Anais do XIX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178
Anais do IV Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
23 e 24 de setembro de 2014
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DO FOSFOPEPTÍDEO DE
CASEÍNA/ FOSFATO DE CÁLCIO AMORFO E DA LISOZIMA,
LACTOFERRINA E LACTOPEROXIDASE NO CIMENTO DE
IONÔMERO DE VIDRO PARA O TRATAMENTO DAS LESÕES DE
CÁRIE DENTINÁRIAS
Giuliana Rodrigues Azenha
Sérgio Luiz Pinheiro
Faculdade de Odontologia
Centro de Ciências da Vida
[email protected]
Dentística Minimamente Invasiva
Centro de Ciências da Vida
[email protected]
Resumo: O objetivo desse trabalho foi avaliar a
associação do fosfopeptídeo de caseína/fosfato de
cálcio amorfo e da lisozima, lactoferrina e
lactoperoxidase no cimento de ionômero de vidro
para o tratamento das lesões de cárie dentinárias.
Foram
selecionados
20
terceiros
molares
permanentes e superfícies dentinárias planas foram
obtidas. As amostras foram impermeabilizadas
exceto a dentina coronária e submetidas ao desafio
cariogênico com cepa padrão de S. mutans por
quinze dias. As lesões de cárie foram seladas com
cimento de ionômero de vidro + fosfopeptideo de
caseína/nanocomplexo de fosfato de cálcio amorfo +
1% de lisozima + 1% de lactoferrina + 1% de
lactoperoxidase. Foram realizadas contagens de S.
mutans antes do selamento do tecido cariado, após
24 horas, 1 mês e 6 meses. O processamento
microbiológico
foi
realizado
por
meio
da
homogeneização, diluição, semeadura e incubação
por 5 dias em anaerobiose. Houve redução
significante de S. mutans após 24 horas do
selamento com cimento de ionômero de vidro
associado ao fosfopeptídeo de caseína/fosfato de
cálcio amorfo, lisozima, lactoferrina e lactoperoxidase
(p=0.0162). Após 1 mês do selamento, houve
crescimento significante de S. mutans em relação a
contagem após 24 horas (p=0.0193). Não houve
diferença significante entre a contagem de S. mutans
após 1 e 6 meses (p=0.8307). A associação do
fosfopeptídeo de caseína/fosfato de cálcio amorfo e
da lisozima, lactoferrina e lactoperoxidase no cimento
de ionômero de vidro aumentou a capacidade de
redução de S.mutans 24 horas após o selamento do
tecido cariado e pode ser uma alternativa para o
tratamento restaurador da doença cárie.
Palavras-chave: Lesão de cárie, Dentina, Cimento
de Ionômero de Vidro.
Área do Conhecimento: Ciências da Saúde Odontologia - PIBIC/CNPq.
1. INTRODUÇÃO
A lesão de cárie dentinária pode ser dividida
histologicamente em camada superficial (dentina
infectada) e profunda (dentina afetada). A primeira
camada apresenta extensa descalcificação e
degeneração das fibras colágenas. A segunda
camada
caracteriza-se
por
descalcificação
intermediária, fibras colágenas reversivelmente
alteradas e odontoblastos com ativo processo de
recalcificação [1,2]. É possível observar seis
camadas distintas na lesão de cárie dentinária: 1externa irreversivelmente desmineralizada; 2translúcida; 3 - subtransparente; 4- esclerótica; 5dentina hígida; 6- pré–dentina. As camadas 2, 3 e 4
correspondem as áreas reversivelmente alteradas
pela lesão de cárie [3].
Na odontologia minimamente invasiva preconiza-se
a remoção da dentina infectada e manutenção da
dentina afetada. O selamento do complexo dentino
pulpar restringe a nutrição microbiana paralisando a
progressão da lesão de cárie [1,2,3,4,5]. A
desmineralização e a remineralização são
processos dinâmicos que estão envolvidos com o
início, progressão e reversão da doença e o
equilíbrio entre esses processos é fundamental
para prevenção e tratamento da doença [6,7].
Algumas alternativas têm sido avaliadas na
literatura
para
auxiliar
no
processo
de
remineralização,
entre
elas,
destaca-se
o
fosfopeptídeo de caseína/fosfato de cácio amorfo
(FC/FCA). A remineralização do esmalte pode ser
feita através da utilização do composto bioativo
FC/FCA [6,8]. O FC/FCA localiza e atrai íons cálcio
e o fosfato da superfície dentária aumentando o
gradiente de concentração na subsuperfície do
esmalte promovendo remineralização in situ
[9,10,11,12,13]. O esmalte remineralizado com
FC/FCA é relativamente mais resistente às
alterações ácidas quando comparado com o
esmalte dentário normal carbonatado [14]. O
FC/FCA é um composto bioativo que auxilia na
manutenção da supersaturação de íons cálcio e
fosfato criando reservatórios que poderão ser
utilizados durante a desmineralização [6]. O
FC/FCA aplicado continuamente sobre superfícies
de dentina expostas por erosão promove redução
do desgaste e lubrificação superficial [15]. O
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potencial anticariogênico do FC/FCA foi atribuído à
capacidade de atrair o fosfato de cálcio amorfo na
superfície do dente mantendo um estado de
supersaturação dos minerais na superfície [9]. O
FC/FCA interage com íons de flúor para produzir
um efeito anticariogênico aditivo através da
formação de uma fase de fosfato de fluoreto de
cálcio amorfo estabilizado [9].
Outra possibilidade terapêutica que pode auxiliar na
reorganização da dentina afetada pela doença cárie
pela sua capacidade antimicrobiana é a utilização
das enzimas lisozima, lactoferrina e lactoperoxidade
[16,17,18]. Essas podem apresentar efeito inibitório
e até mesmo bactericida contra os patógenos da
cavidade oral, entre eles o S. mutans. A interação
da bactéria com os componentes salivares que
formam a película adquirida na superfície do
esmalte está associada com a aderência seletiva
dos S. mutans à superfície. Os componentes
salivares que interagem com os S. mutans são as
mucinas, lisozima, lactoperoxidase, aglutininas,
prolinas e imunoglubinas secretórias. A lisozima
provoca a lise bacteriana através da quebra da
ligação entre o ácido n-acetil-murâmico e o n-acetilglucosamina na parede celular, neutralizando a
patogenicidade das bactérias gram positivas e
negativas [19]. A lisozima é uma molécula
antimicrobiana capaz de degradar o peptidoglicano
da parede celular bacteriana [19,20] e apresenta
também atividade não-muramidase que é atribuída
pelo rompimento da função da membrana
bacteriana através de peptídeos aminoácidos
catiônicos antimicrobianos [21].
A lactoferrina apresenta capacidade antimicrobiana
por reduzir a quantidade de ferro viável para
bactéria promovendo proteção bacteriostática e
bactericida [22]. Além da lisozima e lactoferrina, a
saliva humana contém o sistema antibacteriano
lactoperoxidase, peróxido de hidrogênio e íon
tiocianato. O peróxido de hidrogênio presente na
cavidade oral é produzido pelos microrganismos. A
lactoperoxidade catalisa a oxidação dos íons
tiocianato através do peróxido de hidrogênio
gerando
ácido
hipotiocianoso
ou
ânion
hipotiocianeto, ambos com ação antibacteriana. O
hipotiocianeto age como inibidor bacteriano
interferindo no metabolismo celular [17,23,24].
O objetivo desse trabalho foi avaliar a associação
do fosfopeptídeo de caseína/fosfato de cálcio
amorfo e da lisozima, lactoferrina e lactoperoxidase
no cimento de ionômero de vidro para o tratamento
das lesões de cárie dentinárias.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
A presente pesquisa foi aprovada pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da PUC-Campinas (0345/11).
Seleção das amostras
Foram
selecionados
20
terceiros
molares
permanentes na Clínica Odontológica da PUC
Campinas com Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido assinado pelos respectivos pacientes
doadores.
Critérios de inclusão
Terceiros molares permanentes;
Ausência de trincas ou fraturas examinadas por lupa
(Stemi DV4 - Carl Zeiss, São Paulo, Brasil) com
aumento de 10X.
Critérios de exclusão
Terceiros molares permanentes com trincas ou
fraturas examinadas por lupa (Stemi DV4 - Carl
Zeiss, São Paulo, Brasil) com aumento de 10X.
Procedimentos
Os dentes selecionados foram armazenados em
cloreto de sódio 0.9% contendo azida de sódio
0.02% (LabCenter, São Paulo, Brasil) a 4° C por no
máximo 1 mês (Zhou et al., 2009). Após este
procedimento, os dentes foram lavados com soro
fisiológico com sacarose 10% (LabCenter, São
Paulo, Brasil). Foi feita a remoção do terço oclusal
com disco diamantado dupla face (KG Sorensen
Indústria e Comercio LTDA, São Paulo, Brasil) em
baixa rotação com refrigeração para exposição
dentinária. As superfícies dentinárias foram polidas
com lixas de carboneto de silício 600 umedecidas
(Água T223 advance, Norton, Indústria Brasileira,
São Paulo, Brasil).
Foi feita a impermeabilização das amostras com
resina epóxi (Araldite, São Paulo, Brasil) e esmalte
(Colorama, São Paulo, Brasil) exceto na dentina
coronária no fluxo laminar (Veco, Campinas, SP,
Brasil). Após a impermeabilização dos dentes, os
espécimes foram submetidos ao desafio cariogênico.
Para simular a lesão de cárie em dentina, os dentes
foram colocados em tubos de ensaio estéreis com
meio de sobrevivência Brain Heart Infusion (BHI)
(LabCenter, São Paulo, Brasil) suplementado com
extrato de levedura 0,5% (LabCenter, São Paulo,
Brasil), de glicose 1% (LabCenter, São Paulo, Brasil)
e de sacarose 1% (LabCenter, São Paulo, Brasil). A
cepa padrão de S. mutans ATCC 25175 (Fundação
André Tosello. Campinas- SP, Brasil) padronizada
na escala 0,5 de MacFarland foi introduzida no BHI
(LabCenter, São Paulo, Brasil). As amostras foram
incubadas a 37°C por 1 mês em jarras contendo
envelopes geradores de anaerobiose (LabCenter,
São Paulo, Brasil) em atmosfera contendo 85% de
nitrogênio (N2), 10% de dióxido de carbono (CO2) e
de 5% de hidrogênio (H2) e armazenadas em estufa
bacteriológica (Fanem Ltda, São Paulo, SP, Brasil).
Durante o transcorrer desse período, o meio de
sobrevivência BHI (LabCenter, São Paulo, Brasil) foi
renovado de 2 em 2 dias.
Os espécimes foram tratados com cimento de
ionômero de vidro associado com fosfopeptídeo de
caseína/fosfato de cálcio amorfo, lisozima,
lactoferrina e lactoperoxidase. Foram realizadas
contagens de S. mutans antes do selamento do
tecido cariado e após 24 horas, 1 mês e 6 meses. A
associação do ionômero de vidro foi realizada na
Farmácia de Manipulação da Pontifícia Universidade
Católica de Campinas. Foram utilizadas as enzimas
lisozima (Sigma, São Paulo, Brasil), lactoferrina
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(Sigma, São Paulo, Brasil) e lactoperoxidase (Sigma,
São Paulo, Brasil) na forma de pó e a pasta GC
Tooth Mousse Plus (GC Corporation, Tóquio, Japão)
que contém o fosfopeptídeo de caseína/fosfato de
cálcio amorfo. Ao pó do ionômero de vidro (3M ESPE
Ketac™ Cem Easymix, Deutschland, Alemanha)
incorporou-se 1% de lisozima (Sigma, São Paulo,
Brasil), 1% de lactoferrina (Sigma, São Paulo, Brasil)
e 1% de lactoperoxidase (Sigma, São Paulo, Brasil).
Com auxílio de um vidro de relógio estéril foi pesado
em balança de precisão (Uni Bloc, Shimadzu
Auy220, Kyoto, Japão) 5 g de pó do ionômero de
vidro e a este incorporado 0,05 g de pó de cada
enzima. Após a pesagem, os materiais foram
misturados em cuba de porcelana e misturador
estéril. Um grama de pasta pesada, em balança de
precisão, foi diluída em 4 ml de água destilada e 3%
foi incorporado ao liquido do ionômero de vidro.
As coletas do tecido cariado dentinário foram
executadas com colher para dentina número 20
(SSWhite Duflex, Rio de Janeiro, Brasil) estéril. A
altura de penetração na lesão de cárie foi
padronizada pela marcação de 1 mm na ponta ativa
da colher para dentina. As amostras foram
imediatamente inseridas no meio de transporte BHI
(LabCenter, São Paulo, Brasil).
O material dentinário inserido no meio de transporte
BHI (LabCenter, São Paulo, Brasil) foi manipulado
num período de até 24 horas e homogeneizado
durante 3 minutos em agitador de tubos (Phoenix,
Araraquara, SP, Brasil). Imediatamente após a
homogeneização, foram realizadas 5 diluições
decimais e, de cada uma delas, foram semeadas 3
alíquotas de 25 μL na superfície do meio de cultura
mitis salivarius bacitracina. Todas as placas foram
incubadas em jarras (Oxoid Ltd., Basingstoke,
Hampshire, England) a 37°C durante 5 dias em
atmosfera de 85% de N2, 10% de CO2 e 5% de H2,
obtida pelo uso de envelopes geradores de
anaerobiose e
indicadores de anaerobiose
(AnaerogenTM, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire,
England). Após a incubação, foi feita a contagem do
total de bactérias viáveis.
Análise Estatística
Foram feitas as comparações entre o total de S.
mutans viáveis antes a após os períodos
experimentais no programa Bioestat 4.0. Os
resultados foram submetidos à análise estatística
descritiva
e
ao
teste
de
Kruskal-Wallis
complementado por Student-Newman-Keuls.
3. RESULTADOS
Houve redução significante de S. mutans após 24
horas do selamento com cimento de ionômero de
vidro associado ao fosfopeptídeo de caseína/fosfato
de cálcio amorfo, lisozima, lactoferrina e
lactoperoxidase (p=0.0162). Após 1 mês do
selamento, houve crescimento significante de S.
mutans em relação a contagem após 24 horas
(0.0193). Não houve diferença significante entre a
contagem de S. mutans após 1 e 6 meses
(p=0.8307) (Tabelas 1 e 2).
Tabela 1 - Medianas, desvios interquartílicos, análise
estatística de Kruskal-Wallis (Student-Newman-Keuls)
entre os grupos amostrais (log 10).
GRUPOS
ANTES
24
HORAS
1
MÊS
6
MESES
p
(Kruskal
Wallis)
CIV+FC+
LLL
3.58
(0.50)a
2.82
(0.39)b
3.60
(0.26)a
3.61
(0.04)a
0.0186
CIV+FC+LLL: cimento de ionômero de vidro +
fosfopeptídeo de caseína/fosfato de cálcio amorfo +
lisozima + lactoferrina + lactoperoxidase. Letras ou
números diferentes: diferenças significantes (p<0.05)
Tabela 2 - Análise estatística de Kruskal-Wallis
(Student-Newman-Keuls) entre os grupos amostrais
(log10) – valor de p.
CIV+FC+LLL
ANTES
24 HORAS
1 MÊS
6 MESES
ANTES
--------
0.0162
0.9436
0.7688
24 HORAS
--------
--------
0.0129
0.0069
1 MÊS
--------
--------
--------
0.8307
CIV+FC+LLL: cimento de ionômero de vidro +
fosfopeptídeo de caseína/fosfato de cálcio amorfo +
lisozima + lactoferrina + lactoperoxidase
4. DISCUSSÃO
A destruição dos tecidos dentários na lesão de cárie
é causada por bactérias e os produtos da sua
fermentação. O principal agente etiológico
encontrado nessas lesões são os S. mutans [25].
Uma propriedade do CIV é a liberação de flúor para
a cavidade bucal [26], cuja presença está
relacionada à inibição da desmineralização dos
dentes, ao potencial de remineralização e ao efeito
antibacteriano,
conferindo-lhe
importantes
propriedades preventivas. A liberação de flúor
ocorre, predominantemente, nos primeiros minutos,
tornando-se significativamente mais baixa com o
decorrer do tempo [27]. A adição de substâncias
antibacterianas ao CIV pode aumentar o potencial
antimicrobiano do material, ampliando sua ação nas
superfícies mais susceptíveis a doença cárie
[28,29].
Os resultados desse trabalho demonstraram
redução significante (p<0.05) de S.mutans 24 horas
após o selamento das lesões de cárie com CIV
associado à FC/FCA, lisozima, lactoferrina e
lactoperoxidase quando comparado à contagem de
S. mutans de antes do selamento, confirmando o
efeito antibacteriano do FC/FCA em tamponar a
placa e interferir no crescimento e adesão do S.
mutans [30] e a capacidade antimicrobiana da
lisozima, lactoferrina e lactoperoxidase em auxiliar a
reorganização da dentina afetada [17,18].
O FC/FCA é um composto bioativo que estimula a
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reparação da estrutura dental através da liberação
de íons de cálcio e fosfato [10,11,12,13,30,31]. O
FC/FCA localiza e atrai íons cálcio e o fosfato da
superfície dentária aumentando o gradiente de
concentração na subsuperfície do esmalte
promovendo remineralização in situ [9]. É um
composto que possui melhor osteocondutividade,
melhor degradabilidade, bioatividade, alta adesão
celular, não apresenta citotoxicidade e possui
cinética de estabilização [13]. Neste trabalho, foi
feita a associação de 3% de FC/FCA diluído ao CIV
para avaliar a capacidade antimicrobiana do material
sobre os S. mutans, de acordo com a literatura que
relata que o FC/FCA, atualmente, tem sido muito
utilizado como componente ativo de diversos
produtos e materiais, dentre os quais, destacam-se
os colutórios, pastas dentárias, alguns clareadores,
pastas abrasivas, vernizes e o CIV [6,12,13].
A incorporação de lactoperoxidase salivar na pasta
dental proporcionou efeitos benéficos no tratamento
da doença cárie [32]. Em contrapartida, outro estudo
[33] avaliou a eficácia clínica de um bochecho e gel
oral contendo lactoperoxidade, lactoferrina e
lisozima e foi observado que a utilização de
produtos de higiene oral contendo enzimas
antimicrobianas não interferiu nas lesões de cárie.
Os resultados obtidos nesse trabalho indicam
atividade antibacteriana das enzimas observada
através da redução significativa de S.mutans após
24 horas do selamento.
Ao incorporar clorexidina hexametafosfato ao CIV foi
observado que o efeito antimicrobiano do material
persistiu entre 40 a 90 dias, sendo que o pico de
eficácia se manteve nas primeiras 24 horas [29]. A
liberação de flúor é significativamente maior no CIV
contendo FC/FCA, mas o pico também ocorre
primeiras 24 horas [34].
A contagem de S. mutans após 1 mês e 6 meses do
selamento apresentou crescimento de S. mutans em
relação a contagem após 24 horas, isto pode ser
justificado pela perda e/ou desgaste do selamento
durante o armazenamento. Ao incorporar o FC/FCA
diluído em água destilada no líquido do cimento de
ionômero de vidro nesse trabalho aumentou-se a
concentração de água na composição do material, o
que pode ter interferido na relação pó/liquido e
consequentemente, menor resistência ao desgaste,
maior solubilidade e mistura mais fluida do material
contribuindo para a infiltração marginal e perda
parcial ou total do selamento após armazenamento
no período de 1 mês e 6 meses. As propriedades
do CIV dependem da composição química, do
tamanho e da distribuição das partículas do pó, e da
natureza, do peso molecular e da concentração do
líquido poliácido [35]. As partículas de carga dos CIV
podem permanecer intactas e transmitir força para
matriz
circunvizinha,
podendo
resultar
em
microtrincas; assim, a matriz não é capaz de reter as
partículas que são deslocadas, ocorrendo o
desgaste do material [36].
A incorporação de antimicrobianos ao CIV pode
provocar alterações nas propriedades físicas do
material, como por exemplo, a dureza de superfície,
fator importante para controle da resistência ao
desgaste do material, bem como sua durabilidade
[18], porém, um estudo apontou que a utilização de
pasta contendo FC/FCA antes do sistema adesivo
autocondicionante, pode ocorrer melhora da
durabilidade e resistência de união dos materiais
[37]. A melhora da adesão pode ter ocorrido pela
formação de uma ligação hidrofóbica que pode
garantir menor permeabilidade à água [37]. Foram
avaliadas as propriedades físicas da associação de
FC/FCA 1,56% ao CIV quando estabelecida a presa
do material e foi observado aumento de 23% na
resistência à compressão, aumento de 33% na
resistência de união e aumento do tempo de presa
do material [34].
Os CIVs incorporam bolhas de ar durante a
manipulação, estas introduzem porosidades junto
com as partículas de carga que se expõe durante a
abrasão ou erosão ácida, contribuindo para o
aumento da rugosidade [38]. Tal rugosidade pode
diminuir a resistência ao desgaste do material
restaurador
e
tornar
esta
superfície
significativamente mais propensa ao aumento da
deposição de biofilme bacteriano, com consequente
degradação superficial e infiltração marginal [39],
oque pode ter contribuído com novo crescimento de
S.mutans, uma vez que as amostras permaneceram
armazenadas durante 1 mês e 6 meses em BHI
estando suscetíveis a alterações de pH, presença
de nutrientes, remanescentes de S. mutans e
envelhecimento. Foi comprovada, em estudo, a
existência de fendas marginais entre o cimento de
ionômero de vidro e o dente com lesão de cárie préexistente [40].
A associação de FC/FCA, lisozima, lactoferrina e
lactoperoxidase no CIV permitiu observar nas
primeiras 24 horas significativa redução de S.
mutans, porém, após 1 mês e 6 meses foi
observada viabilidade bacteriana e aumento de S.
mutans que se deve ao envelhecimento da
restauração que provoca fissuras marginais
possibilitando
a
nutrição
das
bactérias
remanescentes.
5. CONCLUSÃO
A associação de FC/FCA, lisozima, lactoferrina e
lactoperoxidase ao CIV é uma opção para aumentar
a capacidade de redução de S.mutans 24 horas
após o selamento do tecido cariado e pode ser uma
alternativa para o tratamento restaurador da doença
cárie.
AGRADECIMENTOS
PUC-Campinas pela oportunidade de desenvolver o
trabalho de Iniciação Científica;
CNPQ pela bolsa de Iniciação Científica (Processo
143991/2013-2);
FAPESP
pelo
auxílio
pesquisa
(processo
2012/10350-6).
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