NEW INSIGHT INTO TRANSLATION DURING YEAST PROGRAMMED CELL DEATH
ABSTRACT
Global mRNA translation impairment has been described during the course of
apoptosis in both mammalian and yeast. Nevertheless, the molecular pathways
modulating translation during different scenarios of yeast apoptosis are still largely
unexplored. Here we show by polysome profile analysis an impairment in capdependent translation initiation, correlated with alterations in translation machinery,
such as the decrease in eIF4A levels and the phosphorylation of eIF2 by Gcn2 protein
kinase upon acetic acid treatment. Gcn2p proved to play a preponderant role for the
progression of the acetic acid-induced apoptosis, not only through the repression of
cap-dependent translation initiation, but also by the induction of a cell cycle arrest in
G0/G1 phase. Despite the observed impairment of cap-dependent translation
initiation, some mRNAs, such as AIF1 and eIF4G, were translated during acetic acid
treatment. eIF4G harbors an IRES in the 5’ untranslated region (5’UTR) of the mRNA
allowing its translation by a cap-independent IRES-mediated translation, being also
crucial for an efficient IRES-mediated translation of other mRNAs. The inhibition of the
cap-dependent translation initiation associated with the observation of AIF1 and eIF4G
efficient translation during acetic acid treatment made us question the possibility of an
alternative IRES-mediated translation occur during acetic acid treatment.
Furthermore, the translation machinery alterations proved to be dependent of
the yeast caspase like protease, metacaspase, which induced also the specific
fragmentation of the glycolytic enzyme glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
(GAPDH). Although metacaspase role in the induction of the apoptosis is well
established, its specific substrates were still unknown. The fact that GAPDH is
specifically cleaved by metacaspase, suggests a role of this enzyme in the apoptotic
process. In mammalian cells, GAPDH interacts with some virus and cellular mRNAs
repressing their internal ribosome entry site (IRES)-mediated translation. GAPDH
cleavage by caspase-1 during apoptosis suggests a regulation of its function by
derepression of the IRES-mediated translation.
Upon the inhibition of translation initiation during acetic acid treatment, eEF1A,
a translation elongation factor responsible for the delivery of aminoacyl-tRNAs to the
ribosomes, appears to play a function unrelated to translation elongation. A proteomic
analysis combined with a proteinase K assay showed that upon acetic acid treatment,
eEF1A is fragmented and the eEF1A N-terminal fragments are present in mitochondria
where they appear to play a pro-apoptotic role. Apart from its role in translation this
protein is also an actin-binding protein being responsible for the actin cytoskeleton
organization. This re-localization to mitochondria reduces its binding to actin leading to
actin cytoskeleton alterations which proved to be conserved from yeast to mammalian
cells.
Our previously reported proteomic analysis in the same apoptotic conditions
revealed an increased expression of heat shock protein 90 (HSP90) isoforms. We
herein demonstrate by microarray analysis of polysomal mRNAs combined with the
HSP90 isoforms 5’ untranslated region (5’UTR) expression in monocistronic reporter
plasmids harboring an hairpin, that HSP90 isoforms are translated by a capindependent mechanism mediated by (IRES) elements. Moreover, genetic abrogation
of HSP90 isoforms indicate divergent roles for HSP90 isoforms, Hsc82p acts as a prosurvival and Hsp82p as a pro-death molecule, upon the acetic acid treatment. In fact,
the deletion of HSC82 leads to a severe necrotic cell death, in spite of an apoptotic cell
death, upon acetic acid treatment. These undisclosed functions of yeast HSP90
isoforms were confirmed through pharmacological inhibition of HSP90 activity, using
17-allylaminogeldanamycin (17AGG), and by the overexpression of each HSP90
isoform during acetic acid. These results suggest that the efficiency of HSP90 isoforms
mRNA translation is an important component of the cellular response to acetic acid. In
summary, the results presented in the scope of this thesis contributed to the
understanding of the translation mechanisms regulating yeast cell death processes.
Candidate: Maria Alexandra Oliveira da Silva
Supervisor: Paula Ludovico
Date: 3rd April 2012
RESUMO
A inibição global da tradução foi descrita no decurso da apoptose tanto em
leveduras como em mamíferos No entanto, as vias moleculares que modulam a
tradução em diferentes cenários de morte celular programada (MCP) em levedura são
ainda desconhecidas. Neste trabalho demonstramos, através de perfis polissomais,
uma inibição da iniciação da tradução dependente da estrutura cap, correlacionada
com alterações na maquinaria de tradução, tais como a redução dos níveis de eIF4A e
a fosforilação do eIF2 mediada pela cinase Gcn2p, durante o tratamento com ácido
acético. Gcn2p provou desempenhar um papel relevante na progressão da morte
induzida por ácido acético não só pela repressão da iniciação da tradução dependente
de cap mas também através da indução de um bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1.
Apesar da diminuição da iniciação da tradução dependente de cap, alguns mRNAs, tais
como o AIF1 e o eIF4G, são traduzidos durante o tratamento com ácido acético. eIF4G
possui um internal ribosome entry site (IRES) na região 5' não traduzida (5'UTR) do
mRNA o que permite a sua tradução independente de cap, sendo também
fundamental para a tradução eficiente de outros mRNAs regulados por IRES. A inibição
da iniciação da tradução dependente de cap associada à observação da tradução de
AIF1 e eIF4G levanta a possibilidade da ocorrência de uma tradução alternativa
mediada por IRES durante o tratamento com ácido acético. Para além disso, as
alterações na maquinaria de tradução observadas durante o tratamento com ácido
acético parecem ser dependentes da ação da caspase de leveduras, a metacaspase,
que provou ser ainda responsável pela clivagem específica da enzima glicolítica
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Embora a importância da metacaspase
na execução da apoptose esteja bem estabelecida, os substratos desta protease são
ainda desconhecidos. O fato da GAPDH ser especificamente clivada pela metacaspase,
sugere um papel desta enzima no processo apoptótico. Em mamíferos, a GAPDH
interage com alguns mRNAs celulares e de vírus inibindo a sua tradução mediada por
IRES. A clivagem da GAPDH pela caspase-1 durante a apoptose sugere uma regulação
da sua função na tradução e a desrepressão da tradução mediada por IRES. Após a
inibição da iniciação da tradução durante o tratamento com ácido acético, o fator de
elongação da tradução eEF1A, responsável pela entrega dos aminoacil-tRNAs nos
ribossomas, parece desempenhar uma função independente do processo de tradução.
Uma análise proteómica em conjunto com um ensaio de proteinase K mostraram que,
após o tratamento das células com ácido acético, o eEF1A é fragmentado e os
fragmentos N-terminais de eEF1A são detetados na matriz mitocondrial onde parecem
desempenhar um papel pró-apoptótico. Para além da sua participação no processo de
tradução esta proteína está também associada à actina sendo responsável pela
organização do citoesqueleto de actina. A relocalização para a mitocôndria reduz a sua
ligação à actina induzindo alterações no citoesqueleto de actina que provaram ser
conservados tanto em levedura como em mamíferos.
Anteriormente, uma análise proteómica, nas mesmas condições apoptóticas,
revelou um aumento dos níveis das isoformas da proteína de choque térmico 90
(HSP90). A análise de microarrays dos mRNAs presentes em frações polissomais
complementada com a expressão dos 5’UTR das isoformas da HSP90 em plasmídeos
monocistrónicos contendo um gancho no 5’UTR, demonstrou a presença de IRES no
5’UTR das HSP90 mediando a sua tradução independente de cap. A deleção genética
das isoformas das Hsp90 sugere que estas desempenham funções divergentes durante
o tratamento com ácido acético, Hsc82p atua como uma molécula de sobrevivência e
Hsp82p como uma molécula pró-apoptótica. Além disso, a deleção da HSC82 conduz a
uma drástica morte celular necrótica durante o tratamento com ácido acético,
sugerindo que estas isoformas são cruciais para o balanço e equilíbrio entre a
apoptose e a necrose. Estas novas funções das isoformas da HSP90 foram confirmadas
através da inibição farmacológica da atividade das HSP90, utilizando 17allylaminogeldanamycin (17AGG), e da sobreexpressão de cada isoforma em células
tratadas com ácido acético. Estes resultados sugerem que a eficiência de tradução do
mRNA das isoformas da HSP90 é um componente importante da resposta celular ao
ácido acético. Em resumo, os resultados apresentados no âmbito desta tese
contribuíram para o aumento do conhecimento dos mecanismos de tradução que
regulação processo apoptótico em levedura.
Candidata: Maria Alexandra Oliveira da Silva
Orientadora: Paula Ludovico
Data: 3 Abril 2012