BIOLOGIA MOLECULAR
AULAS PRÁTICAS
3º ano, 1º semestre
2013-14
EXERCÍCIO Nº 1
Considere que fez uma electroforese em gel de agarose, para verificar o
mapa
de
restrição
do
plasmídeo
pVU1,
abaixo
desenhado.
Desgraçadamente, estava distraído (a) e não registou que enzima(s)
utilizou em cada uma das misturas de reacção que foram analisadas (1 a
6).
Consulte o mapa de restrição do plasmídeo e o esquema da separação
electroforética realizada apresentados, e indique qual ou quais foram as
enzimas utilizadas em cada um dos ensaios de restrição (1 a 6).
BamHI:
BamHI/ HindIII:
PvuI:
HindIII/ PvuI:
PvuI/ BamHI:
Bam HI/ HindIII/ PvuI:
EXERCÍCIO Nº2
As enzimas de restrição BanI, HaeII e SacI foram usadas na construção do
mapa de restrição do plasmídeo pTSU. Efectuaram-se digestões simples e
múltiplas, e os produtos de digestão foram analisados em gel de agarose.
Os resultados obtidos estão representados no esquema seguinte:
Construa o mapa de restrição do plasmídeo pTSU para as enzimas BanI, HaeII
e SacI, indicando no esquema a posição relativa dos diferentes sítios de
restrição.
EXERCÍCIO Nº3
Na Figura está esquematizado um ensaio de sequenciação de um
fragmento de DNA, segundo o método enzimático ou de Sanger.
DNA
5’ - TGC
3’ - ACG
CCA – 3’
GGT – 5’
(429)
(460)
primer
reacção A
α-32P
dATP
ENZIMA (E):___________________
reacção C
α-32P
dATP
reacção G
reacção T
α-32P dATP
α-32P dATP
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
dGTP
dGTP
dGTP
dGTP
dCTP
dCTP
dCTP
dCTP
dTTP
dTTP
dTTP
dTTP
A
____
C
G
T
____
____
ntd 460
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
____
ntd 429
____
____
____
3.1. Identifique a enzima (E) utilizada.
3.2. Por que razão se utilizaram os nucleótidos dideoxi (ddNTP) para definir a
posição do nucleótido correspondente na sequência de DNA?
3.3. Faça a leitura do gel de sequenciação, apresentado no esquema da Fig.1,
entre os nucleótidos 430 e 440, indicando a orientação da sequência lida.
3.4. Escreva a estrutura nucleotídica do fragmento correspondente.
EXERCÍCIO Nº4
A tecnologia do DNA recombinante, baseada em avanços essenciais da
Biologia Molecular de diversos tipos de organismos vivos, tornou
possível, de modo insubstituível, o aprofundamento do conhecimento da
estrutura e funcionamento de genomas complexos.
A Figura 4 corresponde ao esquema de um cDNA full-length (A) e de um vector
de clonagem (B) utilizado na clonagem molecular do mesmo:
A.
E B
5’
S
ATG
H
P
X B
3’
B.
KpnI
BstXI
SmaI
ClaI
ApaI
NotI
XbaI
ScaI
XhoI
HindII
EcoRI
BamHI
SpeI
PstI
BssHII
SacI
Figura 4 - A. Mapa de Restrição do cDNA full-length. Sítios de restrição:
E- EcoRI; B- BamHI; S- SmaI; H- HindIII; P- PstI; X- XhoI.
B. Vector de Clonagem: pBK-CMV. MCS – multiple cloning site; P CMV –
promotor de citomegalovírus; P Lac – promotor lac; Lac Z – β- galactosidase; P
SV-40 – promotor SV-40; SV-40 pA – SV-40 poliA; neo/kan – gene de
resistência a neomicina/ kanamicina.
4.1. Quais os critérios que utilizaria para seleccionar as enzimas de restrição a
utilizar na clonagem direccional do cDNA no vector pBK-CMV? Especifique o
sistema escolhido.
4.2. Refira o método que utilizaria na selecção de clones positivos
eventualmente obtidos no ensaio de clonagem. Justifique.
EXERCÍCIO Nº5
Imagine que está a tentar clonar o cDNA que codifica para a proteína X, num
vector de expressão eucariótico (pBM).
Começou por ligar um fragmento de 2Kb de DNA com extremidades EcoRI,
que corresponde ao quadro de leitura da proteína, com o vector de expressão
pBM, que anteriormente tinha sido linearizado com EcoRI.
Após transformação de células E. coli foram obtidas 5 colónias (A, B, C, D e E).
O DNA plasmídico for extraído a partir de cada uma destas colónias, e foi
digerido com as enzimas de restrição EcoRI e SalI.
Os produtos de digestão foram analisados em gel de agarose, e os resultados
do gel estão representados no diagrama seguinte:
5.1. Explique os vários padrões de restrição obtidos, e escolha o clone que
usaria (A, B, C, D e/ou E), se quisesse exprimir a proteína X numa linha celular
eucariótica.
EXERCÍCIO Nº6
Considere o fragmento HindIII de 1,6 kb (A) e o vector plasmídico
hipotético de 2,7 kb (B), representados na Figura 1 abaixo indicada.
B.
A.
Hind III
Hind III
Hind III
0,3 Kb
1,6 Kb
2,7 Kb
Eco RI
fragmento Hind III
vector plasmídico
Quando se digere o referido fragmento A com BamHI originam-se dois
fragmentos, de 1,2 kb e 0,4 kb. Admita que clonou o fragmento
representado em A no sítio HindIII do vector representado em B.
Como procederia para determinar a orientação do fragmento num dos clones
recombinantes?
EXERCÍCIO Nº7
O gene biomol exprime-se no fígado de rato e a sua expressão é regulada
pelos glucocorticóides. Foram tratados ratos com 30 mg /Kg de dexametasona,
e sacrificados a diferentes tempos após administração do indutor. Foi extraído
RNA total a partir dos fígados de ratos controlo e de ratos tratados, e foi
efectuada uma experiência de Northern blot. Na Figura seguinte está
esquematizado o resultado da experiência de Northern blot.
Tempo (h)
0
1
2
3
4
5
6
mRNA
gene
X
biomol
mRNA
?β- actina
7.1. Analise o esquema anterior e descreva os resultados obtidos, referindo-se
aos tempos de indução do gene biomol pelos glucocorticóides. Justifique a sua
resposta.
O esquema seguinte representa os resultados de um outro ensaio de Northern
blot, em que se analisaram os níveis de expressão de três factores de
transcrição potencialmente envolvidos na regulação do gene biomol.
Tempo (h)
0
1
2
3
4
5
6
mRNA TF1
mRNA TF2
mRNA TF3
mRNA β-actina
7.2. Comparando a relação cronológica entre a expressão dos vários
factores de transcrição (TF1, TF2 e TF3) e a activação da transcrição do
gene biomol, diga qual destes factores estará potencialmente envolvido a
expressão do gene biomol. Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº8
A figura 8-A representa um clone genómico, que comporta a sequência
nucleotídica que codifica para um factor de transcrição de Drosophila
melanogaster.
As setas indicam o sítio de iniciação da transcrição (seta 1), bem como a região
3’ do último exão (seta 2).
Dois fragmentos de restrição obtidos a partir deste clone foram marcados com
32
P e usados como sondas (sonda 1 e sonda 2), num ensaio de Northern blot.
As amostras de mRNA que se utilizaram foram obtidas a partir de diferentes
estadios de desenvolvimento: embrião (E), larva (L) e adulto (A).
O resultado da análise de Northern blot está esquematizado na fig. 5-B.
Fig. 8 - A
2
1
Clone genómico
sonda 1
sonda 2
Fig. 8 – B
E
L
A
Resultados obtidos
com a sonda 1
E
L
A
Resultados obtidos
com a sonda 2
8.1. Interprete os resultados obtidos através da análise de Northern blot, com
ambas as sondas.
8.2. Imagine que quer clonar o cDNA que codifica para este factor de
transcrição:
a) Que estadio de desenvolvimento (E, L ou A) utilizaria para gerar a sua
biblioteca de cDNA? Porquê?
b) Que sonda utilizaria para fazer o screening de uma biblioteca de cDNA.
Porquê?
Depois de ter clonado com sucesso o cDNA que codifica para o factor de
transcrição em estudo, utilizou dois fragmentos do cDNA como novas sondas
(sonda 3 e sonda 4), em novos ensaios de Northern blot.
8.3. Desenhe no diagrama abaixo representado, os resultados que esperaria
obter após hibridação de dois novos blots, com as sondas 3 e sonda 4.
Justifique a sua resposta.
Sequência do cDNA:
5’ ACGTATGATACTGGTACGTCTGTAATGCGAAAAAAAAAAAAAA 3’
sonda 3
E
L
sonda 4
A
Resultados
esperados para a
sonda 3
E
L
A
Resultados
esperados para a
sonda 4
EXERCÍCIO Nº9
Resultados experimentais demonstraram que factor de transcrição FT1
tem capacidade de heterodimerizar com outros dois factores de
transcrição (FT2 e FT3), e que alguns destes heterodímeros são
importantes na regulação da transcrição do gene X.
Imagine que está interessado em caracterizar os diferentes domínios da
proteína FT1.
Para tal, construiu uma série de mutantes de deleção e co-transfectou cada um
destes mutantes com um plasmídeo reporter que contém o promotor próximo
do gene X.
Foram também efectuados ensaios em que adicionalmente se co-transfectaram
os vectores de expressão que codificam para as proteínas FT2 ou FT3
selvagens.
Na tabela seguinte encontram-se os níveis de activação da transcrição do gene
X pelos diferentes mutantes do factor FT1, na presença ou ausência de FT2 ou
FT3:
Domínio mutado de FT1
1
Wt
2
∆1
3
∆2
4
∆3
5
∆4
1
2
3
4
5
2
3
4
5
3
4
5
4
5
1
1
2
1
2
3
5
FT1
FT1 + FT2
FT1 + FT3
+
+++
+++
+
+
+++
+
+++
+
-
-
-
-
-
-
Por outro lado foram efectuados ensaios de EMSA em que se utilizou como
sonda o elemento de resposta do factor FT1 no promotor do gene X e extractos
nucleares de células COS-7 que tinham sido transfectadas com cada um dos
mutantes de deleção. Os resultados obtidos estão representados no diagrama
seguinte:
wt ∆1 ∆2 ∆3 ∆4
shift
sonda livre
9.1. Qual o domínio de ligação ao DNA da proteina FT1? Justifique a sua
resposta.
9.2. Qual o domínio de transactivação da proteina FT1? Justifique a sua
resposta.
9.3. Será que FT1 heterodimeriza com FT2 e FT3 através do mesmo domínio?
Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº10
O gene isca é um gene de expressão hepática, importante nos processos de
destoxificação do organismo. Num artigo recente, investigadores testaram o
papel do factor de transcrição FEL (FTY) na indução da transcrição do gene
isca.
Para tal, foram construídos vários recombinantes contendo a região reguladora
do gene isca, com deleções tanto a montante como a jusante do sítio de
iniciação da transcrição deste gene.
-1560
-1175
6
SV Luc
-1175
-790
5
SV Luc
-2274
-790
4
SV Luc
-790
+1 +50
3
Luc
-2274
+1 +50
2
Luc
-2274
+1
+145
Luc
1
0
1
2
3
4
5
6
7
Actividade Luc (x de indução)
Controlo FTY
Figura 10: Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em culturas de
células CV1 (fibroblastos de rim de macaco). Co-transfecção do vector de
expressão para o factor de transcrição fel (FTY) com os vários recombinantes
contendo a região reguladora do gene isca.
Luc – gene reporter luciferase; SV – promotor SV-40.
10.1. Existe uma diferença fundamental ao nível do promotor utilizado na
construção dos vectores recombinantes 1,2 e 3, e dos 4,5 e 6. Diga qual é essa
diferença.
10.2. De acordo com a análise dos resultados indique qual é a região
responsável pela activação da transcrição do gene isca pelo factor FEL.
Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº11
O gene isca é um gene de expressão hepática induzido pelos glucocorticóides.
Num artigo recente, investigadores tentaram identificar o elemento de resposta
aos glucocorticóides na região reguladora do gene isca.
Para tal, foram construídos vários recombinantes contendo a região reguladora
do gene isca, com deleções tanto a montante como a jusante do sítio de
iniciação da transcrição do gene.
-1560
-1175
SV Luc
-1175
6
-790
SV Luc
-2274
5
-790
4
SV Luc
-790
+1 +50
3
Luc
-2274
+1 +50
2
Luc
-2274
+1
+145
Luc
1
0
5
10
15
20
25
Actividade Luc (x de indução)
Controlo 10uMDEX
Figura 11: Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em células HuH7
(hepatoma humano). Transfecção de vários recombinantes contendo a região
reguladora do gene X. As células foram tratados com veículo ou com 10µM de
dexametasona (DEX). Luc – luciferase; SV – promotor SV-40.
Pela análise dos resultados podemos identificar duas regiões reguladoras no
gene isca: uma das regiões é importante para a expressão basal do gene,
enquanto a outra é responsável pela resposta aos glucocorticóides.
11.1. Identifique essas duas regiões, justificando a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº12
Trabalhos recentes de investigação laboratorial conduziram à clonagem
de um novo receptor nuclear denominado WINTER-FARMO (WF), tendo
sido identificadas uma série de moléculas capazes de activar este novo
factor de transcrição. Uma consulta bibliográfica detalhada permitiu
verificar que os ligandos identificados são igualmente conhecidos como
sendo indutores do gene student.
Na tentativa de identificar o elemento de resposta do factor de transcrição WF
no promotor do gene student foram construídos vários recombinantes contendo
deleções da região reguladora do gene tendo estes mutantes sido cotransfectados com o vector de expressão do factor WF, em culturas da linha
celular COS-1. Na Figura 12 encontram-se representados os níveis de
Kpn I
BamH I
Bgl I
Sph I
BamH I
Xho I
activação dos diferentes mutantes de deleção do gene student pelo factor WF.
+1
Actividade
Luc
LUC
wt
+
LUC
m1
-
LUC
m2
+
LUC
m3
-
m4
+
LUC
Figura 12 -
Ensaios de transfecção-transactivação efectuados em células
eucariotas da linha COS-1. Co-transfecção de vários recombinantes contendo
a região reguladora do gene student, com o vector de expressão do receptor
nuclear WF. Luc – luciferase; wt - wild type ou selvagem; m – mutante.
12.1. De acordo com a análise destes resultados indique qual é a região
responsável pela activação da transcrição do gene student pelo factor de
transcrição WF. Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº13
Na Figura 13 está esquematizado o resultado de uma experiência de EMSA.
Extractos nucleares preparados a partir de vários tecidos animais foram
incubados com o fragmento de restrição da região promotora do gene student
que contém o elemento de resposta do factor WF, e que foi marcada
radioctivamente com 32P.
De modo a testar a especificidade da ligação foram efectuados ensaios de
competição com um excesso molar de competidor que contém a sequência de
consenso de ligação do factor WF.
Sonda
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Competidor
-
-
+
-
+
-
+
-
+
Extracto
nuclear
-
F
F
C
C
I
I
R
R
Figura 13 - F: fígado; C: cérebro; I: intestino; R: rim.
13.1. O que é que pode concluir analisando esta auto-radiografia?
Refira-se especificamente à capacidade de ligação do factor WF nos diferentes
tecidos animais.
13.2. Que experiência(s) é que deveria fazer para determinar se o receptor WF
se encontra nos complexos formados?
EXERCÍCIO Nº14
O gene REGABOFE (RGB) codifica para uma proteína de expressão hepática.
A expressão basal do gene é regulada positivamente pelo factor de transcrição
SEF (Sempre Em Festa), no entanto ainda não tinha sido identificado o
elemento de resposta para este factor.
Dados recentes (ver Figura 14.1 – A, B e C), vieram não só identificar a região
do promotor do gene RGB transactivada pelo SEF, bem como o tipo de
interacções que se estabelecem, a nível da região 5’- adjacente, entre este
factor e os receptores nucleares PXR (Paródia X Receptor) e CAR
(Comemoração Anual Receptor).
A
RGB -1874
RGB / SV40
CAR/PXRRE
GRE
-1839
-1697
EcoRV
-1358
EcoRI
AvrII
AvrII
-250
-362
SmaI
-114
SV40
LUC
LUC
RGB -1874? -1357/-362
LUC
RGB -1874? -250/-114
LUC
Figura 14.1 – Transactivação do promotor RGB pelos factores de transcrição
SEF, PXR e CAR. Co-transfecção de plasmídeos reporter wild-type e mutantes
contendo a região 5’- adjacente do gene RGB, com os vectores de expressão
que codificam para as formas humanas dos factores de transcrição SEF, CAR
e PXR.
Analise a Figura 14.1 e responda às seguintes perguntas:
14.1. Que enzima(s) de restrição foram utilizada para construir o mutante de
deleção RGB -1874∆ -1357/-362?
14.2. Qual a diferença entre os mutantes RGB/SV40 e RGB -1874∆ -1357/362? Justifique a sua resposta.
14.3. Qual a região do promotor do gene RGB transactivada pelo SEF?
Justifique a sua resposta.
DMSO
4OHT
RIF
PB
Tendo em conta que o fenobarbital é um activador do receptor CAR e que
a rifampicina e o 4-hidroxitamoxifeno são agonistas do receptor PXR, e
que ambos os receptores estabelecem interacções proteína-proteína com
o receptor SEF, analise as Figuras 14.1 e 14.2, e responda à pergunta
seguinte:
RGB
β-ACTINA
Figura 14.2 – Efeito do tratamento com agonistas dos receptores nucleares
PXR e CAR nos níveis de mRNA do gene RGB em células HepG2. Análise por
RT-PCR do RNA total (20µg) de células HepG2 tratadas durante 24 h com
veículo (DMSO), com fenobarbital (PB), com rifampicina (RIF) ou com 4hidroxitamoxifeno (4OHT), utilizando primers específicos para o RGB e para a
β-actina.
14.4. Qual é o efeito da interacção entre os receptores nucleares CAR e PXR e
o factor SEF, na regulação da transcrição do gene RGB?
Justifique a sua resposta.
Uma análise bioinformática identificou um potencial elemento de resposta
ao factor SEF na região -362 a +34. Foi efectuado um ensaio de EMSA,
para verificar se o factor SEF tinha capacidade de se ligar a esta
sequência.
Analise a Figura 14.3 e responda às questões seguintes:
RGBCYP-152wt
-152wt
EN
Competidor
anticorpoanti-SEF
Anticorpo
anti-HNF4
Figura 14.3 – Caracterização da actividade de ligação de proteínas presentes
nos extractos nucleares das células HepG2, ao oligonucleótido RGB-152 wt.
Ensaio de EMSA foi efectuado utilizando um oligonucleótido em cadeia dupla
marcado radioactivamente que corresponde ao potencial elemento de resposta
ao SEF no promotor do gene RGB como sonda (RGB-152 wt). Os ensaios de
competição foram efectuados adicionando oligonucleótidos mutados em cadeia
dupla não marcados, numa concentração 100 vezes superior à da sonda. O
ensaio de supershift foi efectuado utilizando um anticorpo anti-SEF.
14.5. O factor SEF tem capacidade de se ligar à sonda? Existirão mais
proteínas nucleares capazes de se ligarem a esta região? Justifique a sua
resposta.
14.6. Qual das mutações (-152mut1 ou -152mut2) introduzidas nos
oligonucleotidos competidores impede a ligação das proteínas nucleares à
sonda? Justifique a sua resposta.
EXERCÍCIO Nº15
Um grupo de investigadores estudou o papel da proteína PXR na
regulação da expressão do gene CYP2B6. O CYP2B6 está envolvido no
metabolismo de numerosos fármacos, e a sua expressão é induzida por
compostos que são ligandos do PXR (por exemplo, rifampicina,
fenobarbital
identificaram
e
dexametasona).
uma
sequência
Resultados
reguladora
de
estudos
localizada
anteriores
numa
região
enhancer, denominada CYP2B6-PBREM. Este módulo regulador contém 2
elementos –cis DR4 (NR1 e NR2) que funcionam como sítios de ligação
para heterodímeros CAR-RXRα.
Os recombinantes contendo o gene repórter Luciferase (Luc) foram preparados
inserindo as estruturas oligonucleotídicas (fig.15.1 - A) correspondentes às
sequências wild-type e mutadas do CYP2B6-PBREM no vector de expressão
pGL3-tk-Luc.
Fig. 15.1 – Regulação do PBREM do CYP2B6 pelo PXR e CAR. (A) Estrutura da
sequência reguladora CYP2B6-PBREM. Os elementos DR4 (NR-1 e NR-2) estão
assinalados por setas, e as bases mutadas estão em letra minúscula.
Ensaios de transactivação dos recombinantes selvagem e mutantes do CYP2B6PBREM pelo PXR (B) e CAR (C) foram feitos através da transfecção transitória de
células HuH7 (hepatoma humano). A activação mediada pelo PXR foi caracterizada
pelo tratamento das células transfectadas com rifampicina ou DMSO (veículo) por 24
horas.
A capacidade de ligação das proteínas PXR e CAR aos sítios NR1 e NR2
foi avaliada por EMSA (fig.15.2).
Fig. 15.2 - Ligação das proteínas reguladoras aos elementos de resposta NR1 e
NR2. (A) EMSA com sondas oligonucleotídicas de dsDNA correspondentes às
sequências de ligação NR1 e NR2 (ver Fig.2-A). Nas reacções de binding foram
usadas proteínas RXRα, CAR e PXR traduzidas in vitro.
15.1. Sabendo que o PXR é um receptor nuclear, diga quais os domínios
estruturais que poderão fazer parte desta proteína, e qual o papel
desempenhado por eles na regulação da expressão genética.
15.2. Com base nos resultados apresentados nas figuras anteriores, responda
às perguntas seguintes:
a) O PXR é um activador ou um repressor da transcrição do gene CYP2B6?
Justifique a sua resposta.
b) Qual é a informação mais evidente que retira da análise do resultado do
EMSA?
Justifique a sua resposta.