CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA
PAULA SOUZA
FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA - FATEC
GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS
MICROPROPAGAÇÃO DE CANA-DE-AÇÚCAR VIA ORGANOGÊNESE
DIRETA
DANIELA FERRAZ DE CAMPOS SILVA
PIRACICABA - SP
JUNHO/2011
DANIELA FERRAZ DE CAMPOS SILVA
MICROPROPAGAÇÃO DE CANA-DE-AÇÚCAR VIA ORGANOGÊNESE
DIRETA
Trabalho de Graduação apresentado ao Curso
de Tecnologia em Biocombustíveis da Faculdade
de Tecnologia de São Paulo como requisito
parcial à obtenção do título de Tecnólogo em
Biocombustíveis.
Orientadora: Profª. Drª. Daniela Defávari do
Nascimento.
Co-orientador: Dr. Enio Tiago de Oliveira.
PIRACICABA - SP
JUNHO/2011
FICHA CATALOGRÁFICA
Silva, Daniela Ferraz de Campos.
Micropropagação de cana-de-açúcar via organogênese direta/ Daniela Ferraz de
Campos Silva. Piracicaba, 2011.
p. 42.
Orientadora: Daniela Defávari do Nascimento
Co-orientador: Enio Tiago de Oliveira
Trabalho de Conclusão de Curso – Faculdade de Tecnologia de São Paulo.
Faculdade de Tecnologia em Biocombustíveis.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Profa. Dra. Daniela Defávari do Nascimento – Orientadora
___________________________________________________________________
Dr. Enio Tiago de Oliveira – Co-orientador - ESALQ /USP – Piracicaba
___________________________________________________________________
Prof. Paulo Cesar Doimo Mendes – FATEC – Piracicaba
Ao meu grande companheiro Rogério,
que está comigo em todas as horas,
me apoiando e me incentivando.
Aos meus queridos filhos, Gabriel e Laura
que são a razão da minha vida.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus que deu forças e iluminou o meu caminho durante esta etapa da minha vida.
Agradeço à minha orientadora professora Daniela Defávari do Nascimento pela
orientação, confiança e amizade.
Ao meu co-orientador Dr. Enio Tiago de Oliveira, pelo auxílio impagável na produção
do trabalho.
A ESALQ por ter disponibilizado a utilização do laboratório do Setor de
Biotecnologia.
A Tatiana Bistaco, do laboratório de Biotecnologia da ESALQ, pela sua paciência e
disposição em ensinar, supervisionar e revisar o trabalho.
A todos os professores que colaboraram ao longo destes anos, para o
enriquecimento de meu intelecto.
Em especial a professora Luciana Fisher por auxílios importantes, que possibilitaram
a conclusão do trabalho.
Aos colegas de classe pela espontaneidade e alegria na troca de informações e
materiais numa rara demonstração de amizade e solidariedade.
Especialmente as minhas amigas Carina e Suellen, pelo incentivo nas horas difíceis,
pela amizade e pela nossa cumplicidade no transcorrer do curso.
A meus pais, irmãs, sobrinhos e toda família pela paciência em tolerar a minha
ausência e apreensão.
E, finalmente aos meus grandes companheiros, meu marido Rogerio, pelo seu
incentivo incontestável, e pelos meus amados filhos Gabriel e Laura, que suportaram
toda minha angústia e falta.
I
‘’...se vi mais longe, foi por estar sobre ombros de gigantes’’
Sir Isaac Newton (1643-1727)
II
RESUMO
A cana-de-açúcar é uma cultura que assume lugar de destaque na economia
mundial e no país. Isso se dá principalmente ao fato da cultura proporcionar um
aproveitamento total da matéria prima, quer seja in natura, ou quando processada.
Assim, cada vez mais a cultura é inserida em programas que visam obter plantas
com características desejáveis, resultando em uma melhor qualidade e
produtividade. As técnicas de micropropagação in vitro utilizadas para a regeneração
de plantas ocorrem através das rotas de embriogênese e de organogênese, ambas
podendo ser direta ou indireta. A rota organogênese direta (utilizada no trabalho) é
quando o desenvolvimento de órgãos acontece diretamente a partir do tecido do
explante, sem passar pela fase de calo. Para alcançar um bom resultado final na
micropropagação in vitro, aspectos como a assepsia, qualidade do explante, meio
nutritivo e fatores ambientais, são de suma importância. Reguladores de
crescimento são substâncias importantes para o cultivo in vitro, pois modificam a
morfologia das plantas, interferindo no desenvolvimento do meristema apical e no
florescimento normal. No presente trabalho foram utilizados diversos meios de
cultivo MS (pré-indução) e MRP (regeneração), com diferentes quantidades de
reguladores e dias em contato com os meios e a exposição à luz. Os resultados
obtidos mostram que as melhores respostas regenerativas de plantas de discos de
ponteiros de cana-de-açúcar, foram observadas no tratamento com pré-indução com
2,4-D em MS3K, incubados em 3 dias no escuro, cultivados por 30 dias em MRP na
luz e cultivados por mais 40 dias na luz em MB.
PALAVRAS-CHAVE: cana-de-açúcar, micropropagação in vitro, organogênese
direta.
III
ABSTRACT
Sugar cane production increasingly plays an important role in the global and
specially in the Brazilian economy. This happens mainly because the culture
provides a total utilization of raw material, either fresh, or when processed. So,
increasingly the culture is embedded in programs aimed to obtain plants with
desirable characteristics, resulting in better quality and productivity. Micropropagation
techniques used for plant regeneration in vitro occurs through the routes of
embryogenesis and organogenesis, both can be directly or indirectly. The
organogenesis direct route (studied in this work) is when the organ development
takes place directly from the explant tissue, without passing the callus phase. To
achieve a good result on in vitro propagation, aspects such as assepsy, quality of the
explant, nutrient media and environmental factors are of main importance. Growth
regulators are substances also important for the in vitro regeneration because it
modifies the morphology of plants, interfering in the apical meristem development
and normal flowering. In this work we used different culture medias MS (preinduction) and MRP (regeneration) with different amounts of regulators and days in
contact with the media and exposure to light. The results show that the best
regenerative responses of leaf discs of sugar cane were observed with pre-induction
treatment in MS3K with 2,4-D incubated for 3 days in the dark, then grown for 30
days in MRP in the light and after, more 40 days in light in MB.
KEYWORDS: sugar-cane, in vitro micropropagation, direct organogenesis.
IV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição dos meios de cultivo de pré-indução MS.................. 11
Tabela 2 – Composição dos meios de cultivo de regeneração MRP..............
11
Tabela 3 - Plantas regeneradas obtidas a partir de discos pré-induzidos
com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias
em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de
regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz.............................................. 16
Tabela 4 - Plantas regeneradas obtidas a partir de discos sem pré-indução
em 2,4-D, em MRP direto na luz e por 3 dias no escuro, 30 dias em MRP na
luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de
regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz.............................................. 17
Tabela 5 – Características regenerativas de 20 explantes finais obtidas a
partir de discos pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6;
9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por
mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2)
na luz................................................................................................................ 18
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Visão geral das estruturas avaliadas nos experimentos de
regeneração. A: Padrão geral das estruturas. B: Plantas grandes. C:
Plantas médias. D: Plantas pequenas. E: Brotos necrosados e F: Calos..... 13
Figura 2 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos
sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no
escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias
em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz............ 15
Figura 3 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos
sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS3K por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias
em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais
de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz....................................... 19
Figura 4 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos
sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS3C por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30
dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios
finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz...........................
20
Figura 5 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos
sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias
em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios
finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz...........................
21
Figura 6 – Características de responsividade na regeneração de plantas
obtidas a partir de explantes iniciais (discos) pré-induzidos por 3; 6; 9 e 12
dias, no escuro, em MS3K, MS3C e MS8, transferidos para MRP e
cultivados por 30 dias na luz......................................................................... 23
VI
SUMÁRIO
RESUMO.......................................................................................................
II
ABSTRACT....................................................................................................
III
LISTA DE TABELAS......................................................................................
IV
LISTA DE FIGURAS......................................................................................
V
1. INTRODUÇÃO....................................................................................
01
2. OBJETIVOS........................................................................................
03
2.1.
Objetivo geral...........................................................................
03
2.2.
Objetivos específicos...............................................................
03
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................
04
3.1.
Cana de açúcar........................................................................
04
3.2.
Cultura de tecidos....................................................................
05
3.3.
Micropropagação de cana-de-açúcar.......................................
06
3.4.
Aspectos importantes para sucesso na micropropagação...
07
3.5.
Reguladores de crescimento....................................................
08
3.6.
Transformação genética...........................................................
08
4. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................
10
4.1.
Materiais...................................................................................
10
4.2.
Métodos....................................................................................
10
4.2.1. Coleta e desinfestação do material....................................
10
4.2.2. Pré-indução.........................................................................
11
4.2.3. Subcultivos e regeneração de plantas................................
11
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................
14
5.1. Períodos de incubação no escuro...............................................
14
5.2. Meios de pré-indução com 2,4-D.................................................
22
5.3. Regeneração final de plantas......................................................
22
6. CONCLUSÕES...................................................................................
24
REFERÊNCIAS.........................................................................................
25
ANEXOS....................................................................................................
30
1
1. INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar ocupa posição de destaque na economia mundial, podendo
ser utilizada in natura, sob forma de forragem, para alimentação animal, ou como
matéria-prima para a produção de açúcar, álcool, bioetanol, biodiesel, produtos
farmacêuticos, aguardente e em ascensão a sua utilização como fonte renovável de
energia. Segundo Análise Energia (2011), na safra de 2008/2009 foram moídas 569
milhões de toneladas de cana-de-açúcar, 15  a mais que a safra anterior.
O Brasil é o maior e mais eficiente produtor de açúcar, álcool e subprodutos
da cana-de-açúcar do mundo, onde a área plantada na safra 2008/2009, foi de 8,5
milhões de hectares, correspondendo a 1 do território nacional (ANÁLISE
ENERGIA, 2011). Contudo, São Paulo detém 60% de área plantada do país,
seguido de Alagoas, Paraná, Minas Gerais, Pernambuco, Mato Grosso, Goiás e
Mato Grosso do Sul (ÚNICA, 2011).
A cana-de-açúcar é uma das principais culturas plantadas no Brasil, e
proporciona expressiva importância sócio-econômica e agroindustrial ao país, assim,
cada vez mais a cultura é engajada em programas que visam o melhoramento de
espécies cultivadas. Deste modo, a cultura é inserida em programas de
micropropagação in vitro, regeneração e melhoramento genético, tendo em vista, a
introdução de características de interesse agronômico, como resistência a pragas e
patógenos, tolerância a herbicidas, aumento no teor de sacarose, entre outros.
A cultura de tecidos vegetais in vitro, é uma técnica baseada no fato de que
qualquer célula vegetal contém toda informação necessária para gerar uma planta
completa através de processo de diferenciação (COCKING apud EMBRAPA,
2011a). Assim, a micropropagação in vitro de cana-de-açúcar é uma alternativa
vantajosa em relação às técnicas convencionais, devido à economia de tempo e a
excelente qualidade fitossanitária e a uniformidade genética das mudas obtidas.
A micropropagação in vitro é constituída de duas rotas morfogenéticas, a
organogênese (direta ou indireta) ou a embriogenêse somática (direta ou indireta). A
organogênese direta refere-se à regeneração direta de plantas, sem a passagem
pela fase de calos, já na indireta a regeneração de gemas é precedida pela
formação de calos (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Todavia, como a resposta
morfogênica é fortemente influenciada pelo genótipo, é fundamental que seja
2
realizada adaptação dos protocolos em cada cultivar a ser utilizada (CIDADE et al.,
2006).
Para se obter sucesso na micropropagação in vitro, vários fatores são
importantes para a realização da técnica, como a origem do explante, a assepsia do
local e do explante a ser manuseado, o meio nutritivo (sais, vitaminas, reguladores
de crescimento, etc.) e os fatores ambientais.
3
2. OBJETIVOS
2.1.
Objetivo geral
Acompanhar o processo morfogenético da regeneração direta de discos de
ponteiros (palmitos) de plantas de cana-de-açúcar, cultivar SP803280.
2.2.

Objetivos específicos
Otimizar o processo de desinfestação de discos de ponteiros de cana-deaçúcar (explantes) de plantas cultivadas e coletadas a campo.

Estudar o efeito pré-indutivo de composições de meios de cultura, pré-cultivo
dos discos no escuro e o comportamento dos explantes em tratamentos finais
de regeneração de plantas.

Avaliar o efeito de tratamentos sobre número e características de estruturas,
principalmente, número e tipo de plantas regeneradas.

Evidenciar o melhor tratamento de regeneração de plantas aplicáveis a
sistemas de transformação genética.
4
3. REVISÃO BILIOGRÁFICA
3.1.
Cana de açúcar
A cana de açúcar é uma planta semiperene (após seu plantio, é cortada
várias vezes antes de ser replantada), pertencente ao gênero Saccharum, da família
Poaceae, originária de regiões tropicais da Ásia, especialmente da Índia (BNDES;
CGEE, 2008). É muito cultivada em países tropicais e subtropicais, onde se alternam
as estações secas e úmidas, para a obtenção da sacarose contida em seu caule,
formado por numerosos nós (SCHUCH, 2011).
A parte aérea da planta é composta pelos colmos, onde se concentra a
sacarose e pelas pontas e folhas que constituem a palha da cana (BNDES; CGEE,
2008). O colmo é cilíndrico, composto por nós, entrenós ou internódios, que provê
sustentação às folhas e à inflorescência. As folhas são divididas em lâmina e bainha,
as quais são alternadas, opostas e presas aos nós e colmos (NETAFIM, 2011).
O Brasil é o maior produtor mundial de cana de açúcar e o segundo maior de
etanol. Entre 1977 e 2006, a produtividade nacional passou de 52,0 t/ha colhido para
74,4 t/ha (CGEE, 2009). Isso devido, principalmente ao fato da cultura proporcionar
um aproveitamento total dentro dos seus processamentos industriais.
A cana-de-açúcar apresenta vários produtos e subprodutos derivados da
moagem da planta, como o melado, usado como componente de rações para
ruminantes e como substituto do açúcar na alimentação humana, o bagaço como
fonte de fibras, pode ser utilizado para alimentação animal – mas é principalmente
empregado para a geração de energia em usinas por meio de sua queima. Outro
importante derivado da cana é a cachaça, obtida da fermentação e da destilação do
caldo (garapa) (CIB, 2011a).
A exploração do potencial energético da cana-de-açúcar iniciou no Brasil em
1975, com a criação do Programa Nacional do Álcool (Proálcool), qual sua finalidade
era incentivar a substituição do petróleo do país por álcool combustível. Com isso, a
aplicabilidade da cana-de-açúcar foi se estendendo, passando a ser adicionada à
gasolina, incorporada ao diesel (biodiesel), utilizada em veículos flex e demais
formas de utilização (SECCO, 2011).
A cultura da cana-de-açúcar assume lugar de destaque na economia
mundial, e para uma melhor produtividade, técnicas com base nos princípios
5
de melhoramento genético vegetal são aplicadas na obtenção de novas plantas e
formas mais eficientes de seleção. Visando à introdução de novas características
como aumento de produtividade, resistência a doenças e pragas e a condições
ambientais adversas, resulta numa melhor qualidade tecnológica e nutricional do
produto final (SCAGLIUSI, 2011).
3.2.
Cultura de tecidos
Segundo Torres et al. (2000), a cultura de tecidos vegetais é uma técnica
onde o cultivo da planta é realizado in vitro, deste modo, pequenos fragmentos de
tecido vivo, chamados explantes, são isolados de um organismo vegetal,
desinfestados e cultivados assepticamente, por períodos indefinidos em um meio de
cultura apropriado. A finalidade é obter uma planta com características idênticas à
original, ou seja, realizar uma clonagem vegetal, de modo a obter um novo indivíduo,
mantendo-se o genótipo idêntico ao original.
A micropropagação de vegetais in vitro, pode ser obtida por fragmentos da
folha, de raiz, de caule ou de qualquer tecido que responda ás condições de indução
do meio de cultura. (TORRES et al., 2000). A cultura se baseia na teoria da
totipotência onde os seres vivos têm a capacidade de regenerar organismos inteiros,
idênticos à matriz doadora, a partir de células únicas (ALVES et al., 2011).
Os meios de cultura para a regeneração de plantas incidem da associação
qualitativa e quantitativa das substâncias essenciais para o desenvolvimento da
planta fora de seu meio natural. O meio nutritivo MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962)
é um meio universalmente usado, especialmente para morfogênese, cultura de
meristemas e regeneração de plantas (UEVORA, 2011).
Segundo Teixeira et al. (2007), os meios nutritivos são compostos por
elementos essenciais e opcionais, sendo bastante variáveis em função da espécie
vegetal e da origem do explante. Dentre os essenciais estão a água, os sais
inorgânicos (macro e micronutrientes), os carboidratos, as vitaminas e os
reguladores de crescimento. Os reguladores de crescimento são fundamentais para
a multiplicação vegetal, entre os mais utilizados estão as citocininas e as auxinas.
Logo os elementos opcionais incluem os compostos orgânicos nitrogenados, ácidos
orgânicos e mio-inositol.
De acordo com o protocolo do sistema de cultivo, os
meios de cultura podem apresentar forma líquida, sólida ou semi-sólida. A
6
geleificação do meio de cultura incide mediante a adição de Ágar, que é um
polissacarídeo extraído de algas marinhas. No entanto, a concentração de sais, a
presença de substancias e o pH do meio de cultura, são fatores que interferem na
geleificação do meio de cultivo.
Além da composição dos meios de cultura, as condições físicas de incubação,
como a temperatura, umidade, intensidade, qualidade e duração do período de luz, e
o próprio genótipo do material vegetal cultivado, influem sobre a morfogênese dos
tecidos vegetais (GEORGE; SHERRINGTON, 1984).
3.3.
Micropropagação de cana-de-açúcar
Para Scagliusi (2011), a regeneração de plantas via cultura de tecidos, pode
ocorrer através de duas rotas morfogênicas distintas: embriogênese somática e
organogênese. A embriogênese somática é o processo pelo qual células somáticas
do explante diferenciam-se em embriões somáticos (não resultantes da fecundação),
ocorrendo a formação de estruturas bipolares. Os embriões somáticos também
podem incidir diretamente do explante, através da embriogênese direta, ou mais
freqüentemente, resultante da cultura de calos, por meio da embriogênese indireta.
A Organogênese é o processo de formação de partes aéreas ou raízes, originadas
de diferentes explantes, os quais são induzidos a sofrer mudanças que levam à
produção de uma estrutura unipolar.
A organogênese pode ser direta ou indireta. No primeiro caso, a regeneração
acontece a partir de um explante primário onde há a formação de um eixo caulinar a
partir de gemas apicais, laterais ou axilares (THORPE, 1980), ou seja, é o
desenvolvimento de órgãos diretamente a partir do tecido do explante, sem passar
por fase de calo (CIB, 2011b). Já na organogênese indireta, ocorre a
desdiferenciação do explante, resultando na formação de calos, que podem ser
definidos como a proliferação de células não diferenciadas (THORPE, 1980), assim,
pode-se dizer que é o desenvolvimento de órgãos a partir de uma massa não
diferenciada de células, ou calo, derivado do explante (CIB, 2011b).
Os discos foliares (segmentos de folhas sobrepostas) de cana-de-açúcar são
capazes de formar plantas inteiras pelas vias organogênica e embriogênica, e tem
sido o tecido alvo alternativo ao processo de transformação genética de cana-deaçúcar (DESAI, 2004; LAKSHMANAN et al., 2005).
7
3.4.
Aspectos importantes para sucesso na micropropagação
A cultura de tecidos atua em diversas áreas da biologia vegetal,
proporcionando suporte técnico na sua aplicação básica e ao apoio às diversas
áreas como a de bioquímica, fisiologia vegetal, fitopatologia e citogenética. Mesmo
considerando todas as possíveis aplicações, a cultura de tecido é uma só, e o
denominador de todas elas é: a assepsia, o explante, o meio nutritivo e os fatores
ambientais: luz e temperatura. Assim,a assepsia é um conjunto de procedimentos
para tornar o explante livre de microrganismos (bactérias, fungos, leveduras entre
outros). Tais procedimentos incluem o uso de antissépticos (bacteriostáticos ou
germicidas), que podem ser antibióticos, alcoóis, halogênios, sais de metais
pesados, fungicidas orgânicos, etc. As vidrarias e os meios de cultura, devem ser
esterilizados por calor seco (forno, ar quente) ou úmido (autoclave). As pinças,
bisturis e demais utensílios metálicos devem ser flambados em ambiente axênico
(livre de germes), utilizando-se de bico de Bunsen em câmara de fluxo laminar (CID,
2011).
Para a obtenção de explantes, devem-se utilizar plantas de boa qualidade,
com perfeitas condições fisiológicas e nutricionais, e que estejam em ativo
crescimento (TORRES et al., 1998). Quanto mais limpa a origem dos explantes,
menos contaminação haverá e mais fácil será desinfestá-los. Assim sendo, segundo
Cruz et al. (2009), os explantes receberão menos choque e conseguintemente as
chances de sobrevivência serão maiores.
Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos de
plantas fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e
controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro. Os componentes
necessários para um meio essencial são: água, macronutrientes, micronutrientes,
sacarose, carboidratos, vitaminas, mio-inositol, reguladores de crescimento ou
hormônios, Ágar e pH adequado (entre 5 e 6) (PEREIRA; MELO, 2011).
A luz e a temperatura são dois fatores ambientais importantes nas salas de
cultura, onde devem ser controlados para que as plantas se desenvolvam
adequadamente. A luz é importante para a planta sob três aspectos: fotossíntese,
fotomorfogênese e o fototropismo. A temperatura em salas de cultura, em geral,
varia entre 24° e 27°C, para um bom crescimento vegetativo (CID, 2011).
8
3.5.
Reguladores de crescimento
Em plantas, assim como nos animais, muitos processos bioquímicos e
fisiológicos são controlados por hormônios. O hormônio natural e outros materiais
são essencialmente "mensageiros químicos", influenciando no desenvolvimento da
planta (HARTMANN et al., 1988).
O hormônio vegetal é uma substância natural produzida pela própria planta,
que pode ser dividido em cinco grupos (Anexo A): auxinas, giberelinas, citocininas,
etileno e ácido abscísico. Logo, os hormônios sintetizados quimicamente provocam
reações similares àquelas causadas pelos naturais (KRUKEMBERGHE, 2011).
Segundo George (1996), o crescimento da planta in vitro é altamente dependente da
interação entre as substâncias de crescimento que ocorrem naturalmente na planta
(hormônios) e os análogos sintéticos (reguladores de crescimento), os quais são
adicionados ao meio de cultura.
As auxinas são substâncias que controlam o crescimento e o alongamento
celular e as citocininas estimulam a divisão celular e reduzem a dominância apical.
(PASQUAL, 2001). Das
citocininas
comercialmente
disponíveis,
a
6-
benzilaminopurina (BAP), é a que, em geral, apresenta melhores resultados in
vitro para promover a multiplicação de diversas espécies (GRATTAPAGLIA;
MACHADO, 1988). Segundo Assis e Teixeira (1998) quanto ao enraizamento, às
auxinas mais utilizadas são o ácido indolbutírico (AIB) e o ácido naftalenoacético
(ANA).
Os reguladores de crescimento podem ser encontrados na forma natural ou
sintética, e quando aplicados em plantas influenciam no seu crescimento e no seu
desenvolvimento (UESB, 2011).
Atuam dentro da planta modificando sua
morfologia, interferindo no desenvolvimento do meristema apical e no florescimento
normal. Contudo, todos reguladores de crescimento tem uma ação similar dentro da
planta, com poucas diferenças em resposta na produção. As reações para essas
diferenças não são claramente compreendidas (BARRET, 1992).
3.6.
Transformação genética
A modificação genética de plantas vem sendo manipulada pelo homem há
séculos, mesmo de forma empírica, quando eram empregados métodos de seleção
9
e melhoramento para a obtenção de novas plantas. Com o decorrer dos tempos,
foram-se introduzindo a engenharia genética e a biotecnologia, assim, novas
tecnologias mais eficientes de seleção foram sendo aplicadas, resultando numa
melhor qualidade tecnológica e nutricional do produto final. (SCAGLIUSI, 2011).
Segundo
Romano
(2011),
pesquisas
em
melhoramento
genético,
fundamentado em técnicas tradicionais têm encontrado dificuldades em obter
soluções para vários problemas que afetam a cana-de-açúcar. Entre eles destacamse, tolerância a déficits hídricos e resistência à broca gigante (Castnia licus). Com a
inclusão destas características no gene, haverá aumento na produtividade da
cultura, além de, permitir que esta seja cultivada em áreas que hoje são restritivas.
Para o desenvolvimento de eventos de cana de açúcar GM (geneticamente
modificados) tolerantes à seca e resistentes à broca gigante, genes podem ser
isolados a partir de técnicas modernas de biologia molecular, utilizando estudos de
transcriptoma, proteômica e de evolução in vitro de moléculas. Após a identificação
dos genes, estes devem ser validados em plantas modelo e incorporados em
variedades elite de cana-de-açúcar. As plantas obtidas poderão expressar as
características de tolerância a estresses e resistência à patógenos e insetos, assim
como as demais características agronômicas avaliadas em campo por melhoristas.
10
4. MATERIAS E MÉTODOS
4.1.
Materiais
Este trabalho de pesquisa foi baseado nos resultados de Lakshmanan et al.
(2006) e conduzido com suporte financeiro, supervisão e orientação de
pesquisadores envolvidos no Projeto Temático FAPESP 2008/52066-8, coordenado
pela Profª Drª Helaine Carrer, desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia Agrícola
(CEBTEC) do Departamento de Ciências Biológicas (LCB) da Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP), possuindo exclusividade de publicação.
Mudas de cana-de-açúcar, cultivar SP803280, gentilmente cedidas pela
Universidade Federal de São Carlos - UFSCAR - Campus Araras – SP, com
aproximadamente 1 mês de idade, foram obtidas a partir de toletes tratados por
termoterapia a 51,5°C por 30 minutos e imersos em solução de fungicida metiltiofan
(benzimidazol) por 3 minutos e plantadas em bandejas com substrato comercial a
base de casca de pinus compostada, vermiculita, areia e fertilizantes. Depois de
estabelecidas, as mudas foram transplantadas para canteiros experimentais do
CEBTEC.
4.2.
Métodos
4.2.1. Coleta e desinfestação do material
Plantas com aproximadamente 8 meses de idade foram coletadas, e delas,
foram isolados os ponteiros a partir dos quatro últimos nós. No laboratório, foram
retiradas folhas e bainhas até os dois últimos nós. Esses ponteiros constituídos de
um cartucho de bainhas, aqui denominados de ‘’palmitos’’, foram imersos 4 vezes
em solução alcoólica 70 v/v e, em câmara de fluxo laminar de ar estéril, foi retirada
mais uma bainha deixando o palmito acompanhado apenas do último nó (região
tissular a partir do meristema apical). Dos primeiros 5 cm a partir do último nó,
imersos em solução de ácido cítrico 150 mg.L -1, foram cortados em torno de 15
discos de 1,5 a 2,0 mm de espessura e inoculados em placas de ‘’petri’’ com 30 ml
de meio de cultura e submetidos a 3 subcultivos.
11
4.2.2. Pré-indução
Na composição basal dos meios de cultura MB (Anexo B), utilizou-se sais e
vitaminas de MS (Anexo C) acrescido de ácido cítrico. No primeiro subcultivo, os
discos foram pré-induzidos em meio MS3C, em MS3K ou em MS8, descritos na
tabela 1, e mantidos por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro a 25ºC ± 1.
Tabela 1 – Composição dos meios de cultivo de pré-indução
Meio basal
2,4-D (ácido 2,4-dicloro fenoxiacético)
Cinetina
Água de coco
MS3C
MS3K
MS8
MB
MB
MB
-1
-1
-1
3 mg.L
3 mg.L
-
0,1 mg.L
-
-
-
50 ml.L
8 mg.L
-1
-1
4.2.3. Subcultivos e regeneração de plantas
No segundo subcultivo, os discos foram transferidos para MRP (tabela 2) e
cultivados na luz com 40 µM.cm-2.s-1 e temperatura de 25°C ±3 , por 30 dias. No
terceiro subcultivo, cada disco (5 repetições) de cada tratamento foi dividido em 4
explantes e transferidos para 4 meios de cultura: MB, MRP,MRP1 e MRP2 (tabela
2), e cultivados por mais 40 dias nas mesmas condições de luz. Cada tratamento do
primeiro subcultivo, pré-indução, foi constituído de 4 repetições de 5 discos cada um.
No segundo subcultivo, todos os discos foram transferidos para MRP e
subcultivados por 30 dias. No terceiro subcultivo, 5 discos de cada tratamento foram
divididos em 4, totalizando 5 repetições de 4 explantes.
Tabela 2 – Composição dos meios de cultivo de regeneração
MRP
Meio basal
MRP1
MB
MRP2
MB
MB
-1
0,45 mg.L
-1
1,86 mg.L
6-BAP (6-benzil aminopurina)
0,45 mg.L
ANA (ácido naftalenoacético)
3,72mg.L
-1
-1
-1
0,45 mg.L
-
No final do segundo subcultivo foram avaliados o número de brotos
produzidos, grau de formação paralela de calos e raízes, e o número de discos
responsivos. No final do terceiro subcultivo foram avaliados o número total de
12
plantas regeneradas (classificadas em pequenas (P) com 0,5 a 1,0 cm, médias (M)
com 1,0 a 3,0 cm, e grandes (G) com 3,0 a 6,0 cm), número de brotos vivos,
porcentagem de explantes necrosados e grau de formação de raízes (Figura 1).
.
13
Figura 1 - Visão geral das estruturas obtidas nos experimentos de regeneração de cana-de-açúcar.
A: Padrão geral das estruturas. B: Plantas grandes. C: Plantas médias. D: Plantas pequenas. E:
Brotos necrosados e F: Calos. (CEBTEC, 2011)
14
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A figura 2 mostra os resultados das interações de períodos de incubação (0;
3; 6; 9 e 12 dias no escuro), pré-indução com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 e
regeneração final de plantas em MB, MRP, MRP1 E MRP2.
5.1.
Períodos de incubação no escuro
A visão geral da figura 2 e os dados numéricos das tabelas 3, 4 e 5,
demonstram que os melhores resultados em termos de regeneração final de plantas
foram observados no período de incubação de 3 dias no escuro, independente do
meio de cultura de pré-indução (MS3K, MS3C ou MS8). O que pode ser confirmado
por Rugini e seus colaboradores (1988), que demonstraram que três dias de escuro
apresenta efeito positivo no enraizamento e desenvolvimento das plântulas e que a
ausência de luz nos primeiros dias favorece o enraizamento por diminuição da ação
da AIA-oxidase.
Observa-se que a regeneração final das plantas apresentou uma tendência
linear decrescente ao longo de 3; 6; 9 e 12 dias no escuro. Por outro lado, observouse a necessidade de incubação no escuro, pois o período zero dias no escuro,
apresentou baixíssima responsividade quando comparada aos períodos 3 e 6 dias.
Além de maior número de plantas na regeneração final, o período de 3 dias
de escuro se mostra interessante pelo fato de 3 dias ser um intervalo de tempo que
pode evidenciar a eficiência do tratamento de desinfestação e consequente
ocorrência de placas contaminadas, evitando assim, maiores prejuízos de tempo e
mão de obra em processos posteriores de transformação genética.
Porém, segundo Murashige (1974), a fotossíntese não é considerada
atividade essencial para o desenvolvimento das plantas in vitro, porém, a luz é
fundamental para a regulação dos processos morfogenéticos.
15
450
400
350
300
250
MB
MRP
200
MRP1
150
MRP2
100
50
0
0 Dias
Escuro
(MRP)
3 Dias
Escuro
(MS3K)
3 Dias
Escuro
(MS3C)
3 Dias
Escuro
(MS8)
6 Dias
Escuro
(MS3K)
6 Dias
Escuro
(MS3C)
6 Dias
Escuro
(MS8)
9 Dias
Escuro
(MS3K)
9 Dias
Escuro
(MS3C)
9 Dias
Escuro
(MS8)
12 Dias
Escuro
(MS3K)
12 Dias
Escuro
(MS3C)
12 Dias
Escuro
(MS8)
Figura 2 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de
discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no
escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. (CEBTEC,
2011)
15
16
Tabela 3 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de
discos pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em
meios finais de regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de tamanho
médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). N.: número de plantas necrosadas (mortas). T: totais de plantas.
Meios
Pré-indução 3 Dias escuro
Pré-indução 6 Dias escuro
Pré-indução 9 Dias escuro
Pré-indução 12 Dias escuro
Número de Brotos
Número de Brotos
Número de Brotos
Número de Brotos
P
M
G
N.
T(P,M,G)
P
M
G
N.
T(P,M,G)
P
M
G
N.
T(P,M,G)
P
M
G
N.
T(P,M,G)
MB
245 132 36 57
413
102 37 52
24
191
17
26
27
10
70
19
3
6
5
28
MRP
315
76 11 32
402
89
7 12
26
108
45
22
0
58
67
53
4
3
35
60
MS3K MRP1 336
40
8 175
384
163
6
2
26
171
80
19
2
56
101
15
1
1
3
17
MRP2 179
25
5 125
209
66
3
1
38
42
60
1
0
45
61
48
3
1
16
52
1075 273 60 389
1408
420 53 67
114
512
202
68
29
169
299
135
11
11
59
157
T
MB
41
28 24 45
93
102 72 17
16
191
30
9
26
18
65
15
0
0
30
15
MRP
73
33
2
82
108
14
0
0
65
14
55
6
4
12
65
11
4
1
18
16
MS3C MRP1 232
16
1
69
249
60
10
1
30
71
22
5
2
26
29
20
0
0
19
20
0
0
90
0
0
0
0
35
0
41
10
3
23
54
10
15
1
12
26
MS8
MRP2
0
T
346
77 27 286
450
176 82 18
146
276
148
30
35
79
213
56
19
2
79
77
MB
45
23 18 13
86
26
28
58
17
4
4
7
25
47
7
0
6
54
MRP
370
25
1
53
396
161 29
9
23
199
5
0
0
8
5
30
0
0
9
30
MRP1 267
23
7 170
297
26
18
0
13
44
27
0
0
3
27
29
0
1
11
30
MRP2
91
5
0 215
96
31
0
0
31
31
22
0
0
5
22
45
3
0
29
48
T
773
76 26 451
875
244 67 21
95
232
71
4
4
23
79
151
10
1
55
162
20 12
16
17
Tabela 4 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir
de discos sem pré-indução em 2,4-D, em MRP direto na luz e por 3 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em
meios finais de regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de
tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). N.: número de plantas necrosadas (mortas). T: totais de plantas
Meios
Zero Dias
3 Dias
Número de Brotos
Número de Brotos
Zero Dias
3 Dias
Características
Características
P
M
G
N.
T(P,M,G)
P
M
G
N.
T(P,M,G)
% E. N.
Nº R.
G. C.
% E. N.
Nº R.
G. C.
MB
17
8
14
14
39
105
56
55
3
216
415
107
-
245
401
2
MRP
63
11
9
9
83
150
17
9
106
176
370
48
1
365
51
3
MRP MRP1
35
16
9
9
60
57
25
0
58
82
385
9
-
335
95
-
MRP2
48
22
13
13
83
69
7
0
115
76
335
54
-
443
35
-
T
163
57
45
45
265
381
105
64
282
550
1505
218
1
1388
582
5
17
18
Tabela 5 – Características regenerativas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos
pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios
finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. % E.N.: porcentagem de explantes necrosados. Nº R.: número total de raízes. G.C.: grau de
formação de calos.
MS3KC
MS8
6 Dias
9 Dias
12 Dias
Características
Características
Características
%
E.N.
Nº R.
G. C.
%
E.N.
Nº R.
G. C.
%
E.N.
Nº R.
G. C.
%
E.N.
Nº R.
G. C.
MB
235
468
2
205
425
3
365
165
4
410
175
7
MRP
250
236
4
375
101
4
405
62
7
380
223
6
MRP1
230
183
6
395
87
3
410
78
4
458
64
4
MRP2
335
118
1
425
50
5
475
105
5
435
108
5
MB
395
270
1
325
154
5
381
147
4
490
76
3
MRP
435
59
4
485
35
4
395
40
4
480
85
5
MRP1
355
69
3
465
41
3
460
39
3
495
32
5
MRP2
490
15
-
490
59
2
420
46
3
495
148
1
MB
390
130
4
360
93
10
266
158
13
405
127
10
MRP
355
65
4
285
113
6
398
82
10
335
63
9
MRP1
275
54
3
415
56
8
334
125
10
365
122
10
MRP2
390
67
5
435
103
7
385
140
11
400
56
9
Meios
MS3K
3 Dias
Características
18
18
19
450
400
350
300
250
Total
200
P
M
150
G
100
50
0
MB
MRP MRP1 MRP2 MB
Direto MRP zero Dias
Escuro
MRP MRP1 MRP2 MB
MRP MRP1 MRP2 MB
MRP MRP1 MRP2 MB
MRP MRP1 MRP2
MS3K 3 Dias Escuro / MRP MS3K 6 Dias Escuro / MRP MS3K 9 Dias Escuro /MRP MS3K 12 Dias Escuro / MRP
30 Dias Luz
30 Dias Luz
30 Dias Luz
30 Dias Luz
Figura 3 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de
discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS3K por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em
MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. Total: número total de plantas por
tratamento (20 explantes – 5 discos divididos em 4 explantes). P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de tamanho
médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). (CEBTEC, 2011)
19
20
450
400
350
300
250
Total
200
P
M
150
G
100
50
0
MB
MRP MRP1 MRP2
MB
MRP MRP1 MRP2
Direto MRP zero Dias Escuro MS3C 3 Dias Escuro / MRP
30 Dias Luz
MB
MRP MRP1 MRP2
MS3C 6 Dias Escuro / MRP
30 Dias Luz
MB
MRP MRP1 MRP2
MB
MRP MRP1 MRP2
MS3C 9 Dias Escuro / MRP MS3C 12 Dias Escuro / MRP
30 Dias Luz
30 Dias Luz
Figura 4 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de
discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS3C por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias
em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. Total: número total de
plantas por tratamento (20 explantes – 5 discos divididos em 4 explantes) . P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas
de tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). (CEBTEC, 2011)
20
21
450
400
350
300
250
Total
200
P
M
150
G
100
50
0
MB
MRP MRP1 MRP2 MB
Direto MRP zero Dias
Escuro
MRP MRP1 MRP2 MB
MS8 3 Dias Escuro / MRP
30 Dias Luz
MRP MRP1 MRP2 MB
MS8 6 Dias Escuro / MRP
30 Dias Luz
MRP MRP1 MRP2 MB
MRP MRP1 MRP2
MS8 9 Dias Escuro / MRP MS8 12 Dias Escuro / MRP
30 Dias Luz
30 Dias Luz
Figura 5 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de
discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em
MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. Total: número total de plantas
por tratamento (20 explantes – 5 discos divididos em 4 explantes). P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de
tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). (CEBTEC, 2011)
21
22
5.2.
Meios de pré-indução com 2,4-D
Os meios de cultura pré-indutivos MS3K e MS8 apresentaram resultados
semelhantes e marcadamente melhores que MS3C em relação ao número total de
plantas regeneradas no final do ciclo de regeneração (figura 2). Contudo, conforme
resultados mostrados nas figuras 3, 4 e 5, os discos pré-induzidos em MS3K
apresentaram maior predominância de plantas tipo médias e grandes.
Assim sendo, é mais interessante a utilização do meio MS3K na pré-indução
dos discos devido a baixa dosagem de 2,4-D, 3 mg.L-1 nessa formulação, contra 8
mg.L-1 em MS8. Além do maior risco de causar variação somaclonal e gerar maiores
volumes de resíduos tóxicos. Doses elevadas de 2,4-D favorecem rápida
proliferação de calos e formação de pró-embriões, estruturas multicelulares que,
quando submetidas à transformação genética, podem gerar quimeras nas plantas
regeneradas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990).
5.3.
Regeneração final de plantas
Os primeiros brotos regenerados puderam ser visualizados depois de 20 dias
de cultivo dos discos em MRP, na luz, como mostrado na figura 6. Observa-se que,
simultaneamente ao surgimento dos brotos, ocorreu formação de calos. Os brotos
foram visualizados principalmente nas pré-induções em MS3C e MS3K incubados
por 3 e 6 dias no escuro. Na pré-indução em MS8 predominou a formação de calos.
Esses resultados sugerem que procedimentos de transformações genéticas sejam
realizados imediatamente depois de um período de 3 dias de incubação no escuro
com pré-indução em 2,4-D, antes do início da formação de calos.
O número total e classificação das plantas e as características das estruturas
regenerativas, nos discos pré-induzidos com 2,4-D por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro
são mostrados na tabela 3. O mesmo é mostrado na mesma tabela para discos sem
pré-indução com 2,4-D, ou seja, inoculados diretamente em MRP incubados por 0 e
3 dias na luz. Ambos cultivados por 30 dias em MRP na luz, divididos em 4
explantes e cultivados por mais 40 dias em MB, MRP, MRP1 e MRP2 na luz. Nas
características regenerativas observou-se expressiva formação de calos e raízes.
Essas características obtidas, podem ter sido consequencia dos altos níveis
23
de ANA (3,72 mg.L-1) no meio MRP, sugerindo sua diminuição para 1,86 mg. L -1, ou
seja, mesma formulação do MRP1, cuja regeneração final das plantas, como
mostrada na figura 1, apresentou número semelhante de plantas em relação aos
melhores tratamentos. Para Fachinello et al. (1994), o aumento da concentração de
auxinas aplicadas nos brotos provoca efeito estimulador de raízes até um certo
valor, a partir do qual acréscimos maiores têm efeito inibitório. A concentração
adequada depende da espécie e do teor da auxina existente nela.
Figura 6 – Características de responsividade na regeneração de plantas a partir de explantes iniciais
(discos) pré-induzidos por 3; 6; 9 e 12 dias, no escuro, em MS3K, MS3C e MS8, transferidos para
MRP e cultivados por 30 dias na luz. (CEBTEC, 2011)
24
6. CONCLUSÕES
As melhores respostas regenerativas de plantas de discos de ponteiros de
cana-de-açúcar, cultivar SP803280, foram observadas no tratamento com préindução com 2,4-D em MS3K, incubados em 3 dias no escuro, cultivados por 30 dias
em MRP na luz, divisão dos discos em 4 explantes e cultivados por mais 40 dias na
luz em MB.
25
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UEVORA
-
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ÚNICA – União da Agroindústria Canavieira. Cana-de-açúcar. Disponível em:
<www.unica.com.br>. Acesso em: Maio de 2011.
30
ANEXOS
ANEXO A – Hormônios vegetais e suas propriedades
Hormônio
Local de síntese
Transporte
Efeitos
Estimula a elongação do caule
e da raiz, atua no fototropismo
e no geotropismo, causa a
dominância apical sobre as
gemas laterais do caule, atua
no desenvolvimento dos
frutos, induz a formação de
raízes adventícias em
estacas, inibe a abscisão de
folhas e frutos, estimula a
síntese de etileno.
Afeta o crescimento e a
diferenciação das raízes,
quebra a dominância apical
em gemas laterais (efeito
oposto ao da auxina), estimula
a divisão e o crescimento
celulares, estimula a
germinação e a floração,
retarda o envelhecimento
(cinetina é um tipo de
citocinina).
Inibe o crescimento; fecha os
estômatos quando falta água;
atua na quebra e dormência
das sementes.
Amadurecimento de frutos,
senescência das folhas e
flores; abscisão de folhas e
frutos.
Auxinas
(AIA, ANA, AIB,
2,4-D)
Meristema apical
(caule), folhas jovens e
sementes.
Polarizado (do caule
para as raízes), através
do parênquima, de
célula a célula.
Citocininas
(cinetina, BAP,
TDZ)
Ápice das raízes,
principalmente.
Via xilema, das raízes
para o sistema.
Ácido Abscício
(ABA)
Folhas maduras e em
sementes.
ABA é exportado a partir
das folhas pelo floema.
Etileno
(C2H4)
Muitos tecidos,
especialmente tecidos
submetidos à
senescência e abscisão.
Sendo um gás, o etileno
move-se por difusão do
seu local de síntese.
Giberelinas
Folhas jovens, em
sementes imaturas e em
raízes
São livremente
transportadas através
do cilema e do floema
Fonte: COLBAND – Colégio Bandeirantes, 2011, modificado pela autora
Crescimento vegetativo das
plantas com a quebra da
dormência de gemas
caulinares e de sementes de
plantas de clima temperado;
induzem a quebra da
dormência; o florescimento de
espécies que são induzidas a
florescer por dias longos.
31
ANEXO B – Composição do meio basal MB
MB
Sais
Meio MS
Vitaminas
Meio MS
Sacarose
30 g.L
-1
-1
Ácido cítrico
150 mg.L
pH
Aferido 5,8
Phytagel
®
-1
2,3g.L
ANEXO C – Composição do meio MS (Murashige & Skoog, 1962)
Componente
Macronutrientes
Nitrato de amônio
Nitrato de potássio
Cloreto de cálcio
Sulfato de magnésio
Fosfato de potássio
Sódio EDTA
Iodeto de potássio
Micronutrientes
Sulfato de ferro
Sulfato de manganês
Sulfato de zinco
Ácido bórico
Molibdato de sódio
Cloreto de cobalto
Sulfato de cobre
Vitaminas
Ácido nicotínico
Cloridrato de piridoxina
Cloridrato de tiamina
Glicina
Mio-inositol
Outros
Agar
Sacarose
-1
Fórmula
Concentração (mg L )
NH4NO3
KNO3
CaCL2.2H2O
MgSO4.7H2O
KH2PO4
Na2EDTA
KI
1650
1900
441
370
170
37,25
0,83
FeSO4.7H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCL2.6H2O
CuSO4.5H2O
27,85
16,9
8,6
6,2
0,25
0,025
0,025
C6H5NO2
C6H12CINO2
C12H18CL2N4OS
C2H5NO2
C6H12O6
0,5
0,5
0,5
2
100
C12H22O11
7.000
30.000
Fonte: EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, 2011b