Anais da XI Jornada de Iniciação Científica da UFRRJ
Um método rápido para determinação de nitrato em alface
Felipe Rebuzzi dos Santos1, Ana Lúcia da Rocha Nobre2* & Leila Martins da Costa Quinteiro3
1. Bolsista de Iniciação Científica PIBIC-UFRRJ, 2000; 2. Profª. Orientadora; 3. Profª. Colaboradora.
Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. CEP 23890000, Seropédica, RJ, Brasil. *[email protected]
Palavras-chave: nitrate; nitrite; cadmium; lettuce.
Abstract
related with its efficiency and, after necessary
modifications, to apply it in lettuce samples.
Nitrate happens naturally in waters and in several
foods, being sometimes used in combination with
nitrite to conserve meats and their derivatives.
Among non-processed foods, some vegetables such
as spinach, lettuce and beet have large
concentrations of nitrate. Depending on the amount
ingested,
nitrates
can
promote
the
methaehemoglobinaemia in children, an illness that
decreases the capacity of the blood to transport
oxygen. Nitrite can react with the amines present in
the food forming nitrosamines, one of the most potent
carcinogenic discovered until now. Liquid
chromatography can be used in the determination of
nitrate. In spite of being one of the most modern
methods, its use is limited because requests high
cost equipment and specialized technical
manipulation. In systems that contain relatively high
amounts of nitrate, however, more classical methods,
such as the colorimetric method, can be employed.
In fact, colorimetric methods are preferred due to
their satisfactory results. Among those, the most
applied method includes the formation of an azoderived through the reaction of nitrite (NO2-) with
aromatic compounds, and reading of its absorbance
at 522 nm. The reduction of nitrate (NO3-) to NO2- is
performed by the cadmium (Cd) packed in a glass
column, where the sample is passed through. The
amount of NO3- is determined through the difference
between the amount of total and partial NO2-. Such
method would be simpler, faster and more efficient if
the reduction stage in the column did not demand
special care in its packing (to obtain an appropriate
reproducibility) neither constant surveillance during
the flow of the sample through the column. This fact
becomes worse and onerous when there is a need of
using several columns (what frequently happens
when there are large analysis volumes). The objective
of this work is to alter some procedures related to
the stage of reduction of the conventional method
and to study some factors and parameters that are
Introdução
Nitrato e nitrito encontram-se amplamente
distribuídos no meio ambiente devido ao ciclo do
nitrogênio e às atividades industriais e agrícolas.
Entre os alimentos não processados, algumas
hortaliças, como o espinafre e a alface, e legumes
(p. ex. beterraba) possuem altos teores de nitrato.
Este pode ser reduzido a nitrito no alimento
(PHILLIPS, 1968), na saliva e no estômago de
adultos. Em crianças, devido à pouca ou nehuma
acidez do estômago, o nitrato ingerido em grandes
quantidades pode se acumular, reagir com a
hemoglobina e provocar a metahemoglobinemia, que
faz reduzir a quantidade de oxigênio transportadada
pelo sangue, além de levar à formação de
nitrosaminas, um dos mais terríveis grupos
carcinogênicos (LYONS, 1994). Por esta razão, o
Comitê Científico para Alimentos da Comissão
Européia considerou as implicações para saúde
humana do nitrato em alimentos em 1995 e
determinou uma Ingestão Diária Aceitável de 3,65
mg NO-3/kg de peso corporal (equivalente a 219 mg/
dia para uma pessoa de 60 kg) (MAFF, 1998). Os
métodos analíticos mais modernos para
determinação de nitrato envolvem análise por
cromatografia líquida, que requer um equipamento
de alto custo, além de manuseio técnico
especializado. Sabe-se, entretanto, que em matrizes
com alto teor deste analito, os métodos que utilizam
a colorimetria produzem resultados satisfatórios. O
método clássico, usado para determinação de nitrato,
envolve a determinação colorimétrica do NO2-, sob
a forma de um composto colorido, antes e após a
redução do nitrato (NICHOLAS & FOX, 1973). A
redução é feita por cádmio empacotado em uma
coluna de vidro, onde a amostra, contendo nitrato, é
percolada (FOLLETT & RATCLIFF, 1963). Pela
295
v. 11, n. 2, p. 295-298, 2001
Anais da XI Jornada de Iniciação Científica da UFRRJ
diferença entre NO2- total e parcial, tem-se NO3-. Este
método entretanto, é trabalhoso, requer cuidados no
empacotamento da coluna para uma reprodutibilidade adequada e necessita que o operador
observe o material percolar através da mesma além
do aumento de custo, quando ocorre a necessidade
do uso de várias colunas. O objetivo deste trabalho
foi modificar alguns procedimentos pertinentes às
etapas do método clássico e com isto eliminar, ou
pelo menos minimizar, as desvantagens. A avaliação
do teor de nitrato em amostras de alface foi realizada
aplicando-se o método modificado.
adequada, pH ideal do meio para a redução e Tempo
de reação entre NO3- e Cd, com e sem agitação.
d) Estudo da modificação da 2a etapa (produção
do composto colorido e de sua absorção): foi
feito com soluções padrão de NO3-. Neste item foram
estudados os seguintes parâmetros: Concentração
dos reagentes responsáveis pelo desenvolvimento
de cor; Ordem de adição dos reagentes de cor;
Determinação do pH da solução colorida (o método
convencional não menciona); Seleção do
comprimento de onda.
e) Avaliação do método modificado: foi realizada
através dos seguintes parâmetros: Reprodutibilidade;
Faixa de concentração de trabalho de NaNO 3;
Recuperação em padrão em amostras de alface;
Curva analítica de NaNO2; Limite de detecção.
Material e Métodos
a) Determinação de nitrato pelo método
Convencional (NICHOLAS & FOX, 1973;
FOLLETT & RATCLIFF, 1963): foi feito com base
na redução do NO 3- a NO2- e formação de um azocomposto róseo e sua determinação colorimétrica a
525 nm. Esse composto é formado pela reação do
NO 2 - com o ácido sulfanílico (ASUL) e o a–
naftilamina (a-NAF). A redução do NO3- (em
solução aquosa com pH = 9,6 - 9,7) é feita através
de sua percolação numa coluna de vidro empacotada
com cádmio.
f) Amostras: 85 amostras de alfaces (obtidas no
comércio da cidade de Seropédica – RJ) foram
analisadas quanto ao teor de nitrato conforme o
método modificado.
g) Extração: para extração de NO2- e NO-3 da
amostra, dois métodos indicados na literatura
(LYONS, 1991 & RATH, 1994). foram estudados. Os
métodos não foram significantemente diferentes a
um nível de confiança de 95%. Desse modo, adotouse o método que apresentou menor coeficiente de
variação e maior facilidade operacional, como se
segue: 5,00g de amostras de alface foram colocados
em 150 mL de água destilada em ebulição por 1
hora (LYONS, 1991). O volume completado a 250,00
mL.
b) Determinação de nitrato pelo método
Modificado: O procedimento modificado, dividido
em duas etapas, foi feito como se segue:
1a Etapa - redução do NO3-: em bécher de 250mL
foram colocados 3g de Cd em grânulos, peneirados
em 20 mesh, sendo esse o leito de redução. Em
seguida, 20,00 mL de uma solução padrão de NaNO3
5 mg/L, tamponada a pH = 9,5, foi colocada em
contato com o leito de redução por 12 horas (ao invés
de ser percolado numa coluna de Cd).
Resultados e Discussão
A partir do estudo de cada uma das duas etapas,
verificou-se que vários parâmetros podem ser
modificados para a efetividade do método, tais como:
2a Etapa - produção do composto colorido e
leitura de sua absorção: em uma alíquota de 10,00
mL da solução reduzida acima foram adicionados 6
mL de ASUL 0,104%p/v e deixados em repouso por
30 minutos no escuro. Foram adicionados 6 mL de
a-NAF 0,092%p/v e o pH acertado entre 2,2 e 2,4. A
absorvância foi medida em um comprimento de onda
de 522 nm.
(1) Parâmetros relacionados com a etapa da
redução (estudados com padrões de nitrato):
a) Empacotamento do Cádmio (método
convencional): usando-se Cd, granulado ou
esponjoso, repetidas vezes, verificou-se que a coluna
rapidamente perdeu sua eficiência e que seu reempacotamento homogêneo (difícil, lento e
trabalhoso) nem sempre era conseguido, sendo uma
das fontes de erro do método convencional.
c) Estudo da modificação da 1a etapa (redução):
para a otimização e o estabelecimento dos
procedimentos de redução descritos acima, foram
estudados os seguintes parâmetros: Massa de Cd
296
Anais da XI Jornada de Iniciação Científica da UFRRJ
b) pH de redução: através do método convencional
verificou-se que o pH ideal do meio reacional está
entre 9,6 e 9,7.
(3) Avaliação do método modificado:
a) Reprodutibilidade: Aplicando-se todos os
procedimentos acima pré-estabelecidos em 10
alíquotas de soluções padrão de NaNO3 5 mg/L
obteve-se uma excelente reprodutibilidade dos
resultados com um coeficiente de variação (CV) de
7,2%.
c) Massa de Cd para o leito de redução (método
modificado): a idéia de se colocar o Cd em bécher
para a redução dos nitratos foi desenvolvida devido
aos problemas ocorridos com a coluna e já
mencionados anteriormente. Testando-se
quantidades de 3 a 12g de Cd, obteve-se resultados
idênticos (com NaNO3 a 6 mg/L no máximo). A
quantidade menor foi a adotada.
b) Recuperação: com soluções padrão de NaNO3
(de 1 a 6 mg/L): obteve-se uma recuperação média
de 113% com CV = 13,2%, considerada aceitável
para o nível de concentração estudado (mg/L)
(HORWITZ, 1982). A recuperação média obtida com
as amostras foi de 105,5%, com CV = 6,90% (duas
amostras de alface, 5,00g de cada, foram fortificadas,
em duplicata, produzindo um N = 10, com
quantidades de 0,125g até 0,650g de NaNO3). Na
Tabela 1 os resultados parciais podem ser
observados com mais detalhes.
d) Tempo de reação entre NO 3 - e Cd, com
agitação: um período de 1 a 5 min foi insuficiente
para a reação se completar e, em tempos maiores,
a solução turvou (Cd desagregando-se).
Sem agitação: com 12h de contato, a reação atingiu
o equilíbrio. Assim, várias amostras podem ser
tratadas deixando-as reagir com o leito de Cd, de
um dia para o outro, sem a necessidade de vigilância.
c) Faixa de concentração para leitura no
espectrofotômetro: NaNO3 em concentrações entre
25 e 130 mg/kg, produz sinais analíticos na faixa de
0,20 a 0,80 de absorvância.
(2) Parâmetros referentes à etapa de produção
do composto colorido:
a) Concentração dos reagentes de cor: os
resultados indicaram as seguintes concentrações
0,092% e 0,104 % p/v para o a-NAF e o ASUL
respectivamente.
d) Curva analítica de NaNO2: na Figura 1, pode-se
observar as curvas padrão de NaNO2 , com oito
pontos. Tais curvas apresentaram excelentes
reprodutibilidades e correlação média de 0,9995. O
limite de detecção (L.D.) de 6,5 x 10-3 mg/L em
NaNO2 foi obtido através do coeficiente angular (b)
da curva padrão média (Y = 0,018 + 0,54X ) e desvio
padrão do branco (s) a partir da expressão: L.D. = 3
s/b.
b) Sequência na adição dos reagentes de cor (e
repouso de meia hora no escuro, para evolução
da cor rósea): Foram estudadas três seqüências de
adição: 1a: NO2- + ASUL + repouso + a-NAF; 2a:
NO2- + a-NAF + repouso + ASUL e 3a: NO2- + ASUL
+ a-NAF + repouso. A primeira foi a que produziu
maior sinal analítico, tal como concluíram
NICHOLAS & FOX, 1973. Esse estudo mostrou
que se o a-NAF for adicionado antes do ASUL o
azo-composto será produzido com menor
rendimento. Tal fato foi demonstrado pela menor
intensidade da cor rósea produzida.
r = 0,9996 Y = 0,029 + 0,54X
r = 0,9995 Y = 0,015 + 0,54X
r = 0,9993 Y = 0,010 + 0,54X
0,40
0,35
Absorvância
0,30
c) Comprimento de onda: verificou-se que em
522nm a absorvância atingiu um valor máximo
(525nm para NICHOLAS & FOX, 1973).
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
d) Valor do pH da solução colorida (não indicado
na literatura): após variações, observou-se um
máximo de absorção em uma faixa de pH de 2,2 a
2,4, onde a estabilização do azo-composto colorido
é máxima.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
[NaNO2] (mg/L)
Figura 1. Curvas de calibração de NaNO2.
297
v. 11, n. 2, p. 295-298, 2001
Anais da XI Jornada de Iniciação Científica da UFRRJ
(4) Aplicação do método modificado em amostras
de alface. A Tabela 2 apresenta a faixa de
concentração de NaNO3 encontrada em 85 amostras
de alface, sendo a média 1567 ± 190,6 mg/kg, em
NaNO3 com CV= 12,2%. Os resultados obtidos pelo
MAFF, 1999. em 105 amostras de alface analisadas
entre julho e novembro de 1998 no Reino Unido,
mostraram uma faixa de 76 a 4543 mg/kg de nitrato,
o que equivale a 104 a 6228 mg/kg de NaNO3.
Tabela 2 - Faixas de concentração de NaNO 3
encontradas nas 85 amostras de alface.
Faixa de
concentração de
NaNO3 (mg/kg)
encontrada
1200 – 1225
1250 – 1275
1300 – 1325
1350 – 1375
1400 – 1425
1450 – 1475
1500 – 1525
1550 – 1575
1600 – 1625
1650 – 1675
1700 – 1725
1750 – 1775
1800 – 1825
Conclusões
Através desse estudo verificou-se que o método
modificado é adequado para determinação de
nitratos, sendo simples, rápido, preciso e
reprodutível. Aplicando-o nas amostras de alfaces
constatou-se a presença de NO3- em concentrações
de 1567 ± 190,6 mg/kg, em NaNO3 com C.V.= 12,2%.
Esse método já está sendo testado em outras
hortaliças e legumes com excelentes resultados.
01
02
NaNO3
Adicionado
(g)
NaNO3
Total
(T) (g)
NaNO3
Obtido
(Ob) (g)
R (%) =
Ob/T x
100
0
0,125
0,250
0,375
0,500
0,750
0
0,125
0,250
0,375
0,500
0,750
0,375
0,500
0,625
0,750
0,875
1,125
0,300
0,425
0,550
0,675
0,800
1,050
-----0,423
0,567
0,703
0,953
1,088
----0,428
0,564
0,716
0,958
1,095
-----84,60
90,72
93,73
108,9
96,71
-----100,7
102,5
106,1
119,8
104,3
% de
amostras
por faixa
2
6
6
1
9
9
0
6
3
11
10
10
12
2,35
7,06
7,08
1,18
10,6
10,6
0,00
7,08
3,52
12,9
11,8
11,8
14,0
Agradecimentos e Auxílio Financeiro
PIBIC/CNPq/UFRRJ.
Tabela 1 – Resultados das recuperações feitas nas
amostras de alface.
Amostra
de
alface
Quantidade de
amostras por
faixa
Referências Bibliográficas
FOLLETT, M.J. & RATCLIFF, P.W., J. Sci. Fd. Agric.,
14: 138, 1963.
HORWITZ, W., Anal. Chem., 54(1): 67A, 1982.
LYONS, D.I., et alii, Analyst, 116: 153, 1991.
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MAFF, Ministério da Agricultura, Pesca e Alimentos
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PHILLIPS, W.E.J., J. Agric. Food Chem., 16:85,
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RATH, S. et alii, Rev. Inst. Adolfo Lutz, 54: 126, 1994.
298