fungos oxidam diferentes substratos, com diferentes velocidades de
reação. Através da preferência pelo substrato é difícil diferenciar entre as lacases e as
tirosinases (monofenol monooxigenases), pertencentes também ao grupo das fenoloxidases
cúpricas. Entre os substratos doadores de elétrons para lacases encontram-se polifenóis, fenóis
metóxi-substituídos (mono e di-), diaminas e uma série de outros substratos, porém tirosina,
substrato de tirosinase, não é oxidada por estas enzimas (REINHAMMAR, 1984;
THURSTON, 1994).
Dong e colaboradores (2005) demonstraram que a fonte de nitrogênio orgânico é
um importante incrementador da produção de lacase, bem como o tipo de incubação (estático
ou agitado) influenciam no gene de expressão dessa enzima.
Shin (2004) detectou lacase produzida por Irpex lacteus, que descoloriu em 93%
efluente da indústria têxtil, após oito dias de tratamento, bem como demonstrou que ele
obteve melhores resultados quando se usou meio de cultura sólido. López e colaboradores
(2004) utilizaram reatores com membranas para imobilizar o fungo e enzimas, no tratamento
e descoloração de compostos recalcitrantes presentes em efluente têxtil. Abdulla e
colaboradores (2000) trataram corantes tipo antraquinona usando a lacase de Trametes hirsuta
imobilizada em alumina e notaram que a degradação do corante depende do tipo de
substituinte da hidroxila.
Unal e Kolankaya (2001) usaram o Trametes versicolor para a descoloração de
efluente da indústria, sendo que a produção de lacase foi induzida pela adição de xilidina ao
efluente. O uso de mediadores, principalmente ABTS, também tem grande valor na
degradação da lignina, mas também outros mediadores como a acetovanilona (AV) e aceto
seringona (AS) podem aumentar a capacidade de degradação lignolítica (CHO et al., 2004).
Embora o uso de mediadores de lacase aumente a eficiência da degradação de
contaminantes orgânicos, a toxicidade e alto valor de mediadores tipo ABTS e HBT são um
empecilho para o uso em grande escala, sendo que os mediadores naturais, como a
metioninona e a cisteína, são mais indicados na melhoria do processo degradativo
(JOHANNES; MAJCHERZYK, 2000).
A produção de lacase usando a xilidina como indutor foi estudada por Garcia;
Santiago e Ulhoa (2006), que demonstrou que a síntese enzimática de lacase de P. sanguineus
era correlata à síntese de cinabarina e que a indução aumenta em nove vezes, comparado a
culturas sem indutores.
33
Freire; Duran e Kubota (2002) desenvolveram um sensor amperométrico para
detecção de fenol presente em soluções, baseado na imobilização da lacase, o que pode ser
aplicado no controle da poluição deste poluente.
2.4.2 Lignina Peroxidase
A evolução da síntese enzimática e a secreção de proteínas vêm sendo observadas
ao longo da evolução, ocorrendo em leveduras e outros eucariontes, assim como em fungos
filamentosos. Durante a evolução de fungos degradadores de lignina, a LiP pode ter sido
sintetizada com função de diminuir a toxicidade no meio intracelular, promovendo reações de
desaminação de produtos de ácidos aminoaromáticos, posteriormente o mecanismo
extracelular, com a presença de LiP, possibilitou a degradação da lignina (RABINOVICH;
BOLOBOVA; VASILCHENKO, 2004).
LiP foi descoberta em 1984, em culturas de Phanerochaete chrysosporium (TIEN;
KIRK, 1984). Essas enzimas são os maiores componentes do sistema envolvido na
degradação de lignina por este organismo. Desde sua descoberta, LiP tem sido caracterizada
molecular e bioquimicamente (JOHJIMA et al., 1999; SUGIURA; HIRAI; NISHIDA et al.,
2003).
Durante o processo de degradação Lignolítica, a LiP é inicialmente oxidada pelo
H2O2 e oxida núcleos aromáticos da molécula de lignina (fenólicos e não fenólicos), gerando
radicais
aniônicos. Eles reagem com nucleófilos (primariamente H2O) e com oxigênio
molecular, gerando uma “combustão enzimática“ onde ligações C-C e C-O são quebradas,
despolimerizando a lignina e abrindo os anéis aromáticos. Esta enzima é uma glicoproteína
que contém Fe protoporfirínico IX como grupo prostético e é dependente de H2O2 para sua
atividade (KIRK et al., 1978).
A lignina peroxidase é uma enzima extracelular, importante no processo
degradativo da lignina, que se apresenta como o mais abundante composto polimérico
aromático na terra. LiP é uma glicoproteína com massa molecular de 41 kDa, que contém 1
mol de ferro protoporfirina IX por mol de enzima. A LiP catalisa o peróxido de hidrogênio no
processo oxidativo multipasso , como se segue:
LiP (Fé 3+ )P. + H2O2 → LiP-I(Fe4+-O)F + H2O
4+
.
4+-
(1)
LiP-I (Fe -O)P + R → LiP-II(Fe O)P + RI
(2)
LiP -II(Fe4+-O)P. + R + 2H+ → LIP(Fe3+)P. + R7 + H2O
(3)
34
No esquema acima, R é o substrato e P o porfirina. O composto LiP-I carregas os
oxidante duplo do peróxido, um como o centro oxiferril (Fe4+-O) e o outro como o porfirina π
cátion radical (P.), com a conseqüente reação não-enzimática ( EDWARDS et al.,1993).
No ciclo catalítico (Figura 6), o Fe contido no grupo heme da LiP, passa por
estados de óxi-redução (MARTÍNEZ, 2002).
Figura 6 - Ciclo catalítico da lignina peroxidase (MARTÍNEZ, 2002).
O primeiro passo compreende a oxidação do Fe (III) da enzima nativa para Fe
(IV), pela ação do H2O2, gerando o composto I, tipo radical catiônico da LiP. Pela redução do
composto I, por transferência de um elétron, é formado o composto II, que ainda contém Fe
(IV). O agente redutor pode ser um substrato como o álcool veratrílico ou o H2O2.
Finalmente, uma etapa de redução por um elétron retorna a enzima a seu estado nativo,
completando o ciclo catalítico. Na ausência do substrato redutor o composto II é oxidado pelo
H2O2 para o composto III, uma forma da LiP com limitada capacidade catalítica, que com
excesso de H2O2 é rapidamente inativada (MARTÍNEZ, 2002).
2.4.3 A Manganês peroxidase
Inicialmente, a MnP (manganês peroxidase) foi descoberta do fungo
Phanerochaete chrysosporium, mas estudos demonstraram que os fungos Dichomitus
squalens, Stereum hirsutum, Lentinus edodes, Rigidoporus lignosus também produzem a MnP
juntamente com a lacase e que ambos mostraram eficiência no branqueamento na lignina kraft
(PAICE et al., 1992). Estudos mostraram que a lacases do Trametes versicolor na presença de
certos fenóis, podem reduzir o Mn3+ a Mn2+ e o sistema MnP-Mn (III) pode ser um oxidante
35
mais importante que a lacase , como verificado na oxidação de vários metoxibenzenos. O
sinergismo entre a lacase e o MnP apresenta melhores resultados que o uso somente da lacase
e a presença de quelatos e peróxido de hidrogênio de origem fúngica gerados na presença da
polpa de madeiras, tem também um papel importante na desmetilação lignínica, embora a
presença da H2O2 pode ser um fator de inibição da atividade enzimática (PAICE et al., 1992).
A síntese de manganês peroxidase (ou peroxidase dependente do manganês) é
possivelmente limitada a certos fungos basidiomicetos, e até então não se evidenciou em
qualquer bactéria, levedura e nenhum basidiomiceto micorrízico. A capacidade de produção
de MnP está distribuída entre grupos de basidiomicetos distintos taxonomicamente. Algumas
espécies colonizadoras de madeira, pertencente às famílias Meruliaceae, Coriolaceae e
Polyporaceae, assim como basidiomicetos decompositores de serapilheira, das famílias
Strophariaceae (família de Psilocybe castanella) e Tricholomataceae expressam atividade de
MnP. O peso molecular de MnP varia de 38 à 62,5 kDa, mas a maioria das enzimas
purificadas têm peso molecular próximo à 45 kDa (HOFRICHTER, 2002). Isoenzimas de
MnP são freqüentemente produzidas e até 11 isoformas diferentes foram descritas para
Ceriporiopsis subvermispora. Essas isoformas diferiram principalmente nos pontos
isoelétricos (pI), que estiveram na faixa ácida (pH 3-4), embora isoformas na faixa neutra e
menos ácida foram encontradas em determinados fungos (LOBOS et al., 1994).
A MnP é uma glicoproteína com Fe protoporfirínico IX como grupo prostético,
dependente de H2O2 para sua atividade. A oxidação de lignina e outros compostos
xenobióticos por MnP é dependente da disponibilidade de íons de manganês. Seu ciclo
catalítico é semelhante ao de LiP; no entanto, o Mn2+ atua como doador de elétrons para gerar
o composto II (HOFRICHTER, 2002).
A enzima manganês peroxidase é a única heme peroxidase capaz de catalisar a
reação de um elétron do Mn2+ a Mn3+, como mostra a reação:
MnP + H2O2 → Mn P Composto I + H2O
(1)
Mn P Composto I + Mn2+ → Mn P Composto II + Mn3+
(2)
Mn P Composto II + Mn2+ → MnP + Mn3+ + H2O
(3)
A enzima gerada pelo Mn3+ é complexada como o ácido etanóico com o oxalato,
que também é secretado por fungos. O complexo orgânico com o Mn3+ complexado com o
ácido oxida o substrato fenólico, incluindo os composto lignínicos e os mediadores
(SUNDARAMOORTHY et al., 1997).
36
O ciclo catalítico da MnP é iniciado pela ligação de H2O2 ou um outro peróxido
orgânico ao ferro nativo da enzima, formando um complexo ferro-peróxido (Figura 7). A
quebra subseqüente da ligação O-O do peróxido requer a transferência de 2 elétrons do grupo
heme da enzima, que resulta na formação de um radical complexo Fe4+-oxo-porfirina (MnPI). Com a quebra da ligação dos oxigênios, uma molécula de água é liberada. Uma redução
seguinte acontece formando o complexo MnP-II (Fe4+-oxo-porfirina não radicalar). Um íon
Mn2+ age como doador de 1 elétron para esse complexo intermediário e é oxidado à Mn3+. A
redução da MnP-II acontece de maneira similar e outro Mn3+ é formado de um Mn2+, levando
assim à geração da forma original da enzima, liberando uma segunda molécula de água. Ao
passo que o MnP-I se comporta como LiP e como a peroxidase de raiz forte (horsehadish) e
pode, junto do íon Mn2+, ser reduzido por outros doadores de elétrons, o MnP-II é pouco
reduzido por outros substratos e requer exclusivamente Mn2+ para completar o ciclo catalítico
(HOFRICHTER, 2002). Mn3+ formado é estabilizado por ácidos orgânicos, tais como ácido
oxálico e age como um agente oxi-redutor difuso, de baixo peso molecular, que ataca
moléculas orgânicas inespecificamente pela subtração de um elétron (GOLD; ALIC, 1993).
Devido a inespecificidade do Mn3+, o sistema MnP é eficiente para oxidação de vários
poluentes orgânicos.
Figura 7 - Ciclo catalítico da manganês peroxidase (HOFRICHTER, 2002).
37
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Preparações das soluções das amostras de corante
Foram preparadas cinco soluções do corante tipo azo: Food Blue nº. 1 fornecido
pela Indústria Eskisa (São Paulo, SP, Brasil) já apresentados nas concentrações de 0,032;
0,062; 0,125; 0,250 e 0,500 g.L-1, que foram guardadas em refrigeração a 4ºC. Foram
inoculados os fungos para posterior estudo degradativo.
3.2 Microrganismo
Ganoderma applanatum. O fungo foi cedido pelo IBAMA (Brasília, DF, Brasil).
Foi mantido em meio de extrato de malte 2% (P/V) a 4oC e repicados semanalmente. Usou-se
meios de cultura para o estudo com fungo. A Figura 8 mostra o respectivo fungo em meio de
cultura sólido com adição do corante food blue nº 1, em processo de descoloração.
(8a)
(8b)
(8c)
Figura 8-Fungo G. applanatum crescido em meio de cultura sólido, com adição de corante food blue nº 1 (a) 1
dia após a inoculação, (b) 12 dias após inoculação e (c) 16 dias após inoculação.
Fonte: Fotos cedidas por Danielle Barbosa.
3.3 Preparações da Fibra Silicática – Crisotila 5S
À fibra silicática cedida pela Empresa SAMA (Minaçu, Goiás, Brasil) com nome
comercial de crisotila 5S com massa de 1,000 g foi adicionada a um volume de 50,00 mL de
água destilada. O sistema foi levado a um banho ultrasônico por 30 min, para retirar
impurezas. Após banho, as fibras foram secas naturalmente e autoclavadas e posteriormente
adicionada às soluções (CASSIOLA et al., 2004).
38
3.4 Meio de cultura
3.4.1-Meio ágar batata (BGA)
Para preparação do meio ágar batata foram colocados 50 mL de caldo de batata; 5
g de glicose; 3,75 g de ágar e água destilada para completar 250 mL. O meio foi autoclavado
durante 15 min a 120 ºC.
3.4.- Condições de crescimento da cultura
Meio sólido:
O meio sólido foi colocado em placas de petri (10 cm de diâmetro) contendo
15,00 (+ 1) mL de meio BGA. Cada placa foi inoculada com disco (5 mm de diâmetro) de
fungo de idade de crescimento de 5 dias meio BGA temperatura ambiente ( em torno de 28º
C).
3.5-Equipamentos e Métodos Analíticos usados
Para avaliação das soluções controles e das soluções em estudo foram empregados
os seguintes parâmetros: pH, Absorbância, Demanda Química de Oxigênio (DQO). Todas as
análises foram efetuadas de acordo com o Standard Methods, Water and Wastewater 20th
Edition, (APHA, 1998). Os outros métodos de análises são relativos ao processo de
tratamento envolvendo fungos e são necessários para a avaliação da eficiência do tratamento.
Os equipamentos utilizados foram: Espectrofotômetro marca Micronal modelo B582 (Brasil), Potenciômetro marca Tecnal (Brasil) modelo Tec-3-MP com eletrodo de
Ag/AgCl e Mesa agitadora refrigerada New Brunswick Scientific (Estados Unidos da
América), modelo C24KC. O Digestor para realização de DQO foi o da marca Hach (Estados
Unidos da América) (COD Reactor). Estufa para cultura de microrganismos Marca Alfa
(Brasil). O Quadro 1 relaciona as características físico-químicas analisadas, descrevendo o
tipo de análise efetuada, bem como especificando os agentes complexantes, tipo de eletrodo,
indicadores, equipamentos e métodos.
Quadro 1 - Característica e tipos de análises realizadas.
Tipo de análise
Característica
pH
Análise potenciométrica direta (eletrodo de Ag/AgCl)
Absorbância
Análise espectrofotométrica (630 nm)
DQO
Análise colorimétrica (método de digestão com dicromato)
39
3.5.1 Métodos para Determinação das Atividades Enzimáticas Antes e Após O Tratamento
das soluções com Fungo.
Antes e após o tratamento (meio líquido) das soluções pelo fungo foram
determinadas as atividades enzimáticas relacionadas com a degradação dos compostos
orgânicos existentes nas soluções. As culturas não inoculadas (controles) foram utilizadas
como controles enzimáticos para descartar possíveis interferências com os métodos de
determinação
das
atividades.
As
atividades
enzimáticas
foram
determinadas
espectrofotometricamente e os resultados expressos em µmoles de substrato oxidado durante
um minuto, por mL de caldo filtrado (U.mL-1). As enzimas pesquisadas foram:
a) Lacase (SZKLARZ et al., 1989- modificado):
A atividade de lacase foi determinada utilizando seringaldazina como substrato
enzimático. A oxidação da seringaldazina (ε525nm= 65.000 mmol.L-1.cm-1) foi conduzida numa
mistura de reação que contenha 0,6 mL do caldo filtrado, 0,2 mL do tampão acetato de sódio
50 mmol.L-1 (pH 5,0) e 0,1 mL de seringaldazina 1,0 mmol.L-1 preparada em etanol. A reação
iniciou-se com a adição da seringaldazina e a velocidade de oxidação desta foi acompanhada
durante 10 minutos a 525 nm.
b) Lignina-Peroxidase (TIEN; KIRK, 1984, modificado):
A atividade de lignina peroxidase (LiP) foi determinada pela oxidação do álcool
veratrílico (ε310nm = 9.300 mmol-1cm-1). A mistura de reação continha 0,6 mL de caldo
filtrado, 0,2 mL de H2O2 2,0 mmol.L-1 e 0,2 mL de uma solução de álcool veratrílico 2,0
mmol.L-1 em tampão citrato fosfato 0,4 mol.L-1 (pH 3,0). A reação foi iniciada pela adição do
H2O2 e o aparecimento do aldeído veratrílico determinado medindo-se a absorvância a 310
nm. A atividade de LiP foi expressa em U.mL-1.
c) Manganês-peroxidase (KUMAHARA et al., 1984):
A atividade de peroxidase dependente de Mn (II) (MnP) foi determinada pela
oxidação do vermelho de fenol. A mistura de reação (1,0 mL) deverá conter 0,5 mL de caldo
filtrado, 0,1 mL de lactato de sódio 0,25 mmol-1, 0,2 mL de albumina bovina 0,5%, 0,05 mL
de MnSO4 2,0 mmol.L-1, 0,05 mL de uma solução de H2O2 2,0 mmol.L-1 preparada em
tampão succinato de sódio 0,2 mol.L-1 (pH 4,5) e 0,1 mL de vermelho de fenol 0,1%. A
mistura foi incubada a 30°C durante 5 minutos e a reação interrompida pela adição de 40 µL
40
de NaOH 2,0 mmol.L-1. A absorvância foi lida a 610 nm e a atividade de MnP expressa como
∆Abs mL -1min-1.
3.6 Realização dos tratamentos
Nos tratamentos das soluções de corante foram colocados 100,00 mL de solução
de corante em um erlenmeyer de 250 mL e em capela de fluxo laminar foram colocados os
conteúdos totais das placas (meio de cultura + fungo) nos erlenmeyers, totalizando 20
amostras. Desses erlenmeyers, 10 continham crisotila e 10 sem crisotila. O experimento foi
feito em duplicata, e que foram usados para controle somente a solução e a mesma contendo
crisotila para comparações com os tempos de tratamentos de 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. Em
seguida, foram colocados na mesa agitadora refrigerada a 28º C e 180 rpm.
O processo biológico foi efetuado no laboratório de enzimologia da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal de Goiás. Para controle foram adicionados culturas dos
fungos, sob as mesmas condições acima, seguida de autoclavagem a uma temperatura de
121°C por 15 minutos sendo agitado em uma mesa agitadora refrigerada sob temperatura de
28°C e 180 rpm (rotações por minuto) , que é o teste de adsorção.
As análises físico-químicas foram efetuadas no laboratório de saneamento da
Faculdade de Engenharia Civil da UFG e no laboratório de Enzimologia da Faculdade de
Farmácia.
3.7 Preparação e manutenção das Amostras
Após os respectivos períodos de tratamento das soluções de corante, estas foram
filtradas em papel de filtro Whatman 1,3 mm sendo o caldo filtrado guardado sob refrigeração
a 4ºC. Todas as amostras foram filtradas posteriormente em membrana Milipore® 0,45 µm e
imediatamente refrigeradas a 4º C (SANTIAGO, 1999). Antes das medições enzimáticas
através de absorbância no UV-vis, as amostras foram centrifugadas durante 20 min a 8000
rpm.
3.8 Espectros no UV-vis
Os espectros no UV-vis foram medidos em cubetas de quartzo de 4 mL marca
Micronal, sendo que foi usado como referência água destilada. A varredura espectral na faixa
de 300 a 750 nm foi feita no intervalo dos comprimentos de onda de quinze nm. Antes da
realização de cada espectro, para evitar a contaminação por adsorção de compostos nas
41
cubetas, estas foram fervidas em água destilada durante vinte minutos seguindo-se de enxágüe
com água destilada. A secagem das mesmas foi feita em temperatura ambiente. Antes das
análises, as cubetas de quartzo foram testadas quanto à sua similaridade, na faixa de 300 a 750
nm , usando-se água destilada como líquido de teste.
42
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Tratamento das Soluções em estudo
Espectros de 300 a 750 nm foram medidos para acompanhar a evolução do
tratamento das soluções de corante tipo azo Food Blue nº. 1, em intervalos de 15 nm. Os
resultados foram apresentados segundo a concentração das soluções de corante, conforme as
Figuras 9a e 9b; 10a e 10b; 11a e 11b; 12a e 12b; 13a e 13b. Como solução de referência,
utilizou-se a solução do corante (sem fungo) e a solução do corante com a fibra silicática.
Para efeito de avaliação de degradação do corante, utilizou-se o comprimento de
onda de 630 nm como comprimento específico e para avaliação de produção de compostos
fúngicos, o comprimento de onda usado foi o de 300 nm.
Na concentração de 0,032 g.L-1 ( Figura 9a e 9b) observou-se a degradação e
adsorção dos corantes nas fibras. Em 405 nm houve uma alteração na absorbância indicando
possível alteração na estrutura molecular do corante, quando se comparou as curvas das
soluções de corante com a solução de corante e fibras silicáticas, pois tal comportamento
indica que a adsorção do corante às fibras tem maior importância que o tratamento com o
fungo.
O uso da crisotila aumentou a atividade biológica fúngica, mostrado pelo aumento
da absorbância na região do UV, salientado em 96 h de tratamento, sugerindo que os maiores
tempos de duração do processo biológico aumentam a produção de PMS (Produtos
Microbianos Solúveis) (AQUINO, 2003). Nessa concentração, houve aumento de absorbância
em 630 nm quando se usou a solução do corante com o fungo, sendo que o uso da crisotila
houve aumento significativo do processo de descoloração, indicando haver uma interação
entre o corante e as fibras e entre o fungo e a crisotila, pois o uso do fungo interferiu no
processo de degradação e adsorção do corante à crisotila. A natureza da interação entre o
fungo e a crisotila pode mudar as vias metabólicas, bem como mudar as taxas de crescimento
micelial (CASSIOLA et. al., 2001) e isso pode explicar o porquê da solução de corante e
crisotila apresentarem a menor absorbância em 630 nm.
43
5,000
Absorbância
4,000
24 h
48 h
72 h
96 h
Solução do Corante
Solução Corante + crisotila
3,000
2,000
1,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
615
645
675
705
735
765
615
645
675
705
735
765
Comprimento de onda - nm
(9a)
5,000
4,000
Absorbância
Solução do Corante
24 h (crisotila)
48 h (crisotila)
3,000
72 h (crisotila)
96 h (crisotila)
Solução Corante + crisotila
2,000
1,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
Comprimento de onda - nm
(9b)
Figura 9 - Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,032 g.L -1 sem crisotila, (b) concentração
de 0,032 g.L -1 com crisotila.
Para concentrações de 0,062 g.L-1 (Figura 10a e 10b), observou-se também a
degradação e adsorção dos corantes nas fibras, similarmente com o que aconteceu na
concentração de 0,032 g.L-1 . Novamente, a adsorção do corante às fibras silicáticas tiveram
44
maior importância que o processo de descoloração e o tempo de tratamento não teve
significância no processo degradativo.
8,000
7,000
Absorbância
6,000
24 h
48 h
72 h
96 h
Solução do Corante
Solução Corante + crisotila
5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
615
645
675
705
735
765
615
645
675
705
735
765
Comprimento de onda - nm
(10a)
8,000
7,000
Solução do Corante
6,000
24 h (crisotila)
Absorbância
48 h (crisotila)
5,000
72 h (crisotila)
96 h (crisotila)
Solução Corante + crisotila
4,000
3,000
2,000
1,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
Comprimento de onda - nm
(10b)
Figura 10 - Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,062 g.L -1 sem crisotila, (b)
concentração de 0,062 g.L -1 com crisotila.
45
Para concentrações de 0,125 g.L-1 (Figura 11a e 11b) notou-se a degradação do
corante pelo fungo e a adsorção da crisotila nas paredes do fungo, havendo a produção de
compostos pelo fungo. Nessa concentração, observou-se o aumento da degradação do corante
pelo fungo, comparando-se com a solução do corante. A adição da crisotila também tem papel
importante, pois ela apresentou menor absorbância no comprimento específico de 630 nm,
mostrando que a adsorção do corante às fibras silicáticas teve maior significância que a
degradação.
Comparando-se as duas formas de tratamento, o uso das fibras não teve grande
importância na síntese enzimática, pois as curvas espectrais quando se usou o as fibras foram
semelhantes às curvas de quando não se usou a crisotila. Nota-se também que o aumento do
tempo de tratamento aumenta a coloração da solução em ambos os casos de tratamento, o que
já foi citado anteriormente por Aquino (2003).
O uso das fibras, aumentou a produção de compostos fúngicos, como pôde ser
observado na Figura 11b em comprimento de onda de 300 nm, salientado em 96 h de
tratamento, o que corrobora com Aquino (2003) em que o tempo de tratamento aumenta a
quantidade de PMS, sendo que a biotransformação tem um papel tão importante quanto a
degradação.
12,000
10,000
24 h
48 h
72 h
96 h
Solução do Corante
Solução Corante + crisotila
Absorbância
8,000
6,000
4,000
2,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
Comprimento de onda - nm
(11a)
615
645
675
705
735
765
46
12,000
10,000
Solução do Corante
24 h (crisotila)
48 (crisotila)
72 h (crisotila)
96 h (crisotila)
Solução Corante + crisotila
Absorbância
8,000
6,000
4,000
2,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
615
645
675
705
735
765
Comprimento de onda - nm
(11b)
Figura 11 - Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,125 g.L -1 sem crisotila, (b)
concentração de 0,125 g.L -1 com crisotila.
Com a concentração de 0,250 g.L-1 (Figura 12a e 12b), a degradação do corante
teve maior importância, principalmente quando se utilizou a fibra silicática, o que vem a
mostrar que a imobilização dos fungos, pode representar um importante aumento de
degradação do contaminante orgânico.
27,000
24,000
24 h
48 h
72 h
96 h
Solução do Corante
Solução Corante + crisotila
21,000
Absorbância
18,000
15,000
12,000
9,000
6,000
3,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
Comprimento de onda - nm
(12a)
615
645
675
705
735
765
47
27,000
24,000
Solução do Corante
24 h (crisotila)
48 h (crisotila)
72 h (crisotila)
96 h (crisotila)
Solução Corante + crisotila
21,000
Absorbância
18,000
15,000
12,000
9,000
6,000
3,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
615
645
675
705
735
765
Comprimento de onda - nm
(12b)
Figura 12 - Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,250 g.L -1 sem crisotila, (b)
concentração de 0,250 g.L -1 com crisotila.
Em 24 h de tratamento, usando-se as fibras como suporte, obteve-se o melhor
tratamento do corante, analisando o comprimento de onda de 630 nm. Tal comportamento
degradativo teve maior importância que a adsorção do corante à fibra, pois a absorbância em
630 nm foi menor que a absorbância do corante com a fibra (controle), conforme mostra as
curvas espectrais. Avaliando-se o comprimento de 300 nm, em 48 h de tratamento sem o uso
da crisotila, obteve-se a menor absorbância, sendo que a maior absorbância foi notada tanto
quanto no uso da crisotila quanto no não uso da mesma, o que indica que houve produção de
compostos fúngicos durante o tratamento biológico.
Já na concentração de 0,500 g.L-1 (Figura 13a e 13b) houve a adsorção da crisotila
nas paredes do fungo, no qual notou-se o aumento da absorbância . Segundo Cassiola, et al.
(2001) o grau de interação entre as células e as fibras da crisotila parece estar relacionado ao
tempo de exposição e a presença ou ausência de nutrientes durante o período de adesão. As
células quando estão na ausência de nutrientes aderem mais intensamente aos nutrientes das
fibras de crisotila.
Sem o uso da fibra silicática, obteve-se maior descoloração do corante,
observando-se em 630 nm, em 24 h de tratamento. A adsorção do corante às fibras foi de
grande importância, pois ela representou maior descoloração em 630 nm, diferentemento do
48
observado com a concentração de 0,250 g L-1. Tal comportamento sugere que o fungo se
adapta melhor à determinadas concentrações do corante, o que pode vir a inibir seu
metabolismo primário e secundário.
45,000
40,000
24 h
48 h
72 h
96 h
Solução do Corante
Solução Corante + crisotila
35,000
Absorbância
30,000
25,000
20,000
15,000
10,000
5,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
615
645
675
705
735
765
615
645
675
705
735
765
Comprimento de onda - nm
(13a)
45,000
40,000
35,000
Absorbância
30,000
Solução do Corante
24 h (crisotila)
48 h (crisotila)
25,000
72 h (crisotila)
96 h (crisotila)
20,000
Solução Corante + crisotila
15,000
10,000
5,000
0,000
285
315
345
375
405
435
465
495
525
555
585
Comprimento de onda - nm
(13b)
Figura 13 - Espectro de 300 a 750 nm da amostra. (a) concentração de 0,500 g.L -1 sem crisotila, (b)
concentração de 0,500 g.L -1 com crisotila.
49
A produção de lignina-peroxidase pode ser acompanhada na Figura 14 através da
absorbância a 310 nm.
0,032 g L-1
0,062 g L-1
0,125 g L-1
0,250 g L-1
0,500 g L-1
0,032 g L-1(Crisotila)
0,062 g L-1(Crisotila)
0,125 g L-1(Crisotila)
0,250 g L-1 (Crisotila)
0,500 g L-1(Crisotila)
Concentração - U. mL
-1
800,00
600,00
400,00
200,00
0,00
0
24
48
72
96
Tempo de tratamento - h
Figura 14 - Determinação da atividade de lignina-peroxidase dos caldos filtrados da amostra,
em pH 3,0 e álcool veratrílico como substrato, em 310 nm.
De acordo com a Figura 14, a maior produção de lignina peroxidase se deu em 96
h de tratamento, com as concentrações de 0,500 g L-1, com as soluções com e sem o uso da
crisotila, o que indica que o fator predominante para a síntese enzimática de lignina
peroxidase é a concentração do substrato, que tem como fonte de nitrogênio o próprio corante.
De acordo com Belinky e colaboradores (2003) a produção de LiP está relacionada à presença
de oxidantes, como o oxigênio, peróxido, sendo que o próprio corante pode funcionar como
agente oxidante, o que indica neste caso que maiores concentrações de corante, maiores
produções de tal enzima.
Para se avaliar o decaimento da matéria orgânica presente no efluente, foi
avaliado a DQO (solúvel, pois os caldos eram filtrados em membrana 0,45 µm), conforme a
Figura 15. Por se tratar de um sistema heterogêneo, em que se diferencia a fase sólida
(micélio, ágar e particulados) da fase líquida (solúvel), a bioatividade fúngica (variação de
pH, síntese enzimática, etc.) pôde ir modificando a proporção entre as duas fases, levando a
resultados em que a relação de DQO seja maior que o valor inicial. Entretanto, valores abaixo
do valor inicial (1,00) possivelmente indicam degradação e podem ser interpretados como
redução da matéria orgânica presente na solução, pois tal metodologia avalia toda matéria
orgânica contida na amostra, sendo que os Produtos Microbianos Solúveis (PMS) que estão
50
presentes no meio, impossibilitam a interpretação dos resultados (AQUINO, 2003). Embora a
varredura indique diminuição de absorbância no comprimento de onda de 630 nm, isto não
pode ser usado como indicador de mineralização do corante, possivelmente uma degradação
do mesmo, gerando moléculas intermediárias.
16,00
14,00
0,032
0,062
0,125
0,250
0,500
12,00
DQO/DQO0
10,00
g.L-1
g.L-1
g.L-1
g.L-1
g.L-1
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
24
48
72
96
Tempo de tratamento - h
(15a)
16,00
14,00
0,032
0,062
0,125
0,250
0,500
12,00
DQO/DQO0
10,00
g.L-1
g.L-1
g.L-1
g.L-1
g.L-1
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
24
48
72
Tempo de tratamento - h
(15b)
Figura 15 - Relação entre a DQO final e a DQO inicial. 13a corresponde variação de DQO
da amostra sem o uso da crisotila e 13b a amostra com crisotila.
96
51
A Figura 16 mostra resultados de monitoramento de pH. O pH das soluções com
corante azul brilhante apresentou valores entre 4,59 a 5,20 (16a) nas soluções sem o uso de
crisotila e 5,17 a 6,1 (16b) nas soluções com crisotila.
12,00
0,032 g.L-1
0,062 g.L-1
0,125 g.L-1
10,00
0,250 g.L-1
0,500 g.L-1
pH
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
24
48
72
96
Tempo de tratamento - h
(16a)
12,00
0,032 g.L-1 Crisotila
10,00
0,062 g.L-1 Crisotila
0,125 g.L-1 Crisotila
0,250 g.L-1 Crisotila
0,500 g.L-1 Crisotila
pH
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
24
48
72
96
Tempo de tratamento - h
(16b)
Figura 16 - Variação do pH durante o tratamento das soluções com corante azul brilhante sem o uso da crisotila
(10a) e com o uso da crisotila (10b).
52
Em geral, o pH das soluções apresentaram-se numa faixa ácida (abaixo de 7,00),
com menor variação de valores de pH quando se usou a crisotila como suporte para os fungos,
indicando possivelmente que a presença da fibra silicática ajuda a manter o pH das soluções
em faixas de intervalos menores, como pode ser observado em 48 h de tratamento na figura
10b. Nos procedimentos com e sem crisotila foi observado, após 72 h de tratamento, que
houve maior variação de intervalos de pH, o que pode ser relacionado com a produção de
PMS, como já citado por Aquino (2003), onde a biotransformação do contaminante pode
alterar a estrutura da matéria orgânica resultante, bem como alterar o pH das amostras.
Essa faixa de pH que os caldos filtrados apresentaram está dentro do intervalo de
pH ótimo para a atividade da lacase, MnP e LiP (WESENBERG; KYRIAKIDES;
AGATHOS, 2003). Já foi relatado que os fungos preferem valores de pH (4,0-6,0) mais ácido,
pois nesta faixa de pH, as fenoloxidases apresentam maior estabilidade (PALMIERI et al.,
1993).
A variação e estabilização do pH foram feita com a produção de compostos de
origem fúngica, verificada com o aumento do pH no tratamento do efluente com os fungos,
sendo que a adição do meio de cultura não foi responsável direta pela variação de pH,
indicando que a bioatividade fúngica está relacionada à manutenção de um pH ideal para
crescimento e síntese de biocompostos (GADD, 1999).
Nos ensaios para lacase, em que se usou a seringaldazina como substrato, não foi detectada a
atividade dessa enzima, o que não pode afirmar que o G. applanatum não sintetize essa
enzima, pois somente uma análise de DNA pode mostrar se o fungo é capaz de sintetizar
lacase. Matos, Bezerra e Dias (2007) usaram o fungo G. applanatum para descolorir e reduzir
compostos fenólicos de efluente de uma indústria de azeite de oliva e comprovaram que o
fungo citado produziu altas concentrações de lacase, o que indica que tal cepa de fungo usada
por eles tem a capacidade de síntese de lacase, diferentemente do que foi observado neste
trabalho.
Nos ensaios da atividade enzimática de manganês peroxidase, devido ao
comprimento de onda do produto da oxidação do vermelho de fenol (610 nm) ser muito
próximo ao comprimento de onda máximo do corante (630 nm), bem como à alta absorbância
das soluções do corante azul brilhante, não foi possível medir a atividade enzimática, mesmo
diluindo-se a amostra, pois em concentrações mais baixas dessa enzima, mostrou-se
indetectável. O fungo em estudo apresentou atividade de MnP, conforme Songulashvili e
colaboradores (2007) e Tsujiyama e Minami (2005).
53
CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
O uso de crisotila como suporte para crescimento de fungos em meio líquido, com
o objetivo de aumentar a produção enzimática teve resultado significativo, mostrando que a
interação entre fungo e crisotila e entre crisotila e corante azul brilhante apresentam
perspectivas importantes. Verificou-se maior produção de lignina peroxidase quando
aumentou a concentração do corante, o que indica que concentrações na faixa de 0,500 g L-1
de corante, o fungo G. applanatum é capaz de sintetizar lignina peroxidase, viabilizando a
mineralização do contaminante orgânico em concentrações mais altas. A concentração de
corante que apresentou melhor resultado de descoloração foi de 0,125 g L-1, usando-se a
crisotila como suporte, o que indica que há uma interação importante entre o suporte silicático
e o fungo. Outra observação importante é a interação entre a crisotila e o corante, que em
concentrações de 0,032 e 0,064 g L-1 houve uma adsorção significativa, o que pode vir a ser
interessante pesquisa futura, para a separação de contaminantes solúveis em efluentes. A
metodologia de DQO não se mostrou confiável na quantificação da matéria orgânica
degradada, durante a realização dos ensaios, o que pode apontar que a adição de esporos dos
fungos, possa ser outra maneira de realizar o processo degradativo.
Estudos futuros utilizando-se a crisotila como suporte podem ser feitos, buscandose uma maior variação de massa do suporte, bem como a adição de fonte primária de glicose,
pois o metabolismo do fungo pode ser alterado com níveis mais altos de glicose, além de
variações de pH ou o uso de soluções tamponadas, que podem ser outra maneiras de aumentar
a produção enzimática.
54
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62
ANEXO 1
Presidência da República
Casa Civil
Subchefia para Assuntos Jurídicos
LEI Nº 9.055, DE 1 DE JUNHO DE 1995.
O PRESIDENTE DA REPÚBLICA Faço saber que o Congresso Nacional decreta e eu
sanciono a seguinte Lei:
Art. 1º É vedada em todo o território nacional:
I - a extração, produção, industrialização, utilização e comercialização da actinolita, amosita
(asbesto marrom), antofilita, crocidolita (amianto azul) e da tremolita, variedades minerais
pertencentes ao grupo dos anfibólios, bem como dos produtos que contenham estas
substâncias minerais;
II - a pulverização (spray) de todos os tipos de fibras, tanto de asbesto/amianto da variedade
crisotila como daquelas naturais e artificiais referidas no art. 2º desta Lei;
III - a venda a granel de fibras em pó, tanto de asbesto/amianto da variedade crisotila como
daquelas naturais e artificiais referidas no art. 2º desta Lei.
Art. 2º O asbesto/amianto da variedade crisotila (asbesto branco), do grupo dos minerais das
serpentinas, e as demais fibras, naturais e artificiais de qualquer origem, utilizadas para o
mesmo fim, serão extraídas, industrializadas, utilizadas e comercializadas em consonância
com as disposições desta Lei.
Parágrafo único. Para os efeitos desta Lei, consideram-se fibras naturais e artificiais as
comprovadamente nocivas à saúde humana.
Art. 3º Ficam mantidas as atuais normas relativas ao asbesto/amianto da variedade crisotila e
às fibras naturais e artificiais referidas no artigo anterior, contidas na legislação de segurança,
higiene e medicina do trabalho, nos acordos internacionais ratificados pela República
Federativa do Brasil e nos acordos assinados entre os sindicatos de trabalhadores e os seus
empregadores, atualizadas sempre que necessário.
§ 1º (VETADO)
§ 2º As normas de segurança, higiene e medicina do trabalho serão fiscalizadas pelas áreas
competentes do Poder Executivo e pelas comissões de fábrica referidas no parágrafo anterior.
63
§ 3º As empresas que ainda não assinaram com os sindicatos de trabalhadores os acordos
referidos no caput deste artigo deverão fazê-lo no prazo de 12 (doze) meses, contados a partir
da publicação desta Lei, e a inobservância desta determinação acarretará, automaticamente, o
cancelamento do seu alvará de funcionamento.
Art. 4º Os órgãos competentes de controle de segurança, higiene e medicina do trabalho
desenvolverão programas sistemáticos de fiscalização, monitoramento e controle dos riscos de
exposição ao asbesto/amianto da variedade crisotila e às fibras naturais e artificiais referidas
no art. 2º desta Lei, diretamente ou através de convênios com instituições públicas ou privadas
credenciadas para tal fim pelo Poder Executivo.
Art. 5º As empresas que manipularem ou utilizarem materiais contendo asbesto/amianto da
variedade crisotila ou as fibras naturais e artificiais referidas no art. 2º desta Lei enviarão,
anualmente, ao Sistema Único de Saúde e aos sindicatos representativos dos trabalhadores
uma listagem dos seus empregados, com indicação de setor, função, cargo, data de
nascimento, de admissão e de avaliação médica periódica, acompanhada do diagnóstico
resultante.
Parágrafo único. Todos os trabalhadores das empresas que lidam com o asbesto/amianto da
variedade crisotila e com as fibras naturais e artificiais referidas no art. 2º desta Lei serão
registrados e acompanhados por serviços do Sistema Único de Saúde, devidamente
qualificados para esse fim, sem prejuízo das ações de promoção, proteção e recuperação da
saúde interna, de responsabilidade das empresas.
Art. 6º O Poder Executivo determinará aos produtores de asbesto/amianto da variedade
crisotila, bem como das fibras naturais e artificiais referidas no art. 2º desta Lei, que não
forneçam estes materiais às empresas que estejam descumprindo qualquer disposição deste
diploma legal.
Parágrafo único. Acontecendo o previsto no caput deste artigo, o Governo Federal não
autorizará a importação da substância mineral ou das fibras referidas no art. 2º desta Lei.
Art. 7º Em todos os locais de trabalho onde os trabalhadores estejam expostos ao
asbesto/amianto da variedade crisotila ou das fibras naturais ou artificiais referidas no art. 2º
desta Lei deverão ser observados os limites de tolerância fixados na legislação pertinente e, na
sua ausência, serão fixados com base nos critérios de controle de exposição recomendados por
organismos nacionais ou internacionais, reconhecidos cientificamente.
§ 1º Outros critérios de controle da exposição dos trabalhadores que não aqueles definidos
pela legislação de Segurança e Medicina do Trabalho deverão ser adotados nos acordos
assinados entre os sindicatos dos trabalhadores e os empregadores, previstos no art. 3º desta
Lei.
§ 2º Os limites fixados deverão ser revisados anualmente, procurando-se reduzir a exposição
ao nível mais baixo que seja razoavelmente exeqüível.
Art. 8º O Poder Executivo estabelecerá normas de segurança e sistemas de acompanhamento
específicos para os setores de fricção e têxtil que utilizam asbesto/amianto da variedade
crisotila ou as fibras naturais ou artificiais referidas no art. 2º desta Lei, para fabricação dos
64
seus produtos, extensivas aos locais onde eles são comercializados ou submetidos a serviços
de manutenção ou reparo.
Art. 9º Os institutos, fundações e universidades públicas ou privadas e os órgãos do Sistema
Único de Saúde promoverão pesquisas científicas e tecnológicas no sentido da utilização, sem
riscos à saúde humana, do asbesto/amianto da variedade crisotila, bem como das fibras
naturais e artificiais referidas no art. 2º desta Lei.
Parágrafo único. As pesquisas referidas no caput deste artigo contarão com linha especial de
financiamento dos órgãos governamentais responsáveis pelo fomento à pesquisa científica e
tecnológica.
Art. 10. O transporte do asbesto/amianto e das fibras naturais e artificiais referidas no art. 2º
desta Lei é considerado de alto risco e, no caso de acidente, a área deverá ser isolada, com
todo o material sendo reembalado dentro de normas de segurança, sob a responsabilidade da
empresa transportadora.
Art. 11. Todas as infrações desta Lei serão encaminhadas pelos órgãos fiscalizadores, após a
devida comprovação, no prazo máximo de setenta e duas horas, ao Ministério Público
Federal, através de comunicação circunstanciada, para as devidas providências.
Parágrafo único. Qualquer pessoa é apta para fazer aos órgãos competentes as denúncias de
que trata este artigo.
Art. 12. (VETADO)
Art. 13. Esta Lei entra em vigor na data de sua publicação.
Art. 14. Revogam-se as disposições em contrário.
Brasília, 1º de junho de 1995; 174º da Independência e 107º da República.
FERNANDO HENRIQUE CARDOSO
Paulo Paiva