Diagnóstico Molecular da
Tuberculose
Profa Dra. Cristiane Cunha Frota
Complexo M. tuberculosis (MTB) evolução
Brosch et al., PNAS, 2002
Complexo MTB (10 espécies)
• Patógenos associados ao Homem:
– M. tuberculosis e M. africanum (de Jong BC, et al, PLoS Negl Trop
Dis. 2010); M. canettii e TB bacilo liso (“smooth TB
bacilli - STB”) (Gutierrez MC, et al,PLoS Pathog. 2005).
• Com amplitude de hospedeiros:
– M. bovis, M. microti, M. caprae, M. orygis, e M.
pinnipedii (Brosch R, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; Huard RC, et al., J
Bacteriol. 2006; van Ingen J, et al., Emerg Infect Dis. 2012) e “Chimpanzee
Bacillus” (Coscolla M, et al., Emerging Infectious Diseases. 2013).
Posição filogenética do complexo MTB
Supply et al., Nat Genet. 2013
Cepa Padrão
• Mycobacterium tuberculosis H37Rv
– 1905 - 1o isolamento
• patogênica e usada como referência.
– 1998:
• genoma completa anotado e publicado.
O genoma do M. tuberculosis
•Banco de dados: TubercuList
http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/
• 4,4 Mbp
• ~4 000 genes
• rico em sequencias de
inserção (IS)
• 65,6% G+C
• Proteinas ricas em Prolina e
àc. Glutâmico: PE e PEGRS
Classificação geral de Função Metabólica
dos genes de M. tuberculosis
Classe
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Função
Metabolismo de lipidios
Síntese proteica
Processos celulares e parede celular
RNAs
Inserções Sequenciais e fagos
Proteinas PE e PPE
Metabolismo Intermediário e
respiração
Função desconhecida
Proteinas regulatórias
Conservação hipotética
Virulência, detoxificação e adaptação
No genes
233
207
708
50
149
170
894
% total
5,7
5,2
13
1,3
3,4
4,2
22
272
189
1051
99
15,3
4,7
22,9
2,3
Diagnóstico
inovador da tuberculose
Objetivo:
Identificar a presença de DNA ou RNA do gênero
Mycobacterium em uma amostra biológica do
paciente.
Esta identificação deve ser:
- Rápida
- Discriminatória da espécie
- Sensível
- De fácil interpretação
- Específica
- Reprodutível
9
Diagnóstico Molecular da Tuberculose
Sequências-alvo do genoma:
16S rRNA
Mycobacterium sp.
IS6110
complexo M. tuberculosis
16S-23S rRNA
espécies de Mycobacterium
rpoB
Análise de deleção genômica
espécies do complexo M. tuberculosis
10
Sequencia genética de escolha
Vantagens:
- específica para o complexo MTB
- 10 a 20 copias em M. tb e M. microti
- 1 cópia em M. bovis
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DA TUBERCULOSE
• In-house
• Comercializados
12
Baseados em PCR (reação em cadeia
da polimerase)
•
•
•
•
•
•
PCR convencional
PCR nested
PCR multiplex
PCR em tempo Real
PCR hibridização
LAMP
PCR convencional
PCR convencional
PCR nested
PCR nested
PCR multiplex
PCR multiplex
Primers:
 M. tuberculosis 65KDa,
 dnaJ
 IS6110
Real Time PCR ou RT-PCR (PCR em Tempo Real)
Leitura do RT-PCR
↑ [DNA]
↓ [DNA]
PCR em Tempo Real
Kumar et al., Journal of Infection. 2014
PCR seguido de hibridização
Vantagens:
-especificidade e sensibilidade
-Diferenciação de espécies
Principio:
-Usa uma sonda (probe) de
nucleotídeos fixados a uma membrana
- revelação por quimioluminescencia
PCR - hibridização
PCR - hibridização
Loop AMP- LAMP
(Ensaio amplificado em alça por enzima isotérmica)
• Identifica 109 copias de DNA em < 1 hora
• Bst polimerase – 60-65oC
• A estrutura é formada 3x em cada metade de ciclo
Iniciadores internos e
externos (6 primers)
Foward – F
Backward - B
World Health Organization. The use of a commercial loop mediated isothermal amplification
assay (TB-LAMP) for the detection of tuberculosis. 2013. WHO/HTM/TB/2013.05. Geneva,
Retrieved from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/83142/1/WHO_HTM_TB_2013.05_eng.pdf.
LAMP (Loop – ensaio amplificado por
enzima isotérmica)
Região primers –
esat6
LAMP- leitura visual
adição de SyberGreen (100x)
Diagnóstico Molecular
• Comercializados
• Material com Baciloscopia positiva:
– Sensibilidade >95%, especificidade 100%
• Material com Baciloscopia negativa:
– Sensibilidade >83%, especificidade 99%
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Testes Comerciais:
• Amplificação de Ácidos Nucleicos
seguido de hibridização
 Roche’s COBAS Amplicor (PCR
hibridização) – DNA
 GenProbe’s Amplified M.
tuberculosis Direct test (AMTD) rRNA
 BD’s ProbeTec-ET
 Geno-type MTBDR plus
assay(GTMD) – Hain Lifescience)
 INNO-LiPA Rif. TB
Testes Comerciais:
• PCR em Tempo Real
COBAS TaqMan MTB test
Cepheid´s Xpert MTB/RIF
Obrigada!!!