Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010
ISSN 1517-8595
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EXPRESSÃO DA ALFA E BETA AMILASE DURANTE A GERMINAÇÃO DE
CEVADA
Iratan Jorge dos Santos 1 , Yaro Luciolo dos Santos 2, Maria Goreti de Almeida Oliveira 3,
Paulo Henrique Alves da Silva 4
RESUMO
O presente trabalho teve o objetivo de monitorar a expressão da alfa e beta amilase, durante o
processo de maltagem. Foram utilizadas sementes de cevada (Hordeum vulgare L.) da
variedade BR-2, umedecidas em bandejas de inox, através do processo cíclico 2/4/1/4/1
intercalado que envolve umedecimento com água potável seguido de repouso a 20ºC, em
seguida foi colocada para germinar com camada de 4 cm de espessura a 16ºC por 84 horas com
umidade em torno 42 – 45 %, repondo água de 16 e 32 horas. Foram retiradas amostras em
intervalos regulares de 8 horas para testes enzimáticos. Durante a germinação as atividades da
enzima alfa amilase foram crescentes com incremento 24 e 72 horas. Com os maiores picos de
aumento em relação ao tempo de germinação, pode-se monitorar a formação da enzima
sugerindo melhores hidrólises amiláceas. Já a beta amilase Os maiores incrementos da atividade
foram notados após 24, 32, e 64 horas de germinação. O estudo dos maiores aumentos dessa
enzima em função da faixa de tempo de germinação pode fornecer informações necessárias para
produção de malte com teores enzimáticos variados, sendo também importante, por ser
indicativo de melhor poder diastático, crucial na produção de açúcares redutores.
Palavra-chave: Hordeum vulgare L.; enzimas; maltagem; poder diastático.
EXPRESSION OF ALPHA AND BETA AMYLASE DURING THE GERMINATION OF
BARLEY
ABSTRACT
This study seeks to monitor the expression of alpha and beta amylase during malting process.
Seeds of barley (Hordeum vulgare L.) of the variety BR-2, in trays of moistened steel, through
cyclical process involving wetting 2/4/1/4/1 intermingled with drinking water put to rest at 20 °
C were then placed to germinate on a 4 cm thick layer at 16 ° C for 84 hours at a humidity level
ranging from 42 to 45%. Water was restored at intervals of 16 - 32 hours. Samples were taken
at regular intervals of 8 hours for enzyme tests. During germination, the activity of the alpha
amylase enzyme increased with time extension to 24 and 72 hours. At the highest increasing
peaks, in relation to germination time, one can monitor the formation of the enzyme and suggest
better amylases hydrolysis. As for the beta amylase, the biggest increases in activity were noted
after 24, 32, and 64 hours of germination. The study of the largest increase of this enzyme as a
function of time of germination may provide the information needed to produce malt with
varied enzyme levels, being also an important indication of much better diastatic power –
crucial for the production of sugars.
Keyword: Hordeum vulgare L., enzymes, malting, diastatic power
.
Protocolo 103.002 80 de 25/09/2008
1
Professor Doutor do Departamento de Tecnologia – Universidade Estadual de Feira de Santana. Br 116, km 03 Campus Universitário
CEP:44031-460 Feira de Santana – BA, Brasil. E-mail: [email protected].
2
Mestrando do Departamento de Microbiologia – Universidade Federal de Viçosa. Avenida Peter Henry Rolfs s/n, Campus Universitário,
CEP 36579-000 Viçosa – MG, Brasil. E-mail: [email protected]
3
Professora Doutora do Departamento de Bioquímica – Universidade Federal de Viçosa. Avenida Peter Henry Rolfs s/n, Campus
Universitário, CEP 36579-000 Viçosa – MG, Brasil. E-mail: [email protected].
4
Professor Doutor do Departamento de Tecnologia de Alimentos - Universidade Federal de Viçosa. Avenida Peter Henry Rolfs s/n, Campus
Universitário, CEP 36579-000 Viçosa – MG, Brasil. E-mail: [email protected]
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Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada
INTRODUÇÃO
Na germinação da semente de cevada
durante a etapa de maltagem ocorrem três fases
evidentes: embebição de água, alongamento da
célula e aumento do número de células. O
início da germinação da cevada ocorre somente
a partir de determinados teores de umidade
acima de 30% (Ma et al., 2002; Helland et al.,
2002).
As enzimas na cevada são produzidas
como resultado da ação de hormônios, que são
distribuídos com a penetração de água do
escutelo ao longo da camada de aleurona
(Maya-ampudia & Bernal-lugo, 2006). Dentre
as enzimas produzidas a alfa e beta amilase
caracterizam-se por serem as principais
enzimas produzidas durante a germinação
(Onyeka & Dibia, 2002; Muralikrishna &
Nirmala, 2005).
A
alfa-amilase
(1,4-α-Dglucanohidrolase,
EC
3.2.1.1,
enzima
dextrinizante) pode atacar as cadeias dos
componentes do amido em qualquer ponto no
interior da cadeia linear. Isto eqüivale dizer que
a alfa-amilase é uma endoenzima que hidrolisa
ligações O-glicosídicas α(1-4), produzindo
oligossacarídeos que contêm ligações α(1-6),
além de glicose e maltose. As ligações α(1-6)
não são quebradas pela alfa-amilase (Georgkraemer et al., 2000; Macgregor et al, 2001;
Juge et al., 2006; Xiao et al., 2006; Eneje et al.,
2004; Adewale et al., 2006).
Segundo Kunze (1996), a alfa-amilase
não está acentuadamente presente na cevada; a
maior parte da alfa-amilase é produzida no
segundo e quarto dias de germinação e a
quantidade desta enzima pode ser aumentada
durante o prolongamento da germinação.
Segundo Georg-kraemer et al. (2000) é crucial
saber os momentos de ascensão das amilases
durante a germinação.
A beta amilase, α-1,4- α glucan
maltohidrolase (EC 3.2.1.2) é uma exoenzima e
hidrolisa ligações α(1-4), a partir da
extremidade não-redutora, produzindo maltose
(Clark et al., 2003; Mohan et al., 2005; Brien &
Fowkes, 2005; Sahlström et al., 2003).
Antes da germinação, a beta-amilase já
está presente em quantidades maiores na
Santos et al.
cevada, quando comparada à alfa-amilase.
Depois de uma diminuição inicial, a quantidade
de beta-amilase tem aumentos consideráveis no
segundo e terceiro dias de germinação (Molinacano et al., 2000, 2001; Kunze, 1996).
A quantidade de alfa e beta-amilase
depende de vários fatores: variedade da cevada,
condições climáticas, tamanho do núcleo
embrionário, conteúdo de água mais elevado na
produção de malte verde, temperatura de
germinação e maceração; quanto mais elevada
à temperatura, mais rápido é o processo (Saika
et al., 2005). Em função da importância desses
fatores se faz necessário o estudo das condições
com determinação de variáveis específicas de
forma a otimizar as atividades enzimáticas.
O objetivo do presente trabalho foi
examinar as mudanças na expressão da alfa e
beta amilase no endosperma da cevada da
variedade BR2 em termos de atividade
específica durante a germinação no processo de
maltagem, de forma a verificar as maiores
produções em relação ao tempo de germinação.
Baseado no ponto de vista que são enzimas de
fundamental importância para fabricação da
cerveja na etapa de mosturação, pois são
responsáveis pela hidrólise dos polissacarídeos
em açúcares mais simples.
MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho foi conduzido nos
Laboratórios
de
Armazenamento
e
Processamento
de
Produtos
Agrícolas
(Departamento de Engenharia Agrícola), de
Tecnologia e Produção de Sementes
(Departamento de Fitotecnia) e de Enzimologia
(Núcleo de Biotecnologia Aplicada a
Agropecuária), todos da Universidade Federal
de Viçosa, Viçosa-MG.
Foram utilizadas sementes de cevada
(Hordeum vulgare L.) da variedade BR-2,
processadas, fornecidas pela Companhia
Brahma (Filial Malteria Navegantes, Porto
Alegre-RS).
As principais etapas do processo de
malteação utilizadas no experimento foram:
classificação, maceração, germinação, secagem
e desbrotamento (Figura 1).
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Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada
 100 − U i
Mt f = Mt i 
 100 − U
f

CLASSIFICAÇÃO
MACERAÇÃO
GERMINAÇÃO
SECAGEM
DESBROTAMENTO
Figura 1 - Fases do processo de malteação da
cevada.
Na etapa de maceração foram utilizadas
amostras de 300 g de cevada, acondicionadas
em bandejas de alumínio inoxidável, em um
ambiente com temperatura controlada a 20 oC.
Utilizou-se um processo cíclico,
denominado “2/4/1/4/1” intercalado, recomendado pela Empresa Brahma. Este processo
consiste de três etapas, que envolvem
umedecimento com água potável, seguido de
repouso ao ar ambiente. Na primeira etapa, o
período de reumedecimento foi de 2 horas e o
de repouso, 4 horas. Na segunda, os períodos
de reumedecimento e de repouso foram,
respectivamente, de 1 e 4 horas. Finalizando,
na terceira etapa, os grãos foram umedecidos
durante 1 hora. As pesagens das amostras
foram realizadas no início do teste e após 2, 6 e
12 horas. Os grãos, durante o processo, foram
revolvidos manualmente, para retirada de CO2.
Em todos os testes, as bandejas
provenientes da etapa de maceração, contendo
camadas finas de 4 cm de grãos, para facilitar o
controle de CO2, foram colocadas em
germinadores a 16 oC, onde permaneceram
durante 84 horas. O teor de água do produto,
controlada por pesagens periódicas em balança
eletrônica, foi mantida em torno de 42 – 45%
b.u., com reposição de água nos intervalos de
tempo de 16 e 32 horas. A quantidade de água
usada na reposição foi determinada pela
equação:
69
Santos et al.




(1)
Mtf = massa total final; Mt i = massa total
inicial; Ui = umidade inicial; Uf = umidade
final.
Durante o período de germinação
(84 horas), foram retiradas amostras em
intervalos regulares de 8 horas. Estas amostras
foram submetidas a testes enzimáticos, para o
acompanhamento do desenvolvimento da
atividade da beta-amilase.
Cinco gramas de malte, finamente
triturados, foram dissolvidos em 100 ml de
cloreto de sódio 0,5%, permanecendo por 1
hora a 30 oC, em constante agitação. Em
seguida, foram centrifugados (9.000 rotações
por 5 minutos) e filtrados em papel-filtro. Dez
mililitros do filtrado, diluídos em 100 ml de
cloreto de sódio 0,5%, foram deixados à
temperatura ambiente, antes da determinação
da atividade.
Foram pipetados 0,04 – 1,0 ml da
solução de maltose com 5 micromoles/ml,
fazendo-se a diluição para 2 ml, em cada tubo,
com água deionizada. Após adicionar 1 ml de
ácido dinitrossalicílico reativo de cor à solução,
esta foi incubada em banho de água fervente,
durante 5 minutos. Após o resfriamento à
temperatura ambiente, a solução foi diluída
com 10 ml, de água deionizada, em cada tubo,
e fez-se a leitura a 540 nm, com o aparelho
calibrado com o branco. Foi determinada a
maltose liberada na curva-padrão.
A atividade da alfa-amilase foi
determinada pelo método de Bernfeld (1955),
utilizando amido como substrato. Para isto, foi
pipetado 0,5 ml da solução de extrato de cevada
ou malte ou água, no caso do controle,
adicionado a 0,5 ml da solução de amido 1%
(p/v), em tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH
6,9, com 0,006 M de cloreto de sódio. Após a
incubação dessa solução durante 3 minutos, a
25 oC,
adicionou-se
1 ml
de
ácido
dinitrossalicílico 1% (p/v), reativo de cor, e,
novamente, ela foi incubada durante 5 minutos,
em banho-maria. Após este procedimento,
levou-se a solução a 25 oC e, em seguida, foram
adicionados 10 ml de água deionizada,
determinando-se a absorvância da mistura de
reação a 540 nm. A quantidade de micromoles
de maltose liberada foi obtida por meio da
curva-padrão. A partir desses valores, foram
calculadas as atividades, utilizando a seguinte
equação:
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70
U mg =
Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada
Micromoles liberados
3 minutos x mg proteinas
(2)
Utilizou-se o mesmo procedimento
anterior, para determinação da beta-amilase.
Neste caso, a solução-tampão utilizada foi
acetato de sódio 0,016 M, pH 4,8.
As dosagens de proteínas foram
realizadas pelo método do ácido bicinconínico
Smith et al. (1985), utilizando albumina sérica
bovina como padrão, na concentração de 2,0
mg/mL de água deionizada.
Os compostos utilizados para reagir com
as proteínas da cevada foram os reagentes A e
B.
Para o preparo do reagente A,
dissolveram-se 1,0 de bicinconinato de sódio,
160,0 mg de tartarato de sódio, 1,8 g de
carbonato de sódio, 400,0 mg de hidróxido de
sódio e 950,0 mg de bicarbonato de sódio, em
Santos et al.
100,0 ml de água deionizada, e o pH foi
ajustado para 11,3.
Para o preparo do reagente B,
dissolveram 4,0 g de sulfato de cobre em 100,0
ml de água deionizada.
Para as dosagens, em triplicatas a 50 µl
da amostra, adicionou-se 1,0 ml do reagente de
trabalho (100:2 reagente A: reagente B). A
solução foi agitada e levada para banho-maria a
37 oC, por 30 minutos. Em seguida, os tubos
foram resfriados à temperatura ambiente, por
20 minutos, e a absorvância foi lida a 540 nm.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Procedendo ao processo germinativo do
grão de cevada sob temperatura controlada de
16°C foi conferido um incremento na enzima
alfa-amilase (Figura 2).
Figura 2 - Perfil de formação da alfa-amilase
Nas primeiras horas de germinação, até
atingir 8 horas, ocorreu redução, da atividade
específica da enzima alfa-amilase de 79% que
provavelmente segundo Georg-kramer et al.
(2000), pode estar ligada a presença de um
inibidor cujo principal propósito é amortecer a
atividade da alfa amilase para evitar uma
germinação prematura (Figura 2). Em trabalhos
desenvolvidos por Kunze (1996) também foi
observado que a alfa-amilase não está
acentuadamente presente na cevada não
malteada. No intervalo de tempo restante
durante o processo germinativo a atividade da
enzima permaneceu sempre em crescimento.
Pode-se observar que nas 8 horas finais
do primeiro dia, até completar 24 horas, ocorreu
o primeiro grande aumento da enzima alfaamilase (141%), seguido de um aumento
moderado até 64 horas (160%) (Figura 2). Após
72 horas de germinação, notou-se um aumento
acentuado da enzima, que passou de
0,0437 U/mg (tempo zero) para 0,0828 U/mg
(tempo 84 horas), resultados que estão de
acordo com relatos de Kunze (1996), onde
afirma que a maior parte da alfa-amilase é
produzida no segundo e quarto dias de
germinação e a quantidade desta enzima pode
ser aumentada durante o prolongamento da
germinação, quando são requeridos maltes
muito ricos em enzimas para converter grandes
quantidades de amido nas cervejarias. Também
de acordo com trabalhos efetuados por Georgkraemer et al. (2000) os níveis das amilases
produzidas na cevada aparecem em ascensão
durante a maltagem com atividades diferentes
ao longo do processo, e é importante determinar
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Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada
quando este momento ocorre durante a
germinação porque é crucial para obter máxima
produção da enzima para assegurar a
degradação do amido em açúcares mais simples
utilizados no processo fermentativo e para se ter
um controle do tempo de germinação.
Provavelmente
os
aumentos
e
diminuições na síntese da alfa amilase estão
relacionadas a processo fisiológico na formação
do grão e no desenvolvimento e início da
germinação. Essa síntese está submetida ao
controle hormonal das giberelinas na camada de
Santos et al.
71
aleurona (Maya-ampudia & Bernal-lugo, 2006;
Muralikrishna & Nirmala, 2005).
Durante as oito primeiras horas de
germinação (Figura 3), foi observada redução,
da atividade específica da enzima beta-amilase
de 81% em relação ao total inicial da enzima.
Isso pode estar relacionado provavelmente com
a forma compacta em que a beta amilase está
presente no grão de cevada, não tendo sua
atividade totalmente evidenciada. Outras
diminuições durante a germinação também
foram observadas em trabalhos por Molinacano et al. (2001).
Figura 3 - Perfil de formação da beta amilase em atividade específica
No intervalo de tempo restante, a
atividade da enzima foi sempre crescente
(Figura 3) o que concorda com os resultados
obtidos por Ziegler (1999) e Evans et al.
(1997), que relataram aumentos sensíveis na
atividade enzimática no decorrer da
germinação. Foram observados três aumentos
marcantes na atividade específica nos tempos
de germinação de 24, 32 e 64 horas. Os
resultados estão parcialmente de acordo com os
de Kunze (1996), que relatou um aumento da
enzima nos segundo e terceiro dias de
germinação. As atividades dessa enzima podem
estar relacionadas a processos fisiológicos
ocorrentes na formação do grão e no inicio do
desenvolvimento da germinação. Esses
resultados estão de acordo com as pesquisas
efetuadas por Evans et al. (1997) que também
observou as maiores produções da beta amilase
durante o desenvolvimento do grão tendo as
maiores atividades no segundo dia de
germinação e nos dias subsequentes, que podem
estar relacionados à mudança da forma
compacta para forma livre que ocorre nessa
enzima. Em pesquisas realizadas por Wang et
al. (2003) o autor afirma que a beta-amilase é
sintetizada
e
acumulada
durante
desenvolvimento do grão, apresenta-se em duas
formas principais: um complexo de proteína
insolúvel (forma compacta) principalmente
associado com a periferia dos grânulos de
amido, e uma forma solúvel ou livre. A forma
compacta é ligada por pontes de dissulfeto
situadas na periferia dos endospermas dos
grânulos de amido. A forma compacta não é
completamente inativa, mas expressa uma
fração da atividade após a liberação. A ativação
enzimática pode ser em decorrência da redução
das ligações dissulfeto levando a uma mudança
na conformação na parte ativa ou em
conseqüência de alguma despolimerização de
oligômeros.
A atividade de beta-amilase nesse
experimento passou de 0,0510 U/mg (tempo
zero) para 0,1136 U/mg (tempo 84 horas), um
aumento de 2,23 vezes (Figura 3). A
otimização do tempo de germinação
adequado para atingir o nível de atividade da
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Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada
beta amilase e encerrar a germinação é
fundamental para atingir bons resultados na
maltagem. Para Georg-kramer et al. (2000)
muitas empresas produtoras de malte vêm
tentando reduzir o período de germinação no
processo de maltagem, o que permitiriam a
redução de despesas e a maltagem de uma
quantidade de grãos em menos tempo. O
processo de maltagem induz a germinação e
assegura o crescimento da semente com
produção de beta amilase de relevante
influência no poder diastático.
CONCLUSÃO
Existe sempre uma tendência de aumento
na atividade das duas enzimas.
A beta amilase apresenta maiores
atividades que a alfa amilase nas condições
testadas
Os maiores aumentos de atividade da alfa
amilase acontecem após 24 e 72 horas de
germinação. Já para beta amilase os maiores
incrementos da atividade específica ocorrem
após 24, 32, e 64 horas de germinação.
O estudo dos maiores aumentos dessa
enzima em função do faixa de tempo de
germinação forneceu informações necessária
para produção de malte com teores enzimáticos
variados, podendo ser utilizado na hidrólise de
amidos de varias origens.
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