Expressão em células de mamíferos de anticorpo
sintético de cadeia única selecionado por interação
com p53 murina.
Malta, F.S.V.#; Ortega, J.M.; Nery, F.C. e Rodriguez, M.B.
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O sistema do duplo-híbrido foi usado para triar anticorpos
sintéticos de cadeia única (SScFv) que interagissem com a porção Cterminal de p53 murino (aa. 72-390), numa triagem já realizada
foram selecionados três anticorpos anti-p53 (Figura1). No atual
trabalho, pretendemos caracterizar tais anticorpos para uma
possível utilização no diagnóstico do câncer. Um alinhamento de
proteína realizado entre p53 murina e p53 humana revelou 84% de
identidade e 88% de similaridade (Figura2).
Figura1: Híbrido1(BD+Isca-p53) e Híbrido2 (SScFv+AD) interagindo e
ativando a transcrição do gene repórter.
Figura2: Alinhamento protéico de p53 murina (gi 200205) e p53 humana (gi 35210).
Para tanto, fusionamos estes minianticorpos na proteína verde
fluorescente (EGFP) para observar o comportamento desses
minianticorpos quando utilizados para transfectar células de
mamíferos (Figuras 3 e 4).
Figura4: Fibroblasto de camundongo (3T3) transfectada com: A- pEGFP-C
(controle) c/ carenciamento de soro 0,2%; B- pEGFP-C (controle) s/
carenciamento de soro 10%; C- Controle; D- Controle s/ filtro; E- pEGFP-C915 s/ carenciamento de soro 10%; e F- pEGFP-C9-15 s/ carenciamento e s/
filtro.
CONCLUSÃO
Figura3: Célula de ovário de Hamster (CHO) transfectada com: A- pEGFP-C (controle);
B- pEGFP-C9-15 (células mortas); C- pEGFP-C16-19 (células mortas); e D- pEGFPC16-19 (uma única célula viva com fluorescência predominante no núcleo).
Concluímos que os anticorpos são letais para a
célula, ainda não sabemos se a morte ocorre via
apoptose, em algumas células transfectadas é possível
ver o núcleo mais fluorescente, fortalecendo a hipótese
de ligação `a p53 in vivo. Os resultados obtidos com as
células WISH (não mostrados) confirmam que os
anticorpos são letais, novos experimentos de
transfecção utilizando estas células e também células
HeLa serão realizados.