Estratégias de classificação e identificação de
bactérias: clássicas, genéticas e moleculares
Visão do microbiologista
Suporte clínico e assesoramento
Diagnose laboratorial da infecção
Gestão do paciente
Infecções novas ou resistentes
Agentes antimicrobianos
Tomada de decisões
Isolamento de patógenos
Sangue
– Bacteremia. Presença de bactérias no sangue.
– Septicemia. Organismo virulento entrando de uma
foco infeccioso para o sangue até outros tecidos
causando novas infecções.
– 10 ml ascepticamente em culturas
aerobias/anaerobias
- Pode estar contaminado com bactérias da pele
como Staphylococcus epidermidis .
Culturas de urina
•
•
•
•
Comuns em hospitais.
Titulos de 105 organismos/ml
Avaliação microscópica
Nitrito. Bacteria entérica nitrato-nitrito
Culturas fecais
• pH cai rapidamente, vial contendo tampão
fosfato para transporte.
• pH ácido inibe crescimento de Shigella e
Salmonella.
• Crescimento de amostras em vários meios
Feridas e abcesos
• Cotonete ou siringa depois de limpar a
superficie com alcool 70%.
• Feridas purulentas:
• S aureus, bactérias entéricas, P. Aeruginosa,
Bactérias anaeróbicas: Bacteroides e
Clostridium. Transporte anaeróbico
Espécimens genitais
• Descarga da urétra
purulenta: gonorrea
• Transmitido por contato
pessoal
• Resistente naturalmente a
vancomicina, nistatina,
colistina
• Gram negativa-gonococo
Métodos convencionais
Método convencional
• Depende da habilidade para
cultivar
– Treponema pallidum (sífilis,
bactéria anaeróbica)
• Lento, especialmente para
espécies fastidiosas
Mycobacterium spp.
• Nem sempre definitivo
• A maioria das amostras clínicas são crescidas
primeiro em meio enriquecido de uso geral como
agar sangue, que suporta crescimento da maioria dos
organismos aerobios e anaerobios facultativos, gram
+ e gramm -.
• Meio de enriquecimento, Uso de meio seletivo e
condições de incubação necessárias para isolar o
microorganismo de amostras. É uma parte
importante da microbiologia clínica.
-Ágar Sangue: meio utilizado para a maioria dos
materiais clínicos. Permite o crescimento de grande parte
dos patógenos não fastidiosos ou que requerem
incubação especial. Devido a adição de sangue de
carneiro desfribinado proporciona a leitura das
hemólises causadas pelo genêro Streptococcus spp.
• O BD Hektoen Enteric Agar (agar entérico de Hektoen) é
um meio para diferenciação moderadamente selectivo
utilizado para o isolamento e diferenciação de
microorganismos entéricos gram-negativos provenientes
de amostras clínicas e não-clínicas. É um meio
particularmente importante para o isolamento de espécies
de Shigella e Salmonella.
Agar chocolate. Adição de sangue, mas só é
adicionado qd a temperatura é de 80ºC
(ocorre lise dos eritrócitos) microrg
exigentes c/o o Género Neisseria.
• Tabela 24.1 mostra meios enriquecidos e meios
seletivos para os isolamento de patógenos.
• Meio diferencial. São meios especializados
que permitem a identificação de organismos
baseado no seu crescimento e apariência no
meio.
• Microbiologistas experientes podem fazer a
tentativa de identificar um isolado clínico
observando a cor e morfología das colonias do
patógeno suspeito crescido em vários meios
como descrito na tabela as described in Table
24.2.
Métodos de identificação
dependentes do crescimento
• São métodos tradicionais para identificar
patógenos observando as mudanças
metabólicas induzidas pelo crescimentol. São
rápidas e certeras.
Diagnóstico mudança de cor
Sistema desenhado para testes da familia Enterobacteriaceae
• Table 24.3 gives important clinical diagnostic tests for bacteria.
Susceptibilidade a
antimicrobianos
• Drogas antimicrobianas são usada
amplamente
• Patógenos devem ser testados para a
susceptibilidade a antibióticos individual para
garantir a quimioterapia adequada. Esta
abordagem rigorosa ao tratamento
antimicrobiano é normalmente aplicada
somente em ambientes de cuidados a saúde.
• O procedimento padrão que avalia a atividade antimicrobiana é chamado
de método de Kirby–Bauer (Figure 24.8).
• Antibiogramas são reportes periodicos para
indicar a susceptibilidade de organismos
isolados a antibioticos usados no local.
Fitas com um gradiente de concentração de antibiótico
Segurança no laboratório de
microbiologia.
• Requer treinamento específico, planejamento e cuidado
para prevenir infecção dos trabalhadores do laboratório com
os patógenos.
• Materiais como culturas vivas, meios de cultura inoculados,
usado agulhas hipodérmicas, e amostras de pacientes
requerem precauções específicas para o manuseio seguro.
Métodos de Diagnóstico de
Doenças Infecciosas
Imunologia Clínica e
Imunoensaios
•A resposta imune é um resultado natural da infecção.
Os principais aspectos da imunidade estão resumidos
na Figura 24,10.
• Respostas imunes específicas, em especial
os títulos de anticorpos e testes cutâneos,
podem ser monitorados para fornecer
informações sobre infecções passadas, actuais
infecções, e convalescença (Figura 24.11).
• Testes comuns de imunodiagnóstico de
patógenos são apresentados na Tabela 24.5.
Anticorpos monoclonais e
policlonais
• são usados para pesquisa e aplicações
clínicas.
• Table 24.6 shows characteristics of monoclonal
and polyclonal antibody production.
Reações in vitro antígenoanicorpo: Serologia
• O estudo de reações antígeno-anticorpo in
vitro são chamadas serologia.
• Reações antígeno-anticorpo requerem que o
anticorpo se ligue ao antígeno. Tipos de
reações: Table 24.7.
• Specifiidade (Table 24.8) and sensbilidade definem a precisão dos
testes sorológicos individuais
• Reações de Neutralização (Figure 24.13) e
precipitação (Figure 24.14) são alguns
exemplos de testes de ligação de antígenos
que produzem resultados visíveis envolvendo
interações antígeno-anticorpo.
Agglutination
• testes de aglutinação direta são amplamente
utilizados para determinação dos tipos
sanguíneos (Figura 24.15).
• Uma série de testes de aglutinação passiva estão
disponíveis para a identificação de uma variedade de
agentes patogênicos e produtos relacionados com o
patógeno. Os testes de soroaglutinação são rápidos,
relativamente sensíveis, altamente específicos, de
simples execução e de baixo custo.
•Pérolas de latex-Proteína A liga Staphylococcus
aureus
•Nisseria gonorrheae, haemophilus influenzae , C
neoformans, C. albicans
Anticorpos Fluorescentes
• anticorpos fluorescentes são usadas para a
identificação rápida e precisa de patógenos e
outras substâncias antigênicas de amostras de
tecido e outros ambientes complexos.
•Ex. Bacillus anthracis- antrax pode ser usado
para diagnóstico com microscópio
fluorescente (esporos mandados por correio)
• Fluorescent antibody-based methods (Figure
24.18) can be used for identification, quantitative
enumeration, and sorting of a variety of cell types.
Immunoblot Procedures
• Immunoblot (Western blot) procedures
(Figure 24.27) are used to detect antibodies
to specific antigens or to detect the presence
of the antigens themselves.
1, soro controle positivo HIV
2, soro controle negativo (sadio)
3, soro paciente positivo forte
4, soro paciente positivo fraco
5, branco
Diagnóstico molecular
• Nucleic acid hybridization is a powerful laboratory tool used
to identify microorganisms (Figure 24.28).
• Para criar uma sonda de ácido nucléico, uma
determinada seqüência de ácido nucléico para
o microorganismo de interesse deve estar
disponível
• Talvez o uso mais difundido da tecnologia é
baseado na aplicação de amplificação gênica
(PCR). Vários métodos baseados em DNA são
actualmente utilizados em clínicas,
laboratórios de alimentos, e em pesquisa.
• Table 24.9 lists pathogens identified with nucleic
acid probe and PCR methods.
Sequenciamento de rRNA
• Maior avanço para classificar organismos
• Diferenças na sequencia de nucleotídeos é usada
para classificar procariontes.
• 16S rRNA
Actually look at the DNA that
• 23S rRNA
codes for the rRNA
How is this accomplished?
Extract DNA from a colony, or from
an environmental sample without
growing the organism.
PCR with primers for
rRNA sequences
Automated DNA
sequencer
Coefficient of Similarity
Bacteria phylogenetic relationships based on rRNA sequences