Biotecnologia Microbiana
Produção de Bioplásticos por Culturas Microbianas
Mistas
Luísa S. Serafim¹, Paulo C. Lemos¹,² Maria A.M. Reis¹
¹ CQFB/REQUIMTE, Chemistry Department, FCT/UNL, Quinta da Torre, 2829-516 Caparica Portugal
² Instituto de Tecnologia Química e Biológica (ITQB), UNL, 2870-156 Oeiras, Portugal
[email protected]
1  Introdução
Os plásticos convencionais, produzidos a partir de derivados de petróleo,
originam enormes problemas de
contaminação ambiental por não
serem biodegradáveis, persistindo
como contaminantes durante longos
períodos de tempo. Tem havido uma
grande pesquisa no sentido de desenvolver polímeros biodegradáveis com
propriedades idênticas às dos plásticos
convencionais, de modo a poderem
substituir estes últimos em aplicações
semelhantes.
Existem no mercado diversos plásticos
biodegradáveis tais como polihidroxialcanoatos (PHAs), polilactato
(PLA) e poliglicolatos (PGA). Os
PHAs são termoplásticos e possuem
propriedades físicas e químicas muito semelhantes às do polipropileno,
o que os torna possíveis candidatos
progressivamente mais aplicáveis na
sua substituição.
O grande obstáculo à substituição do
polipropileno por PHAs tem sido de
natureza económica. De facto, o preço
dos PHAs é cerca de nove vezes superior ao do polipropileno (€ 9/kg para o
PHB contra €1/kg para o polipropileno) (Biby, 2002).
alternativa interessante às culturas
puras. A selecção de culturas mistas
com elevada capacidade de acumulação de PHAs ocorre naturalmente em
resultado das condições de operação
do reactor e, consequentemente, não
há necessidade de esterilização do
sistema. Por outro lado, a utilização
de culturas mistas facilita o uso de
substratos complexos obtidos a partir
de resíduos orgânicos, dado que a
população microbiana se adapta continuamente à mudança de substrato.
Assim, a possibilidade de produção de
PHAs por culturas microbianas mistas
pode reduzir substancialmente o custo
destes biopolímeros e, consequentemente, torná-los economicamente
mais competitivos com o polipropileno. O preço dos PHAs produzidos por
culturas mistas pode, de facto, baixar
para cerca de metade do preço dos
produzidos por culturas puras, devido
essencialmente à redução do custo dos
substratos e dos custos de investimento (Meesters, 1998).
2- Características e Aplicações dos PHAs
Os PHAs existem no citoplasma da
célula sob a forma de grânulos (0.2
a 0.5 µm de diâmetro) rodeados por
uma membrana (Sudesh et al., 2000)
(Figura 1). Os grânulos fluorescentes
de PHAs podem ser observados por
microscopia de epifluorescência
usando corantes lipofílicos tais como
o Azul de Nilo (Figura 4).
A fórmula química geral dos PHAs
está representada na Figura 2. Foram
identificados mais de 100 monómeros
diferentes como constituintes dos
PHAs em várias bactérias. O polihidroxibutirato (PHB), constituído por
monómeros de 3-hidroxibutirato, é
o PHA mais bem caracterizado e o
acumulado com maior frequência
por bactérias (Madigan et al., 2000).
Outros PHAs frequentemente acumulados por bactérias incluem o
polihidroxivalerato (PHV), polihidroximetilvalerato (PMHV) e o
A razão principal do elevado custo
dos PHAs decorre do facto de actualmente serem produzidos por culturas
microbianas puras e substratos caros
(glucose e ácido propiónico), o que
resulta em custos elevados de investimento e de produção (necessidade
de um maior controlo da operação e
de equipamento auxiliar para esterilização).
O uso de culturas mistas para produção de PHAs pode constituir uma
Figura 1 – Grânulos de PHB acumulados por Azotobacter vinelandii UWD (Page et al., 1995)
 Boletim de Biotecnologia
Biotecnologia Microbiana
térias pode atingir 80 % do seu peso
celular (Kim et al. 1994).
Figura 2 – Fórmula química geral dos PHAs (Lee, 1996)
polihidroximetilbutirato
(PMHB).
A sua presença e proporção relativa
dependem do tipo de substrato usado
pelo microrganismo.
Se forem usadas misturas de substratos, os microrganismos podem
sintetizar co-polímeros, compostos
por diferentes monómeros. O copolímero constituído por monómeros
de 3-hidroxibutirato e de 3-hidroxivalerato (3 HB-co-3HV) é produzido
industrialmente por uma cultura pura
de Ralstonia eutropha, usando como
substratos ácido propiónico e glucose. A formação de um co-polímero
contendo unidades de 3HB e 3HV
altera as propriedades do material,
conduzindo a uma diminuição da
cristalinidade e da temperatura de
fusão, obtendo-se um polímero
menos rígido e mais resistente, que
proporciona melhores condições de
processamento. Consequentemente, as
propriedades do co-polímero podem
ser definidas variando a composição
relativa dos ácidos orgânicos presentes
no meio de cultura.
O peso molecular dos PHAs produzidos industrialmente por culturas
puras varia entre 1.7 x 105 e 4.5 x 106.
Os PHAs mais comuns são polímeros
semicristalinos. O grau de cristalinidade depende da composição do
polímero: sendo 60-80% para o PHB
e decrescendo para 30-40% para o copolímero cujo conteúdo em unidades
HV é de 30% (mol/mol).
As aplicações mais gerais dos PHAs
incluem filmes para embalagens e
plásticos convencionais. Dado que os
PHAs são biocompatíveis, são usados
em aplicações médicas e farmacêuticas (fios de sutura cirúrgica, implantes
ósseos, fármacos de libertação lenta,
etc.). Na agricultura, os PHAs são
usados em produtos de libertação de
reguladores de crescimento de plantas
ou de pesticidas.
3- Microbiologia
Os PHAs são sintetizados por um
grande número de bactérias Gram
negativas e Gram positivas pertencentes pelo menos a 75 géneros diferentes.
Alguns exemplos de culturas puras
usadas industrialmente para produzir
PHAs incluiem a Ralstonia eutropha,
Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii e diversas espécies de Pseudomonas.
Os PHAs podem ser eficientemente
produzidos por microrganismos
geneticamente modificados, como
por exemplo a Echerichia coli recombinante.
A produção de PHAs por estas bactérias ocorre, na maioria dos casos, em
situações em que um nutriente, que
não a fonte de carbono, é limitante
para o crescimento. A quantidade de
polímero acumulado por estas bac-
Para além de culturas puras microbianas, as culturas mistas tem sido referenciadas como produtoras de PHAs.
A acumulação de PHAs por culturas
mistas é particularmente importante
em populações microbianas presentes
em estações de tratamento de efluentes que experimentam condições
transientes de disponibilidade de
carbono e/ou oxigénio. Exemplos de
microrganismos que sintetizam PHAs
em condições transientes de oxigénio
são as Bactérias Acumuladoras de Fósforo (PAOs “Polyphosphate Accumulating Organisms”), responsáveis pela
remoção de concentrações elevadas
de fósforo de efluentes. Nas estações
de tratamento biológico de efluentes
contaminados com fósforo, a biomassa recircula continuamente entre
ambientes anaeróbios e aeróbios, o que
estimula a síntese de reservas intracelulares. A acumulação de reservas
intracelulares, nomeadamente PHAs,
tem um papel muito importante no
metabolismo destes microrganismos.
Nestes sistemas ocorre um outro
grupo de microrganismos designado
Bactérias Acumuladoras de Glicogénio (GAOs-”Glycogen Accumulating
Organisms”) que sintetizam PHAs
mas não acumulam fósforo (Liu et al.,
1996). A quantidade de biopolímero
acumulado por PAOs e GAOs é relativamente baixa, não ultrapassando
20% do peso celular, o que limita a sua
utilização para a produção industrial
de PHAs.
A produção de PHAs por culturas
mistas aeróbias é especialmente elevada quando estas são submetidas a condições transientes de disponibilidade
de carbono. As condições transientes
de excesso e falta de substrato causam
respostas dinâmicas no metabolismo
celular. Sob estas condições dinâmicas,
o crescimento torna-se desequilibrado (“unbalanced”), i.e. o substrato é
consumido sem ocorrer um aumento
correspondente de todos os componentes celulares (sem síntese de
biomassa activa) (Beccari et al., 1998).
Neste caso, o substrato é armazenado
no interior da célula sob a forma de
PHAs. A produção de PHAs por culBoletim de Biotecnologia
17
Biotecnologia Microbiana
turas expostas a condições dinâmicas
de disponibilidade de carbono, pode
atingir valores superiores a 60% do
peso celular (Reis et al., 2003). Não
existe, até ao momento, uma identificação microbiológica dos grupos ou
grupo de bactérias pertencentes a este
fénotipo.
Algumas plantas produtoras de cereais, tais como o girassol e a soja, conseguem sintetizar PHAs. Contudo, o
rendimento de produção (4% do peso
da planta) é muito inferior ao produzido por bactérias, o que, actualmente,
reduz a viabilidade de produção de
PHAs por esta via.
Este artigo aborda a produção de
PHAs por culturas mistas sujeitas a
condições dinâmicas de disponibilidade de carbono.
4  Processo de Produção
de PHAs por culturas
mistas em Condições
Transientes de Adição de
Carbono
4.1- Mecanismo de produção de
PHAs
Quando uma cultura microbiana
experimenta um aumento brusco na
concentração de substrato disponível,
após um período de limitação do
crescimento, podem ocorrer dois tipos
de adaptação, que dependem essencialmente da natureza do substrato,
da cultura microbiana e das condições
de operação (Daiger e Grady, 1982):
a biomassa pode adaptar-se às novas
condições aumentando o crescimento
celular (crescimento como resposta)
ou rapidamente acumular o substrato
sob a forma de reservas intracelulares
(acumulação como resposta). A acumulação de reservas é a resposta mais
rápida porque requer uma menor
adaptação fisiológica dos microrganismos. Nestas condições, há um
desacoplamento entre o consumo de
substrato e o crescimento, ocorrendo
acumulação de reservas intracelulares. O fenómeno de acumulação de
reservas intracelulares é geralmente
dominante (cerca de 70%) sobre o
 Boletim de Biotecnologia
Figura 3 – Perfis de concentrações e da velocidade especifica de crescimento num processo com
culturas mistas submetidas a condições dinâmicas de adição de carbono.
crescimento. Se o tempo de exposição
ao substrato se prolongar de tal modo
que ocorra adaptação fisiológica, o
crescimento celular torna-se o processo dominante.
O mecanismo de acumulação de
reservas poliméricas quando os
microrganismos são sujeitos a condições transientes de carbono (períodos
curtos de excesso de carbono alternados com períodos longos de limitação
de carbono externo) foi proposto por
Majone et al. (1999):
- Após um período prolongado de
limitação de carbono (“fome”), os
microrganismos, quando expostos
a elevadas concentrações de carbono (“fartura”), transformam a
maior parte do substrato em reservas poliméricas internas e o restante em crescimento celular (Figura
3). Após a exaustão do substrato
externo, as reservas internas são
usadas para crescimento e manutenção celular. Neste período de
limitação de carbono, a velocidade
específica de crescimento atinge
valores muito baixos, o que obriga
o microrganismo a uma adaptação
fisiológica na fase seguinte quando
confrontado com um excesso de
carbono disponível, resultando
preferencialmente num mecanismo de acumulação de reservas em
detrimento do crescimento celular.
Nestas condições, e contrariamente ao que acontece com as PAOs e
GAOs, a acumulação de reservas
intracelulares a partir do substrato
externo e o crescimento, ocorrem
em simultâneo.
Neste tipo de sistemas dinâmicos,
os microrganismos que possuem a
capacidade de acumular substrato
sob a forma de reservas intracelulares podem sobreviver durante a fase
de ausência de carbono externo e,
portanto, têm uma vantagem competitiva sobre os microrganismos que não
possuem esta capacidade, tornado-se
dominantes.
A Figura 4 representa os grânulos de
PHB corados no início e no fim da fase
de “fartura” para uma cultura mista
sujeita a ciclos de “fome” e “fartura”.
4.2-Metabolismo
Não existe ainda nenhum modelo
metabólico para o processo de produção de PHAs por culturas aeróbias
sujeitas a condições dinâmicas de
adição de carbono, mas provavelmente não será muito diferente do que é
conhecido para culturas puras que
acumulam PHAs (Figura 5). O composto intermediário chave na síntese
e degradação de PHAs é o acetil-CoA.
Enquanto existe substrato externo forma-se acetil-CoA, que é parcialmente
desviado para a produção de PHAs
e para crescimento, através do ciclo
dos ácidos tricarboxílicos (TCA). Na
síntese de PHB são condensadas duas
Biotecnologia Microbiana
(a)
(b)
Figura 4 – Grânulos de PHAs observados por microscopia de epifluorescência após coloração com Azul de Nilo.(a) início da fase de “fartura” ; (b)
fim da fase de “fartura”
moléculas de acetil-CoA para formar
acetoacetil-CoA, sendo esta reacção
catalisada pela enzima 3- Cetotiolase.
A síntese de PHB prossegue pela acção
das enzimas NADPH redutase e PHB
sintetase. Após a exaustão do substrato
externo, o PHB é degradado, produzindo-se acetil-CoA que é usado para
crescimento e manutenção celular
(ciclo a tracejado na Figura 5).
4.3 – Optimização do processo
Um dos factores que tem limitado a
produção de PHAs por culturas mistas tem sido o baixo rendimento de
produção quando comparado com o
obtido por culturas puras, nomeadamente por Ralstonia eutropha, usada
na produção Industrial de PHAs (Kim
et al., 1994). De facto, enquanto este
microrganismo é capaz de acumular
cerca de 80% (massa de PHA por
massa celular), o valor referido na
literatura para culturas mistas não
ultrapassa 60% (Reis et al., 2003).
Este valor máximo de acumulação
de PHAs foi obtido com culturas de
lamas activadas, sujeitas a condições
transientes de adição de substrato
(“Fome e Fartura”) descritas anteriormente. Deverá notar-se, contudo, que
o interesse pela produção de PHAs
por culturas mistas tem tido como
principal objectivo estudar os mecanismos de acumulação de reservas
intracelulares e não a sua optimização
com vista à produção industrial, pelo
que é de esperar que, manipulando os
parâmetros de operação do processo, o
rendimento de produção de PHAs por
culturas mistas possa atingir valores
superiores aos descritos na literatura.
A optimização da produção de PHAs
tem de passar necessariamente pela
selecção da configuração de reactor e
das condições de operação que conduzam à obtenção de rendimentos e
produtividades elevadas. A configuração de reactor mais usada para estudar
a produção de PHAs por culturas
mistas, usando o processo de “Fome
e Fartura”, é o reactor descontínuo
sequencial (SBR). O SBR é operado
em ciclos de cerca de 12 a 24 horas. A
adição de substrato é feita por pulso,
sendo consumido em cerca de 1 a 2
horas, seguindo-se um período de
cerca de 10 a 22 horas de ausência
de carbono externo (Dircks et al.,
2001, Serafim et al., 2002). Os SBRs
são reactores ideais para seleccionar
populações microbianas com elevada
capacidade de acumulação de PHAs,
porque a biomassa cresce em condições transientes. Este tipo de reactor
é fácil de controlar e é altamente
Figura 5 – Metabolismo de síntese e degradação de PHB por diversos microrganismos (modificado a partir de Sudesh et al., 2000).
Boletim de Biotecnologia
19
Biotecnologia Microbiana
Figura 6 – Efeito da concentração de substrato na produtividade especifica (qp), no rendimento
de produção de PHB (Yp/s) e no conteúdo em PHB na biomassa (%HB).
flexível, permitindo a alteração rápida
dos ciclos de operação (duração da
alimentação e extensão do ciclo).
4.3.1- Efeito da concentração de
substrato
O efeito da concentração de substrato
na quantidade de polímero produzida
foi estudado usando acetato como
substrato e um SBR operado com
ciclos de 12 horas. O acetato foi adicionado num único pulso, sendo consumido entre 1-4 horas, dependendo
da concentração usada, seguindo-se
um período de 8 a 11 horas de ausência de carbono. Os resultados obtidos
para as diferentes concentrações de
acetato estão representados na Figura
6. Verifica-se que o conteúdo em PHB
na biomassa aumenta com a concentração de substrato, atingindo 67% do
peso celular. No entanto, a produtividade específica em polímero atinge o
máximo (0.75 mmmol C/mmol X.h)
para 90mmol C/l e decresce acentuadamente para a concentração de substrato de 180mmol C/l. Este decréscimo
é originado pela inibição da síntese de
PHB para elevadas concentrações de
substrato. A razão entre a quantidade
de polímero produzido e de substrato
consumido (Yp/s), é independente da
concentração de substrato usada, atingindo um valor médio de 0.72 Cmmol
HB/Cmmol HAc.
 Boletim de Biotecnologia
É interessante notar que as produtividades específicas (0.41-0.75 Cmmol
HB/Cmmmol X.h) obtidas por
culturas mistas sujeitas a condições
transientes de adição de carbono,
são cerca de uma ordem de grandeza
superiores às obtidas (0.013 Cmmol
HB/Cmmmol X.h) por culturas puras
usadas industrialmente (Kim et al.,
1994). Do ponto de vista da optimização do processo, esta característica das
culturas mistas é muito importante,
por permitir obter elevadas produtividades com concentrações celulares
baixas.
4.3.2- Estratégia de operação do
Reactor
Uma forma de garantir a produção
de elevadas quantidades de polímero,
minimizando a inibição por substrato,
será adicionar o substrato de forma
semi-contínua (“fed-batch”) ou contínua. No último caso o substrato,
correspondente ao máximo anterior
(180mmol C/l), é adicionado continuamente durante a fase de “fartura”,
seguindo-se um período de “fome”. No
primeiro caso, a mesma quantidade de
substrato é distribuída por três pulsos
sequenciais, seguindo-se igualmente
um período de “fome”.
Os resultados obtidos para os dois
tipos de estratégia de alimentação
do reactor estão representados na
Figura 7. A alimentação em contínuo
(Figura 7a) resultou numa diminuição
na produtividade do reactor (0.30
Cmmol HB/Cmmmol X.h) e no
conteúdo em polímero nas células
(56%), relativamente à situação em
que a mesma quantidade de substrato
(180mmol C/l) tinha sido adicionada
num pulso (Figura 6). Este resultado
pode ser explicado pelo facto de no
sistema alimentado em contínuo, o
substrato dentro do reactor ter sido
limitante para o processo de acumulação de PHB. Pelo contrário, quando
a mesma quantidade de substrato foi
adicionada em três pulsos (Figura
7b), a produtividade (0.80 Cmmol
HB/Cmmmol X.h) e a quantidade de
polímero acumulado (78.5%) aumentaram significativamente em relação
às experiências em que o substrato
foi adicionado num único pulso e em
contínuo. O conteúdo em PHB nas
células (78.5%) é idêntico ao obtido
por culturas puras (80%), o que torna
o processo de “ Fome e Fartura” extremamente atractivo para a produção
industrial de PHAs.
A adição de 4 pulsos de carbono não
originou qualquer aumento na acumulação de PHB, podendo afirmar-se
que as células atingiram a máxima
capacidade de acumulação de polímero para 180mmol C/l, distribuído em
três pulsos.
5-Conclusões
Manipulando os parâmetros de operação do reactor, a quantidade de PHB
obtida por culturas mistas pode atingir valores semelhantes aos obtidos
por culturas puras.
Embora este estudo tenha sido efectuado com ácido acético, experiências
realizadas com outro tipo de substratos, tais como ácido propiónico e ácido
butírico, revelaram que os ácidos orgânicos voláteis são excelentes substratos
para a produção de PHAs por culturas
mistas. Tendo em conta este aspecto,
pode-se concluir que a produção de
PHAs por culturas mistas abre novas
perspectivas à utilização e valorização
de resíduos industriais que possuam
na sua composição compostos orgâni-
Biotecnologia Microbiana
(a)
(b)
Figura 7 – Produção de PHB para dois tipos de adição de substrato: (a)- alimentação em contínuo; (b) – alimentação por pulsos. (æ - velocidade
de adição de acetato (a) e concentração de acetato (b), à- % de PHB, ç- OUR (velocidade específica de consumo de oxigénio (oxygen uptake rate),
ó-concentração de amónia).
cos fermentáveis (ex. soro de leite, rescaldo de melaço) ou fermentados (ex.
ácidos orgânicos). No primeiro caso
o processo deve incluir uma etapa de
fermentação a montante do processo
de produção de biopolímero.
No caso de se desenvolverem condições que tornem o processo de produção de PHAs por culturas mistas e
resíduos industriais economicamente
viável, num futuro próximo esta
tecnologia permitiria reduzir de forma
significativa a utilização de plásticos
não biodegradáveis e a necessidade de
tratamento do tipo de resíduos industriais referidos, resolvendo um duplo
problema ambiental.
Agradecimentos
Este projecto (POCTI/35675/BIO/2000)
foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT). Luísa S. Serafim e
Paulo C. Lemos agradecem à FCT pelas
bolsas PRAXIS XXI BD/18287/98 e BPD/
20197/99, respectivamente.
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