Biotinilação
Este protocolo é destinado à marcação exclusiva de proteínas expostas na superfície
celular (pulse), para então monitorar o processamento e/ou degradação das mesmas ao
longo do tempo (chase).
Marcação com biotina:
- A marcação deve ser feita a 4 oC para minimizar endocitose.
- Lavar células com PBS gelado (Para células aderentes usar PBS suplementado com
Ca++ e Mg++ para minimizar perda de células durante as lavagens).
- Incubar células com solução de Biotina 1 mM gelada (EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin
from PIERCE - cat #21335) em meio DMEM (ou outro meio de cultura adequado). Para
células aderentes o volume deve ser suficiente para cobrir as células na placa (ex. 700 uL
para placas de 35 mm). Incubar por 30 minutos a 4 oC ou em gelo sob leve agitação.
- Após 30 minutos substitua a solução de biotina por uma solução fresca idêntica e incube
nas mesmas condições por mais 30 minutos. Incubação total de 1h.
- Lave as células 2 vezes com PBS gelado.
- Incube células por 10 minutos em 1 mL de solução de NH4Cl 50 mM em PBS (gelado)
para fazer o “quench” da biotina residual.
- Lave as células 3 vezes com PBS gelado.
- Congele a amostra de células que serão seu tempo 0 (pulse) e adicione meio de cultura
adequado (ex. DMEM) às outras amostras.
- Incube as amostras adicionais à 37 oC nas condições normais de cultura por diferentes
tempos (ex. 1, 2, 4, 8 h).
- Ao fim de cada tempo, lave as células da amostra correspondente com PBS e congele.
Cromatografia de afinidade.
- Ressuspenda células congeladas em 1 mL de tampão de lise (50 mM Tris pH 7.5, 150
mM NaCl, 10% (v/v) glycerol, 5 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, suplementado com
inibidores de protease) em um tubo eppendorf e incube por 30 minutos em gelo.
- Centrifugue a 14.000 rpm por 15 minutos a 4 oC e transfira 900 uL do sobrenadante
para um novo tubo Eppendorf.
- Lave o volume adequado de “Neutravidin agarose resin” (thermo scientific # 29200),
(30 uL por amostra), com PBS por duas vezes e mais duas vezes com tampão de lise.
Ressuspenda a resina com tampão de lise para obter o mesmo volume inicial.
- Adicione os 30 uL de resina aos 900 uL do extrato de células e incube a 4 oC por 1-2h
sob agitação leve.
- Lave a resina com 1 mL de tampão de lise, centrifugue 1-2 minutos a 2500 g e remova o
sobrenadante. Repita este procedimento por pelo menos mais 3 vezes e em seguida lave
com PBS.
- Remova o PBS. Ferva as amostras em tampão de SDS-PAGE e analise proteínas por
eletroforese seguida de western blot para a detecção de CD4.