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AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
REDUÇÃO BACTERIANA COM DIODO EMISSOR DE LUZ
AZUL ASSOCIADO AO FOTOSSENSIBILIZADOR
RODAMINA ÁCIDA B: ESTUDO IN VITRO SOBRE
STREPTOCOCCUS
MUTANS
MARIA CRISTINA EIKO HASHIMOTO
Dissertação apresentada como parte
dos requisitos para obtenção do Grau de
Mestre Profissional na área de Lasers em
Odontologia.
Orientadora:
Profa. Dra. Martha Simões Ribeiro
Co-orientador:
Prof. Dr. Edgar YujiTanjl
São Paulo
2005
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AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
REDUÇÃO BACTERIANA COM DÍODO EMISSOR DE LUZ AZUL
ASSOCIADO AO FOTOSSENSIBILIZADOR RODAMINA ÁCIDA B:
ESTUDO IN VITRO SOBRE STREPTOCOCCUS MUTANS
MARIA CRISTINA EIKO HASHIMOTO
Dissertação apresentada como parte
dos requisitos para obtenção do Grau
de Mestre Profissional na área de
Lasers em Odontologia
Orientadora:
Profa. Dra. Martha Simões Ribeiro
Co-orientador:
Prof. Dr. Edgar Yuji Tanji
São Paulo
2005
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MESTRADO PROFISSIONALIZANTE LASERS EM
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Agradeço
especialmente,
À minina querida orientadora
Ritjeiro, que com seu carinlio,
contagiante
Profa. Dra. Martina Simões
profissionalismo
e bom humor
me conduziu até aqui. Meu sincero
agradecimento
pela sua paciência e dedicação e pela honra de sua orientação
neste trabalho.
A o Prof. Dr. Edgar Yuji Tanji pela sua co-orientação, pela sua boa vontade, ajuda
e incentivo.
À Prof*.
Dra. Silvana Cai, do Depto. de Microbiología do ICB-USP, pela sua
orientação na área de Microbiología, pela sua paciência e boa vontade em ensinar
e pela seriedade de seu trabalho.
A o Prof. Dr. Laércio G o m e s , pelo uso do Laboratorio de Espectroscopia.
A o s c o l e g a s A é c i o Y a m a d a Jr., Renato de Araújo Prates e Luiz Cláudio Suzuki,
por t o d o s os m o m e n t o s durante a fase do experimento, pela solidariedade, pelo
carinho e incentivo e principalmente pela amizade.
A o O s v a l d o , da MMOptics, Brazil, pelo uso do equipamento Bright Lee II.
À CCI Q u í m i c a Importação Exportação e Representações Ltda., pela amostra
cedida d a rodamina ácida B.
A o Prof. Dr. G e s s é Eduardo Calvo Nogueira, pela sua orientação no primeiro
projeto de pesquisa, pela sua boa vontade e m ajudar, pela sua competência, meu
sincero reconhecimento.
A o Prof. Dr. Eduardo M a k o t o A d a c h i , minha gratidão por ter sido m e u professor e
amigo, por todos os ensinamentos, por mostrar o caminho e torcer pelas minhas
conquistas. Obrigada pelo apoio d a d o para que eu iniciasse o mestrado, pelo
incentivo e pela sinceridade de sua amizade.
A o Prof. Dr. Michel Nicoiau Youssef, pela oportunidade de estágio no Depto. de
Dentística da F O U S P e pelo incentivo para que e u iniciasse o mestrado.
A o Prof. Dr. Flávio Carnevale Filho, pela sua amizade, pelo seu incentivo, m e u
sincero agradecimento.
À amiga Patrícia Ebel, pela solidariedade, pela amizade sincera e generosidade.
Muito obrigada.
À amiga Ana Paula
Franchi, pela solidariedade nos m o m e n t o s difíceis, pela
amizade incondicional e pela sua imensa bondade.
A o colega Aguinaldo Silva G a r c e z Segundo, pelo auxílio nas fotos das colônias de
Streptococcus
A
todos
os
mutans.
professores
e
funcionários
do
mestrado
profissionalizante
pela
paciência e dedicação, muito obrigada.
A todos os colegas d o mestrado profissionalizante e acadêmico, pelos momentos
de descontração e alegria e pela amizade.
A todas as pessoas q u e direta ou indiretamente, contribuíram para que eu
concluísse este trabalho, m e u sincero agradecimento.
R e d u ç ã o b a c t e r i a n a c o m d i o d o e m i s s o r d e luz a z u l a s s o c i a d o a o
f o t o s s e n s i b i l i z a d o r r o d a m i n a á c i d a B. E s t u d o in vitro s o b r e
Streptococcus
mutans.
Maria Cristina Eiko H a s h i m o t o
RESUMO
A terapia fotodinâmica (PDT) consiste no uso de um fotossensibilizador
(FS), oxigênio e uma fonte de luz com c o m p r i m e n t o de onda ressonante c o m o
agente
fotossensibilizador.
Estes
fotossensibilizadores
absorvem
a
energia
luminosa e são levados a um estado excitado, produzindo espécies reativas de
oxigénio q u e resultam e m morte celular. Os objetivos deste trabalho foram avaliar
a redução de Streptococcus
mutans, in vitro, utilizando como FS a rodamina ácida
B, utilizada e m soluções evidenciadoras de cárie, associada a um diodo emissor
de luz azul (LED) de Â=470 nm; comparar o efeito bactericida de duas diferentes
doses e investigar por espectroscopia de absorção óptica a interação do FS c o m
o S. mutans,
antes e após a irradiação. A s a m o s t r a s bacterianas foram divididas
e m cinco grupos: controle, rodamina, LED, P D T 3 minutos (D= 17,52 J/cm^), P D T
5 minutos (D= 29,2J/cm^). A redução bacteriana foi de 96,74% para At=3 min e de
9 7 , 2 6 % para At=5 min. A m b a s as doses foram efetivas em reduzir S. mutans,
mas
não mostraram diferenças significantes entre si. A espectroscopia de absorção
óptica indicou que h o u v e interação entre o S. mutans e a rodamina antes e a p ó s a
irradiação, e que a a b s o r ç ã o miuda q u a n d o a dose é fracionada. Estes resultados
s u g e r e m q u e a terapia fotodinâmica utilizando u m diodo emissor de luz azul
associado à rodamina ácida B pode ser um m é t o d o efetivo para redução de S.
mutans.
11
Lethal photosensitization following blue light emitting diode and acid
rhodamine B. In vitro study on Streptococcus
mutans.
Maria Cristina Eiko Hashimoto
ABSTRACT
Photodynamic therapy (PDT) requires the usage of a photosensitizer (PS),
oxygen and light of an appropriate wavelength. These photosensitizers absorb the
light photon and are led from their stable ground state to an unstable excited state,
producing cytotoxic reactive oxygen species responsible for celular death. The
purposes of this study were evaluate whether S. mutans could be killed by light
emitting diode (LED), K= 470 nm, associated with acid rhodamine B, known for its
usage in caries detector solution; compare the bactericidal effect between two
different doses and investigate the interaction between the PS and S. mutans,
before and after irradiation, by optical absorption spectroscopy. The samples were
divided into five groups: control, rhodamine, LED, PDT 3 minutes (D= 17,52
2
2
J/cm ), PDT 5 minutes (D= 29,2J/cm ). The reduction in the mean viable counts
was 96,74% for At= 3 min, and 97,26% for At= 5 min. Both doses were effective
for killing S. mutans,
but there was not any significant difference
among
themselves. The absorption optical spectrum analysis indicated that there was
interaction between S. mutans and rhodamine before and after irradiation, and the
absorption could be changed when the dose is fractioned. These results suggest
that photodynamic therapy using a blue light emitting diode associated with acid
rhodamine B can be an effective method for killing S. mutans.
Ill
SUMARIO
1. I N T R O D U Ç Ã O
01
2. O B J E T I V O S
06
3. R E V I S Ã O DE L I T E R A T U R A
3.1 Cárie dental
07
3.1.1 Prevenção da cárie dental
09
3.2 Terapia fotodinâmica
10
3.2.1 Histórico
10
3.2.2 Fundamentos da P D T
11
3.2.3 Mecanismo da citotoxidade e m PDT
13
3.2.4 A g e n t e s Fotossensibilizadores
14
3.3 Diodo emissor de luz azul {light emitting
diode - LED)
16
3.4 A ç ã o bactericida da P D T
18
4. M A T E R I A I S E M É T O D O S
24
5. R E S U L T A D O S
31
6. D I S C U S S Ã O
38
CONCLUSÕES
45
ANEXOS
46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
49
IV
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1
Colônias de S. mutans em placas de Petri
24
em meio de cultura TSA
Figura 2
Fórmula estrutural da rodamina ácida B
24
Figura 3
Espectrofotômetro Cary 17 (Varian - USA)
25
do Laboratório de Espectroscopia de Absorção
Óptica do CLA-IPEN
Figura 4
Bright LEC II (MMOptics, São Carlos, SP - Brazil)
26
Figurão
Centrífuga Jouan, modelo A-14
26
Figura 6
Irradiação do grupo B (LED)
27
Figura 7
Irradiação do grupo D (PDT 3 minutos)
28
Figura 8
Irradiação do grupo E (PDT 5 minutos)
28
Figura 9
Diluições das suspensões de S. mutans
29
Figura 10
Câmara de fluxo laminar do Laboratório de
29
Microbiologia Oral (ICB-USP)
Figura 11
Figura 12
Espectro de absorção da rodamina ácida B
Rodamina 0 , 1 % : Espectro de absorção da rodamina
ácida B a 0 , 1 % ; SM+rodamina PIT: Espectro de absorção
do S. mutans + rodamina após tempo de pré-irradiação de
5 minutos; PDT 3 minutos: Espectro de absorção do
31
32
S. mutans
+ rodamina após PDT por 3 minutos;
PDT 5 minutos: Espectro de absorção do
S. mutans
+ rodamina após PDT por 5 minutos
Gráfico da absorção do S. mutans e m A= 470 nm
durante a P D T de 1 a 5 minutos
Alterações na absorção da rodamina ácida B
após associação c o m S. mutans e após P D T
Alterações na absorção do S. mutans após a PDT
Número de células viáveis de S. mutans
Número de células viáveis de S. mutans,
e m porcentagem, antes e após P D T
nos grupos
VI
L I S T A DE A B R E V I A T U R A S
He-Ne
Hélio Neónio
J/cm^
Joule por centímetro q u a d r a d o
PDT
Terapia Fotodinâmica
PIT
T e m p o de pré-irradiaçãp
FS
fotossensibilizador
SM
Streptococcus
W
watt
nm
nanometro
LED
diodo emissor de luz
pg/mL
micrograma por mililitro
pL
microlitro
mW
miliwatt
BHI
infusão de cérebro coração
GaAs
A r s e n e t o de G a l i o
TSA
Triptone Soja A g a r
s
segundo
mutans
VII
TSB
Caldo de Triptone Soja
M
concentração molar
GaAiAs
Arseneto de Gálio e Alumínio
TBO
Azul de orto toluidina
mm
milímetro
kHz
kilohertz
mW/cm^
miliwatt por centímetro quadrado
joule
mg/mL
miligrama por mililitro
g/mol
grama por mol
ufc/mL
unidades formadoras de colônia por mililitro
mM
milimolar
grau Celsius
cm
centímetro
cm'
centímetro quadrado
PBS
sodium phosphate
CO^
dióxido de carbono
buffer
VIH
A
comprimento de onda
Ai
tempo
D
dose
AIPCS2
ftalocianina
aluminio disulfonatado
Ca++
Cálcio
tT
T e m p o de vida
(pT
estado tripleto
1. I N T R O D U Ç Ã O
Os primeiros registros da doença cárie datam de cerca de 280 milhões d e
anos, sendo os primeiros a c h a d o s em fósseis de peixes. Posteriormente, foram
encontrados registros em dinossauros herbívoros há 70 milhões de anos; e m
fósseis de répteis, macacos e pré-hominídeos, há 54 milhões de anos; e e m
mamíferos há 25 milhões de anos. No Homo sapiens,
os a c h a d o s datam de mais
de 1 milhão de anos ( L E R M A N , 1964).
Durante
estes
séculos,
várias
foram
as
teorias
elaboradas
para
o
esclarecimento desta doença e a busca por uma resposta v e m desde a época dos
Sumários ( N E W B R U M , 1988).
Hipócrates, e m 460-370 a.C. deu importância â presença de alimentos na
boca, sugerindo que fatores locais e gerais interferiam na presença de cárie.
Aristóteles, em 384-322 a.C. descreveu que figos macios e doces se aderiam aos
dentes, apodreciam e c a u s a v a m cáries. A n t h o n y v a n L e e u w e n n h o e k (1683), o pai
da m o d e r n a microscopia, descreveu p e q u e n o s microorganismos "extraídos de u m
dente comprometido", afirmando que os m e s m o s c a u s a v a m desconforto e dor de
dente.
Porém, a p e n a s
no final do séc.
XX
Miller d e u
cunho
científico
às
investigações, afirmando que a cárie era c a u s a d a por ácidos produzidos pelos
microorganismos da boca ( L E R M A N , 1964).
A associação clínica entre a presença do Streptococcus
mutans e a doença
cárie e m h u m a n o s foi demonstrada e m um n ú m e r o considerável de estudos.
Pesquisas longitudinais confirmaram o papel importante do S. mutans
na maioria
das cáries de fissura, interproximal e de superfície lisa e sugeriram que a
predominância do S. mutans
antecedia a predominância dos iactobacilos.
A
complexidade da relação flora-cárie e as dificuldades de a m o s t r a g e m de u m sítio
q u e reflita a realidade do desenvolvimento da cárie dificultam o estabelecimento
de afirmações absolutas relacionadas c o m a seqüência de eventos envolvidos
c o m o início da lesão cariosa ( L O E S C H E , 1993).
A s bactérias encontradas na cavidade oral geralmente p o d e m ser divididas
e m dois grandes grupos: patógenos principais, fortemente associados às cáries, e
as
bactérias
que
são
encontradas
juntas
com
os
patógenos
principais
na
microbiota das lesões iniciais e dentina cariada. A s bactérias mais importantes
associadas
ás
estreptococos,
lesões de cárie e m
sendo
a
mais
humanos
importante
estão
o
S.
incluídas no grupo
mutans
dos
(THYLSTRUP
e
F E J E R S K O V , 2001).
Os
S. mutans
são os
principais
patógenos
da cavidade
oral, têm
a
c a p a c i d a d e de sintetizar a partir de carboidratos metabolizados, um polímero
extracelular
denominado
dextrano,
que
por
sua
vez
auxilia
esses
microorganismos no processo de a d e s ã o ao esmalte dentário. Os lactobacilos são
colonizadores secundários, responsáveis pelo progresso das lesões cavitadas. Os
actinomicetos predominam nas superfícies radiculares dos dentes ( L O E S C H E ,
1993).
A p ó s a desmineralização do esmalte, a lesão progride lentamente
em
direção à dentina, formando uma área de dentina desmineralizada sob uma zona
desmineralizada e infectada com bactérias. Clinicamente, é difícil distinguir essas
z o n a s e a remoção apenas da dentina contaminada é extremamente crítica;
c o n s e q ü e n t e m e n t e , grande quantidade de tecido sadio é removida durante o
preparo cavitário ( B U R N S et al., 1994). O desenvolvimento de uma nova terapia
capaz
de
matar
bactérias
cariogênicas
in
situ,
reduziria
a
necessidade
de
r e m o ç ã o de u m a grande quantidade de tecido sadio, a u m e n t a n d o dessa forma, a
longevidade do elemento dental restaurado ( B U R N S et al., 1994; B U R N S e í al.,
1995).
O processo patogênico pode ser prevenido, revertido ou retardado pela
r e m o ç ã o ou alteração do ambiente e dos fatores microbiológicos adversos. O
controle microbiano ou as abordagens terapêuticas mais desejáveis são aquelas
e m q u e não haja impacto a longo prazo na microbiota residente, o u se alguma
a d a p t a ç ã o ocorrer,
F E J E R S K O V , 2001).
não resulte e m patogenicidade contínua ( T H Y L S T R U P
e
A redução de microorganismos patogênicos da superfície dental é uma das
estratégias de p r e v e n ç ã o e controle da doença cárie, porém, nem sempre se
c o n s e g u e o controle mecânico do biofilme. Neste sentido, várias terapias p o d e m
ser
empregadas
como
a
utilização
de
agentes
quimioterápicos
e
quimioprofiláticos, lasers e m alta intensidade pela geração de calor, ou a terapia
fotodinâmica ( P D T - photodynamic
therapy),
objeto deste estudo.
Estudos anteriores mostraram que agentes antimicrobianos
podem
causar
Tentativas
problemas
de
resistência
bacteriana
prévias d e esterilização da dentina
tradicionais
(COURVATIN,
através do uso de
1996).
materiais
fenólicos apresentaram efeito deletério à polpa devido à difusão de materiais
tóxicos
ao
longo
dos
túbulos
dentinários
(FUSAYAMA,
1998).
A
terapia
fotodinâmica surge neste cenário c o m o u m a alternativa promissora, pois não
existem na literatura indícios de resistência microbiana á P D T e esta, por sua vez,
pode ser confinada á área da lesão pela aplicação cuidadosa do corante e
restrição da irradiação por meio do uso de fibra óptica, quando
necessário
( W I L S O N , 1993).
A l g u n s estudos d e m o n s t r a r a m q u e diversas espécies de bactérias orais, na
presença de u m apropriado agente fotossensibilizador (FS) p o d e m ser mortas por
um laser em baixa intensidade ( V E N E Z I O e í ai.
1985; O K A M O T O et ai,
D O B S O N e W I L S O N , 1992; W I L S O N e MIA, 1993;
ai, 1993; B U R N S et ai, 1994; B U R N S et ai,
1997; R O V A L D I e í ai,
1992;
W I L S O N , 1993; B U R N S et
1995; W I L S O N eí. a/, 1995; W A L S H ,
2 0 0 0 ; K Ô M E R I K e W I L S O N . 2002; S E A L e í ai,
2002;
M A T E V S K I et ai, 2003).
A
terapia
fotodinâmica
na
Odontologia
pode
ser
uma
alternativa
no
c o m b a t e a infecções locais. Nesse caso, não é necessário q u e a fonte de luz seja
proveniente de um laser e m baixa intensidade e sim, que o fotossensibilizador
penetre na bactéria e q u e a fonte de luz possua c o m p r i m e n t o de onda ressonante
com o fotossensibilizador para a produção de espécies reativas de oxigênio q u e
irão causar morte celular.
o
diodo emissor de luz ( L E D - light emitting diode) é uma fonte de luz
alternativa em relação ao laser de baixa potência e apresenta como vantagens a
possibilidade de produção de equipamentos compactos e de menor custo, além
de possuírem uma banda espectral mais ressonante à banda de absorção do
fotossensibilizador.
Agentes fotossensibilizadores têm sido estudados desde 1900, e o seu
interesse tem crescido durante as décadas passadas devido à possibilidade de
uso
destes
agentes
no diagnóstico
e tratamento
de tumores
malignos
( S A N D E R S O N et al., 1972; B E N S O N et al., 1982).
A rodamina ácida B é um composto químico utilizado em soluções
evidenciadoras de cárie. A concentração utilizada para este fim é de 1% diluída
em propilenoglicol, não apresentando qualquer efeito tóxico, mutagênico ou
cancerígeno ( F U S A Y A M A , 1997).
Sua utilização como evidenciador de cáries é devido à sua capacidade de
penetrar na dentina cariada pela quebra irreversível das ligações intermoleculares
e, portanto, corando a região de dentina infectada e desorganizada, o que não
ocorre com a dentina sadia por esta possuir uma estrutura molecular que não
permite a penetração do corante. Dessa forma, a rodamina ácida B é capaz de
diferenciar a dentina sadia da dentina infectada e desorganizada ( F U S A Y A M A ,
1998).
A rodamina ácida B é um corante da família das rosaminas, utilizado
também na fabricação de produtos cosméticos e tem como fórmula química
C27H29N2Na07S2 (hidrogênio 3,6 -
bis dietilamino 9, 2.4 disulfonatofenil
xantilium), de peso molecular 580.7 g/mol. É conhecida na literatura pelos
seguintes sinônimos: C 177, Food Red 106, Amido Rhodamine
sulforhodamine
Covasol
B, Amacid Rhodamine
B, Solar Rhodamine
W 4002, Erío Acid Red XB, Acid leather
106. Acid Red XB, Pontancyl
Brilliant
Pink.
B, acid red
52,
B, Red no. 106, Rose
Red KB. Aizen Food Red
no.
Até o presente momento não foram
encontrados registros de sua utilização como fotossensibilizador dentro do
principio da terapia fotodinâmica.
Se as bactérias que c a u s a m a cárie p u d e s s e m ser eliminadas in situ, a
necessidade d e remoção d e u m a grande quantidade de dentina poderia ser
minimizada,
aumentando
dessa forma
a longevidade do elemento dental. A
utilização da rodamina ácida B c o m o fotossensibilizador viabilizaria u m a nova
alternativa para a redução bacteriana através da terapia fotodinâmica, seja no
aspecto preventivo, para matar bactérias patogênicas presentes em biofilmes
dentais o u , devido á sua c a p a c i d a d e de corar dentina infectada e desorganizada,
para a eliminação de bactérias in situ, através da aplicação localizada d o corante
e irradiação por u m a fonte d e luz a d e q u a d a . Dessa forma, seria possível atuar de
maneira
mais
conservadora
em
relação
ao elemento
dental,
necessidade de remoção d e u m a grande quantidade d e tecido sadio.
diminuindo
a
2. O B J E T I V O S
•
Investigar se a rodamina
soluções
evidenciadoras
fotossensibilizador,
para
ácida
de
B, conhecida
cárie,
redução
de
pela sua utilização
pode
ser
utilizada
S,
mutans,
como
utilizando
um
em
agente
diodo
emissor de luz azul;
•
C o m p a r a r o efeito bactericida sobre S. mutans
utilizando duas diferentes
doses;
•
Investigar, por espectroscopia de absorção óptica, a interação da rodamina
ácida B com o S. mutans
antes e após a terapia fotodinâmica.
I
3. R E V I S Ã O DE L I T E R A T U R A
3.1 C á r i e d e n t a l
Em 1890, Miller sugeriu que a cárie dental seria o resultado da ação de
ácidos orgânicos sobre os fosfatos de cálcio do dente. Ele concluiu que o ácido
f o r m a d o pelas bactérias da saliva resultava na decomposição do dente. C o m isto
formulou a teoria "quimioparasitaria" da cárie dental. O trabalho de Miller formou a
base para a teoria atual "placa-hospedeiro-substrato" de formação da cárie.
Imediatamente após a limpeza da superfície dental, ocorre a deposição de
uma
camada
acelular
denominada
película
adquirida.
Os
microorganismos
pioneiros na colonização desta película são os estreptococos
sanguinis,
Streptococcus
oralis e Streptococcus
{Streptococcus
mitis) e em proporções m e n o r e s
Neisseria e Actinomyces ( G I B B O N S E HAY, 1988).
A
cárie
dental
é
uma
doença
crônica
infecto-contagiosa,
de
caráter
multifatorial, ou seja, dependente de fatores genéticos, ambientais, dietéticos e
bacterianos. É uma doença complexa que envolve uma desmineralização inicial
do esmalte seguido da destruição da fase orgânica da dentina ( L O E S C H E , 1993).
A cárie progride lentamente através do esmalte, e se desloca rapidamente
dentro da dentina. Esta alteração no ritmo de desenvolvimento pode ser explicada
pela c o m p o s i ç ã o química do esmalte e dentina. O esmalte tem 9 9 % de mineral e
1 % de proteína, enquanto a dentina contém 7 0 % de mineral e 3 0 % de matriz
orgânica. A lesão em esmalte progride lentamente, pois o ácido derivado do
metabolismo da placa pode ser neutralizado por t a m p õ e s salivares, de maneira
que a desmineralização do esmalte progride lentamente. Q u a n d o a lesão se
estende e m direção à dentina, a influência do tampão salivar diminui e a lesão
dentinária torna-se um sítio retentive onde predominam os pHs baixos. O pH
baixo, por sua vez, altera o microambiente. Além de solubilizar os minerais da
dentina, os pHs baixos d e s n a t u r a m o colágeno da mesma e selecionam, com
grande capacidade, os microorganismos capazes de sobreviver e crescer em
condições ácidas e metabolizar o colágeno desnaturado. Estes fatores fazem c o m
que as lesões de dentina sejann bastante distintas das lesões de esmalte, e
oferecem
uma
explicação
para
a
rápida
destruição
do
tecido
dentinário
( L O E S C H E , 1993).
Poucas
colágeno
é
bactérias
da cavidade
prontamente
oral possuem colagenases.
desnaturado
pelo ácido, formando
Todavia,
gelatina,
que
o
é
degradada por muitos microorganismos orais. A s s i m , a seguinte seqüência é
possível na lesão dentinária: o ácido solubiliza a porção mineral do
dente,
e x p o n d o a matriz de colágeno. O ácido, bem como componentes de sais c o m alta
concentração
degradam
de
Ca++,
desnaturam
o colágeno-gelatina
em
o
colágeno.
peptídeos
As
proteases
e aminoácidos
de
bacterianas
baixo
peso
molecular, q u e podem ser utilizados na biossíntese bacteriana. O processo é
auto-repetitivo,
determinando
a
extensão
da
lesão
com
os
produtos
do
d e s d o b r a m e n t o de colágeno transformados e m proteína microbiana ( L O E S C H E ,
1993).
A lesão incipiente ocorre q u a n d o a atividade acidogênica do cariogênico
causa o deslocamento dos minerais do dente para a superficie do esmalte, c o m a
finalidade de t a m p o n a r o pH na interface placa-esmalte. A amostra para e x a m e
bacteriológico
nesta fase deve revelar tanto um aumento proporcional
como
absoluto nas concentrações do microorganismo cariogênico, c o m o o c a s o do S.
m u í a n s ( L O E S C H E , 1993).
S e g u n d o dados da O M S (Organização Mundial de Saúde), a d o e n ç a cárie
e as periodontopatias estão entre as d o e n ç a s mais prevalentes do ser h u m a n o ,
atingindo h o m e n s e mulheres de todas as idades, grupos étnicos e classes
sociais. O Brasil faz parte do grupo de países com as 10 maiores prevalências de
cárie do m u n d o ( M E D E I R O S , 1998).
A
microbiota
oral
dos
humanos
compreende
cerca
de 4 0 0
espécies
bacterianas, a l é m de fungos, protozoários e virus, porém, o desenvolvimento das
doenças nesse ambiente só vai ocorrer quando houver u m desequilíbrio
ecossistema
do
biofilme bacteriano.
Certas condições ambientais, c o m o
no
por
exemplo, um a u m e n t o na freqüência de consumo da sacarose pode levar ao
desenvolvimento de espécies sacarolíticas acidúricas e acidogênicas c o m o os
estreptococos do g r u p o mutans e lactobacilos, causando a destruição dos tecidos
mineralizados dos d e n t e s ( M A R C O T T E e LAVOIE, 1998).
3.1.1. P r e v e n ç ã o da c á r i e d e n t a l
É conhecido na literatura q u e uma das principais estratégias de prevenção
e controle da d o e n ç a cárie é a redução de microorganismos patogênicos da
superfície dental. Neste sentido, várias terapias p o d e m ser e m p r e g a d a s c o m o a
utilização de agentes quimioterápicos e quimioprofiláticos ( L A S T E R e L O B E N E ,
1990; J E N K I N S et al., 1 9 9 1 ; S C H E A E K E N et al., 1 9 9 1 ; M E L B E R G et al., 1991),
lasers
em
alta
intensidade
pela
geração
de
calor
(MORITZ
et
a/., 1997;
M A I O R A N A et al., 2 0 0 2 ; G U T K N E C H T et al., 2002; C O R T E S , 2003), ou a terapia
fotodinâmica
(VENEZIO
et
al.,
1985; O K A M O T O
W I L S O N , 1992; W I L S O N e MIA, 1993;
et al.,
1992;
DOBSON
e
W I L S O N , 1993; B U R N S et al., 1993;
B U R N S eí al., 1994; B U R N S e í al., 1995; W I L S O N eí. al, 1995; W A L S H , 1997;
R O V A L D I eí al., 2000; K Ô M E R I K e W I L S O N , 2002; S E A L eí al., 2002; M A T E V S K I
eí al., 2003).
A seleção de uma substância antimicrobiana deve levar em conta alguns
fatores, considerando a particularidade do ambiente bucal. E m primeiro lugar,
d e v e ser avaliada a toxicidade d a substância e m relação aos tecidos da cavidade
bucal, pois a maioria dos antimicrobianos utilizados, por s e r e m inespecíficos,
pode provocar efeito colateral. E m segundo lugar, a substância d e v e ser de baixa
permeabilidade pelos tecidos bucais, considerando efeitos gerais para a saúde.
Em terceiro lugar, a substância antimicrobiana não d e v e provocar desequilíbrio da
microbiota residente na cavidade bucal, pois levaria a outras d o e n ç a s decorrentes
da proliferação de microorganismos
oportunistas.
Por último, para que
uma
substância antimicrobiana seja eficiente na cavidade bucal, ela precisa apresentar
substantividade (retentividade), pois, devido ao fluxo contínuo de saliva, o efeito
quimioterápico seria diluído rapidamente (SCHEIE, 1989; G O O D S O N , 1989).
A maioria d o s agentes quimioprofiláticos consiste de antimicrobianos de
amplo espectro q u e são utilizados de acordo c o m a hipótese da placa
não
10
específica. Os c o m p o n e n t e s
da microbiota oral apresentam vários graus de
susceptibilidade a tais agentes e, portanto, s e u uso pode causar desequilibrio
ecológico desfavorável. Pode-se esperar que qualquer agente químico que afete
as células microbianas tenha alguns efeitos prejudiciais contra as células do
hospedeiro, a m e n o s q u e a estrutura alvo ou via metabólica seja exclusiva da
célula microbiana ( G I E R T S E N eí a/., 1989). Existem relatos na literatura de q u e
agentes
antimicrobianos
tradicionais
p o d e m causar
problemas de resistência
bacteriana ( C O U R V A T I N , 1996).
A terapia fotodinâmica, inicialmente utilizada para o tratamento de tumores,
pode ser uma alternativa para a redução de microorganismos cariogênicos, tanto
aqueles presentes e m biofilmes, atuando de forma preventiva, ou através da
eliminação de bactérias in situ, minimizando dessa forma a quantidade de tecido
sadio a ser removido durante o preparo cavitário convencional. Alguns trabalhos
demonstraram o potencial bactericida desta modalidade d e terapia,
lasers
utilizando
e m baixa intensidade (VENEZIO et al., 1985; O K A M O T O et al., 1992;
D O B S O N e W I L S O N , 1992; W I L S O N e MIA, 1993; W I L S O N , 1993; B U R N S et
al., 1993; B U R N S etal.,
1994; B U R N S etal,
1995; W I L S O N et. al, 1995; W A L S H ,
1997; R O V A L D I et al., 2000; K Ô M E R I K e W I L S O N , 2002; Z A N I N et al., 2002;
S E A L et al., 2002; M A T E V S K I et al., 2003).
3.2 T e r a p i a f o t o d i n â m i c a ( P D T )
3 . 2 . 1 . Histórico
No início d o século passado, acreditava-se q u e a luz d a v a bons resultados
na cura d o câncer.
O s c a r Raab, em 1900, descobriu q u e s e colocasse u m
recipiente a o sol c o n t e n d o u m organismo unicelular injetado c o m corante, a célula
morria e m seis minutos; o mesmo não ocorria q u a n d o este era colocado e m um
recipiente escuro. E m u m trabalho inicial de Raab, utilizando corantes e m placas
de Petri c o n t e n d o protozoários, observou-se que, quando o s experimentos eram
realizados durante o dia, ocorria a morte destes organismos, o que não ocorria
quando e r a m realizados durante a noite.
A partir daí, o autor provou a conexão
entre a ativação d e s s e s corantes pela luz c o m resultados terapêuticos.
11
Em
1903, Niels Finsen ganhou o Prêmio Nobel pelo seu trabalho em
fototerapia. Finsen descobriu q u e o tratamento c o m luz poderia controlar as
manifestações na pele da tuberculose, uma doença muito c o m u m na época.
( F I N S E N , 1901).
De maneira similar, a luz pode tratar outras condições médicas importantes
tais c o m o o raquitismo e hiperbillirubinemia neonatal ( R O N et al., 2004).
Clinicamente, a terapia fotodinâmica c o m e ç o u a ser utilizada apenas por
volta dos a n o s 70 e m e a d o s dos anos 80, q u a n d o c o m e ç a r a m as investigações
dentro d o s m e c a n i s m o s e uso clínico dos derivados da hematoporfirina (HpD),
para tratamento de tumores. U m laser e m baixa intensidade é capaz de ativar
corantes específicos,
produzindo espécies
reativas de oxigênio que
causam
injúria e morte de células tumorais ( D O U G H E R T Y , 1 9 9 3 ) .
Dentro da Odontologia, a terapia fotodinâmica é assunto de interesse no
que diz respeito à a ç ã o bactericida contra microorganismos causadores da cárie,
d o e n ç a periodontal e lesões de periápice.
A terapia fotodinâmica é baseada na capacidade de certas substâncias
penetrarem preferencialmente dentro de células neoplásicas e a citotoxicidade é
então induzida pela ativação destas substâncias com luz de um determinado
comprimento de onda ( K E S S E L , 2004).
3.2.2 F u n d a m e n t o s da P D T
A terapia fotodinâmica ( P D T ) é uma modalidade de tratamento que requer
o uso de u m fotossensibilizador, oxigênio e uma fonte de luz c o m comprimento de
onda ressonante c o m o agente fotossensibilizador. Estes fotossensibilizadores
a b s o r v e m a energia luminosa e são levados a u m estado excitado, produzindo
espécies altamente reativas de oxigênio que resultam e m injúria e morte celular
( D O U G H E R T Y e f a / . , 1998).
12
O efeito fotodinâmico no qual se baseia a P D T ocorre quando a molécula
do fotossensibilizador abson/e u m fóton, que por sua vez sai de seu estado
fundamental (So) e vai para o estado excitado singleto (Si). Neste m o m e n t o pode
ocorrer a perda de energia por processos de fluorescência ou conversão interna
do estado Si para So e/ou ocorrer o processo de cruzamento entre sistemas,
levando a molécula para o estado excitado tripleto. A razão das velocidades
destes processos determina o rendimento quântico do estado tripleto cpT.
(pT= kicsi/ (kfl + kic + kicsi)
O n d e kicsi, kfl e kic são constantes de velocidade dos processos
cruzamento
entre
sistemas
do
estado
Si
para
estado
Ti,
de
fluorescência
e
c o n v e r s ã o interna, respectivamente.
A energia do estado T i p o d e ser dissipada pelo processo de cruzamento
entre sistemas d e v o l v e n d o a molécula para o estado So ou transferida para outras
moléculas no meio.
Estes processos determinam o tempo de vida (tT) deste
estado.
t T = 1/(kics2 + 2:kqi [Q]i)
O n d e kics2 é a constante d e velocidade do processo d e cruzamento entre
sistemas d o estado T i para o e s t a d o So, kqi é a constante de supressão do estado
tripleto para vários supressores e [ Q ] i são as concentrações destes supressores.
Quando
uma
molécula
do
fotossensibilizador
no s e u
estado
excitado
tripleto encontra c o m uma molécula de oxigênio, que tem seu estado fundamental
t a m b é m tripleto, ela transfere sua energia para esta molécula, formando o estado
excitado singleto do oxigênio. O oxigênio neste estado é quimicamente
muito
ativo e pode induzir várias reações e m cadeia com componentes da célula tais
c o m o DNA, proteínas, fosfolipídios da membrana celular, tendo como resultado a
morte da célula.
Este caminho
chama-se
"reações
tipo H" ( A K H M A N O V
e
13
CHERNIAEVA,
1990; O S C H N E R ,
1997; H U L T É N et al.,
1999; M O O R , 2000;
K A N O F S K Y e SIMA; 2000).
A molécula d e oxigênio no estado singleto t a m b é m pode perder energia por
processos de emissão de fóton ou de cruzamento entre sistemas e voltar para o
seu estado f u n d a m e n t a l s e m começar as reações. Esses processos determinam
o tempo de vida do estado singleto t CAg):
t ('Ag)= 1/ (kem +
kics3
+ I k r i [R]i)
onde kics3 é a constante de cruzamento entre sistemas para o estado singleto;
kem e kri s ã o as constantes de velocidade dos processos de emissão de fótons e
de reação química entre o oxigênio singleto e o reagente e [R]i que são as
concentrações destes reagentes.
Então,
a
eficiência
do
processo
fotodinâmico
aumenta
quando
o
rendimento quântico e o tempo de vida do estado tripleto do fotossensibilizador
aumentam.
Existe u m outro caminho c h a m a d o "reações tipo 1" que inclui as reações de
transferência de elétron entre a molécula do sensibilizador no seu estado excitado
(Si) e as moléculas do ambiente. Porém, devido a o curto tempo de vida do estado
Si, a participação deste processo não ultrapassa 1 0 % do efeito total do processo
( D O U G H E R T Y eí al., 1998; H U L T É N e í al., 1999; M O O R , 2000; K A N O F S K Y e
SIMA; 2 0 0 0 ) .
3 . 2 . 3 . M e c a n i s m o da citotoxicidade e m P D T
O degrau inicial para a terapia fotodinâmica é a absorção da luz por um
fotossensibilizador, p r o m o v e n d o a migração d a molécula deste fotossensibilizador
de
seu
estado
estável
para
um
estado
excitado
com
um
tempo
de
vida
e x t r e m a m e n t e curto (estado singleto excitado). O estado singleto pode tanto
decair para seu estado fundamental, emitindo luz na forma de fluorescência, ou
ser transformado e m u m estado excitado tripleto. O fotossensibilizador e m seu
14
estado tripleto excitado interage rapidamente c o m moléculas vizinhas e oxigênio,
gerando a f o r m a ç ã o d e peróxidos, íons superóxidos, radicais hidroxila e oxigênio
singleto. Acredita-se q u e o oxigênio singleto seja o principal responsável pela
citotoxicidade d e v i d o à sua eficiente interação c o m diferentes biomoléculas. Os
efeitos da terapia fotodinâmica são detectáveis dentro de poucas horas a p ó s a
PDT
e
incluem
organelas
mudanças
celulares,
tais
bioquímicas
como
a
e
microscópicas
inativação
de
nas
enzimas,
membranas
aumento
e
da
permeabilidade celular, interrupção do processo de divisão celular, interrupção da
respiração celular e lise da célula ( K O N A N et al., 2002).
Estruturas
da
célula
como,
por
exemplo,
a
mitocôndria,
o
retículo
endoplasmático, lisossomos, complexo de Goigi, membrana plasmática p o d e m
ser alvos da terapia fotodinâmica. Danos a essas estruturas podem levar à morte
celular. Em cultura de células e e m modelos animais, esta morte envolve um
m e c a n i s m o conhecido c o m o apoptose ( K E S S E L , 2004).
Em u m e s t u d o envolvendo a dinâmica de oxigenação das células foram
utilizados regimes de dose contínua e d o s e s fracionadas sobre queratinócitos
normais de pele h u m a n a . No regime de doses fracionadas foram
realizadas
quatro exposições de 10 s cada, com um intervalo de 200 s, mantendo-se a
potência do laser constante. Os resultados deste estudo mostraram que o regime
de doses fracionadas causa um aumento na taxa de oxigenação durante o
momento inicial d a segunda, terceira e quarta fração de irradiação. O s autores
sugerem q u e o intervalo entre as irradiações causa uma re-oxigenação
das
células, permitindo u m aumento da g e r a ç ã o de oxigênio entre as frações de
irradiação. C o m o o oxigênio exerce um papel fundamental na degradação de
espécies fluorescentes, os autores a r g u m e n t a m q u e o fracionamento da d o s e
pode melhorar a eficácia da terapia fotodinâmica (MPHIL, e i a / . , 2 0 0 4 ) .
3.2.4 A g e n t e s fotossensibilizadores
A g e n t e s fotossensibilizadores têm sido estudados desde 1900. Durante as
décadas passadas, devido á possibilidade de uso destes agentes no diagnóstico
e tratamento de t u m o r e s malignos várias pesquisas foram conduzidas c o m o
15
Objetivo de encontrar um composto ideal ( S A N D E R S O N et al., 1972; B E N S O N et
al., 1982; A L L I S O N etal.. 2004).
Fotossensibilizadores dentro da terapia fotodinâmica são as ferramentas
que permitem a transferência da energia luminosa e m um tipo de reação química,
cujos produtos finais resultam numa rápida cito e vásculo-citotoxicidade que são
condições sine qua non para a terapia fotodinâmica ( K O N A N , 2002).
Para que um c o m p o s t o seja considerado um b o m fotossensibilizador d e v e
apresentar algumas das seguintes propriedades: alto coeficiente de absorção na
região do espectro de excitação da luz, estado tripleto de apropriada energia, para
permitir a transferência de energia ao e s t a d o singleto, alta eficiência quântica para
a formação de oxigênio singleto, alto tempo de vida do estado tripleto e alta
fotoestabilidade (DE R O S A e C R U T C H L E Y , 2002).
A eficiência quântica de um c o m p o s t o está diretamente relacionada à sua
capacidade de gerar oxigênio singleto. C o m o se acredita que o oxigênio singleto
seja o principal responsável pela citotoxicidade devido à sua eficiente interação
c o m diferentes biomoléculas, pode-se dizer que a alta eficiência quântica de um
agente fotossensibilizador é uma característica desejada para sua utilização e m
P D T ( K O N A N e í al.. 2002).
A l é m das características acima, o fotossensibilizador deve apresentar baixa
toxicidade,
rápida
eliminação
pelo organismo,
seletividade
pelo tecido
alvo,
capacidade de ativação por u m determinado comprimento de onda, fácil aplicação
e não deve apresentar potencial mutagênico ou carcinogênico ( R O N et al., 2004).
A terapia fotodinâmica
tem
um
potencial para se tornar uma
grande
ferramenta de uso clínico, porém, maiores estudos ainda d e v e m ser conduzidos
no
sentido
de
encontrar
agentes
fotossensibilizadores
ideais,
assim
como
determinar uma correta dosimetría. Para superar tais dificuldades, é necessário o
conhecimento
propriedades
dos
m e c a n i s m o s fundamentais
ópticas
dos
vários
tecidos
fotossensibilizadores ( A L L I S O N eí al., 2004).
da terapia fotodinâmica
humanos
com
ou
e
das
sem
16
A rodamina ácida B, utilizada neste estudo, é um composto químico
utilizado, entre outros fins, em soluções evidenciadoras de cárie. A concentração
utilizada para este fim é de 1 % diluída em propilenoglicol, não apresentando
qualquer
efeito
tóxico,
mutagênico
ou
cancerígeno.
Sua
utilização
como
evidenciador de cáries é devido à sua capacidade de penetrar na dentina cariada
pela quebra irreversível das ligações intermoleculares e, portanto, corando a
região de dentina infectada e desorganizada, o que não ocorre com a dentina
sadia devido esta possuir uma estrutura molecular que não permite a penetração
do corante. Dessa forma, a rodamina ácida B é capaz de diferenciar a dentina
sadia da dentina infectada e desorganizada (FUSAYAMA, 1997; FUSAYAMA,
1998).
A rodamina ácida B é um corante da família das rosaminas, também
utilizado na fabricação de produtos cosméticos e tem como fórmula química
C27H29N2Na07S2
(hidrogênio
3,6
-
bis
dietilamino
9,
2,4
disulfonatofenil
xantilium), de peso molecular 580.7g/mol. É conhecida na literatura
pelos
seguintes sinônimos: C 177, Food Red 106, Amido Rhodamine B, acid red 52,
sulforhodamine
B, Amacid Rhodamine B, Solar Rhodamine B, Red no. 106, Rose
Covasol W 4002, Erío Acid Red XB, Acid leather Red KB, Aizen Food Red no.
106, Acid Red XB, Pontancyl Brílliant Pink.
3.3 Díodo emissor de luz (light emitting diode - LED)
Um LED possui uma luz com potência máxima quando
direcionada
perpendicularmente à superfície irradiada (FLOYD, 1991).
O
diodo
semicondutor
emissor
de
luz consiste
composto
de
várias
num dispositivo
camadas
de
com
meio
semicondutores
ativo
dopados
adequadamente e que emitem luz quando uma determinada tensão é aplicada
entre as camadas. Nos diodos emissores de luz, a luz é produzida por um
processo chamado eletroluminescência (CRAFORD et ai, 2001).
Sua composição é semelhante aos lasers de diodo semicondutores que
são utilizados em diversas áreas como terapia com laser em baixa intensidade,
Cowssfe wocm.
r
n r»n«aA NUOEWWNPBfc
17
aparelhos d e CD e D V D , leitores de códigos de barra, entre outros. O L E D azul é
um semicondutor confeccionado à base de nitreto de gálio, gerando m e n o s calor
e
podendo
ser
até
dezessete
vezes
mais
eficiente
do que
as
lâmpadas
convencionais. C o m p a r a n d o os lasers e os LEDs, os lasers são monocromáticos,
a p r e s e n t a n d o alta pureza espectral, e n q u a n t o o LED
possui uma banda estreita
de c o m p r i m e n t o s de onda, ou seja, a luz do LED azul é azul, azul-esverdeada e
azul-violeta ( T U B O Y , 2003).
O feixe de luz do laser é coerente e o do LED é não-coerente. No entanto,
isso n ã o significa que a intensidade produzida por um feixe de luz /aser seja maior
que a do LED. Porém, a interação da luz c o m a célula bacteriana d e p e n d e de
outros fatores como comprimento de onda, potência da luz e tempo de exposição.
Tais fatores dirão se os efeitos serão fotoquímicos, fototérmicos, fotoablativos ou
f o t o m e c á n i c o s ( M A N G , 2004).
O uso do LED para terapia fotodinâmica t e m sido discutido e m estudos
recentes, já que não é necessária uma luz coerente para a PDT, pois esta
coerência é perdida e m alguns décimos d e milímetros após a penetração no
tecido ( B R A N C A L E O N e M O S E L E Y , 2002; J U Z E N I E N E etal., 2004).
A o contrário de urna fonte de luz c o m alta intensidade monocromática, o
L E D é capaz de produzir uma alta intensidade sobre uma banda espectral mais
abrangente. Para a P D T , a característica d e monocromaticidade é importante;
entretanto, a efetividade da fonte de luz vai depender de fatores c o m o
irradiáncia espectral, transmissão
no tecido e propriedades de absorção
a
do
fotossensibilizador ( B R A N C A L E O N e M O S E L E Y , 2002).
Fatores
bacterianos
também
irão
interferir,
logicamente,
tais
como
a
natureza da bactéria, seu estado fisiológico, densidade da população e ambiente
e m q u e está envolvida. Parámetros importantes são a cor, condutividade térmica
e p H , assim c o m o seus c o m p o n e n t e s orgánicos ( W I L S O N , 1993).
Muitas aplicações médicas, incluindo a terapia fotodinâmica, e n v o l v e m o
u s o d e lasers. Todavia, c o m o a coerência d a luz não é necessária para a P D T ,
18
pesquisas têm sido feitas para a construção de fontes de luz não coerentes para
esta finalidade, já que são relativamente estáveis, acessíveis, fáceis de operar e
requerem manutenção simples. J U Z E N I E N E et al., 2004, realizaram um estudo
utilizando
fotopolimerizador
convencional,
com
luz
halógena
e
filtro,
de
comprimento de onda d e 560-740 nm e um L E D de comprimento de onda d e 6 0 0 650
n m . Os
resultados
mostraram
a eficiência
da terapia
fotodinâmica
na
inativação de células in vitro e q u e o LED apresentou uma maior penetração no
tecido do que o fotopolimerizador c o m luz halógena.
Lasers
e fontes de luz não coerentes têm sido utilizados e m terapia de
t u m o r e s apresentando efeitos similares, o que torna viável a utilização de LEDs
para a terapia fotodinâmica
(WITHEHURST
et al.,
1995; M O S E L E Y ,
1996;
S O L E R et ai, 2000; C L A R K et ai, 2003; J U Z E N I E N E et ai, 2004).
O s LEDs são aparelhos compactos, e requerem menos energia para a
p r o d u ç ã o da luz de c o m p r i m e n t o de onda desejado, podendo ser utilizados na
ativação de fotossensibilizadores administrados tópicamente, o n d e uma grande
penetração de luz no tecido não é necessária ( M A N G , 2004).
3.4. A ç ã o bactericida da P D T
Derivados
de
hematoporfirina,
utilizados
para terapia
fotodinâmica
de
t u m o r e s foram utilizados c o m a finalidade de se obter efeito bactericida contra
Staphylococcus
Streptococcus
anaerobius,
aureus,
M-G
Streptococcus
intermedius,
Peptococcus
magnus
faecailis,
Streptococcus
e Clostridium
Bacteroides
fragilis,
mutans,
Peptostreptococcus
perfringes.
A luz utilizada para
ativação da hematoporfirina foi a luz de um projetor de 3 0 0 W , q u e produz 100
m W de luz no c o m p r i m e n t o de onda de 630 a 640 n m , durante 20 minutos. O s
resultados foram positivos para todas as bactérias citadas ( V E N E Z I O e í al., 1985).
Nos últimos anos, a terapia fotodinâmica tem sido utilizada c o m a finalidade
de se obter efeito bactericida sobre microorganismos bucais. A a ç ã o bactericida
p o d e ser obtida através de corantes que variam do azul, púrpura e verde que são
fortemente absorvidos e m X=632 n m . Este trabalho utilizou o azul de orto toluidina
( T B O ) a 75 pg/mL e u m laser de HeNe de A.=632,8 nm. O s resultados m o s t r a r a m
que a luz vermelha visível pode exercer uma a ç ã o inibitória de crescimento d e
microorganismos do biofilme dental quando um corante apropriado é utilizado
( O K A M O T O etal.,
1992).
A terapia fotodinâmica tem mostrado sua efetividade na redução bacteriana
de
microorganismos
patógenos
bucais,
mesmo
quando
essas
bactérias
se
encontram em biofilmes, c o m o ocorre na placa subgengival. Este estudo utilizou
os
fotossensibilizadores
cristal
violeta,
TBO,
azul
de
metileno,
ftalocianina,
hematoporfirina e hematoporfirina éster, e m concentrações variando de 0 , 1 % a
0,005%. O /aser utilizado foi o HeNe de X=632,8 n m , c o m potência de 7,3 m W . A s
espécies bacterianas testadas foram o Streptococcus
gingivalis,
Fusobacterium
nucleatum
sanguis,
e Actinobacilius
Porphyromonas
actinomycetemcomitans,
todas e m forma d e biofilmes. A s bactérias foram submetidas à irradiação por 10 s,
30 s e 60 s. O cristal violeta, azul de metileno, T B O e ftalocianina foram capazes
de sensibilizar S. sanguis
e m forma de biofilmes c o m t e m p o de exposição de 10 s
( D = 5 , 5 J / c m ^ ) . T B O e azul de metileno na concentração de 0,005% se mostraram
efetivos contra biofilmes d a s quatro espécies bacterianas testadas nos t e m p o s d e
10
s
e
30
s.
Em
hematoporfirina éster e
contraste,
ftalocianina
fotossensibilizadores
como
hematoporfirina,
que são utilizados na terapia fotodinâmica de
tumores não a p r e s e n t a r a m resultados efetivos c o m a concentração e t e m p o s d e
exposição e m p r e g a d o s ( D O B S O N e W I L S O N , 1992).
S u s p e n s õ e s d e Candida
albicans
foram sensibilizadas por um laser
de
HeNe (A.=632,8 n m ) , a u m a densidade de energia de 66,36 J/cm", associado ao
T B O , tionina e cristal violeta. Houve a diminuição de unidades formadoras de
colônias c o m o uso d o s três fotossensibilizadores. A dihematoporfirina
éster,
t a m b é m utilizada neste estudo, não foi eficiente dentro d a s condições testadas. O
laser de G a A s (?i=660 nm) a uma densidade de energia d e 2,04 J/cm^, associado
ao azul d e metileno foi c a p a z de sensibilizar C. albicans.
O t e m p o d e pré-
irradiação foi de 5 minutos e o t e m p o de irradiação foi de 120 s. A maior redução
obtida foi c o m o cristal violeta a 0,5 mg/mL associado ao laser de HeNe (À.=632,8
nm), apresentando 9 1 % d e redução bacteriana ( W I L S O N e MIA, 1993).
20
Bactérias cariogênicas f o r a m expostas á luz d e um laser de H e N e (?.=632,8
nm) c o m 7,3 m W e d e n s i d a d e de energia de 33,6 J/cm^. A s bactérias testadas
foram o S. mutans,
S. sobrinus,
Lactobacillus
casei e Actinomyces
viscosus.
O
corante T B O foi adicionado a o meio de cultura na concentração de 50 f.ig/mL. A s
s u s p e n s õ e s bacterianas f o r a m s e m e a d a s e m placas de Petri contendo Triptone
Soja A g a r ( T S A ) e a irradiação realizada e m duplicata em diferentes áreas da
placa. O s resultados foram efetivos para a s quatro espécies testadas. No g r u p o
o n d e foi adicionado a p e n a s o corante, o u naquele submetido a p e n a s à irradiação
não houve redução do n ú m e r o d e células viáveis. O s autores sugeriram esta
técnica para esterilização d e u m a lesão de cárie previamente à restauração
( B U R N S etal.,
1993).
S. mutans,
S. sobrinus,
L. casei
e A. viscosus,
m e s m o e m forma d e
biofilmes p o d e m ser sensibilizados utilizando um laser de HeNe (A.=632,8 nm)
c o m potência de 7,3 m W , o u u m laser de G a A s (>.=660nm), c o m potência d e 11
mW,
com tempos
de exposição
d e 60 s, utilizando
respectivamente
como
fotossensibilizadores o T B O o u A D P (ftalocianina alumínio disulfonatado) ( B U R N S
etal..
1992; B U R N S etal.,
1993).
E m outro trabalho, a s m e s m a s espécies de bactérias foram e x p o s t a s à luz
d e u m laser d e Arseneto d e Gálio e Alumínio (A,=660nm) c o m potência d e 11 m W ,
e diâmetro d o feixe de 9 m m , na presença d e A D P , c o m concentrações variando
entre 10 pg/mL e 100 p g / m L , e t e m p o s de exposição entre 30 e 90 s e g u n d o s . O
corante foi adicionado ao meio d e cultura contendo Caldo de Triptone Soja (TSB),
e a s s u s p e n s õ e s s e m e a d a s e m placas de Petri contendo Triptone Soja Á g a r
(TSA). A s irradiações foram realizadas e m diferentes áreas da placa e m duplicata,
e incubadas por 48 h para a o b s e r v a ç ã o das zonas de crescimento. O s resultados
m o s t r a r a m 9 3 % de redução bacteriana para o S. mutans
quando a c o n c e n t r a ç ã o
do corante foi d e 50 pg/mL e t e m p o d e irradiação de 9 0 s. Para o g r u p o q u e
utilizou a p e n a s corante, a s s i m c o m o para o grupo que utilizou a p e n a s laser não
foi o b s e r v a d o redução no n ú m e r o d e células viáveis ( B U R N S et al., 1994).
21
Suspensões
de
S. mutans
expostos à luz de u m laser
respectivamente.
Fatias
foram
coradas
com
TBO
e ftalocianina
e
de H e N e (>.=632,8 nm) e GaAIAs (?v=660 nm),
de dentina
foram
desmineralizadas
com
solução
de
E D T A a 0,1 M por 8, 16, 24 e 32 h e interpostas entre o laser de HeNe e a
suspensão bacteriana para serem submetidas à irradiação, e em experimentos
separados, as bactérias foram embebidas e m matriz de colágeno antes de serem
irradiadas para reproduzir condições mais próximas d a s encontradas in vivo.
A
potência do HeNe foi d e 7,3 W c o m u m feixe d e 1,3 m m d e diâmetro. A potência
do laser de GaAIAs foi de 11 m W , c o m diâmetro do feixe de 9 m m , no m o d o
pulsado
com
uma
taxa
de
repetição
de
20
kHz.
Na
presença
de
dentina
desmineralizada por 8, 16, 24 e 32 h, a redução bacteriana encontrada foi de
89%, 6 8 % , 8 2 % e 8 5 % , respectivamente, c o m t e m p o d e irradiação de 480 s. O
fotossensiblizador
número
de
TBO
bactérias
isoladamente
viáveis,
causou
uma
correspondendo
redução
a
11,
significativa
32,
18
e
no
15%,
respectivamente, de morte bacteriana. Q u a n d o foi utilizado o laser de G a A I A s
com a
ftalocianina,
desmineralizadas
fotossensibilizador
a r e d u ç ã o bacteriana foi d e 9 9 , 9 9 % para fatias de dentina
por
8,
16, 24 e 32 h. Neste caso,
isoladamente
causou
qualquer
nem
efeito
na
o laser,
nem
viabilidade
o
da
bactéria. Q u a n d o a bactéria foi embebida e m colágeno, a redução de 9 9 % foi
obtida c o m irradiação por 180 s. N e m a
causou
qualquer
efeito
significativo
ftalocianina
n e m o /aser isoladamente
sobre a viabilidade
dos
S. mutans.
Os
resultados confirmaram o efeito bactericida m e s m o q u a n d o as bactérias estão
embebidas em u m a matriz d e colágeno e sob dentina desmineralizada ( B U R N S et
al., 1995).
A m o s t r a s de placa bacteriana supragengival foram coletadas e s e m e a d a s
em meio de cultura para serem submetidas à terapia fotodinâmica. T o d a s as
placas apresentaram c r e s c i m e n t o de Streptococcus
sp. e Actinomyces
sp. Foram
utilizados o laser de He Ne (A.=632,8 nm), c o m potência d e 7,3 m W e diâmetro do
feixe d e 1,3 m m a s s o c i a d o ao T B O , e o laser de G a A s {X=660 nm), c o m potência
de 11 m W e diâmetro d o feixe de 9 m m , no m o d o pulsado c o m taxa de repetição
de 20 kHz, associado ao fotossensibilizador
ftalocianina
alumínio disulfonatado
(AIPcSz). Q u a n d o as bactérias foram expostas durante 180 s às irradiações d o s
7">
lasers de HeNe e G a A s , associadas ao T B O ou AIPcSz, respectivamente, houve
considerável redução no número de células viáveis em todos os microorganismos
testados, apresentando 9 7 % de redução sobre espécies anaerobias utilizando
laser óe G a A s e 1 0 0 % de redução sobre Streptococcus
o
sp. c o m o laser de HeNe.
A p e n a s o fotossensibilizador ou irradiação isoladamente não mostraram qualquer
efeito significativo sobre a redução de células viáveis ( W I L S O N et al., 1995).
A
porfirina
de
sensibilizar
microorganismos patogênicos gram-positivos como o Propionibacterium
acnes, o
Actinomyces
endógena
odontolyticus
de
algumas
bactérias foi capaz
e Porphyromonas
gingivalis.
A
espectroscopia
de
fluorescencia mostrou que estas bactérias sintetizam o fotossensibilizador natural
photoporfirina IX. A fonte de luz utilizada foi um laser de HeNe, com comprimento
de onda de 632,8 n m , intensidade de 100 mW/cm^, densidade de energia de 360
J/cm^. O número de células viáveis após tratamento foi de 0,58 ufc/mL para
Propionibacterium
acnes,
0,30 ufc/mL para Actinomyces
ufc/mL para Porphyromonas
gingivalis.
O S. mutans
odontolyticus
e 0,59
não apresentou
nenhum
fotoefeito, pois não possui a porfirina autofluorescente ( K Ö N I G , 2000).
Outro
estudo
sobre
o
efeito
do
laser
mais
cariogênicas foi realizado c o m colônias de S. mutans,
casei e Lactobacillus
acidofilus.
corante
sobre
S. sobrinus,
bactérias
Lactobacillus
O laser utilizado para este estudo foi um laser de
arseneto de gálio alumínio (X=660 nm), c o m potência de saída de 16 m W , sonda
de
0,8
mm
de
diâmetro
e
densidade
de
energia
de
28,8
J/cm^
O
fotossensibilizador utilizado foi o T B O c o m concentração de 100 jag/mL e tempo
de
exposição
de
900
segundos.
Observou-se
total inibição de
crescimento
bacteriano no tratamento com laser mais corante dentro dos parâmetros acima
(ZANIN et al., 2002).
Biofilmes
de
Streptococcus
intermedius
foram
sensibilizados
com
a
associação de 100 pg/mL de T B O e 600 s de irradiação c o m laser de HeNe
((>.=632,8 nm), energia de 21 J e potência de 35 m W . A redução bacteriana foi de
5 log 1 o UFO (SEAL et al., 2002).
23
Os m e c a n i s m o s de ação da terapia fotodinâmica sobre as células não
estão ainda
completamente
elucidados,
porém, existem alguns estudos
que
sugerem m u d a n ç a s bioquímicas e m m e m b r a n a celular, causando a lise da célula;
em mitocôndria, impedindo o processo de respiração celular; e m DNA, impedindo
o processo de divisão celular; pela inativação de enzimas responsáveis
pelo
metabolismo celular e pelo aumento da permeabilidade celular ( G R E B E N O V Á et
ai. 2003).
24
4. M A T E R I A I S E M E T O D O S
A bactéria utilizada nesse estudo foi S. mutans
(ATOO 2 5 1 7 5 ) (Figura 1)
mantido e m estoque no laboratório d e Microbiologia Oral, ICB/USP. Este trabalho foi
realizado c o m a colaboração da Profa. Silvana Cai (ICB/USP).
Figura 1: Colônias de S. mutans em placas de Petri em meio de cultura TSA.
O fotossensibilizador utilizado foi a rodamina ácida B, q u e pertence à família
das rosaminas, e t e m c o m o fórmula química C27H29N2Na07S2 (hidrogênio 3,6 - bis
dietilamino 9, 2,4 disulfonatofenil xantilium), d e peso molecular 580.7 g/mol.
A amostra da rodamina ácida B (Q-X-434/45100) foi gentilmente cedido pela
CCI Q u í m i c a Importação e Exportação e Representações Ltda. A fórmula química
estrutural está ilustrada na figura 2.
ÍC2H5)2Ns
Figura 2: Fórmula estrutural da rodamina ácida B.
25
As
espectroscopias
de
absorção
óptica
foram
realizadas
com
o
espectrofotômetro Cary 17 (Varian, U S A ) , utilizando cubeta de quartzo c o m c a m i n h o
óptico de I m m
(Figura 3). T o d a s as leituras f o r a m realizadas
mantendo-se
a
temperatura ambiente d e 25° C.
Figura 3: Espectrofotômetro Cary 17 (Varian- USA) do Laboratório de Espectroscopia
de Absorção Óptica do CLA-IPEN.
Inicialmente, foi obtido o espectro de a b s o r ç ã o da rodamina ácida B diluida
e m água destilada, a s s i m c o m o o espectro do S. mutans antes da associação c o m a
rodamina.
Logo após, f o r a m obtidos espectros d e a b s o r ç ã o da rodamina
ácida
B
associada ao S. mutans a fim d e verificar a interação bactéria/corante. Foi realizada
a espectroscopia a p ó s o PIT (tempo d e pré-irradiação) de 5 minutos e após a
irradiação por 3 e 5 minutos. O PIT corresponde ao t e m p o necessário para que o
corante entre e m contato c o m a bactéria.
Em seguida, foi realizada a espectroscopia d e absorção do S. mutans
durante
a P D T c o m doses fracionadas d e 1 minuto c a d a (D=5,84J/cm2), percorrendo os
t e m p o s de 1 a 5 minutos.
A concentração
padronizados
de
d o corante a s s i m c o m o a quantidade d e ufc/mL
acordo
com
a
parte experimental
sobre
redução
foram
bacteriana
26
utilizada neste estudo. Antes de cada leitura, foi realizada a agitação da cubeta para
a h o m o g e n e i z a ç ã o da amostra.
O e q u i p a m e n t o utilizado para a irradiação foi o Bright Lec II (MMOptics, S ã o
Carlos, SP, Brazil), constituído de u m diodo emissor de luz azul de c o m p r i m e n t o de
onda de 4 7 0 (+/- 25) n m , diâmetro da saída do feixe de 12 m m , área da saída do
feixe de 1,13 cm^, potência óptica d e 110 m W e intensidade de 97,4 m W / c m ^ (Figura
4).
Figura 4: Briglit Lec II (MMOptics, São Carlos - SP, Brazil).
Alíquotas de 80 i^l de S. mutans
( A T C C 2 5 1 7 5 ) e m estoque f o r a m s e m e a d a s
e m Caldo de Triptone Soja (TSB) e incubadas a 37° C durante 4 8 horas para o
crescimento bacteriano.
A p ó s o crescimento, a cultura bacteriana foi centrifugada a 14000 rpm por 3
minutos (Centrífuga J o u a n , modelo A - 1 4 ) (Figura 5), e o sobrenadante lavado d u a s
vezes e m solução t a m p ã o PBS {Sodium Ptiosptiate
Figura 5: Centrífuga Jouan, modelo A-14.
Buffer, 0,1 M, pH 7,2).
27
A p ó s retirada do sobrenadante, a s bactérias f o r a m coletadas e colocadas
e m solução t a m p ã o PBS para a padronização do número de células.
Foram realizados os testes de catalase e análise das características morfotintoriais, através da coloração de G r a m para confirmação da espécie.
A suspensão foi padronizada c o m escala 0,5 de McFarland q u e corresponde
a 1,5x108 unidades formadoras d e colônia por mililitro (ufc/mL). A p ó s o preparo dos
g r u p o s , o número de ufc/mL foi d e 1,35 x 10^ ufc/mL pois f o r a m utilizados 900 iaL de
s u s p e n s ã o bacteriana adicionados de 100 |iL de solução t a m p ã o ou rodamina ácida
B.
A p ó s a padronização, a s u s p e n s ã o bacteriana foi dividida e m cinco tubos d e
ensaio de acordo c o m os grupos abaixo:
Grupo A: controle - f o r a m colocados 900
de s u s p e n s ã o bacteriana mais
100 |iL de solução t a m p ã o .
Grupo B.- LED - foram colocados 900 |iL de suspensão bacteriana mais 100
I^L de solução t a m p ã o e feita a irradiação por 5 minutos (Figura 6).
Figura 6: Irradiação do grupo B (LED).
Grupo C: rodamina - f o r a m colocados 900 ^iL de s u s p e n s ã o bacteriana mais
100 \xL de corante rodamina ácida B na concentração de 1 % , para a concentração
final de 0 , 1 % de massa por v o l u m e (M=1,72 m M ) . O t e m p o de contato das bactérias
28
c o m o corante foi de 5 minutos. O s anexos de 1 a 3 ilustram a interação da rodamina
c o m S. mutans.
Grupo D: PDT 3 minutos - foram colocados 900 |iL de s u s p e n s ã o bacteriana
mais
100 [iL
de corante
rodamina
ácida
B na concentração
de
1 % para
a
concentração final de 0 , 1 % de m a s s a por volume (M=1,72 m M ) . O tempo de préirradiação foi de 5 minutos e o da irradiação de 3 minutos. A d o s e utilizada foi de
17,52 J / c m ^ F i g u r a 7).
Figura 7: Irradiação do grupo D (PDT 3min).
Grupo E: PDT 5 minutos - f o r a m colocados 900
mais
100 \xL de corante
rodamina
ácida
de s u s p e n s ã o bacteriana
B na concentração
de
1 % para
a
concentração final de 0 , 1 % de m a s s a por v o l u m e (M=1,72 m M ) . O tempo de préirradiação foi de 5 minutos e o da irradiação de 5 minutos. A d o s e utilizada foi de
29,2 J/cm^ (Figura 8).
Figura 8: Irradiação do grupo E (PDT 5 min).
29
A irradiação foi realizada no sentido de baixo para cima do tubo de ensaio
(Garcez, 2002).
A p ó s os procedimentos, as s u s p e n s õ e s bacterianas de c a d a grupo f o r a m
diluidas e m ^0~\
10"^, 10"^ (Figura 9), e alíquotas de 100 pL de cada grupo f o r a m
s e m e a d a s , e m triplicata, e m placas de Petri contendo Triptone Soja A g a r (TSA), para
a c o n t a g e m das células viáveis.
ÊÊt
Figura 9: Diluições das suspensões de S. mutans.
T o d o s os procedimentos f o r a m realizados no interior de fluxo laminar para
evitar a contaminação c o m o meio externo (Figura 10). A p ó s a s e m e a d u r a , as placas
f o r a m incubadas a 3 7 ° C , e m ambiente contendo de 5 a 1 0 % de CO2 por 4 8 h.
Figura 10: Cámara de fluxo laminar do Laboratorio de Microbiologia Oral (ICB-USP).
30
A p ó s este período, foi realizada a contagem das ufc/mL, e os resultados
submetidos à análise estatística (teste t - student,
0,05).
c o m nível de significância de
31
5. R E S U L T A D O S
O espectro de absorção d a rodamina ácida B é mostrado na figura 1 1 . É
possível observar quatro bandas de absorção: duas m e n o s intensas entre 350 nm e
400 nm e entre 400 nm e 470 n m . A s bandas mais intensas situam-se no ultravioleta
(< 350 nm) e entre 500 n m e 6 0 0 n m .
5-1
4-
CO
3
3-
o
«CO
m
<
1-
300
400
500
600
700
comprimento de onda (nm)
Figura 1 1 : Espectro de absorção da rodamina ácida B.
800
32
A figura 12 mostra o espectro de absorção entre X= 300 e 500 nm da
rodamina ácida B a 0 , 1 % (M= 1,72 m M ) ; d o S. mutans
pré-irradiação de 5 minutos (PIT); do S. mutans
+ rodamina após t e m p o de
+ rodamina após P D T por 3 min
(D=17,52 J/cm^) e a p ó s PDT por 5 min (D=29,2 J/cm^). Foi possível observar uma
diminuição da a b s o r ç ã o após a associação da rodamina c o m o S. mutans,
após a P D T ocorreu u m a u m e n t o dessa absorção.
Não foi possível
porém,
obsen/ar
diferenças significativas no espectro de absorção entre os t e m p o s de 3 e 5 minutos.
PDT 3 min
5n
PDT 5 min
Sm + Rodamina PIT
Rodamina 0,1%
4-
3O
O
È
<
2
1 -
300
I
I
— 1 —
350
400
450
500
comprimento de onda (nm)
Figura 12: Rodamina 0 , 1 % : Espectro de absorção da rodamina ácida B a 0 , 1 % ; SM+rodamina
PIT: Espectro de absorção do S. mutans
+ rodamina após tempo de pré-irradiação de 5
minutos; PDT 3 minutos: Espectro de absorção do S. mutans
+ rodamina após PDT por 3
minutos; PDT 5 minutos: Espectro de absorção do S. mutans
+ rodamina após PDT por 5
minutos.
32
A figura 12 mostra o espectro de absorção entre X= 300 e 500 nm da
rodamina ácida B a 0 , 1 % (M= 1,72 mM); do S. mutans + rodamina após tempo de
pré-irradiação de 5 minutos (PIT); do S. mutans + rodamina após PDT por 3 min
2
2
(D=17,52 J/cm ) e após PDT por 5 min (D=29,2 J/cm ). Foi possível observar uma
diminuição da absorção após a associação da rodamina com o S. mutans, porém,
após a PDT ocorreu um aumento dessa absorção. Não foi possível observar
diferenças significativas no espectro de absorção entre os tempos de 3 e 5 minutos.
PDT 3 min
PDT 5 min
Sm + Rodamina PIT
Rodamina 0 , 1 %
U-J
300
,
1
350
1
,
1
450
1
400
,
1
500
comprimento de onda (nm)
Figura 12: Rodamina 0 , 1 % : Espectro de absorção da rodamina ácida B a 0 , 1 % ; SM+rodamina
PIT: Espectro de absorção do S. mutans
+ rodamina após tempo de pré-irradiação de 5
minutos; PDT 3 minutos: Espectro de absorção do S. mutans + rodamina após PDT por 3
minutos; PDT 5 minutos: Espectro de absorção do S. mutans + rodamina após PDT por 5
minutos.
33
A figura 13 ¡lustra a absorção d o S. mutans
durante a P D T corn d o s e s
fracionadas percorrendo o s t e m p o s de 1 a 5 minutos. Foi possível observar u m
a u m e n t o da absorção e m A= 4 7 0 nm nos dois minutos iniciais e depois
uma
estabilização na absorção até os 5 minutos.
2,0-
1,8-
1,6-
¿
•g
1.4-1
O
w
•B
1.2-
<
1,0-
0,8
Tempo (min)
Figura 13: Gráfico da absorção do S. mutans
minutos.
em A= 470 nm durante a PDT de 1 a 5
34
A figura 14 mostra as alterações na absorção da rodamina ácida B após a
associação com S. mutans e após a PDT. De acordo com o espectro de absorção,
as mudanças ocorreram no comprimento de onda de 280 a 300 nm. No comprimento
de onda utilizado (A= 470 nm) não foi possível observar nenhuma alteração
significativa no espectro de absorção.
PDT 3 - Sm
PDT 5 -Sm
Rod Sm - Sm
—i
200
1
1
300
1
1
400
1
1
500
,
,
,
600
1
700
,
f-
800
Comprimento de onda (nm)
Figura 14: Alterações na absorção da rodamina ácida B após associação com S.
mutans e após PDT. PDT 3 - SM: Espectro de absorção da rodamina após a PDT por 3
minutos; PDT 5 - SM: Espectro de absorção da rodamina após PDT por 5 minutos; Rod
SM - SM: Espectro de absorção da rodamina após o tempo de pré-irradiação de 5
minutos.
35
A figura 15 mostra o espectro de absorção d o S. mutans antes da associação
c o m a rodamina, após a associação c o m a rodamina por 5 minutos (PIT), e após a
P D T por 3 e 5 minutos. Foi possível observar diferenças nas bandas d e absorção
ópticas entre À = 200 e 500 n m após a associação d o S. mutans c o m a rodamina e
após a P D T por 3 e 5 minutos. H o u v e u m a u m e n t o da absorção a p ó s a P D T por 3
minutos e m todo o espectro. A p ó s a P D T por 5 minutos h o u v e u m a q u e d a de
absorção entre À=280 e 3 0 0 n m .
Figura 15: Alterações na absorção do S. mutans após a PDT. Rod Sm - Rod:
Espectro de absorção do S. mutans após a associação com a rodamina por 5
minutos (PIT); Rod PDT 3 - Rod: Espectro de absorção do S. mutans após a
PDT por 3 minutos; Rod PDT 5 - Rod: Espectro de absorção do S. mutans após
a PDT por 5 minutos; Sm: Espectro de absorção do S. mutans
associação com a rodamina.
antes da
36
A figura 16 representa o n ú m e r o de células viáveis de S. mutans
antes e a p ó s
a PDT.
1E7-
1000000-
100000
1
C+L-
—r^
1
Controle
1
L+CGrupos
1 --r-' 1 ^
1
PDT 3 mni PDT 5 min
Figura 16: Número de células viáveis de S. mutans nos grupos.
C+L-: grupo rodamina
Controle: grupo controle
L+C-: grupo LED
PDT 3 min: grupo PDT 3 minutos
PDT 5 min: grupo PDT 5 minutos
A figura 17 representa o n ú m e r o de células viáveis, e m porcentagem, de S.
mutans
antes e após a P D T .
37
-•— Controle
L+C*—L-C+
PDT 3min
* — P D T 5min
Figura 17: Número de células viáveis, em porcentagem, de S. mutans antes e após a
PDT.
As
suspensões
bacterianas
expostas
somente
ao
fotossensibilizador
rodamina ácida B durante 5 minutos não apresentaram redução na viabilidade dos
S. mutans.
As suspensões bacterianas expostas somente à irradiação por 5 minutos
também não apresentaram redução na viabilidade dos S. mutans.
As suspensões bacterianas expostas à PDT por 3 minutos apresentaram
redução na viabilidade dos S. mutans. O número total de bactérias viáveis foi de
6
4,41 x 10 ufc/ml, que corresponde à redução bacteriana de 96,74%.
As suspensões bacterianas expostas à PDT por 5 minutos apresentaram
redução na viabilidade dos S. mutans. O total de bactérias viáveis foi de 3,7 x 1 0
6
ufc/ml, que corresponde à redução bacteriana de 97,26%.
A análise estatística mostrou que a terapia fotodinâmica com um diodo
emissor de luz em X= 470 nm e rodamina ácida B como fotossensibilizador foi
significantemente eficiente em reduzir o número de células viáveis de S. mutans. No
entanto, não foram observadas diferenças estatísticas significativas comparando-se
2
2
as doses de 17,52 J/cm (At= 3 min) e 29,2 J/cm (At= 5 min).
37
120
n
c
S
£
u
100
Controle
80
L+C60
L-C+
PDT 3min
40
•o
-^tí—PDT 5min
20
O
Antes
Depois
Figura 17: Número de células viáveis, em porcentagem, de S. mutans
antes e após a
PDT.
As
suspensões
bacterianas
expostas
somente
ao
fotossensibilizador
rodamina ácida B durante 5 minutos não apresentaram redução na viabilidade dos
S.
mutans.
A s suspensões bacterianas e x p o s t a s somente á irradiação por 5 minutos
t a m b é m não apresentaram redução na viabilidade dos S.
mutans.
A s suspensões bacterianas expostas á P D T por 3 minutos apresentaram
redução na viabilidade dos S. mutans.
O número total d e bactérias viáveis foi de
4,41 X 106 ufc/ml, que c o r r e s p o n d e à redução bacteriana d e 96,74%.
A s suspensões bacterianas expostas à P D T por 5 minutos
redução na viabilidade d o s S. mutans.
apresentaram
O total de bactérias viáveis foi de 3,7 x 10^
ufc/ml, q u e corresponde á redução bacteriana d e 97,26%.
A análise estatística mostrou q u e a terapia fotodinâmica c o m um diodo
emissor de luz e m ?.= 4 7 0 n m e rodamina ácida B c o m o fotossensibilizador foi
significantemente eficiente e m reduzir o número de células viáveis de S. mutans.
No
entanto, não foram o b s e r v a d a s diferenças estatísticas significativas c o m p a r a n d o - s e
as d o s e s de 17,52 J/cm^ (At= 3 min) e 29,2 J/cm^(At= 5 min).
38
6. D I S C U S S Ã O
A p e s a r do caráter multifatorial da doença cárie, é conhecido na literatura
que a redução d o s microorganismos patogênicos da superfície dental constitui
uma d a s principais estratégias de prevenção e controle da doença
(MILLER,
1890; G I B B O N S e HAY, 1988; M A R C O T T E e L A V O I E , 1998; T H Y L S T R U P e
F E J E R S K O V , 2001).
Várias terapias têm sido empregadas para a prevenção da doença cárie e
incluem o uso d e agentes quimioterápicos
e quimioprofiláticos
L O B E N E , 1990; J E N K I N S ef a/., 1 9 9 1 ; S C H E A E K E N etal.,
((LASTER
e
1 9 9 1 ; M E L B E R G et
al., 1991), lasers e m alta intensidade pela geração d e calor ( M O R I T Z e í a/.,1997;
M A I O R A N A eí al., 2002; G U T K N E C H T eí al., 2002; C O R T E S , 2003), o u a terapia
fotodinâmica
(VENEZIO
e í al.,
1985; O K A M O T O
e í al.,
1992; D O B S O N
e
W I L S O N , 1992; W I L S O N e MIA, 1993; W I L S O N , 1993; B U R N S eí al., 1993;
B U R N S eí al., 1994; B U R N S eí al., 1995; W I L S O N eí. al, 1995; W A L S H , 1997;
R O V A L D I eí al., 2000; K Ô M E R I K e W I L S O N , 2002; S E A L eí al., 2002; M A T E V S K I
etal., 2003).
A maioria d o s agentes quimioprofiláticos consiste d e antimicrobianos d e
amplo espectro ( G I E R T S E N eí al., 1989), porém, a utilização de tais agentes
pode causar u m desequilíbrio ecológico desfavorável levando a o desenvolvimento
d e infecções oportunistas.
Outro problema e m relação a o s agentes antimicrobianos tradicionais é q u e
existem relatos na literatura de q u e estes agentes podem levar à resistência
bacteriana
(COURVATIN,
1996).
Até
o
presente
momento,
não
foram
encontrados registros sobre resistência bacteriana à P D T .
A terapia fotodinâmica surge nesse cenário c o m o uma alternativa para a
redução de microorganismos patogênicos, c o m o é o caso do S. mutans,
principais
um dos
patógenos envolvidos c o m o aparecimento e desenvolvimento
d o e n ç a cárie.
da
39
Neste estudo, foram obtidos bons resultados na redução de S.
utilizando
um
diodo
emissor
de
luz
azul
de
?i=470
nm
mutans.
associado
ao
fotossensibilizador rodamina ácida B. C o m uma densidade de energia de 17,52
J/cm^ (tempo de exposição de 3 minutos), a redução bacteriana foi de 9 6 , 7 4 % ,
enquanto que para uma dose de 29,2 J/cm^ (tempo de exposição de 5 minutos), a
morte de S. mutans foi de 97,26%.
A rodamina ácida B é utilizada na Odontologia c o m o evidenciador de cárie
e esta é a primeria vez que seu uso é reportado c o m o fotossenssibilizador. Para
um tratamento que é superficial, c o m o no caso de infecções locais, é mais
importante,
para obtenção do efeito fotodinâmico, a capacidade d e ativar
o
fotossensibilizador, do que a utilização d e maiores comprimentos de o n d a , onde é
possível uma maior penetração tecidual. A rodamina ácida B apresenta
uma
absorção no azul mais intensa do que no vermelho e m X= 660 nm, que é o
comprimento de onda disponível comercialmente ao adquirir-se um laser
em
baixa intensidade. Já que o LED azul c o m X= 4 7 0 nm é utilizado clinicamente para
procedimentos de clareamento dental e fotopolimerização de resinas, optou-se
pela utilização desta fonte d e luz para fotossensibilização da rodamina. A p ó s a
análise da espectroscopia foi possível observar uma mudança no espectro de
absorção da rodamina após a associação desta com o S. mutans.
A p ó s esta
associação ocorreu u m a diminuição na absorção, que voltou a subir logo após a
irradiação (Fig. 12). Entre os t e m p o s de 3 e 5 minutos, não houve
nenhuma
mudança no espectro d e absorção e m X= 470 n m , o que sugere que durante este
t e m p o o FS não estaria perdendo sua eficiência (Fig. 13). A p ó s a P D T por 5
minutos ocorreu uma diminuição da absorção entre X=280 e 300 n m , q u e poderia
sugerir alterações e m a l g u m a s das estruturas da célula bacteriana, j á que após
esse período ocorreu a morte de 97, 2 6 % do total d a s células viáveis de S,
mutans (Fig. 15).
De acordo c o m os resultados obtidos sobre a redução bacteriana
foram observadas diferenças estatísticas significativas na redução de S.
para as doses de
17,52 J/cm^ e 29,2 J/cm^, correspondendo
mutans
a tempos
irradiação de 3 e 5 minutos. A espectroscopia de absorção do S.
não
de
mutans,
40
associado ao FS, durante a P D T nos tempos de 1 a 5 minutos mostrou um
aumento da absorção nos dois primeiros minutos e depois uma estabilização até
os 5 minutos. Esses resultados sugerem que pode ser possível conseguir um
efeito bactericida significativo com tempos de irradiação entre 1 e 2 minutos e que
o fracionamento da dose pode ser importante, já que ocorre um aumento da taxa
de
absorção
nos
dois
primeiros
minutos.
Poderiam
ser obtidos
resultados
diferentes se fossem comparados regimes de doses contínuas, por exemplo, a
irradiação durante 3 minutos consecutivos, com o regime de doses fracionadas,
com 3 doses de 1 minuto cada, seguidas de intervalos de alguns minutos entre as
irradiações.
Segundo o estudo de MPHIL et al., 2004, o regime de doses fracionadas
possibilita um aumento da taxa de oxigenação imediatamente após o intervalo
entre as irradiações, que poderia ser traduzido como uma re-oxigenação da
célula, ou seja, um aumento da geração de oxigênio, importante para a eficácia
da terapia fotodinâmica.
Derivados
de
hematoporfirina,
utilizados para terapia fotodinâmica
de
tumores foram utilizados com a finalidade de se obter efeito bactericida contra
espécies de Staphylococcus e Streptococcus
utilizando uma fonte de luz com
potência de 300 m W ( V E N E Z I O e í al., 1985) com resultados positivos para todas
as bactérias testadas, porém, não foram apresentados os números de bactérias
mortas pela terapia. Neste trabalho, os autores mostraram que uma fonte de luz
que não seja coerente é possível, porém, devido à sua baixa energia, necessita
de um longo tempo de exposição o que clinicamente não é viável.
Nos últimos anos, a terapia fotodinâmica tem sido utilizada com a finalidade
de se obter efeito bactericida sobre microorganismos patógenos bucais. Para
tanto, têm sido utilizados fotossensibilizadores cuja coloração variam do azul,
púrpura e verde e que são fortemente absorvidos a A,=630 nm, associados a
lasers e m baixa intensidade que emitem no vermelho visível ( O K A M O T O eí al.,
1992; W I L S O N e MIA, 1993; W I L S O N etal.,
1995).
41
A l g u n s estudos t ê m demonstrado resultados efetivos m e s m o quando a s
bactérias
se
encontram
sob
a forma
de
biofilmes,
como
ocorre
na
placa
subgengival ( D O B S O N e W I L S O N , 1992; B U R N S et al., 1992; B U R N S et al.,
1993; B U R N S et al., 1994; S E A L e í al., 2002), ou m e s m o q u a n d o as bactérias
estão e m b e b i d a s e m matriz de colágeno e sob dentina desmineralizada ( B U R N S
etal.,
1995).
A terapia fotodinâmica foi sugerida c o m o u m a técnica para a esterilização
de u m a lesão de cárie previamente à restauração, utilizando T B O , associado a
um laser äe HeNe (A=632,8 nm), c o m 7,3 m W de potência e densidade de energia
de 33,6 J / c m 2 ( B U R N S e í al., 1993; W A L S H , 1997; S E A L eí al., 2002; Z A N I N eí
al., 2002).
No presente estudo, foi utilizado um fotossensibilizador que pertence à
família das rosaminas, cujas bandas de absorção situam-se entre 350 e 600 n m ,
associado a um díodo emissor de luz azul de X=470 nm. Este fotossensibilizador é
utilizado dentro da Odontologia e m soluções evidenciadoras de cárie, o que
viabilizaria a redução de bactérias cariogênicas in situ, minimizando a quantidade
de tecido sadio a ser removido durante um preparo cavitário convencional. A
utilização d e um L E D d e comprimento de o n d a de 4 7 0 n m é devido ao fato de q u e
este equipamento j á existe comercialmente para procedimentos de clareamento
dental e polimerização d e resinas.
O S. mutans
n ã o possui u m a porfirina autofluorescente, ao contrário de
algu m as bactérias c o m o o Actinomyces
Porphyromonas
gingivalis
que
odontolyticus,
sintetizam
um
Propionibacterium
fotossensibilizador
acnes e
natural,
a
photoporfirina IX, que é capaz de ser sensibilizada por um laser de H e N e de
A=632 nm ( K Ö N I G , 2 0 0 0 ) . Portanto, para um estudo c o m S. mutans é necessário
o uso de u m corante específico de acordo c o m a fonte de luz a ser utilizada.
A p ó s a penetração no tecido, a coerência da luz é perdida e m alguns
d é c i m o s de milímetros. A o contrário de uma fonte de luz monocromática, o LED é
capaz de produzir luz c o m uma banda espectral mais abrangente ( B R A N C A L E O N
e M O S E L E Y , 2002; J U Z E N I E N E e í al., 2004).
42
M e s m o para o tratamento d e t u m o r e s , o n d e teoricamente necessita-se de
uma maior penetração tecidual, fontes de luz não coerentes têm sido utilizadas
a p r e s e n t a n d o efeitos similares aos do /aser e m baixa intensidade ( W I T H E H U R S T
et al.,
1995; M O S E L E Y ,
1996; S O L E R
et
al.,
2000; C L A R K
et al.,
2003;
J U Z E N I E N E e i a / . , 2004).
Para tratamentos que são superficiais, c o m o é o caso da desinfecção de
preparos cavitários ou redução d e S. mutans
presentes e m biofilmes, não é
necessário que a fonte de luz seja proveniente de um laser, já que não é
necessária
uma grande penetração tecidual, e sim q u e o
fotossensibilizador
possua u m a banda espectral a d e q u a d a à fonte de luz utilizada. Sendo assim, a
do L E D p o d e ser utilizada para este fim, e apresenta c o m o vantagens o fato de
serem e q u i p a m e n t o s compactos, relativamente estáveis, acessíveis, fáceis de
operar e de manutenção simples.
N ã o f o r a m encontrados até o m o m e n t o , trabalhos na literatura referindo-se
à ação
bactericida de LEDs a s s o c i a d o s a agentes fotossensibilizadores.
Os
resultados deste estudo mostraram q u e a rodamina ácida B associada a um L E D
de X=470
princípio
nm p o d e ser utilizada c o m o a g e n t e fotossensibilizador dentro
da
terapia
fotodinâmica,
com
a
finalidade
de
do
sensibilizar
microorganismos patógenos da c a v i d a d e oral, neste caso, o S. mutans.
Diversos estudos têm d e m o n s t r a d o o potencial da terapia fotodinâmica e m
aplicações clínicas c o m o a desinfecção d e canais, bolsas periodontais, lesões d e
cárie e regiões d e perimplantites. T o d a v i a , outros estudos d e v e m ser conduzidos
no sentido de adequar parâmetros para q u e a terapia fotodinâmica possa ser
utilizada clinicamente, pois é conhecido q u e a s bactérias sob a forma de biofilmes
e e m lesões de cárie são mais resistentes do que as crescidas em meio d e
cultura.
Estudos in vitro mostraram a a ç ã o bactericida contra
microorganismos
bucais de fotossensibilizadores cuja coloração variam do azul, púrpura e verde e
que s ã o fortemente absorvidos e m A= 6 3 0 n m , associados a lasers
e m baixa
43
intensidade ( V E N E Z I O etal.,
1985; W I L S O N etal.,
DOBSON
e WILSON,
1992; W I L S O N
WILSON.
1993; B U R N S et al.,
1992; O K A M O T O etal., 1992;
e MIA., 1993; B U R N S
1994; B U R N S et al.,
et al., 1993;
1995; W A L S H , 1997;
D Ö R T B U D A K etal., 2 0 0 1 ; S E A L et al., 2002; K Ö N I G , 2002; Z A N I N et al., 2002).
Porém, nesses trabalhos, a terapia fotodinâmica é s e m p r e realizada c o m a
utilização
de
um
laser
em
emissão
no
vermelho
visível
do
espectro
eletromagnético, o q u e explica o u s o de fotossensibilizadores capazes d e serem
absorvidos por estes comprimentos de onda.
Para este estudo, foi escolhido c o m o fonte d e luz u m diodo emissor de luz
azul por possuir comprimento d e onda de 4 7 0 n m , s i t u a n d o - s e e m u m a d a s
b a n d a s de absorção d o fotossensibilizador utilizado.
A rodamina ácida B é utilizada c o m o evidencíadora d e cárie pela s u a
capacidade de penetrar na dentina cariada pela quebra irreversível d a s ligações
intermoleculares
e,
portanto,
corando
a
região
de
dentina
infectada
e
desorganizada ( F U S A Y A M A , 1997; F U S A Y A M A , 1998).
O S. mutans
mostrou s e r c a p a z de absorver a rodamina ácida B e s e r
fotossensibilizado por u m L E D azul d e X= 4 7 0 n m .
Dessa forma, através d a
terapia fotodinâmica, seria possível a eliminação d a s bactérias cariogênicas in
situ,
diminuindo
conseqüentemente,
a
quantidade
contribuindo
de
para
tecido
a
sadio
preservação
a
ser
do
removido
elemento
e,
dental
restaurado.
É difícil o estabelecimento d e parâmetros d e c o m p a r a ç ã o c o m e s t u d o s
anteriores, j á que a maioria d o s trabalhos sobre redução bacteriana c o m P D T é
realizada c o m lasers e, lasers e L E D s p o s s u e m algumas diferenças básicas no
q u e diz respeito às s u a s características de cromaticidade, coerência e potência
luminosa.
A porcentagem de redução bacteriana obtida c o m a rodamina ácida B,
q u a n d o as amostras foram irradiadas por 3 e 5 minutos, foi d e 9 6 , 7 4 % e 9 7 , 2 6 %
44
respectivamente. Esses resultados ficaram b e m próximos aos encontrados e m
trabalhos anteriores utilizando o laser em baixa intensidade ( B U R N S et al., 1993;
B U R N S et al., 1994; B U R N S et al., 1995; W I L S O N et al., 1995; Z A N I N et al.,
2002).
Maiores e s t u d o s clínicos ainda d e v e m ser conduzidos antes de tornar a
terapia fotodinâmica aplicável na clínica diária. P o r é m , os resultados deste e s t u d o
s u g e r e m q u e a P D T apresenta um b o m potencial para uso clínico, já que um dos
grandes problemas atuais é a resistência bacteriana a agentes químicos, assim
c o m o o desequilíbrio da microflora pelo uso de agentes de amplo espectro.
A P D T p o d e ser confinada á área da lesão pela aplicação cuidadosa d o
corante e restrição da irradiação s o m e n t e ao local de interesse.
A utilização da rodamina ácida B c o m o F S é devido a o fato de que este
c o m p o s t o já é utilizada clinicamente para evidenciar dentina cariada. A terapia
fotodinâmica possibilitaria a morte de bactérias cariogênicas In situ. C o m o é difícil
diferenciar clinicamente a dentina sadia da dentina infectada, a P D T poderia
auxiliar na esterilização do preparo cavitário previamente à restauração, c o m o j á
proposto por estudos anteriores utilizando outros F S e laser e m baixa intensidade
( B U R N S etal., 1993).
S U G E S T Õ E S DE T R A B A L H O S F U T U R O S :
•
Pesquisar o mecanismo de morte bacteriana através da P D T ;
•
Avaliar se há o u não indícios de resistência bacteriana à PDT.
45
CONCLUSÕES
De a c o r d o c o m o s resultados obtidos pode-se concluir que:
1. A rodamina ácida B na concentração de 1,72 m M associada a um diodo
e m i s s o r de luz de À= 4 7 0 nm, é c a p a z de reduzir significativamente o
n ú m e r o de células viáveis de S. mutans,
in vitro;
2. C o m p a r a n d o - s e as densidades de energia utilizadas nos t e m p o s de 3 e
5 minutos, n ã o houve diferença estatisticamente significante na redução
d e S. mutans
entre os grupos D e E.
3. A espectroscopia de absorção óptica sugere que há interação entre S.
mutans
e rodamina ácida B, e a a b s o r ç ã o óptica e m A,= 4 7 0 n m sofre
alterações q u a n d o a dose é fracionada.
46
ANEXOS
A n e x o 1 : Fotografías e m p e q u e n o a u m e n t o d e colonias d e S. mutans
placas de Petri c o r a d a s c o m o fotossensibilizador rodamina ácida B.
em
47
A n e x o 2 : Fotografias e m m é d i o a u m e n t o d e colônias de S. mutans
em
placas de Petri c o r a d a s c o m o fotossensibilizador rodamina ácida B.
48
-i
0
'4
A n e x o 3 : Fotografias e m g r a n d e a u m e n t o d e colonias de S. mutans
placas de Petri coradas c o m o fotossensibilizador rodamina ácida B.
em
49
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