DRG IgE ELISA
Finalidade
Kit para a determinação quantitativa da concentração da Imunoglobulina E
(IgE) em amostras de soro.
Somente para uso diagnostico in vitro.
Armazenar a 2-8° C.
Introdução
Pacientes com doenças de alergia atopica como asma atópica, dermatite
atópica e febre do feno tem mostrado aumento nos níveis de IgE total no
sangue. IgE é também conhecido como anticorpo reagênico. Normalmente
níveis elevados de IgE indicam um aumento na probabilidade da
hipersensibilidade do IgE mediado, responsável pelas reações alérgicas.
Infestações parasitárias como ancilostomíase e certas desordens clinicas
incluindo aspergiloses, também tem demonstrado causa no aumento dos
níveis de IgE. Quedas nos níveis de IgE são encontradas em casos de
hipogamaglobulinemia, doenças auto-imune, colites ulcerativas, hepatite,
câncer e malaria. Níveis de IgE no sangue do cordão ou soro podem ter valor
prognostico na avaliação de risco na condição de futura alergia em crianças.
A concentração sérica de IgE em paciente é dependente em ambos da
extensão da reação alérgica e numero de diferentes alérgicos no qual o
paciente está sensibilizado. Indivíduos normais não alérgicos em
concentrações de IgE variam amplamente e cresce firmemente durante a
infância, mantendo o nível elevado até a idade de 15 a 20 anos e depois
permanecem constantes até os 60 anos quando eles declinam lentamente.
Princípio do Ensaio
O IgE Elisa está baseado num ensaio ELISA de fase sólida. O ensaio utiliza um
anticorpo monoclonal anti-IgE para fase sólida fixado na cavidade da
microplaca e outro anticorpo monoclonal anti-IgE de ovelha junto com solução
conjugada de enzima-anticorpo (enzima peroxidase). A amostra é adicionada
ao anticorpo IgE recoberto na microplaca e incubado com a solução tampão a
temperatura ambiente por 30 minutos. Se IgE está presente na amostra,
então combinará com o anticorpo da cavidade. A cavidade é então lavada
para remover qualquer amostra de teste residual e anticorpo IgE marcado
com a solução de conjugado enzimático é então adicionado. O conjugado se
ligará imunologicamente ao IgE na cavidade, resultando nas moléculas de IgE
sendo ligada entre a fase sólida e anticorpos da enzima ligada. Depois da
incubação a temperatura ambiente por 30 minutos, as cavidades são lavadas
para remover os anticorpos não ligados. A solução de TMB é adicionada e
incubada a temperatura ambiente por 20 minutos, resultando no
desenvolvimento de cor azul. A cor desenvolvida é estacionada com a adição
da Solução de Parada e a cor muda para amarela e é medida
espectrofotometricamente a 450 nm. A concentração de IgE é diretamente
proporcional a intensidade da cor na amostra teste.
Material e componentes
Material fornecido com o kit:
1) Anticorpo recobrindo as cavidades da microplaca com 96 testes
2) Reagente Enzima Conjugada (pronto para uso)........... 1 x 18 mL
3) Calibradores de IgE (pronto para uso)............ ..............6 x 0,5 mL
Concentrações: 0 – 10 – 50 – 100 – 400 – 800 UI/mL.
4) Solução Tampão (pronto para uso)............................... 1x 13 mL
4) Reagente de TMB (pronto para uso)............................. 1 x 11 mL
5) Solução de Parada (pronto para uso).............................1 x 11 mL
Material necessário, mas não fornecido:
Pipetas de precisão: 20 uL, 100 uL e 150 uL.
Água destilada
Ponteira de Pipetas descartáveis
Agitador Vortex ou equivalente
Papel absorvente
Leitora de microplaca com comprimento de onda de 450 nm ± 10 nm e faixa
de densidade óptica de dois desvios padrões
Papel gráfico.
Coleta de amostras e Preparo
O soro deve ser obtido a partir da amostra de sangue total obtido através de
técnicas adequadas de coleta. Este kit é para uso com amostras de soro sem
aditivos.
Armazenamento do kit e Equipamento
O kit fechado deve ser estocado entre 2-8°C até a recepção e a microplaca
deve ser mantida na embalagem com dissecante para minimizar a exposição à
umidade e formação de água.
Os kits abertos permanecem ativos ate dois meses se estocados entre 2-8°C.
Realizar a medida de absorbância com Leitora de Microplaca com comprimento
de onda de 450 nm ± 10 nm e faixa de densidade óptica de dois desvios
padrões.
Procedimento do Ensaio
1. Separar a quantidade de cavidades necessária no suporte das tiras.
2. Pipetar 20 uL de Calibradores, amostras e controles nas cavidades
marcadas.
3. Pipetar 100 uL de solução Tampão em cada cavidade.
4. Homogeneizar por 10 segundos. É muito importante ter completa
homogeneização nesse momento.
5. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente (18-25ºC)
6. Aspirar à mistura da incubação.
7. Lavar e aspirar as cavidades 5 vezes com água destilada ou deionizada.
8. Inverter as cavidades no papel absorvente para remover todas as gotas de
água.
9. Pipetar 150 uL do Reagente de Conjugado Enzimático em cada
cavidade. Homogeneizar por 10 segundos.
10. Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente (18-25ºC).
11. Inverter as cavidades no papel absorvente para remover todas as gotas de
água.
12. Lavar e aspirar as cavidades 5 vezes com água destilada ou deionizada.
13. Inverter as cavidades no papel absorvente para remover todas as gotas de
água.
14.Pipetar 100 uL do Reagente TMB em cada cavidade. Homogeneizar por 5
segundos.
15. Incubar a temperatura ambiente, no escuro, por 20 minutos.
16. Parar a reação adicionando 100 uL de Solução de Parada em cada
cavidade.
17. Homogeneizar por 30 segundos. É importante ter certeza da mudança da
cor azul para a cor amarela completamente.
18. Ler a densidade óptica a 450 nm com a Leitora de Microplaca dentro de 15
minutos.
Calculo dos Resultados.
1. Calcular a média do valor da absorbância para cada Calibrador, Controle e
amostras.
2. Construir uma curva padrão plotando a média da absorbância obtida de
cada Calibrador contra a Concentração em ng/mL em papel milimetrado, com
valor da absorbância na vertical ou eixo Y e concentração na horizontal ou eixo
X.
3. Usando o valor médio da absorbância de cada amostra, determinar a
concentração correspondente de Ferritina em ng/mL na curva padrão.
Exemplo de curva padrão.
Resultados de uma corrida padrão típica com leitura de densidade ótica a 450
nm mostrada no eixo Y contra concentração de HGH mostrada no eixo X. Esta
curva é somente com o propósito ilustrativo e não deve ser usada no calculo
de amostras desconhecidas. Todo o usuário deve obter sua própria curva
padrão e dados do paciente em cada experimento.
Concentração de IgE (UI/ml)
Absorbância (450 nm)
0
0.058
10
0.167
50
0.538
100
400
800
0.950
2.135
2.748
Valores Esperados e Sensibilidade
O nível da imunoglobulina total E em adultos normais, alergia-livres é menor que
150 IU/mL no soro. A variação em concentrações totais de IgE pode ser esperada
em determinados grupos de idade e em circunstâncias clínicas, como descrito
momentaneamente na “introdução” acima. Cada laboratório deve estabelecer
suas próprias escalas normais baseadas na população paciente nas áreas
geográficas. Estes valores têm o significado clínico somente depois que um
número estatìstica significativo de ensaios foi executado durante um período
apropriado de tempo. A literatura disponível fornece a imunoglobulina total
relativa a E da seguinte informação no soro humano
População geográfica normal
Escala Normal: Idade (anos)
0-3
3-4
4-7
4-14
15 +
39 IU/mL IgE
IgE (IU/mL)
< 10
< 25
< 50
< 100
< 150
Limitações do Procedimento
•
Reprodutibilidade dos resultados foi obtida quando o ensaio foi
realizado seguindo completamente as instruções contidas no kit e de
acordo com as boas praticas de laboratório.
•
O procedimento de lavagem é critico. Lavagem insuficiente poderá
resultar em falha na precisão e elevar falsamente a leitura de
absorbância.
•
Amostras com forte lipemia, hemólise ou amostra turva não devem
ser usadas nesse ensaio.
•
Os resultados obtidos com o uso desse kit devem ser usados somente
como adjuvantes para outros procedimentos diagnósticos e como
auxiliar na conduta médica.
Bibliografia
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Zetterstrom and Hohansson S.G.O. Allergy 1981; 36:537.
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4.
Ishizaka T. Ann allergy 1982; 48: 313.
5.
Kulczyski A. Jr. J. Allergy Clin. Immunol. 1981; 68:5.
Produzido por:
DRG Instruments GmbH
Frauenbergstr. 18
D-35039 Marburg
Importado e Distribuido por:
RZ DE OLIVEIRA DIAGNÓSTICA
Rua Apinajés, 1694 (antigo Dr. Paulo Vieira, 91)
CEP.01258-000 - Pompéia - São Paulo - SP
CNPJ 05.328.040/0001-80
Técn. Resp. Dra. Renata Zuculin de Oliveira - CRF-SP 37986
Para uso exclusivo diagnóstico "in vitro"
Reg. ANVISA 80313040065
POTENCIALMENTE INFECTANTE
CONSERVAR A TEMPERATURA 2°C A 8°C
PARA DESCARTE, CONSULTAR INSTRUÇÕES DE USO
SERVIÇO DE ATENDIMENTO AO CLIENTE: Quaisquer dúvidas técnicas no
manuseio deste kit ou no seu procedimento, contatar a nossa ASSESSORIA
CIENTÍFICA.
Atendimento ao consumidor – Fone (011) 3871-0095