Milena Peixoto do Valle
Mestranda em Endocrinologia Genética
Faculdade de Medicina da USP
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Sistemas de sensores de DNA se baseiam na imobilização da
sonda fita simples de DNA (ssDNA) na superfície da
nanopartícula,
que reconhece a complementariedade da
sequência do DNA alvo (tDNA) por hibridização do DNA.
A hibridização pode ser mensurada eletronicamente,
opticamente, eletroquimicamente ou usando um dipositivo
sensível de massa.
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São regiões de sequência de DNA curtas (menos de 800 pares de base)
que apresentem variabilidade suficiente para discriminar espécies
Um ensaio de código de barras de DNA utiliza oligonucleotídeos
modificados em nanopartículas (AuNPs) para amplificação do sinal e
nanopartículas magnéticas
(MNPs) para facilitar a separação do
complexo de nanopartículas da amostra.
B
Objetivo:
Conseguir detectar e identificar a presença do gene do “antígeno A”
(pagA) - Bacillus anthracis e o gene “elemento de inserção” (Iel) de
Salmonella enteritidis simultaneamente.
Componentes:
 O sistema de biosensores é composto por três nanopartículas:
nanopartículas de ouro (AuNPs), nanopartículas magnéticas (MNPs), e
nanopartículas rastreadoras (NTs, como PbS, CdS e ZnS).
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Sobre a abordagem com ensaios de barcode DNA (bDNA) , esta técnica teria vantagens
sobre a detecção óptica , muito usada em ensaios com nanopartículas, que ocupam muito
espaço físico.
O requerimento de espaço físico pode ser minimizado utilizando o sistema eletroquiímico
para diagnósticos biomédicos proposto, que pode ser integrado a micro sistemas, incluindo o
processamento do sinal.
No entanto , sistemas portáteis que poderiam ser utilizados em campo, ainda estão sendo
desenvolvidos.
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Culturas - Bacillus anthracis e Salmonella enteritidis
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Miniprep
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PCR pagA(B. anthracis) e Iel (S.enteritidis)
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Eletroforese
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Purificação
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Diluições em H2O
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[tDNA] confirmadas por espectrofotômetro
Oligonucleotídeos thiolados foram conjugados às nanopartículas:
Para a detecção do S. enteritidis pelo gene insertion element (Iel)
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A primeira sonda de DNA (1pDNA) na AuNPs: 5-AATATGCTGCCTACTGCCCTACGCTT-SH-3’;
A segunda sonda de DNA(2pDNA) nas MNPs: 5-SH-TTTATGTAGTCCTGTATCTTCGCCGT-3’.
Para a detecção do gene pagA do B. anthracis
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A primeira sonda de DNA (1pDNA) na AuNPs : 5-SH-GGAAGAGTGAGGGTGGATACAGGCT-3’;
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A segunda sonda de DNA(2pDNA) nas MNPs : 5-AGATTTAAATC TGGTAGAAAGGCGG–SH-3
-bDNA nas AuNPs para detectar ambos os genes : 5-NH2-TTATTCGTAGCTAAAA AAAAAA-SH3’
A dimensão e as propriedades espectroscópicas das AuNPs e dos NTs
foram caracterizadas pela TEM (Transmission Electron Microscope).
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Às MNPs foram adicionadas as 2pDNA respectivas para cada gene (pagA e Iel).
Às AuNPs, foram adicionados o bDNA juntamente à 1pDNA na proporção 100:1
(complexo estável a TA).
A esse conjugado são adicionado os NTs específicos para cada 1pDNA (pagA e
Iel).
A- bio bDNA + NTs + crosslinkers
B- bio bDNA + NTs
C- CdS NTs
Diluições de
[tDNA]
tDNA
aquecido a
94oC
Separação
dsDNA em
ssDNA
Resfriamento
rápido 4oC
Foram adicionadas as MNP-2pDNA
Formação do complexo MNP-2pDNA/tDNA – lavagem
Adicionado o complexo 1pDNA-AuNP-bDNA-NTs
Formado o complexo MNP-2pDNA/tDNA/1pDNA-AuNP-bDNA-NTs
Aplicação do complexo ao campo magnético – 5 lavagens
O sanduíche lavado foi dissolvido em ácido nítrico que libera os íons NTs (Pb2+
ou Cd2+).
Depois é acrecentada uma solução ácida com bismuto que permite a
mensuração etroquímica dos NTs .
Square-Wave Anodic Stripping
Voltammetry (SWASV)
Razões para o deslocamento do pico:
-DDP Ag/AgCl
-SPCE diferentes
Pb
Cd
-0,61
-0,87
?
“The possible reason would be that the
washing steps were not thorough and
the unreacted PbS NTs generated the
noise.”
Cd/Salm.
Pb/Antr.
-0,87
-0,61
B. anthracis, Pb ( −0.61V)
(tDNA-50 ng/mL, 5 ng/mL,
500 pg/mL,
e50 pg/mL) são 38uA,
34uA, 29.5uA, and 23uA,
respectivamente.
S. enteritidis, Cd(−0.87V)
(tDNA-50 ng/mL, 5 ng/mL,
500 pg/mL, and 50 pg/mL)
são 42.5uA, 35uA, 32uA, e
27uA, respectivamente
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A conjugação dos grupos carbolixílicos nos NTs e a conjugação dos grupos amino nos biobarcoded AuNPs foi eficiente.
Após mixar as nanopartículas
com o tDNA
2pDNA/tDNA/1pDNA-AuNP-bDNA-NTs) foi formado.
o sanduíche
estrutural (MNP-
Os sinais eletroquímicos emitidos pelos NTs liberados aumentam com o aumento da [tDNA].
O biossensor tem boa especificidade e sensibilidade na detecção individual do gene pagA de
B. anthracis usando PbS NTs na concentração mínima de 0.2 pg/mL.
O limite da detecção deste sensor multiplex bio-barcoded DNA é 0.5 ng/mL para o gene
“insertion element “(Iel) de S. enteritidis utilizando CdS, e 50 pg/mL para ogene “pagA” de
B. anthracis utilizando PbS NTs.
O sensor de código de barras baseado nas nanopartículas tem potencial para aplicação da
múltipla detecção de agentes de bioterrorismo, co – infeção, e múltiplos contaminantes numa
mesma amostra...
FIM