CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
KARINNE CRISTINNE DA SILVA CUNHA
SOBREVIDA DAS CÉLULAS GANGLIONARES
DA RETINA INDUZIDA PELO PMA:
ENVOLVIMENTO DA PKC/ E JNK.
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE VISANDO A
OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM
NEUROIMONULOGIA
Orientadora: Elizabeth Giestal de Araujo
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINESE
2006
KARINNE CRISTINE DA SILVA CUNHA
SOBREVIDA DAS CÉLULAS GANGLIONARES DA RETINA
INDUZIDA PELO PMA: ENVOLVIMENTO DA PKC/ E JNK.
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos Hertha Meyer
do Departamento de Neurobiologia, Instituto de Biologia - UFF.
Dissertação
Universidade
de
mestrado
Federal
submetida
Fluminense
à
como
requisito parcial de obtenção de grau Mestre
em Neuroimunologia.
Orientadora: Elizabeth Giestal de Araújo
NITERÓI
2006
ii
C 972
Cunha, Karinne Cristinne da Silva
Sobrevida das células ganglionares das células
ganglionares da retina induzida pelo PMA: envolvimento da PKC∗
e JNK / Karinne Cristinne da Silva Cunha. - Niterói: [s. n.], 2006.
74 f.
Trabalho de Conclusão de Curso - (Bacharelado em
Ciências Biológicas) - Universidade Federal
Fluminense, 2006
1. Proteínas. 2. PKC Serina - Treonina Quinase.
3. Células ganglionares. I. Título.
CDD 574.133
iii
KARINNE CRISTINE DA SILVA CUNHA
SOBREVIDA DAS CÉLULAS GANGLIONARES DA RETINA
INDUZIDA PELO PMA: ENVOLVIMENTO DA PKC/ E JNK.
Dissertação de mestrado submetida à
Universidade Federal Fluminense
como requisito parcial para obtenção
de Mestre em Neuroimunologia
Aprovada em Agosto de 2006
BANCA EXAMINADORA
Dra. Patrícia Franca Gardino
UFRJ
Dra. Aline Araujo dos Santos
Universidade Estácio de Sá
Dra. Ana Lúcia Marques Ventura
UFF
REVISOR E SUPLENTE
_____________________________________________________________
Dra. Helena Carla Castro Cardoso de Almeida
UFF
iv
“Tudo vale a pena se a alma não é pequena”
Fernando Pessoa
v
Dedico esta dissertação à Janete
Cunha por seu exemplo de vida e
por tudo que ela representa, e às
crianças da casa Maria de Magdala
por darem um novo sentido à minha
vida. Serei eternamente grata.
vi
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus por sua presença constante na minha vida, pelas oportunidades e
por seu amor.
À minha orientadora Beth por seu apoio, incentivo e exemplo de dedicação, além de seu afeto e compreensão
sempre presentes.
Aos amigos do laboratório pela ajuda e pelo companheirismo. Sem contar também com os momentos de
descontração e alegria proporcionados por eles.
Aos amigos Babu, Carla e Docinho em especial, por toda a ajuda nos problemas com o computador e
também nas minhas inúmeras solicitações. Muito obrigada.
Ao Alexandre por todas as coisas que me ensinou no laboratório, ao Alecsandro e Sr. Bernardino pelo apoio
técnico.
Aos meus pais por me permitirem a dádiva da vida.
Às amigas Alba, Graciete e Ivete pela amizade, carinho e pelo colo, muitas vezes.
A Anderson por todo seu incentivo e apoio.
Aos amigos que mesmo eu estando longe se fizeram presentes, principalmente Flávia e Mariana que moram
comigo e convivem com meu estresse, e também Carina, Cristiane e Elaine.
Ao meu namorado Thiago por está sempre ao meu lado, por sua amizade, carinho e ajuda constante.
Às minhas primas Maria Luisa e Thaís por me socorrer sempre que precisei. Valeu!
Aos meus familiares que contribuíram para mais esta etapa. Obrigada.
vii
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................
ix
RESUMO....................................................................................................
xi
ABSTRACT................................................................................................
xii
INTRODUÇÃO...........................................................................................
Proteína cinase.............................................................................................
Família, estrutura e função..........................................................................
Ativação da PKC.........................................................................................
Localização das PKCs.................................................................................
Morte celular natural e apoptose.................................................................
Eventos bioquímicos intracelulares x Morte celular natural.......................
A retina........................................................................................................
Células ganglionares da retina.....................................................................
1
1
1
4
10
12
15
18
20
2 OBJETIVOS................................................................................................
2.1 Objetivo geral..............................................................................................
2.2 Objetivo específico......................................................................................
27
27
28
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................
Animais utilizados.......................................................................................
Materiais......................................................................................................
Marcação das células ganglionares..............................................................
Cultura.........................................................................................................
Revelação da peroxidase nas culturas.........................................................
Observação das células ganglionares..........................................................
29
29
29
30
32
33
34
4 RESULTADOS...........................................................................................
35
5 DISCUSSÃO...............................................................................................
45
6 CONCLUSÃO............................................................................................
51
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGÁFICAS...........................................................
52
1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.2
1.2.1
1.3
1.4
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPc 3´5´- adenosina monofosfato cíclico
ATP – adenosina trifosfato
BAPTA-AM - 1.2 bis(aminofenoxi)etano-N,N,N´, N´-ácido tetra acético
Bcl2 – proteína de linfoma de célula B tipo 2
BDNF - fator neurotrófico derivado do cérebro
BFA - brefeldina A
CGR - células ganglionares da retina
C-KIPS – proteínas de interação com a PKC
CMF – salina sem cálcio e sem magnésio
CNTF – fator neurotrófico ciliar
DAG - diacilglicerol
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA - ácido desoxirribonucleico
EGF – fator de crescimento epidermal
EGFr - receptor fator de crescimento epidermal
EPO - eritropoetina
EPOR - receptor da eritropoetina
ERK – cinase regulada por sinais extracelulares
FGF – fator de crescimento de fibroblasto
GCL - camada de células ganglionares
IAPs – proteínas inibidoras da apoptose
IL-2 – interleucina 2
IL-4 – interleucina 4
INL - camada nuclear interna
IP3 - inositol trifosfato
IPL – camada plexiforme interna
JAK- janus cinase
JNK – cjun cinase
LIF – fator inibidor da leucemia
ix
MAP cinase - proteína cinase ativada por mitógeno
MARCKs – substrato cinase C rico em alanina miristolada
MEK - cinase ativadora da MAP cinase
NGF - fator neurotrófico do nervo
NT-3 - neurotrofina 3
NT-4/5 - neurotrofina 4/5
NT-6 - neurotrofina 6
ONL - camada nuclear externa
OPL - camada plexiforme externa
PI3-cinase - fosfatidilinositol 3 cinase
PKA – proteína cinase A
PKC - proteína cinase C
PKD – proteína cinase D
PLC - fosfolipase C
PMA - acetato de forbol miristato
PRKs – cinases relacionadas à PKC
PS - fosfatidilserina
RACKs – receptores para cinases ativadas
Raf - cinase que ativa a MEK
Ras - proteína de sarcoma de rato
RICKS – receptores para isoenzimas de cinases C inativas
SNC - sistema nervoso central
SNP – sistema nervoso periférico
Src – sarcoma da retina de galinha
TGF - fator de crescimento tumoral
TrkA - receptor tirosina cinase A
TrkB - receptor tirosina cinase B
TrkC - receptor tirosina cinase C
x
RESUMO
A proteína cinase C (PKC) é uma serina/treonina cinase mediadora de vários
eventos intracelulares tais como proliferação, diferenciação, apoptose e sobrevida.
A literatura descreve que o tratamento com acetato de forbol miristato (PMA) por
48h é capaz de aumentar a sobrevida das células ganglionares da retina in vitro.
Neste trabalho temos como objetivo caracterizar as vias bioquímicas intracelulares
envolvidas nos efeitos causados pelo PMA. Nossos resultados demonstram que o
efeito do PMA na sobrevida das células ganglionares é independente da presença do
soro fetal bovino, da ativação da fosfolipase C (PLC), da via da Src, das vias da
MEK, da PI 3-K e da p38 MAP cinase. Este efeito também independe da liberação
vesicular de polipeptídeos e da ativação dos receptores de alta afinidade para
neurotrofinas. Entretanto, observamos que o efeito do PMA é dependente da
ativação da PKCδ e a da JNK. Baseados nesses resultados, concluímos que as
enzimas PKCδ e JNK desempenham um importante papel na sobrevida das células
ganglionares da retina.
xi
ABSTRACT
Protein kinase C is a serine-threonine kinase controlling different events such
as proliferation, differentiation, apoptosis and survival. Literature described that
PMA increases the survival of retinal ganglion cells kept in vitro for 48h. The aim
of this work was to investigate the intracellular pathways involved in PMA effect.
Our data show that the PMA effect is not mediated by PLC, Src, MEK, PI-3 kinase
and p38. The release of polypeptides and activation of Trk receptors are also not
involved in the PMA effect. Importantly we observed that the effect of PMA
depends on PKCδ and JNK. Based in these results we may conclude that PKCδ and
JNK play an important role controlling retinal ganglion cells survival.
xii
1. INTRODUÇÃO
1.1.
Proteína cinase C
1.1.1 Família, Estrutura e Função
A proteína cinase C (PKC) faz parte de uma família de proteínas
serina/treonina cinases e sua ativação medeia inúmeras respostas intracelulares
(Toker, 1998, para revisão). Esta enzima participa de várias etapas do
desenvolvimento do sistema nervoso, mediando eventos proliferativos, de
diferenciação, de sobrevida, de neuritogênese e de apoptose (Singer, 1996).
Entretanto, sua atividade não se restringe ao período do desenvolvimento, visto que
durante a vida adulta, a PKC controla várias respostas celulares tais como a ativação
plaquetária, remodelamento do citoesqueleto de actina, modulação de canais
iônicos, secreção, dentre outros (Toker, 1998).
Ao longo dos anos, diferentes grupos de pesquisa vêm estudando os
mecanismos de regulação da atividade da PKC. Esta proteína é composta de 2
subunidades: a) subunidade regulatória que apresenta os domínios C1, responsável
pela ligação com o diacilglicerol (DAG) e com o éster de forbol (PMA), e o C2,
responsável pela ligação com o cálcio, e b) a subunidade catalítica altamente
conservada dentre as diferentes isoformas, que apresenta os domínios C3 e C4
1
responsáveis pela ligação do ATP e do substrato, respectivamente (Michie &
Nakagawa, 2005 para revisão) (Figura 1).
Figura 1: Esquema da estrutura das diferentes isoformas da PKC mostrando os
domínios catalítico, regulatório; de ligação para o PMA/DAG, o cálcio e o ATP, e
o homólogo a peckstrina (PH) e um domínio putativo de ligação com a membrana,
ambos da PKC .
(Retirado de Mochly-Rosen and Gordon, 1998)
A família das proteínas cinases C é composta por mais de 10 isoformas que
inicialmente foram subdivididas em 3 classes ou subfamílias: (Tabela 1), certamente
houve uma alteração na família das proteínas cinases C, com a inclusão da nova
classe das cinases relacionadas à PKC (PRKs).
2
A classe convencional é representada pelas isoenzimas α (alfa), βI (beta I),
βII (beta II) e γ (gama), que apresentam como característica sítios de ligação para o
éster de forbol e para o cálcio. A ativação destas isoenzimas é dependente de cálcio,
de DAG de fosfatidilserina e de ácido fosfatídico. (Tabela 1)
A classe nova é representada pelas isoenzimas δ (delta), 0 (epsilon), η(eta) e
θ (teta) cuja ativação independe de cálcio. Estas enzimas são ativadas por DAG,
ácido fosfatídico, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e forbol éster.
A classe atípica é composta pelas isoenzimas ζ (zeta) e λ/ (lambda, também
conhecida como iota), que são cálcio independentes possuem um domínio C1
modificado que não permite a interação com o DAG e não apresentam sítio de
ligação para o éster de forbol, não sendo portanto por eles ativadas. De forma
interessante
diversos
trabalhos
mostram
ativação
destas
enzimas
por
fosfatidilserina, ácidos graxos, fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, ceramida e ácido
fosfatídico (Michie & Nakagawa, 2005 para revisão).
A PKCµ (mu), também chamada de proteína cinase D (PKD), apresenta
posição intermediária entre as classes nova e atípica. Esta isoenzima não responde
ao cálcio, ao éster de forbol (Singer,1996), ou ao DAG, entretanto esta parece
precisar da fosfatidilserina (PS), à semelhança do que acontece com as isoformas da
classe atípica. Alguns autores a colocam em posição intermediária entre as classes
3
nova e atípica, já outros preferem colocá-la na classe atípica (Toker, 1998 para
revisão e Mellor & Parker, 1998 para revisão) (Tabela 1).
Existem ainda trabalhos que falam de outra subfamília, a das cinases
relacionadas à PKC (PRK), também chamadas de PKN (Mellor & Parker, 1998 para
revisão; Toker, 1998, para revisão). Essa subfamíla é constituída de três isoenzimas
PRK 1-3, que não são ativadas por cálcio, DAG ou ésteres de forbol (Mellor &
Parker, 1998 para revisão) (Tabela 1)
Classes
Issoformas
Convencional
α, β, βII, γ
Nova
δ, ε, η, θ
Atípica
ζ, λ
Intermediária entre as
µ
classes Nova e Atípica
PRKs
PRK 1-3
Tabela 1: Classificação da família da proteína cinase
C (PKC). (Mellor & Parker, 1998 para revisão).
1.1.2 Ativação da PKC
Uma via fisiológica bem conhecida de ativação da PKC se dá através
da via da proteína G (Figura 2). Neurotransmissores clássicos ou polipeptídeos se
ligam a receptores específicos na membrana, ativando uma cascata que envolve a
proteína G, a PLC 1 com a subsequente produ ção de inositol trifosfato (IP3) e
4
diacilglicerol (DAG). O IP3 produzido se liga ao receptor específico presente no
retículo endoplasmático, promovendo a liberação de cálcio desta organela e
conseqüentemente a translocação da PKC para a membrana. A ativação desta
proteína é então induzida pelo DAG, pelo cálcio e pela fosfatidilserina. A PKC se
torna ativa após a retirada do bloqueio do sítio catalítico que ocorre subsequente à
ligação com o DAG. Ocorre então o aumento de afinidade da PKC pela
fostatidilserina, que juntamente com a ligação do cálcio no sítio específico, induz a
mudança conformacional e a ativação da enzima (Newton, 1995).
Figura 2: Descrição da via de ativação da PKC através de receptores
metabotrópicos.
www.biocarta.com/pathfiles/h_pkcPathway.gif
Diferente da via rápida de ativação da PKC descrita acima, para que ocorra
uma ativação prolongada é necessário que haja a produção do DAG, a partir da
fosfatidilcolina, pela ação da fosfolipase D (PLD). Nesta reação o ácido fosfatídico
5
é transformado em DAG pelas fosfomonoesterases, sendo os intermediários o ácido
fosfatídico e a colina (Liu & Heckman, 1998 para revisão).
Uma outra forma de ativação da PKC é via receptores catalíticos, que ao
serem ativados induzem a ativação direta da PLC e consequentemente à produção
do DAG como descrito anteriormente (Yang & Kazanietz, 2003).
Figura 3: Formas de ativação das PKCs: incluindo as via
receptores metabotrópicos, receptores tirosina kinase e PMA e
também as vias de sinalização e efeitos envolvendo as PKCs.
Retirado de Yang & Kazanietz, 2003
6
Experimentalmente, a ativação da PKC ocorre através da utilização do
acetato de forbol miristato (PMA), um éster de forbol promotor de tumor (Kazanietz
& Blumberg, 1996) (Figura 3). Os ésteres de forbol são produtos naturais isolados
de Croton tiglium e de outras plantas da família Euphorbiacea (Kazanietz &
Blumberg, 1996). Estes compostos têm sido amplamente utilizados em ensaios de
ativação da proteína cinase C. O PMA ativa a PKC diretamente devido a sua
característica apolar que o permite atravessar a membrana celular facilmente
(Figura 4). Esta molécula também consegue ativar a PKC de forma prolongada,
visto que não é metabolizado pela célula. A ativação crônica da PKC induzida pelo
PMA leva à “downregulation” desta enzima (Pongracz et al., 1994).
Figura 4: Estrutura molecular do PMA
Retirado de www.biochemj.org/bj/ 344/0451/bj3440451f01.gif.
Atualmente a literatura descreve que, além da PKC, o DAG e os ésteres de
forbol possuem outras proteínas-alvo como a proteína cinase D, “Ras guanylilreleasing protein” (GRP), proteínas ativadora de GTPase, DAG cinase (DGK) e
“myotonic dystrophy cinase- related Cdc42-binding cinases”. Contudo, para que
essas proteínas sejam ativadas, a PKC também deve estar ativa o que nos permite
7
dizer que o tratamento com PMA resulta consequentemente na ativação da PKC
(Spitaler & Cantrell, 2004 para revisão).
A forma ativada da PKC fosforila os resíduos serina e treonina de suas
proteínas-alvo (Gatti et al., 1996), sendo que as histonas, as MARCKS
(myristoylated, alanine-rich C kinase substrate) e a MAP kinase-kinase-kinase (Raf)
são seus alvos mais conhecidos (Cross et al., 2000 para revisão). Algumas PKCs
conseguem entrar diretamente no núcleo e ativar genes regulatórios, como a PKC
delta (Cross et al., 2000). A translocação da PKC para o local específico
relacionado à sua função difere bastante entre as isoformas. Esta enzima pode se
associar à membrana plasmática, aos elementos do citoesqueleto ou ao núcleo. Em
culturas de células NG 108-15, a PKC / na forma inativa localiza-se próximo ao
aparelho de Golgi. Contudo, após o tratamento com PMA por 10 minutos, a enzima
é translocada para o núcleo e para a região perinuclear. De forma análoga, a PKC
II está associada a estruturas fibrilares em miócitos cardíacos no seu estado
inativo, sendo translocada para a região perinuclear quando se torna ativa. De forma
inversa, a PKC 0 normalmente se encontra no núcleo e região perinuclear e
transloca-se para regiões de contato celular e provavelmente para elementos
contráteis em miócitos quando ativada (Mochly-Rosen & Gordon, 1998 para
revisão).
Existem várias proteínas que participam de forma indireta da ação da PKC,
dentre elas podemos citar: a) proteínas que mantêm a PKC na forma inativada
8
ligada a estruturas celulares (i.e. RICKs - receptores para isoenzimas de cinases C
inativas); b) proteínas que regulam a translocação da PKC e que se diferem de
acordo com a isoenzima ativada (i.e. RACKs – receptores para cinases ativadas); c)
proteínas ligadoras de PKC e reguladoras de sua atividade e localização intracelular
denominadas C-KIPS proteínas de interação com a PKC. Estas têm participação na
ativação, translocação e estabilização da PKC e estão distribuídas em quatro
categorias:
ƒProteínas que participam no direcionamento da PKC até seus ativadores
fisiológicos.
ƒProteínas que direcionam a PKC para um determinado compartimento celular
após sua ativação.
ƒProteínas que são substratos para a PKC ou que formam complexos com a PKC
e seus substratos.
ƒOutras proteínas de sinalização que formam complexos com a PKC e não se
enquadram adequadamente nos itens anteriores (Poole et al., 2004, para revisão).
Alterações na interação da PKC com as C-KIPS podem levar à condições
patológicas como a cardiopatia dilatada (Arimura et al., 2004), o que demonstra a
grande importância destas proteínas na homeostasia.
A modulação da atividade da PKC também está relacionada com a ação de
um glicosídeo endógeno, semelhante à ouabaína. Diferentes trabalhos têm
9
demonstrado que dependendo da preparação estudada, a ouabaína pode ativar ou
inibir a atividade da proteína cinase C (Efendiev et al., 1999).
1.1.3 Localização das PKCs
A distribuição das isoenzimas da PKC varia em diferentes tecidos,como
mostrado na tabela 2; tendo sido determinada através das técnicas de Northen e
Western blot.
Tabela 2: Distribuição das isoenzimas de PKC nos tecidos (Liu & Heckman, 1998).
Enzimas
Localização
PKC α, βI, βII, δ , ξ e ζ
Em todos os tecidos
PKC γ
No sistema nervoso central e à medula.
PKC η
Na pele e nos pulmões e pequena quantidade no
cérebro e baço.
PKC θ
No músculo esquelético, e em menor quantidade
nos pulmões, baço, pele e cérebro.
PKC µ
Em vários tecidos e é fortemente expressada no
timo e nos pulmões
Estudos imunohistoquímicos e de hibridização in situ, mostraram a presença
das isoformas . e da PKC na retina de ratos adultos. No método
imunohistoquímico, foi detectada a presença da PKC . na camada nuclear interna e
plexiforme interna, o que sugere que as células que expressam essa isoforma sejam
um subgrupo de amácrinas e células bipolares, relacionadas aos bastonetes, que
10
transmitem sinal visual ON para as células ganglionares ON da retina. No estudo de
hibridização, a PKC. foi encontrada na camada nuclear interna e na camada das
células ganglionares da retina, enquanto a PKC foi localizada nas camadas
nuclear, plexiforme interna e das células ganglionares. Na camada nuclear interna,
esta enzima foi detectada na região das células bipolares relacionada aos cones e
células amácrinas (Kosaka et al., 1998). Neste mesmo estudo, não foi detectada a
presença da PKC em nenhuma camada da retina (Kosaka et al., 1998). A
distribuição das isoenzimas de PKC nos diferentes tecidos talvez explique em parte
a diversidade de efeitos da PKC encontrados ao nível celular.
Estudos mostraram que a PKC está envolvida no controle da proliferação
celular, sendo capaz de modular a transição da fase G1 para a fase S (Leszezynski,
1995). A ativação desta enzima leva a um aumento na proliferação de células gliais
em cérebro de ratos neonatos (Bhat, 1989), enquanto o processo de
“downregulation” inibe a proliferação de células da linhagem de neuroblastoma
(Mohan et al., 1999). O tratamento com um inibidor de PKC resulta na diminuição
da proliferação em células de leucemia mielóide de ratos (Leszezynski, 1995).
Em relação à apoptose, estudos têm mostrado que o aumento na expressão da
PKC e diminuição da PKC está associado à apoptose espontânea na linhagem
mielóide humana U-937. A apoptose causada por glicocorticóides em timócitos está
relacionada com a translocação e ativação da PKC0, enquanto a ativação da PKC
11
bloqueia a apoptose em timócito, células hematopoiéticas dependentes de IL-3 e em
células epiteliais renais (McConkey & Orrenius, 1996).
A PKC também medeia a liberação de neurotransmissores, sendo
demonstrada a atuação desta enzima na liberação de neurotransmissores em
preparações de sinaptossomas obtidas de diversas regiões do sistema nervoso. Em
cortes de hipocampo de ratos, a ativação da PKC pelo forbol éster induz o aumento
da liberação de glutamato causado pelo K+ (Vaughan et al., 1998 para revisão). A
ativação da PKC aumenta ainda a liberação de noradrenalina induzida por
estimulação elétrica em cortes de córtex de cérebro de camundongos (Vaughan et
al., 1998 para revisão) estando também envolvida na regulação da liberação de
acetilcolina (Allgaier et al., 1988, Iannazzo et al., 2000).
1.2. Morte celular natural e apoptose
O desenvolvimento do sistema nervoso compreende várias etapas
relacionadas com a proliferação, a migração e a diferenciação de células nervosas e
gliais que o constituem. A morte celular natural é um evento fisiológico bastante
conservado filogeneticamente, que parece controlar o número de células neuronais e
gliais no sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico (SNP). No
entanto, vários trabalhos apontam um papel importante da apoptose nas doenças
neurodegenerativas e em processos de envelhecimento.
12
Morfologicamente, a apoptose tem como características a perda do volume
celular, a condensação da cromatina, a fragmentação organizada do DNA em
oligonucleossomas provocada pela ativação das endonucleases, a manutenção da
estrutura de outras organelas e da membrana plasmática até o seu rompimento e por
fim a fagocitose dos corpúsculos apoptóticos por macrófagos e por células vizinhas.
Uma característica muito importante da apoptose é a ausência de resposta
inflamatória no tecido. O que resulta na morte de algumas células e na preservação
do restante do tecido. Como se houvesse um “suicídio individual” (Bär,1996).
A primeira vez que se descreveu o fenômeno de apoptose foi em 1906 (apud
Purves e Lichtman, 1985) e desde então este fenômeno continuou a ser estudado por
inúmeros pesquisadores, havendo destaque para o estudo no sistema nervoso.
Durante os períodos iniciais de desenvolvimento do sistema nervoso, cerca de
metade dos neurônios gerados morre. A teoria neurotrófica postula que os neurônios
competem por quantidade limitadas de fatores tróficos liberados pelos seus alvos.
As células que conseguem estabelecer os contactos sinápticos adequados
sobrevivem, pois são capazes de obter os fatores tróficos em quantidades
adequadas.
Os fatores neurotróficos podem pertencer à família das neurotrofinas
constituídas pelos fatores de crescimento do nervo (NGF), neurotrófico derivado do
cérebro-(BDNF), Neurotrofina 3 (NT-3) e Neurotrofina 4/5 (NT-4/5) (Oppenheim,
1991). Esses fatores são produzidos pelos neurônios alvo em quantidades limitadas
13
e, corroborando a idéia de que somente as células nervosas capazes de captá-los irão
sobreviver a retirada do alvo resulta no aumento da morte neuronal. Por outro lado,
tanto o aumento no tamanho, como o aumento na expressão de fatores neurotróficos
na população alvo, gera o aumento da sobrevida neuronal (Acheson & Lindsay,
1996). A teoria trófica indica que é durante a chegada dos axônios aos seus alvos,
ou seja, durante a sinaptogênese que ocorre a apoptose (Purves, 1988). No entanto,
um grande número de estudos descreve também a apoptose dos precursores
neuronais e de neuroblastos jovens, que ocorre em várias áreas do cérebro, no
cerebelo e na retina, durante a neurogênese (Lossi & Merighi, 2003). Atualmente
diversos trabalhos demonstram o papel dos precursores de algumas neurotrofinas na
indução da morte celular. O precursor do fator crescimento do nervo (proNGF) e o
precursor do fator neurotrófico derivado do cérebro (proBDNF) induzem a morte
celular ao se ligarem ao complexo p75/sortilina (Nykjaer et al., 2004).
Além das células alvo que desempenham um papel crucial na regulação da
morte celular programada, vários trabalhos vêm mostrando a participação das
células aferentes (Okado & Oppenheim, 1984; Clarke, 1985) e das células gliais
(Newman & Reichenbach, 1996) no controle da sobrevida e diferenciação neuronal
(Linden, 1994).
14
1.2.1 Eventos bioquímicos intracelulares x morte celular natural
Eventos bioquímicos intracelulares também são importantes na regulação da
morte celular natural, e os níveis intracelulares de cálcio têm um importante papel
neste fenômeno. Estudos mostram que um aumento na concentração intracelular do
cálcio, sem atingir níveis tóxicos, permite a sobrevivência neuronal mesmo na
ausência de fatores tróficos (Franklin & Johnson, 1992). Este aumento nos níveis
citoplasmáticos de cálcio poderia ser conseguido através da atividade elétrica das
células aferentes. A despolarização crônica de neurônios através da utilização de
altas concentrações extracelulares de potássio (Franklin & Johnson, 1992) ou
através da abertura de canais de sódio induzida pela veratridina é capaz de inibir a
degeneração neuronal em cultura (Pereira & Araujo, 1997).
O estudo realizado com o Caenorhabditis elegans (C. elegans), um verme
que possui 1090 células e destas 131 morrem por apoptose durante seu
desenvolvimento foi de grande importância para o melhor entendimento e descrição
do fenômeno da apoptose. Os genes ced 3 e ced 4 da C. elegans foram identificados
como essenciais para a iniciação do programa de morte, enquanto o ced 9 foi
identificado como um gene que deveria ser inibido para disparar o processo de
apoptose. Uma significativa homologia foi identificada entre o ced 9 e um gene
isolado do linfoma de célula B (bcl 2) que também regula negativamente o
programa de morte, e também codifica a proteína Bcl 2 em mamíferos. De forma
interessante, a família de proteínas Bcl 2 possui membros
15
proapoptóticos e
antiapoptóticos (McConkey & Orrenius, 1996 para revisão; Villa et al.,1997).
Alguns membros antiapoptóticos localizam-se na membrana externa da mitocôndria
e previnem a saída do citocromo C, preservando a vida da célula. Os membros
proapoptóticos podem estar no citoplasma ou na membrana mitocondrial e uma
mudança conformacional de sua estrutura ou sua translocação pode induzir
mudanças no potencial de membrana mitocondrial, que culmina com a liberação do
citocromo C. Quando a mitocôndria libera o citocromo C, este se liga a Apaf -1 e
induz a ativação da cascata das caspases (cysteine-dependent aspartate-specific
proteases) (Zimmermann & Green, 2000). As caspases são sintetizadas na forma de
procaspases e se tornam ativas após clivagem. Estas enzimas são divididas em duas
classes: a) as caspases iniciadoras da cascata de sinalização (i.e. as caspases 8 e 10)
e b) as caspases efetoras da resposta que agem sobre os substratos nucleares,
culminando na apoptose (i.e. as caspases 3, 6 e 7) (Salvesen,1999; Thornberry,1996
para revisão; Thornberry & Lazebnik, 1998 para revisão).
Existem duas vias de ativação das caspases, a extrínseca e a intríseca. A via
extrínseca se dá com a interação do receptor de morte Fas e seu ligante, que provoca
a autoconversão da caspase 8 para a forma ativa, posteriormente ativando a caspase
3, que induzindo assim a célula à apoptose. Na via intríseca, relacionada com a
mitocôndria, a via da caspase é ativada após a saída do citocromo C, formando o
apoptossoma (citocromo C + Apaf 1+ procaspase 9 e ATP) (Polster & Fiskum,
2004). Esta formação leva à ativação da caspase 9 e conseqüentemente a ativação
da caspase 3, que causará a fragmentação do DNA, atuando no complexo
16
CADDFF40 (uma nuclease) e no ICAD/FF45 (seu inibidor). A caspase 3 cliva o
inibidor e então a nuclease corta a cromatina (Zimmermann & Green, 2001).
As células também possuem inibidores naturais das caspases, denominadas
proteínas inibidoras da apoptose (IAPs), que podem impedir o processo da apoptose
através da ligação, inibição e possivelmente degradação das caspases (Thornberry &
Lazebnik, 1998).
O estudo da apoptose é de grande interesse clínico, visto seu papel no
desenvolvimento neuronal, e sua participação em processos degenerativos. Outro
aspecto interessante da apoptose é a possibilidade terapêutica que advêm da indução
deste fenômeno degenerativo. Como exemplo podemos relatar a apoptose de células
infectadas por vírus, que se constitui numa barreira muito importante para impedir a
replicação viral (Uren & Vaux, 1996), e a utilização da radiação ionizante e de
oncogenes como agentes capazes de deflagrar apoptose (Thompson,1995). A busca
do conhecimento no que diz respeito aos mecanismos capazes de induzir à apoptose
tem sido de grande utilidade em terapias contra o câncer, visto que a indução ao
suicídio dessas células transformadas é o mecanismo utilizado pelas drogas
quimioterápicas e pela radioterapia. O conhecimento mais amplo sobre este
fenômeno, viabilizará para este tratamento o uso de drogas específicas com cada
vez menos efeitos colaterais. De fato, quanto maior especificidade existir no
tratamento, quanto melhor será o tratamento do paciente e maiores as suas
possibilidades de cura (Uren & Vaux, 1996).
17
1.3. A Retina
A retina é um tecido extremamente organizado pertencente ao sistema
nervoso central, cuja localização permite sua fácil obtenção, sem o risco de trazer
tecido conjuntivo adjacente ou outras populações neuronais. Esta característica e
sua organização em camadas sinápticas e nucleares, muito semelhante ao observado
em outras estruturas do sistema nervoso, facilita o seu estudo in vitro o que torna a
retina um excelente modelo experimental (Dowling, 1991; Cepko, 1993 para
revisão).
A retina está organizada em cinco camadas, incluindo 3 camadas nucleares
intercaladas por 2 camadas plexiformes, onde ocorrem os contatos sinápticos.
Podemos então observar na retina a presença da camada nuclear externa (ONL),
onde estão os corpos celulares dos fotorreceptores (cones e bastonetes); camada
plexiforme externa (OPL), onde os prolongamentos de fotorreceptores, células
bipolares e horizontais fazem conexões sinápticas entre si; camada nuclear interna
(INL), onde se encontram os corpos celulares das células bipolares, horizontais,
amácrinas e das células ganglionares deslocadas; camada plexiforme interna (IPL),
onde os prolongamentos de células bipolares, amácrinas e ganglionares fazem
sinapses; camada de células ganglionares (GCL), onde estão os corpos celulares das
amácrinas deslocadas e as células ganglionares (Dowling, 1991 para revisão). A
célula de Muller é um tipo particular de astrócito radial, exclusivo da retina, que
18
está localizado na camada nuclear interna e seus prolongamentos se estendem por
toda a retina (Newman & Reichenbach, 1996 para revisão). É importante ressaltar
que nos primeiros dias após o nascimento do rato, a retina ainda não tem sua
estruturação em camadas, apresentando apenas a camada das células ganglionares,
início da nuclear interna e uma extensa camada de neuroblastos (figura 4).
O processamento da informação luminosa no SNC se inicia quando a luz
atravessa toda a retina transparente e estimula o segmento externo dos
fotorreceptores. Nessa região ocorre então a transdução do sinal luminoso em sinal
elétrico. Na seqüência, há o processamento do sinal elétrico na camada plexiforme
externa, atingindo as células horizontais, que são responsáveis pelo processamento
lateral na retina, e as células bipolares, que fazem sinapses na camada plexiforme
interna. As células amácrinas, que também fazem o processamento lateral, e as
ganglionares são então ativadas. Os axônios das células ganglionares formam o
nervo óptico, sendo responsáveis pela chegada da informação visual a outras partes
do sistema nervoso central (Dowling, 1991 para revisão).
19
Figura 4: Modelo de retina de rato neonato (P0-P2).Observamos a camada de
células ganglionares, amácrinas, fotoreceptores e uma extensa camada de
neuroblastos.
Esquema dado por Gustavo Corrêa
1.4. Células Ganglionares da Retina
O rato no primeiro dia pós-natal (idade P0) possui uma retina bastante
imatura. No entanto, as células ganglionares já se encontram fora do ciclo mitótico,
já que a neurogênese desta população ocorre no período entre 14 a 20 dias
embrionários (E14-E20) (Reese e Colello, 1992). Um fato importante é que de P0 a
P10 este grupamento neuronal se encontra no período de morte celular natural
(Linden e Perry, 1983).
Estudos têm demonstrado que, em P0, é possível detectar RNA mensageiro
para os receptores de alta (Trk A e B) e baixa (p75) afinidade para as neurotrofinas
tanto na camada de células ganglionares como na camada plexiforme interna
20
(Ugolini et al., 1995). As neurotrofinas induzem diferentes respostas nas células
ganglionares incluindo: a manutenção da sobrevida inclusive após lesão, a indução
de crescimento axonal e a formação correta das vias de projeção e regulação dos
contactos sinápticos das células ganglionares com seus aferentes e seus alvos
(Cohen-Cory e Fraser, 1994).
A axotomia das células ganglionares ocasiona sua rápida degeneração
(Allcut et al., 1984). Em 1986, foi demonstrado que o BDNF é capaz de aumentar a
sobrevida das células ganglionares mantidas em cultura (Johnson et al., 1986).
Posteriormente foi identificada a presença do receptor Trk B e do RNA mensageiro
para o BDNF em células ganglionares de ratos neonatos e de ratos adultos (Jelsma
et al., 1993, Pérez e Caminos, 1995). Rickman e Rickman em 1996 injetaram
BDNF no colículo superior de hamsters jovens e evidenciaram a diminuição da
morte celular natural das células ganglionares, corroborando o efeito trófico desta
neurotrofina.
A neurotrofina 4 (NT-4) atua promovendo a sobrevida das células
ganglionares não só durante o desenvolvimento como também em células de ratos
adultos (Cohen et al., 1994; Ary-Pires et al., 1997). Além disso, existem trabalhos
que demonstram os efeitos desta neurotrofina no processo de morte celular natural
das CGR de ratos (Cui e Harvey, 2000).
21
A neurotrofina 3 (NT-3) parece não exercer nenhum efeito sobre as CGR, no
que se refere a sobrevida, ramificação de neuritos ou crescimento axonal (von
Bartheld, 1998). No entanto, foi evidenciado o RNAm para o receptor de alta
afinidade para essa neurotrofina (TrkC) na camada das células ganglionares de ratos
(Ernfors et al., 1988; Kittelerová et al., 1995).
No que se refere ao NGF, as células ganglionares expressam tanto o RNAm
para esta neurotrofina (Zanellato et al.,1993), como o receptor de alta afinidade
TrkA (Rickman e Becha, 1995). Estudos in vivo, mostraram que o NGF, o BDNF e
NT-4/5 influenciam a morte celular após lesão isquêmica, promovendo um retardo
neste processo (von Bartheld, 1998 para revisão).
As células ganglionares de rato expressam o receptor p75 durante o
desenvolvimento (Eckentein 1988; Yan e Johnson, 1988; Carminoto et al., 1991;
Rickman et al., 1992). Contudo, a expressão está inibida em ratos adultos (Hu et al.,
1998), sendo reativada após lesão do nervo óptico (Maffei et al., 1990).
As neurotrofinas e a ativação de seus receptores participam da morte celular
programada quando os axônios estão fazendo seus contatos com o alvo e
estabelecendo sinapses (Cowan et al., 1984) e em um momento anterior à
sinaptogenese, onde a morte pode ser ativada com a ligação do NGF ao seu receptor
de baixa afinidade, p75 (Frade et al., 1996).
22
O crescimento de neuritos das células ganglionares da retina de ratos
mantidas em cultura é induzido pelo FGFa, mas este não é capaz de regular a
sobrevida destas células (Lipton et al., 1988). Na sua forma básica, o FGF previne a
degeneração das células ganglionares após lesão do nervo óptico (Sievers et al.,
1987).
O efeito do EGF na diferenciação das células ganglionares em períodos
iniciais do desenvolvimento tem sido demonstrado (McCabe et al., 1999).
Entretanto, não há relato sobre seu efeito na sobrevida desta população neuronal.
Dados recentes do nosso laboratório demonstram que o tratamento com EGF não
aumenta a sobrevida das células ganglionares mantidas em cultura (Corrêa,
comunicação pessoal).
As interleucinas também influenciam a sobrevida das CGR. A interleucina-6
(IL-6) aumenta a sobrevida das CGR da retina de ratos mantidas em cultura por
48h. Este efeito tem envolvimento dos canais de cálcio tipo L e a ativação da PKC,
sem envolvimento da PKA. No entanto, observa-se a participação das vias da PI3
cinase, da MEK, e dos receptores tirosina cinase (Torres e Araujo, 2001).
A interleucina 4 (IL-4) e a interleucina 2 (IL-2) são capazes de aumentar a
sobrevida das células ganglionares, utilizando vias bioquímicas diferentes. O efeito
de ambas é dose-dependente, contudo o efeito da IL-4 é abolido pelo bloqueio da
proliferação glial e pelo bloqueio dos receptores M1, enquanto que a IL-2
23
independe destes eventos para exercer seu efeito (Sholl-Franco et al., 2001). Dados
não publicados do nosso laboratório a respeito da IL-2 mostram que o efeito desta
molécula na sobrevida das CGR passa pela ativação das tirosinas cinases
intracelulares, em particular a da JAK3 (Souza, 2006).
Há algum tempo vem sendo demonstrado o efeito trófico da eritropoetina
(EPO) no SNC (Jelkmann e Metzen, 1996). Estudos mostraram a expressão da EPO
e do seu receptor EPOR na retina e no cérebro (Bocker-Meffert et al., 2002; Marti et
al., 1996). Estes receptores são encontrados no corpo celular e nos dendritos das
células ganglionares da retina, sendo que a axotomia não interfere na sua expressão.
De forma interessante, após a axotomia, ocorre o resgate das CGR quando a EPO é
oferecida de forma exógena à essas células. O efeito é mediado pela PI 3 cinase e
pela inibição da ativação da caspase 3 (Weishaupt et al., 2004). Outros trabalhos
mostram que, após axotomia, a estimulação dos EPOR resulta na a ativação das vias
da PI 3 cinase e da ERK-1/2 em CGR em degeneração. No entanto, apenas a ERK1/2 confere neuroproteção às células, não tendo a participação da PI 3 cinase nesse
efeito (Kilic et al., 2005).
Uma outra forma de aumentar a sobrevida das CGR é com o uso de agentes
despolarizantes. Pereira e Araujo em 2000 demonstraram o aumento da sobrevida
das CGR induzido pela veratridina, um inibidor da inativação dos canais de sódio
dependentes de voltagem. O efeito observado era dependente do cálcio intracelular,
mas não do cálcio extracelular, sendo necessário a proliferação celular e a ativação
24
dos receptores muscarínicos do tipo M1. Posteriormente, em 2001 Pereira e
colaboradores evidenciaram a importância do sistema colinérgico na sobrevida da
célula ganglionar. Os agonistas colinérgicos eram capazes de aumentar a sobrevida
das CGR em cultura, sendo imprescindível a participação dos receptores M1. Este
efeito era abolido com a inibição dos receptores Trk e pelo bloqueio da secreção de
polipeptídios. Os autores propuseram com base nesses dados a liberação de fatores
tróficos induzida pela atividade elétrica, que regulam a sobrevida das CGR.
Estudos mostram que, em culturas purificadas de CGR, o efeito de alguns
fatores tróficos no aumento da sobrevida dessas células só é obtido quando há um
aumento dos níveis intracelulares de AMPc. Este aumento pode ser induzido por
uma despolarização com o potássio, ocorrendo através da ativação da adenilato
ciclase do tipo 1 dependente de cálcio, gerando também o aumento da sobrevida
(Meyer et al., 1995). Em 1998, eles mostraram que ambos a despolarização e o
aumento nos níveis de AMPc levavam à um aumento dos receptores Trk B
inseridos na membrana das células ganglionares, sendo estas mais responsivas ao
BDNF. Santos e Araujo em 2001, demonstraram, utilizando culturas de CGR sem a
adição de fatores tróficos, que o AMPc aumenta a sobrevida dessas células de forma
dose-dependente. Para isto era necessária a participação do sistema colinérgico,
sugerindo que o aumento do AMPc induz um aumento da atividade colinérgica, o
que permite a produção de fatores tróficos localmente, favorecendo a sobrevida das
CGR.
25
A ouabaína é um derivado de esteróide que inibe a atividade da Na+,K+ATPase. Esta molécula foi o primeiro glicosídeo cardíaco usado na terapia da
insuficiência cardíaca congestiva, pois induz um aumento na concentração
intracelular de Ca2+ no miocárdio (Hansen, 1984). A ouabaína endógena foi
identificada no plasma humano (Hamlyn et al., 1991) e muitos estudos indicam sua
síntese e liberação pelas adrenais (Foster et al., 1998). Sua função está relacionada
com o controle fisiológico da homeostasia do sódio, especialmente na retenção
renal crônica de sódio e expansão de volume plasmático (Yates & McDougall,
1997). Após o tratamento com ouabaína, diferentes vias intracelulares são ativadas
envolvendo distintas enzimas tais como: proteína kinase C, cálcio calmodulina
kinase, a cascata da Ras/Raf/MAP kinase e também tirosinas kinase como EGFr e
SRC (Xie & Askari, 2002). Zhou e colaboradores (2001) demonstraram o efeito
anti-apoptótico da ouabaína em células LLC-PK1. O envolvimento da enzima PI3kinase no efeito da ouabaína caracterizado (Zhou et al., 2001).
Em 2005, Corrêa e colaboradores mostraram pela primeira vez que a
ouabaína aumentava a sobrevida das CGR de forma dose-dependente e mediado
pela PKC. Visto que concentração utilizada (3ng/mL) é próxima ao valor
fisiológico, os autores sugerem que a ouabaína em vez de bloquear a Na+,K+ATPase, estaria regulando a atividade dessa enzima e com isso, resgatando as
células ganglionares da morte.
26
2. OBJETIVOS DO TRABALHO
A PKC é uma proteína essencial em diferentes etapas do desenvolvimento
das células nervosas. Nosso laboratório tem estudado sobre os efeitos do PMA na
sobrevida das células ganglionares da retina mantidas em cultura, caracterizando o
aumento da sobrevida dessa população neuronal após o tratamento com este agente
por 48h. Esse efeito mostrou-se ser dependente da concentração de PMA utilizada,
onde apenas um pulso de PMA não mimetiza o efeito do tratamento por 48h.
Quando as culturas foram tratadas com um inibidor da PKC, o efeito do PMA foi
totalmente abolido e apenas altas concentrações de genisteína (inibidor de tirosinas
cinases) foram capazes de inibir a ação do éster de forbol (Santos & Araujo, 2000).
2.1 Objetivo Geral
Baseados nos resultados obtidos em nosso laboratório, neste trabalho
continuamos os estudos com o PMA, objetivando caracterizar as vias bioquímicas
envolvidas neste efeito e identificar a isoenzima de PKC, que provavelmente estaria
mediando o aumento na sobrevida das células ganglionares induzido pelo
tratamento com PMA.
27
2.2 Objetivos Específicos
Analisamos o efeito do tratamento com o PMA na presença de soro fetal
bovino, do inibidor dos receptores de alta afinidade para as neurotrofinas (K252a),
do inibidor da secreção vesicular de polipeptídeos (BFA), da Src (PP1); da isoforma
da PKC/ (Rottlerina). Investigamos ainda as vias da PLC, da PI-3K, MEK, p38 e da
JNK.
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais utilizados
Em nosso trabalho utilizamos ratos neonatos da linhagem Lister Hooded nas
primeiras 72 horas após o nascimento.
3.2. Materiais
Meio de cultura 199, tripsina e soro fetal bovino foram comprados da
GIBCO (Gaithersburg – USA); glutamina, penicilina, estreptomicina, poli-Lornitina e horseradish peroxidase (HRP) foram obtidos da Sigma (St. Louis - USA);
K252a, PD98059, LY294002 e brefeldina A (BFA), U73122 foram fornecidos pela
BIOMOL (Plymouth Meeting – USA); acetato de forbol miristato (PMA) adquirido
da Invitrogen (California – USA); PP1, JNK, SB203580 fornecidos pela
Calbiochem (California – USA); dimetilsufóxido (DMSO) foi comprado da
Mallinckrodt Baker (Paris – USA); entelan proveniente da Merk (Darmstadt –
Germany); salina sem cálcio e sem magnésio (CMF); Rottlerina cedida gentilmente
pelo professor Carlos Frederico Leite Fontes da UFRJ.
29
3.3. Marcação das células ganglionares
Células ganglionares da retina de ratos pigmentados da linhagem Lister
Hooded foram marcadas pelo transporte retrógrado de peroxidase. Nas primeiras 24
horas após o nascimento (dia zero), o animal foi anestesiado por hipotermia e fez-se
uma incisão longitudinal na região occipital da cabeça. A cartilagem foi cortada
com o auxílio de uma tesoura de microcirurgia e os colículos foram expostos.
Ambos os colículos receberam injeções de peroxidase (Sigma tipo VI – P8375)
30% diluída em DMSO 2%. O volume total injetado em cada colículo corresponde
D / $Sós um período de aproximadamente 16 horas, procedemos à cultura
(figura 5).
30
A
&6
5'
5(
B
Ct 4h
Ct 48h
PMA 48h
Figura 5: Foto e esquema de injeção da peroxidase. (A) Fotomicrografia em campo claro e
(B) em contraste de fase.
31
3.4. Cultura
As culturas foram realizadas de acordo com o seguinte protocolo:
A- Ratos de ambos os sexos, até o dia pós natal 2 foram mortos pelo processo de
decapitação.
B- Os globos oculares foram rapidamente retirados e colocados numa solução
salina sem cálcio e sem magnésio (CMF) à temperatura ambiente.
C- Dissecou-se a retina e logo procedeu-se o tratamento enzimático com tripsina
(Worthington, a 0,1%) por 20 minutos a 37oC em CMF.
D- Após a tripsinização, acrescentou-se meio de cultura (199, GIBCO), acrescido
de 5% de soro fetal bovino, glutamina 2mM, penicilina 100U/mL e
HVWUHSWRPLFLQD JP/ 6LJPD &RP R DX[ílio de uma pipeta Pasteur de
ponta afilada, promoveu-se a separação final das células no meio de cultura.
E- Distribuiu-se então as células sobre as lamínulas pré-tratadas anteriormente com
poli-L-RUQLWLQD JP/ 6LJPD H GLVSRVWDV QR IXQGR GH XPD SODFD GH 3HWUL
de 35mm. Em cada placa foi colocado um volume de 1mL de meio de cultura
contendo 1,25 x 106 células. As células foram então colocadas na estufa a 37oC
numa atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2.
F- Transcorridas 2 a 4 horas, acrescentou-se 1mL de meio de cultura nas placas
controle. Nas placas experimentais, adicionamos as drogas a serem testadas.
Neste exato momento foram também fixadas algumas culturas, que irão
corresponder ao nosso controle de 100% da população de células ganglionares.
As demais culturas são mantidas por 48h in vitro e posteriormente fixadas.
32
3.5. Revelação da peroxidase nas culturas.
As células foram fixadas por 5 minutos em solução de Karnovski (1%
paraformaldeído e 2% glutaraldeído). Em seguida o fixador foi retirado e lavou-se a
preparação com tampão fosfato 0,1M pH 7,3. Posteriormente, revelou-se a enzima
peroxidase pelo método de Mesulan que usa a tetrametilbenzidina (TMB) diluído
em alcool absoluto como cromógeno (Mesulan, 1978).
- Método TMB para peroxidase
- Solução A
* 185 mL de H2O destilada gelada.
* 10 mL de tampão acetato 0,2 M pH 3,3.
* 200 mg de nitroprussiato de sódio.
- Solução B
* 2 mL de álcool absoluto.
* 10 mg de TMB.
Obs: Aquecer o álcool até mais ou menos 50oC e em seguida adicionar TMB
“triturando” até desfazer-se.
- Misturar a solução A e B na hora da incubação.
- Lavar a preparação em tampão fosfato gelado pH 7,2.
33
- Lavar 3 vezes em água destilada gelada.
- Pré incubar 20 minutos na mistura A+B.
- Adicionar 3mL de H2O2 1% para cada 100mL da mistura de pré-incubação
(concentração final de 0,3%).
Após a reação, as culturas foram lavadas em 6 trocas com tampão acetato
(5%) 0,2M pH 3,3. A seguir, as lamínulas foram desidratadas ao vento e montadas
em lâminas histológicas que foram guardadas à temperatura de 4oC.
3.6. Observação das células marcadas.
A observação das células ganglionares marcadas foi realizada em
microscópio de campo claro com um aumento de 400 vezes. Nesta condição de
observação, as células marcadas são facilmente identificadas dada a granulação azul
escura que apresentam. Para estimar o número de células por lâmina, foi realizada
uma contagem sistemática de campos por lamínula. A quantidade de células
ganglionares contadas no controle 4 horas ficava em torno de 500 a 600 células por
lamínula. Nos outros tratamentos a relação foi feita então pela porcentagem com o
controle de 4 horas.
34
4. RESULTADOS
Inicialmente avaliamos a importância do soro fetal bovino no efeito induzido
pelo PMA nas nossas culturas. Nossos resultados experimentais mostraram que
mesmo na privação de soro, o PMA continuava aumentando a sobrevida das CGR
(Figura 6).
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
*
60
*
0
CT 4h
CT 48h
CT 48h s/soro
PMA 50ng/mL
PMA s/soro
Figura 6: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da retina
depois de 48 h em cultura, na presença e na ausência de soro fetal bovino. CT,
controle; PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as médias ± o erro padrão
da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de 48h .
Em seguida, investigamos a participação da via da enzima fosfolipase C no
efeito do PMA, visto que resultados anteriores indicavam que este era dependente
da ativação inicial da enzima PKC, e que a via da fosfolipase C é uma das vias
fisiológicas que levam à da PKC.
35
Para investigar a participação da fosfolipase C (PLC) envolvida no efeito do
PMA utilizamos um inibidor seletivo desta enzima (U73122) na concentração de
4µM.
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50 ng/mL
U73122 4µM
PMA + U73122
Figura 7: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, na presença do inibidor da PLC (U73122 4µM).
CT, controle; PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as médias ± o erro
padrão da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de 48h.
Podemos observar na figura 7 que o U73122 não foi capaz de abolir o efeito
do PMA. Este resultado está de acordo com a hipótese de que o PMA está ativando
diretamente a PKC, excluindo a enzima fosfolipase C desta via de sinalização.
36
Em seguida, analisamos um possível envolvimento das neurotrofinas no
efeito do PMA. Para isso foi utilizado o K252-a, um bloqueador dos receptores Trk,
na concentração de 50nM.
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
K252a 50nM
PMA+K252a
Figura 8: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, na presença do bloqueador dos receptores Trk
(K252-a 50nM). CT, controle; PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as
médias ± o erro padrão da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de
48h.
Podemos observar na figura 8 que o tratamento com K252-a não bloqueia o
efeito do PMA, sugerindo que estes receptores não participam deste efeito (Figura
8).
37
Para analisar a participação de polipeptídeos diferentes das neurotrofinas, no
efeito do PMA, utilizamos a Brefeldina-A (3ng/mL), um inibidor da secreção
vesicular destas macromoléculas e observamos que não houve bloqueio da ação do
PMA (Figura 9).
*
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
BFA 3ng/mL
PMA + BFA
Figura 9: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, na presença de Brefeldina-A (3ng/mL). CT,
controle; PMA, acetato de forbol miristato; BFA, Brefeldina A. Estão presentes as
médias ± o erro padrão da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de 48h.
38
Para avaliar se as Srcs estariam envolvidas no efeito do PMA, foi usado PP1,
um inibidor seletivo destas enzimas.
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
PP1 1µM
PMA + PP1
Figura 10: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, na presença do inibidor da Src PP1 (1µM). CT,
controle; PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as médias ± erro padrão
da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de 48h.
Os resultados apresentados na figura 10 indicam que as proteínas Srcs não
estão envolvidas no efeito do PMA, visto que o PP1 não foi capaz de reverter o
efeito.
39
Avaliamos ainda o possível envolvimento da via da PI-3 kinase no efeito do
PMA. As culturas foram então tratadas com o Ly294002, um inibidor seletivo desta
enzima, na presença de PMA.
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
PMA + LY
Ly 2,5µM
Figura 11: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, na presença do inibidor da PI- 3K, Ly294002
(2,5µM). CT, controle; PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as
médias ± o erro padrão da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de
48h.
Nossos resultados mostram que a via da PI3 cinase não participa do efeito do
PMA, visto que o Ly294002 não foi capaz de inibir o aumento na sobrevida das
células ganglionares induzido pelo éster de forbol (Figura 11).
40
A próxima etapa deste trabalho foi investigar a participação das vias da MAP
cinase no efeito do PMA. Para isso, analisamos inicialmente a participação da MEK
através da utilização de um inibidor seletivo desta enzima, o PD98059, na
concentração de 50µM (Figura 12).
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
PD 50µM
PMA + PD
Figura 12: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, na presença do inibidor da MEK, PD98059
(50µM). CT, controle; PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as médias
± o erro padrão da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de 48h.
Podemos observar na figura 12 que o inibidor da MEK não aboliu o efeito do
PMA, o que infere que esta enzima não deva estar mediando o efeito estudado.
41
A via da p38 é outra via da MAPK e também foi avaliada através da
utilização de um inibidor, o SB203580, na presença do PMA (Figura13).
Novamente, podemos observar que não houve bloqueio do efeito do PMA na
presença deste inibidor.
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
SB 20µM
PMA + SB
Figura 13: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da retina
depois de 48 h em cultura, na presença do inibidor da via da p38, SB203580 (20µM).
CT, controle; PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as médias ± o erro
padrão da média. n: 6-8. * p< 0,001 comparado ao controle de 48h.
42
Finalmente, avaliamos a participação da via da JNK, utilizando um inibidor
desta via na concentração de 1mM (Figura 14).
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
JNK 1mM
PMA + JNK
Figura 14: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, . CT, controle; PMA, acetato de forbol miristato.
Estão presentes as médias ± o erro padrão da média. n: 6-8.
* p< 0,001 comparado ao controle de 48h
Podemos constatar na figura 14, que houve inibição total do efeito do PMA,
revelando a importância desta via no efeito observado com o PMA.
43
Após a busca das vias envolvidas no aumento da sobrevida das células
ganglionares, decidimos identificar a isoforma da PKC que poderia estar sendo
ativada pelo PMA. Dados anteriores do laboratório apontavam para uma isorforma
da classe nova, visto que o aumento na sobrevida das células ganglionares induzido
pelo PMA era independente do cálcio intracelular (Santos & Araújo, 2000). Assim,
testamos então a Rottlerina (4µM),um inibidor da PKCδ (delta), na presença do
PMA (Figura 15).
Sobrevida das CGR
(% do controle)
120
*
60
0
CT 4h
CT 48h
PMA 50ng/mL
Rotlerina 4µM
PMA + Rotlerina
Figura 15: Efeito do PMA (50ng/mL) na sobrevida das células ganglionares da
retina depois de 48 h em cultura, na presença de Rottlerina (4µM). CT, controle;
PMA, acetato de forbol miristato. Estão presentes as médias ± o erro padrão da
média. n: 6-8.
* p< 0.001 comparado ao controle de 48h.
A Rottlerina foi capaz de bloquear o efeito do PMA sobre a sobrevida das
células ganglionares da retina, como revela a figura 15.
44
5. DISCUSSÃO
A participação do soro fetal bovino no aumento da sobrevida das células
ganglionares induzido pelo PMA sempre foi questionada, já que o soro apresenta,
na sua composição, várias moléculas que poderiam contribuir para o aumento da
sobrevida. Ao se realizar os ensaios contendo PMA na ausência de soro fetal
bovino, nossos resultados mostraram que a presença do soro não é crucial para o
efeito do PMA, já que sua ausência não aboliu o aumento da sobrevida das células
ganglionares. É interessante observar que na ausência do soro, a sobrevida das
células ganglionares nas culturas controle é diminuída. O resultado das culturas
controle indica a possível presença de moléculas tróficas no soro fetal bovino
responsáveis pela sobrevida das células ganglionares em culturas controle.
Em uma revisão de 1998, Toker descreve que as isoformas de PKCs
lambda(λ), epsilon(0), zeta (ζ) e mu (µ) podem ser ativadas pela PI 3-K e PLC
diretamente. Estudos in vivo envolvendo receptores mutantes do PDGF, mostram
que a ativação da PKC0 pode ser dependente da PLCγ e da via da PI 3-K. Além
disso, estudos indicam que a PI 3-cinase pode ativar in vitro as PKCs da classe nova
(/,0 e η) e também aquelas classe atípica (ζ) (Toker, 1998 para revisão). Para
investigar o envolvimento da PLC e da PI 3 cinase no efeito do PMA sobre as
células ganglionares utilizamos o U73122 e o LY294002, inibidores da PLC e da PI
3-cinase, respectivamente. Nossos resultados demonstram que nenhuma destas vias
deva estar mediando o efeito visto que nenhum destes inibidores aboliu o aumento
45
da sobrevida das células ganglionares induzido pelo PMA. Podemos inferir que o
PMA esteja ativando diretamente a PKC e a partir desta ativação uma cascata seja
ativada, sendo que não envolve nenhuma das duas enzimas (PLC e PI 3-cinase).
Dados do nosso laboratório mostraram que o tratamento com veratridina, um
agente despolarizante, aumenta a sobrevida das células ganglionares da retina. Este
efeito é mediado pela ativação da PKC, pela liberação vesicular de polipeptídeos e
pela ativação dos receptores de alta afinidade para as neurotrofina (Pereira e Araujo,
2000). Dados da literatura demonstraram que o tratamento com NGF induz à
ativação da PKC 0 em c élulas PC 12 (Toker 1998, para revisão). Assim,
investigamos se o efeito do PMA era dependente da liberação vesicular de
polipeptídeos e ou da ativação dos receptores para as neurotrofinas. Nossos
resultados mostram que os receptores Trk e a secreção de polipeptídeos não estão
envolvidos no efeito do PMA.
A utilização de um modelo de isquemia/ perfusão miocárdica em coelhos
descrito na literatura, mostra um aumento na atividade da Src na fração citosólica,
sendo este efeito bloqueado pelos inibidores da tirosina cinase e da PKC
(Armstrong, 2004, para revisão). Com o intuito de avaliar a possível fosforilação da
Src pela PKC, utilizamos o PP1 e observamos que esta via não está envolvida no
efeito do PMA, já que não houve nenhuma alteração no aumento da sobrevida das
células ganglionares.
46
A PKC0 e a PKC estão envolvidas em transdução de sinal mitogênico e,
provavelmente exercem seus efeitos na transcrição gênica, pelo menos em parte,
através da ativação da via da MAPK (Toker, 1998 para revisão). A PKC0 pode
funcionar ainda como um oncogen através do aumento da atividade da Raf-1 kinase,
e então modular a via da MAPK. A expressão aumentada desta isoforma leva à
ativação de MAPK (Toker, 1998 para revisão) e vários trabalhos na literatura
mostram que, logo após a ativação da PKC, ocorre a ativação da via da MAPK.
Experimentos de co-tranfecção com alelo ativado da PKC estimula a ativação tanto
da MAPK-kinase (MEK) e MAPK. Estudos subseqüentes mostraram que outras
isoformas da PKC, incluindo as PKCs da classe convencional, são capazes de ativar
a via da MAPK, não sendo esse papel restrito apenas a PKC. Estudos mais recentes
têm reforçado o papel de várias isoformas da PKC na ativação da Raf-1, MEK e
MAPK em células (Toker, 1998 para revisão). Um aumento da atividade da ERK
(p42/p44) em cardiomiócitos adultos que apresentavam um aumento na expressão
da PKC0 foi observado e abolido com a inibição da PKC (Armstrong, 2004, para
revisão).
Com base nos resultados descritos na literatura, avaliamos se a via da MAPK
estaria mediando o aumento da sobrevida das células ganglionares induzido pelo
PMA nas nossas culturas, utilizando o inibidor da MEK.
Nossos dados mostram que o aumento na sobrevida das células ganglionares
não é abolido com a utilização do inibidor da MEK. Investigamos ainda a
participação da via da p38 no mecanismo de ação do PMA na sobrevida das células
47
ganglionares. Visto que é necessária a ativação da PKC para o efeito do PMA
(Santos e Araujo, 2000), precisávamos investigar ainda se outras enzimas da família
das MAP cinases não estariam mediando o efeito. Contudo, nossos resultados nos
permitem descartar a via da p38, já que o tratamento com PMA na presença do
inibidor desta enzima não aboliu o aumento na sobrevida das células ganglionares.
Em 2004, alguns trabalhos mostraram que a PKC pode ativar a via da JNK.
Em coelhos, a indução de isquemia resultou em um aumento da atividade da p42
(fração nuclear) e p54 (fração citosólica) da JNK e esse aumento era bloqueado com
a inibição da PKC (Armstrong, 2004, para revisão). Testamos então o efeito do
inibidor da via da JNK na presença do PMA, que foi capaz de abolir o aumento na
sobrevida das células ganglionares induzido pelo PMA. De forma importante, este
dado contrasta com aqueles presentes na literatura que demonstram a participação
JNK em mecanismos de apoptose.O trabalho de Lang e colaboradores em 2004,
mostrou que o PMA era capaz de ativar de forma dose-dependente a via da JNK em
células de câncer de pulmão não pequenas e que o tratamento com inibidores da
PKC abolia o efeito. Nosso resultado mostra que a via da JNK não está
exclusivamente ligada ao fenômeno de apoptose, o que aponta a necessidade futura
de se investigar como esta via está induzindo o aumento na sobrevida das células
ganglionares.
Posteriormente procuramos identificar a isoforma da PKC que estaria sendo
ativada pelo PMA, visto que as isoformas da classe nova são independente de
48
cálcio, e que dados do nosso laboratório mostravam que o BAPTA- AM, um
quelante intracelular de cálcio, não bloqueava o efeito do PMA na sobrevida das
células ganglionares da retina (Santos & Araujo, 2000). Assim, testamos então a
Rottlerina, um inibidor da PKC/, uma enzima da classe nova. A Rottlerina foi capaz
de inibir o efeito do PMA sobre as células ganglionares, demonstrando que a PKC/
era a isoforma que o PMA ativava para exercer seu efeito “trófico”.
Em 2004, Lang e colaboradores evidenciaram a translocação das isoformas da
PKC., PKC II e PKC0, excluindo a PKC/ após o tratamento com PMA. Os
autores também demonstraram que a PKC . e a PKC0 agem juntas para regular a
ativação da JNK, sendo que a ativação induzida pelo PMA envolvia a via
Rac1/Cdc42/PKC. que convergia para a via PKC0/MEK1/2. De forma constratante,
em nosso sistema parece existir uma via diferente das anteriormente descritas,
sugerindo a possibilidade de participação de outras proteínas nos processo de
ativação da JNK.
Não podemos descartar a participação de outras PKCs na ativação da via da
JNK, pois em sua revisão de 2004, Toker sugere a existência de uma hierarquia na
cascata de ativação da PKC, onde uma isoforma ativaria outra (i.e. a PKC0 VHULD
DWLYDGD SHOD 3.& H DWLYDULD D 3.& 1R HQWDQWR Qão se sabe se este evento
ocorreria com todas as isoformas ou seria restrito a estas. Com isso, é possível que
haja a cooperação da PKC/ FRP RXWUD LVRIRUPD SDUD D DWLYDção da JNK, pois o
PMA poderia ativar outras isoformas, e no caso do nosso efeito, uma isoforma da
49
classe nova poderia ser a própria PKC0 2 HVWXGR GHVVD FRRSHUDção é uma
perspectiva interessante e importante para a melhoria do conhecimento sobre esse
processo.
A literatura mostra que fatores de transcrição podem ser fosforilados pela
JNK, como o ATF2 e c-jun help que regulam a expressão gênica em resposta a
fatores de crescimento, citocinas e outros estímulos de estresse celular (Haper &
LoGrasso, 2001). O mecanismo pelo qual a PKC/ leva a ativação da JNK e a
caracterização do envolvimento de uma via relacionada estritamente com morte na
indução de sobrevida são questões ainda a se investigar.
50
6. CONCLUSÃO
Os resultados apresentados neste trabalho demonstram que o efeito do PMA
na sobrevida das células ganglionares é independente da presença do soro fetal
bovino, da ativação da PLC, da via das proteínas Src, da via da MEK, da via da PI
3-K e da via da p38 MAP kinase. Este efeito também independe da liberação
vesicular de polipeptídeos nem da participação dos receptores de alta afinidade para
neurotrofinas. Entretanto, de forma interessante observamos a participação da via da
JNK, que está freqüentemente envolvida na indução de morte celular. Além disso,
vimos que a PKCδ, membro da classe nova, é a isoforma da PKC que está sendo
ativada pelo PMA e que é responsável pelo aumento de sobrevida das células
ganglionares.
51
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