Métodos para detecção de
alérgenos em alimentos
Gerlinde Teixeira
Departamento de Imunobiologia
Universidade Federal Fluminense
Antigenos vs Alérgenos

Antigeno
– Imunógeno

Qualquer substância capaz de estimular
linfócitos
– Proteinas, lipoproteinas, glicoproteinas,
– Hapteno

Qualquer substância capaz de estimular
linfócitos desde que acoplado a uma proteina
– Moléculas pequenas como os corantes
Antigenos vs Alérgenos

Alergeno
– Qualquer substancia que leva a reações
adversas sejam mediadas por
Linfócitos B – produção de IgE ou IgG
 Linfócitos T – produção de citocinas de padrão

– Th1 - Inf, Il-1, Il-2, TNF
– Th2 - Il-4, Il-5, Il-6, Il-10,
Resposta a antígenos
alimentares
Tolerância oral
Proteína
alimentar
Via oral
 Anticorpos sistêmicos
 Células B e T
sistêmicas
 Resposta local – Th3
Imunização
sistêmica
 Anticorpos sistêmicos
 Células B e T sistêmicas
 Resposta local – Th1 / Th2
Classificação dos Alérgenos
alimentares

Crustáceos

– Lagosta
– Camarão
– Siri




–
–
–
–
Moluscos
– Mexilhões
– lulas
Peixes
Clara de ovo
Leite
Sementes





Gergelim
Girassol
Sementes de algodão
Mostarda
Nozes
Amendoim
Morango
Legumes
Trigo
Reações adversas a alimentos

Os sinais e sintomas consequentes a
uma variedade de reações
fisiopatologicas que podem ser
mediadas por mecanismos
– Imunológicos
– Não imunológicos
Mecanismos envolvidos nas
alergias alimentares

Mediados por IgE
– Reações anafiláticas leves ao choque

Mediadas por IgG e seus subtipos
–
–
–
–

Reações anafiláticas leves ao choque
Diarreia
Inflamação intestinal crônica
Dermatite herpetiforme
IgA
– Insuficiência renal
Estrutura da Imunoglobulina
As cinco classes de Ig

O que determna
– a classe são as regiões FC
– a especificidade a região Fab

É possivel ter uma especificidade com as 5 classes
As formas poliméricas
IgA
IgM
Propriedades das Ig’s
humanas
Classe de cadeia H
Subclasse de cadeia H
IgG
IgA
IgM
IgD
IgE


m
d
e
1 a 4 1, 2
kel
kel
kel
Fixação do complemento
+
0
++++
0
0
Meia vida sérica (dias)
23
6
5
3
2
Transferência Placentária
+
0
0
0
0
Lise bacteriana
+
+
+++
?
?
Atividade anti-viral
+
+++
+
?
?
Tipo de cadeia L
kel kel
Propriedades das IgG’s
humanas
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Abundancia (% de IgG total)
70
20
06
04
Meia vida no soro
23
23
7
23
+++
+
+++ +++
Fixação de complemento
+
+
+++
-
Ligação a Receptores FC
+++
-
+++
+
Passagem placentária
Idiotipo
Hipersensibilidade Tipo I
Hipersensibilidade imediata
mediada por IgE e IgG1
Mecanismo de ação


Estimulo antigênico com proteínas heterólogas
Ativação de Linfócitos Th2
– produção de Il4, Il5, Il6

Mudança de isotipo para IgE
– Ocupação dos rFc de alta afinidade dos mastócitos
Ativação de Mastócitos




Novo estimulo
antigênico
Ligação do antígeno
à IgE
Degranulação dos
mastócitos
Inflamação
Patologia Humana, Robbins
Hipersensibilidade Tipo III
Hipersensibilidade mediata
mediada por imunocomplexos de IgG
Mecanismos de ação

As lesões teciduais
– IgG ativa inúmeros mediadores séricos, em
especial o sistema complemento


Os complexos se formam predominantemente
na circulação
Lesão
– deposito nas paredes dos vasos sanguíneos da
microcirculação principalmente em estruturas de
filtragem, como o glomérulo renal, articulação, etc
Formação do imunocomplexo


Só se formam na
presença de antígenos
com múltiplos epitopos
(>2)
Quando moléculas de
antígenos solúveis e
anticorpos estão
presentes numa relação
molar apropriada, podem
unir-se umas às outras
formando uma rede
multimolecular.
Hipersensibilidade Tipo IV
Hipersensibilidade tardia
mediada por células
Mecanismos de ação

Mediada por células,
– linfócitos T
– macrófagos ativados
– Citocinas Il 1, Il 2, TNF, INF
Dietas de exclusão

Um dos princiapis tratamentos para as
alergias alimentares
– Pode ter como consequencia
as deficiencias alimentares
 Dificuldade para os cuidadores de pacientes
alergicos
 Dificuldade de integração de algumas crianças
às atividades sociais que envolvem a
alimentação

Alérgenos

Como a reação a alergenos é
potencialmente severa se faz necessário
regulamentações de seu controle.
– Rotulagem - alerta da presença dos
principais alergenos principal meio de
previnir

como ocorre para o gluten
Métodos para detecção de
antígenos alimentares

Através de anticorpos
– Anticorpos de pacientes alergicos
– Produção de anticorpos policlonais
– Produção de anticorpos monoclonais

Purificação de proteínas
- Precipitação
– Colunas de purificação
Análise de alimentos baseado
em IgE humana



Por colunas de afinidade
Testes de ELISA
Radio imunoensaio
Immunoblotting


Reagentes utilizando anticorpos Monoespecificos
Imunoblotting com antígenos
Produção de anticorpos
policlonais

Obtida a fração antigenica imunizar o animal
com >100 mg de antígeno associado a um
adjuvante
Primária
dia o
Ag +
adjuvante
sangria
14
Secundária
21
Ag
sangria
28
Produção
de Ac
monoclonais
Esquema da técnica do ELISA
Cobertura da
placa com cada
fração
Incubação com
soro imune
Lavar a placa 2x
Incubar com ptn
não relacionada
Lavar a placa 6x
Incubação Ac
marcado com
enzima
interromper com
H2SO4
Incubação com
substrato cromógeno
Lavar a placa 2x
Lavar a placa 6x
Ler a
490nm
Resultados


Baixa reatividade no ELISA
Razões para isto
adesividade baixa
das frações
proteicas ao
plástico
baixa
antigenicidade
a diminuição de reação AgAC
menos Ac marcado
menor atividade ezimática
menos cor
ELISA DE CAPTURA


Sensibilidade aumentada
Permite a quantificação
Ac anti X
Ptn inespecífica +
Ag a ser testado
Finalização da reação
com Ac marcado
Ac anti X de
outro animal
Imunoblot
– Preparar o extrato proteico
– Correr um gel de poliacrilamida
– Transferir para nitrocelulose
– Reação imunologica semelhante ao ELISA
– Leitura da absorbancia para determinação
da intensidade de reação.
Polymerase chain reaction (PCR)

Vantagem
– a alta afinidade

Desvantagens
– Preço
– Determinação das sequencias de iniciação
Antígenos sequenciados





Mais de 600
Espécie
Nome vulgar
Allergeno
Número de aminoácidos