ESTUDO DA PRODUÇÃO DE RESVERATROL A PARTIR DE
Botrytis cinerea EM UVAS MERLOT DE SANTA CATARINA
Programa Unisul de Iniciação Científica - PUIC
Autora: Ariane Lumertz Francisco - Orientadora: Dra. Denise Moritz – Programa Unisul de Iniciação Científica (PUIC) - Curso:
Farmácia - Campos: Tubarão
A busca de compostos com atividades terapêuticas benéficas vem sido intensificada, impulsionando pesquisas por novas
substâncias capazes de satisfazer tais necessidades, levando à identificação de novos fármacos que possam ser empregados em
diversos tipos tratamentos. Dentro deste contexto a molécula de resveratrol obtém um grande enfoque, possuindo diversas ações
bioquímica e fisiológicas tendo um amplo espectro de benefícios à saúde. (AGGARWALL; SHISHODIA; AGGARWAL, 2006).
O resveratrol é um composto fenólico pertencente à classe dos estilbenos. Está presente em diversas fontes da dieta humana,
tais como frutas, vegetais, chás e vinhos. As uvas são consideradas uma das maiores fontes quando comparadas a outras frutas e
vegetais.
Sabe-se que a produção de resveratrol é estimulada em maior concentração nas variedades de Vitis vinifera das uvas por
ataque de fungos (Botrytis cinérea), sendo considerado um marcador bioquímico para a resistência a Botrytis cinérea, por stress e por
radiação ultravioleta. Assim, a produção do resveratrol nas plantas pode ser considerada parte do mecanismo de defesa. (ARSEGO,
2004).
Uma série de trabalhos vem sendo realizados buscando desenvolver métodos que permitam otimizar sua obtenção de maneira
natural (engenharia genética) ou sintética. Isso faz com que um possível medicamento produzido com resveratrol possa ser barato e,
portanto, acessível às populações menos favorecidas. De fato, esta abordagem já é uma realidade em países do primeiro mundo, onde
o resveratrol é comercializado sob a forma de comprimidos como antioxidante e complemento alimentar (NICHOLSON, et al., 1995).
Desta forma, tornam-se promissores novos campos de pesquisa no desenvolvimento desta molécula para o tratamento e a prevenção
de várias doenças, aumentando assim a expectativa de vida humana.
Cabe aqui ressaltar que trata-se de um trabalho inovador, pois ainda não havia nesta universidade (UNISUL) estudos com o
resveratrol, principalmente sua quantificação em cromatografia gasosa, revelando resultados surpreendentes e contradizendo
relevantes referências bibliográficas, apresentando deste modo novos e promissos caminhos de pesquisa desta surpreendente
molécula.
O foco principal deste trabalho foi estudar a produção de trans-resveratrol por indução de uma linhagem selvagem de Botrytis
cinerea em cultivo submerso utilizando a uva ou partes dela (casca, semente ou polpa). O controle microbiológico destes ensaios
também foram investigados.
2.1 Objetivo Geral
- Estudar a produção de resveratrol por indução de estresse em uvas Merlot colhidas de vinícolas
catarinenses do Planalto Catarinense.
2.2 Objetivos Específicos
- Quantificação do resveratrol através de análises de cromatografia gasosa em uvas sãs e suas partes
isoladas (casca, polpa e semente), da variedade Merlot do Planalto Catarinense.
- Quantificação do resveratrol através de análises de cromatografia gasosa em uvas, e suas partes
isoladas (casca, polpa e semente), da variedade Merlot do Planalto Catarinense após inoculação do fungo
Botrytis cinerea.
As amostras em estudo foram uvas da
variedade Vitis vinifera “Merlot”
Amostragem e detecção de trans-resveratrol
Figura 4 - evolução do trans-resveratrol por cromatografia
gasosa na casca das uvas, polpa e semente de sem a
inoculação com o fungo Botrytis cinerea (Figura 4b, 4c e
4d, respectivamente) em comparação com a curva padrão
de resveratrol (Sigma – Aldrich) (Figura 4a).
1– Coleta, armazenamento e transporte.
Figura e: incubação em shaker
orbital por 15 dias à temperatura
de 25 0C ao abrigo da luz.
2 - Processamento de preparação das
amostras: Separação manual do caroço,
casca, polpa.
A técnica de cromatografia (CG) mostrou-se eficaz na detecção da molécula de trans-resveratrol,
apresentando resultados comparáveis às técnicas de cromatografia de alta eficiência (CLAE). Cabe ressaltar
que não se pode comparar neste trabalho as duas técnicas principalmente pela diferença de safra, colheita, o
sistema de condução técnicas de manejo de vinhedo, luz, bem como condições operacionais, etc.
A avaliação das amostras no que concerne às concentrações de resveratrol indicaram a ocorrência de
valores insatisfatórios com a indução da espécie desejada (Botrytis cinerea). Contudo, faz-se necessária uma
investigação detalhada de outros parâmetros que podem ter influenciado influenciar a qualidade dos vinhos,
suco de uva e seus derivados, tais como a procedência da uva, o microclima na área de cultivo, o tipo de solo
onde a uva foi plantada, a ocorrência de doenças fúngicas nos parreirais a cada ano, as práticas enológicas
aplicadas e o tempo de permanência dos vinhos das diversas safras nas barricas de carvalho.
3 - Cultivo dos bagos de uvas em meio BDA
para isolamento do fungo Botrytis cinerea.
Figura c: verso da placa de Petri
após inoculação de parte da
amostra preparada (casca da uva)
Etapas de retirada de amostras para dosagem de resveratrol após
inoculação das uvas ou parte delas com Botrytis cinerea. Incubação inicial
por 24 horas em estufa 25 0C e incubação em shaker orbital por 15 dias à
temperatura de 25 0C ao abrigo da luz.
Conforme demonstra a Figura 5, a concentração máxima de resveratrol nos ensaios
realizados por cromatografia gasosa atingiu 6,53 mg/L de trans-resveratrol,
concentração mais elevada que nos ensaios realizados por cromatografia de alta
eficiência (4,49 mg/L) em trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de
Farmácia (2007).
A condução dos experimentos foi realizada
em 5 etapas:
Figura b: cromatógrafo CG90 com detector de ionização
de
chama
(DIC
arhidrogênio), injetor manual e
coluna HP-1 (Crosslinked
Methyl siloxane 30 m X 0,53
mm x 1,5 µm) acoplado a um
microcomputador.
Detecção e registro de fungos filamentosos observados:
Figura 5 – Evolução da concentração de transresveratrol na casca de uvas sãs e uvas
inoculadas com Botrytis cinerea.
Métodos Analíticos
Figura a: Amostras uvas da
variedade Vitis vinifera
“Merlot” contaminadas.
Neste estudo, foi comparada a presença do trans-resveratrol em uvas sãs e uvas contaminadas com Botrys
cinerea (Figura 2a). Também foi realizada a análise microbiológica das uvas, evitando assim a contaminação da fruta por
outros microrganismos indesejáveis, uma vez que, a contaminação deveria ser induzida apenas pela espécie Botrys
cinerea.
As amostras utilizadas foram uvas do cultivar Merlot (vitis vinifera) coletadas na safra de 2008 do lote 09 de uma
vinícola do planalto catarinense, situado no município de São Joaquim-SC.
A quantificação do resveratrol foi feita através da cromatografia gasosa (CG) do mosto (uvas sãs e inoculadas), e
partes das uvas (casca, polpa e semente) inoculadas com Botrys cinerea.
4 - Sanitização de parte das amostras
separadas na etapa 2 com hipoclorito de
sódio 2% por uma hora para posterior
inoculação.
5 – Análise de trans-resveratrol das uvas ou
parte delas antes e após inoculação com a
espécie de fungo isolado na etapa 3.
Figura d: Incubação inicial por
24 horas em estufa 25 ºC
Figura f: Cultivo de casca de uva
“Merlot” em frasco Erlenmeyer
inoculado com B. cinerea.
Figura g: Cultivo de polpa de uva
“Merlot” em frasco Erlenmeyer inoculado
com B. cinerea.
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