POTENTIAL OF ECTOMYCORRHIZAL FUNGI AS
DRIVERS OF PLANT ESTABLISHMENT ON SOILS
CONTAMINATED WITH FLUORINATED ORGANIC
COMPOUNDS
Thesis submitted to the Universidade Católica Portuguesa to attain the
degree of PhD in Biotechnology – with specialization in Environmental
Science and Engineering
By
Albina Cristina Ribeiro Franco
November 2013
POTENTIAL OF ECTOMYCORRHIZAL FUNGI AS
DRIVERS OF PLANT ESTABLISHMENT ON SOILS
CONTAMINATED WITH FLUORINATED ORGANIC
COMPOUNDS
Thesis submitted to the Universidade Católica Portuguesa to attain the
degree of PhD in Biotechnology – with specialization in Environmental
Science and Engineering
By
Albina Cristina Ribeiro Franco
Under the supervision of Professor Doctor Paula Maria Lima Castro
Under the co-supervision of Doctor Rui Oliveira
November 2013
To my parents and my sister,
To my grandmother and granduncle
And to Rui
ABSTRACT
Abstract
Ectomycorrhizal (ECM) fungi can play an important role on forest
ecosystems. It is crucial to understand and explore the capacity of ECM fungi to
improve plant development and successful establishment on disturbed soils. The
main objective of the work described in this thesis was to explore the potential of
ECM fungi found to persist in a disturbed area to tolerate and/or degrade fluorinated
organic compounds, and also to assess the tolerance and symbiotic efficiency of
ECM fungi - Pine on contaminated soils.
The diversity and persistence of ECM fungi in a Pinus pinaster plantation
established with plants inoculated at the nursery with selected ECM fungi and with
non-inoculated plants was investigated. Nursery inoculated plants promoted plant
growth in the field, with different ECM communities found to be present on the
inoculated and non-inoculated plants. The inoculated fungi Laccaria sp., Rhizopogon
sp., Suillus bovinus, and Pisolithus sp. persisted on the inoculated plants after 2 and 5
years of field establishment. Laccaria sp., Rhizopogon sp., and Pisolithus sp. were
also detected within the non-inoculated trees but, with the exception of Pisolithus sp.,
the fungi did not correspond to the same fungal species detected on the inoculated
plants. The results reinforced the benefits of using nursery inoculated plants on forest
reclamation processes.
The potential of P. tinctorius, a widespread fungus on forest and found to
persist in plants after field establishment in disturbed areas, to tolerate and/or degrade
organic pollutants was further assessed. P. tinctorius was able to tolerate and degrade
2- and 3-Fluorophenol (FP) at different extents in glucose supplemented liquid
medium. 3-Fluorocatechol (FC) and 4-FC were detected as degradation metabolites.
Metabolic intermediates compatible with fluoromuconates were identified, indicating
that cleavage of the aromatic ring occurred. To our knowledge, this is the first time
the degradation of mono-FP by an ECM fungus is reported. P. tinctorius was also
capable to tolerate and degrade trifluoroacetate, at different extents, in solid and
liquid medium supplemented with glucose. Defluorination was not found and a
volatile compound with a mass similar to fluoroform was detected from cultures of
the fungus. However, further confirmation of this compound is still needed. The
-ii-
Abstract
results evidence the role ECM fungi play in the degradation of fluorinated organic
compounds, enhancing their potential contribution to rhizoremediation technology.
The effect of benfluralin, a persistent herbicide, on the development of P.
pinea seedlings and colonisation by P. tinctorius and S. bellinii was performed.
Benfluralin had an inhibitory effect on plant growth and ECM colonisation.
Inoculation with P. tinctorius promoted plant development and nutrient uptake in
benfluralin spiked soil, suggesting that the fungus may have conferred seedlings
protection against benfluralin toxicity. The same was not observed on the seedlings
inoculated with S. bellinii. Therefore, the use of P. tinctorius - P. pinea symbiosis
could enhance plant establishment in pesticide contaminated soils. Furthermore, how
benfluralin affected P. pinea seedlings previously mycorrhized with P. tinctorius and
S. bellinii was also assessed. Mycorrhized P. pinea seedlings revealed higher plant
growth in the presence of benfluralin, although the herbicide affected ECM
colonisation and nutrient uptake, even after establishing the symbiosis. Fungal role
on plant antioxidant response in the absence and presence of benfluralin was also
evaluated. Inoculation with S. bellinii led to higher lipid peroxidation in the presence
and absence of benfluralin, suggesting that this increase could be related to the
fungus symbiosis and not to benfluralin. In plants inoculated with P. tinctorius, lipid
peroxidation and H2O2 decreased, indicating that the fungus conferred root protection
against benfluralin. Superoxide dismutase and catalase activity increased on noninoculated seedlings exposed to benfluralin, but the same was not observed in the
inoculated seedlings. Therefore, the antioxidant response to abiotic stress depends of
the plant-fungus species, and of the level of stress. The results corroborated the
findings from the previous study, demonstrating that P. tinctorius-P. pinea
association represents a possibility for increasing plant’s protection and growth when
exposed to contaminated soils.
Overall, P. tinctorius revealed to be capable to tolerate and degrade
fluorinated organic compounds, as well as to potentiate plant growth on
contaminated soils. As such, P. tinctorius could confer plants with an important
advantage as a reconversion strategy for soils contaminated with organic pollutants.
-iii-
RESUMO
Resumo
Os fungos ectomicorrízicos (ECM) desempenham um papel importante nos
ecossistemas florestais. Desta forma, é importante compreender e explorar a
capacidade destes fungos no estabelecimento e desenvolvimento de plantas em solos
contaminados. O trabalho descrito nesta tese teve como principal objetivo explorar o
potencial dos fungos ECM, que persistiram em locais sob stress, de tolerar e/ou
degradar compostos fluorados orgânicos, assim como avaliar a tolerância e eficiência
simbiótica de fungos ECM com plantas em solos contaminados.
A diversidade e persistência de fungos ECM numa plantação de Pinus
pinaster, estabelecida numa zona de solo queimado, com plantas inoculadas em
viveiro com fungos ECM selecionados e plantas não-inoculadas foram investigadas.
A inoculação com os fungos ECM promoveu o crescimento das plantas no campo,
existindo diferenças ao nível das comunidades de fungos ECM nas plantas
inoculadas e não inoculadas após 2 e 5 anos da plantação. Os fungos inoculados em
viveiro Laccaria sp., Rhizopogon sp., Suillus bovinus, e Pisolithus sp. persistiram nas
plantas inoculadas. Laccaria sp., Rhizopogon sp., e Pisolithus sp. também foram
detetados nas plantas não-inoculadas, contudo estes fungos não correspondem às
mesmas espécies encontradas nas plantas inoculadas, com a exceção de Pisolithus
sp.. Estes resultados reforçam os benefícios do uso de plantas inoculadas com fungos
ECM em viveiro na recuperação de áreas florestais.
O fungo P. tinctorius, que se encontra muito frequentemente nas florestas,
persistiu nas plantas inoculadas no campo. O seu potencial para tolerar e/ou degradar
mono – fluorofenois (FP) foi avaliado. P. tinctorius foi capaz de tolerar e degradar 2e 3-FP em meio sólido e líquido suplementado com glucose. 3- Fluorocatechol (FC)
e 4-FC foram detetados como intermediários da degradação. Outros compostos
compatíveis com fluoromuconatos também foram identificados, sugerindo que o
fungo foi capaz de quebrar o anel aromático, contudo a libertação de fluoretos não
foi detetada. Esta é a primeira vez que a degradação de mono -FP por um fungo
ECM é reportada. Este fungo, P. tinctorius, também foi capaz de tolerar e degradar
trifluoroacetato em meio sólido e líquido suplementado com glucose. A liberação do
ião fluoreto não foi detetada, tendo sido identificado um composto volátil com massa
-vi-
Resumo
equivalente ao fluorofórmio. Os resultados evidenciam a capacidade dos fungos
ECM para degradar compostos fluorados orgânicos.
O efeito do herbicida benfluralina no desenvolvimento de plântulas de P.
pinea e na colonização das raízes pelos fungos P. tinctorius e S. bellinii foi avaliado.
O herbicida benfluralina teve um efeito inibitório no crescimento das plântulas assim
como na colonização das raízes pelos fungos ECM. No entanto, a inoculação com o
fungo P. tinctorius permitiu o crescimento das plântulas de P. pinea e a absorção de
nutrientes em solos contaminados com o herbicida, mas o mesmo não foi observado
na inoculação com S. bellinii. Os resultados demostram que o P. tinctorius conferiu
proteção às plântulas de P. pinea contra a toxicidade da benfluralina, sugerindo que a
associação P. tinctorius - P. pinea poderá ser vantajosa no crescimento de plantas em
solos contaminados. O efeito da benfluralin em plântulas de P. pinea micorrizadas
com os mesmos fungos também foi estudado. As plântulas micorrizadas
apresentaram crescimento superior a plantas controlo na presença de benfluralina,
embora o herbicida tenha afetado a colonização dos fungos e a absorção de
nutrientes. O papel dos fungos ECM na resposta antioxidante da plântula na ausência
e presença da benfluralina também foi avaliado. A inoculação com S. bellinii
proporcionou uma maior peroxidação lipídica na planta na presença de benfluralina,
enquanto a inoculação com P. tinctorius diminuiu os danos celulares, sugerindo que
este fungo teve um papel protetor contra a benfluralina. A atividade das enzimas
superóxido dismutase e catálase aumentou nas plântulas não-inoculados expostas à
benfluralina, contudo o mesmo não foi evidenciado nas plântulas inoculadas,
sugerindo que a resposta depende das espécies de fungos e do nível de stress
aplicado. O presente estudo confirma que a associação P. tinctorius ¬ P. pinea pode
aumentar a proteção e crescimento da planta em solos contaminados.
Em geral, P. tinctorius foi capaz de tolerar e degradar compostos fluorados
orgânicos, potenciando o crescimento e desenvolvimento de P. pinea em solos
contaminados com benfluralin. Como tal, P. tinctorius poderá ser uma importante
ferramenta na reconversão de solos contaminados com poluentes orgânicos.
-vii-