__________________________________________________________________Avaliação da Atividade Antioxidante de Flavonóides 1
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES
Clayton Queiroz Alves1
Hugo Neves Brandão2
Jorge Maurício David3
Juceni Pereira David4
Luciano da S. Lima5
RESUMO: Este trabalho descreve a avaliação da atividade antioxidante de alguns flavonóides
isolados de plantas da região do semi-árido. Os flavonóides selecionados foram submetidos aos
testes de inibição da oxidação do β-caroteno promovido pelo ácido oleanólico e o de seqüestro do
radical DPPH. Esses testes foram acompanhados por espectrofotometria, utilizando-se como
controle positivo o pirogalol, ácido gálico e quercetina. Pelos resultados observados, pode-se
constatar que a atividade antioxidante dos flavonóides é dependente da presença de grupos
hidroxílicos como substituintes e de sua coplanaridade.
Palavras-chave: Atividade antioxidante; Flavonóides; Seqüestro de radicais.
ABSTRACT: This work describes the antioxidant evaluation of flavonoids isolated from plants of
Brazilian semi-arid region. The compounds were submitted to autooxidation of β-carotene in the
system containing linollenic acid and the also the DPPH assays. These experiments were monitored
by spectrophotometry employing as positive control pirogalol, gallic acid and quercetin. The results
show that the antioxidant activities of the flavonoids is dependent of the presence of hydroxyl
groups and the coplanarity of the structure.
Key-words: Antioxidant activity; Flavonoids; Radicalar quenching
1 Introdução
Flavonóides são substâncias pertencentes a uma classe de produtos naturais que atualmente
podem ser consideradas micronutrientes. Estão presentes na dieta humana rica em vegetais e frutas,
Mestre em Química – UFBA e doutorando do Programa de Pós-Graduação em Química do Instituto de Química
UFBA. E-mail: [email protected]
2 Mestre em Química – UFBA. Professor. Auxiliar do Departamento de Farmácia da UEFS, doutorando do Programa de
Pós-Graduação em Química do Instituto de Química UFBA.. E-mail: [email protected]
3 Doutor em Química – USP. Professor do Instituto de Química da UFBA. E-mail: [email protected]
4 Doutora em Química – USP. Professor do Instituto de Química da UFBA. E-mail: [email protected]
5 Mestre em Química – UFBA e doutorando do Programa de Pós-Graduação em Química do Instituto de Química
UFBA E-mail: [email protected]
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que são as principais fontes dessas substâncias. De modo geral, os polifenóis e em particular os
flavonóides possuem estrutura ideal para o seqüestro de radicais, sendo antioxidantes mais efetivos
que as vitaminas C e E. A atividade antioxidante dos flavonóides depende da sua estrutura e pode ser
determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de H e elétrons, estabilidade do
radical flavanoil formado; reatividade em frente a outros antioxidantes, capacidade de quelar metais
de transição e solubilidade e interação com as membranas (BARREIROS et al, 2000). De modo
geral, quanto maior o número de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de H e de
elétrons. Flavonóides monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por exemplo, a 5-hidroxiflavona tem atividade não-detectável (CAO et al, 1997). Entre os flavonóides diidroxilados,
destacam-se aqueles que possuem o sistema catecol (3’,4’-diidroxi) no anel B. Os flavonóides com
múltiplas hidroxilas como a quercetina (1), miricetina (2), luteolina (3), fustina (4), eriodictiol (5) e
taxifolina (6) possuem forte atividade antioxidante (Figura 1) quando comparados ao α-tocoferol,
ácido ascórbico, β-caroteno (Yang et al, 2001).
Este trabalho descreve a avaliação da atividade antioxidante de flavonóides isolados de
plantas do semi-árido nordestino quanto ao poder de seqüestro do radical DPPH e da inibição da
oxidação do β-caroteno no sistema β-caroteno/ácido linoléico.
Figura 1: Flavonóides com atividade antioxidante
OH
OH
O
HO
OH
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
HO
OH
O
OH
O
1
OH
O
2
OH
O
3
OH
OH
HO
OH
OH
OH
OH
O
HO
OH
O
HO
OH
O
OH
OH
4
O
OH
5
O
6
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2 Parte Experimental
Os flavonóides testados (Figura 2) foram isolados das folhas de Cenostigma gardenerianum (Ref.
Clayton), Cratylia mollis (Ref. Luciano) e Moldenhawera nutans (VALE et al, 2005) a partir de seus
extratos metanólicos através de métodos cromatográficos usuais e foram caracterizados por métodos
espectrométricos (IV, UV, EM e RMN). DPPH, β-caroteno, ácido linolênico foram obtidos da
Aldrich; o pirogalol da Merck e o ácido gálico isolado de fontes naturais (VALE et al., 2005). As
reações foram monitoradas em espectrofotômetro Cary I da Varian.
Figura 2: Flavonóides testados
OH
OH
OH
HO
OH
HO
O
HO
O
OH O
O
O
OH
HO
HO
OH
HO
OH
OH
O
O
O
OH
OH
O
OH
OH
O
O
O
OH
HO
O
OH
OH
OH
7
8
OH
9
OH
OH
OH
HO
O
HO
O
MeO
O
OH
O
HO
O
OH O
HO
O
OH
OH O
O
OR2 O
OR1
O
OH
OH
10
11
12 R1=R2=H
13 R1=Glu, R2=H
14 R1=Gal, R2=H
15 R1=Xil, R2=galoil
Teste da Inibição da co-oxidação do β-caroteno: A atividade antioxidante in vitro das substâncias
selecionadas foi determinada pelo do método da inibição da reação de co-oxidação do β-caroteno,
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provocada pela adição de ácido linoléico. Este método foi desenvolvido por Marco (1968) e
modificado por Miller (1971). Resumidamente, a mistura de 1,0mL de solução de β-caroteno
(0,2mg/mL em CHCl3); 20mg ácido linoléico e 200mg de Tween 60 foi submetida à completa
evaporação do clorofórmio. Em seguida, então adicionados 90mL de água destilada, agitando-se
vigorosamente para promover a aeração. Substâncias puras (50, 100 e 200 µg) foram adicionadas às
cubetas contendo 2,5mL da emulsão do sistema β-caroteno/ácido linoléico, sendo a reação
acompanhada no espectrofotômetro em λ = 470nm, com leitura imediata e em intervalos de 15min,
durante 1h, incubando as cubetas a 50ºC. As análises foram realizadas em triplicatas, empregando-se
quercetina (1) como padrão positivo, acompanhadas por controle sem adição de substância-teste. A
capacidade antioxidante foi expressa em percentual de inibição da oxidação através do decaimento da
absorbância, medido em relação ao controle (quercetina ou ácido gálico).
Fórmula para cálculo de Atividade Antioxidante:
AA= 100 [1- (A0 – At) / (A00 – At0)]
Onde:
A0= Absorbância inicial da amostra
At= Absorbância final da amostra
A00= Absorbância inicial do branco
At0= Absorbância final do branco
Seqüestro do radical livre DPPH: Esse teste avalia a habilidade que uma substância tem de
seqüestrar o radical livre estável DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e está baseado no descoramento
de uma solução composta pelo radical estável, de cor violeta, quando da adição de substâncias que
podem ceder um átomo de hidrogênio (BRAND-WILLIAMS et al., 1995). Para esse procedimento,
foi preparada solução etanólica de DPPH (45µg/mL) e soluções com as substâncias-testes e padrão
em três concentrações diferentes (100, 50 e 25 µg/mL) em EtOH. Nesse ensaio, também foram
utilizados quercetina (1), ácido gálico ou pirogalol como substâncias-referências considerando o
poder de seqüestrar 100% dos radicais. As determinações foram realizadas no sistema contendo
3,0mL da solução de DPPH e 50µL de etanol para o controle, ou o mesmo volume para as soluções
de padrão e amostras. As leituras das absorbâncias, a λ=517nm, foram realizadas imediatamente e
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após 30min de incubação da reação à temperatura ambiente, protegida de luz, em espectrofotômetro.
Todas as análises foram realizadas em triplicatas.
3 Discussão dos Resultados
Os resultados da atividade antioxidante das substâncias avaliadas foram expressos em
percentual de inibição da oxidação (Figuras 3 e 4), mostram que algumas delas apresentam potencial
antioxidante, que varia de acordo com o tipo de composto e do método utilizado.
No teste da inibição da oxidação do β-caroteno, o potencial antioxidante da substância
testada é medido pela capacidade deste em seqüestrar o radical livre, gerado durante a peroxidação
do ácido linoléico, ou seja, quanto mais fácil for sua oxidação, mais ele competirá com o β-caroteno
na reação com os radicais, protegendo-o. O teste utilizando o radical estável DPPH mede a
capacidade das substâncias testadas em doar hidrogênio radicalar a este radical, assim, quanto maior
o número de hidroxilas presentes na amostra, maior sua atividade antioxidante. A estabilidade do
radical formado é outro fator que influencia no potencial antioxidante, sendo maior nas substâncias
que possuem maior capacidade de deslocalizar o radical pela estrutura (DUARTE-ALMEIDA et al.,
2006).
Nos testes realizados, observou-se que as substâncias 7 e 8 apresentaram excelente atividade
antioxidante, chegando a ser, em algumas concentrações, mais efetivas que 1 utilizada como padrão
(quercetina). A substância 10 apresentou atividade moderada em ambos os métodos e a substância 9
não apresentou atividade.
1
7
8
9
10
% de inibição
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
50
100
200
Concentração
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Figura 3: Gráfico do teste da inibição da oxidação do β-caroteno dos flavonóides 7-10
1
7
9
10
11
% de seqüestro
120
100
80
60
40
20
0
25
50
100
Concentração
Figura 4: Gráfico do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) dos flavonóides 7-10
Ac. Gálico
12
% de sequestro
100
80
60
40
20
0
30
60
120
Concentração
Figura 5 – Gráfico do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) do flavonóide 12 em relação ao
ácido gálico
Nas Tabelas 1 e 2 encontram-se descritos os resultados de atividade antioxidante observados
para as substâncias 12-15. Dentre esses flavonóides, o que apresentou atividade mais considerável foi
a laricetrina 5-galoil-3-β-D-xilopiranosídeo (15) para o teste de inibição da auto-oxidação do βcaroteno e a laricetrina (12) no seqüestro do DPPH. Estes resultados estão de acordo com os
observados para os flavonóides, de um modo geral, uma vez que substâncias planares, com grupos
catecóis e sistema conjugado são melhores seqüestrados de radicais livres. A presença de
substituintes em 13-15 (resíduos de açúcares e grupos galoil) diminui a atividade seqüestradora de
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radicais, pois a estrutura do flavonóide perde a coplanaridade devido a presença de grupos
volumosos. É digno de nota que a presença do galactosídeo em 15, quando comparado com o
glicosídeo (13), diminue a atividade antioxidante da substância.
Tabela 1: Determinação da AA de 13-16 através do método da autooxidação do β-caroteno
Substância
AA*
% AA
Laricetrina (13)
Intervalo de confiança 95%
15.5
Substância
13.7 – 17.3
AA*
Laricetrina 3-β-glicosídeo (14)
17.8
16.0 – 19.6
Laricetrina 3-β-galactosídeo (15)
25.9
23.1 – 28.7
55.3
54.2 – 56.4
Laricetrina 5-galoil-3-β-Dxilopiranosídeo (16)
* 1mg/mL. % em relação ao ácido gálico (100%)
Tabela 2: Determinação do IC50 a partir do teste de seqüestro do DPPH para 13-16*
Substância
IC50 (µM)
Intervalo de confiança 95%
Laricetrina (13)
1.8
1.7 – 1.9
Laricetrina 3-β-glicosídeo (14)
7.5
7.1 – 7.9
Laricetrina 3-β-galactosídeo (15)
3.0
2.8 – 3.2
Laricetrina 5-galoil-3-β-D-
6.5
6.2 – 6.8
xilopiranosídeo (16)
* dados obtidos a partir da comparação com o pirogalol
Referências
BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. P.; DAVID, J. M.. Estresse Oxidativo: Relação entre geração
de espécies reativas e a defesa do organismo. Química nova v. 29, p. 113-123, 2006.
CAO, G. H.; SOFIC, E.; PRIOR, R. L. Antioxidant and Prooxidant Behavior of Flavonoids:
Structure-Activity Relationships. Free Radical Biology & Medicine v. 22, p. 749-760, 1997.
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__________________________________________________________________Avaliação da Atividade Antioxidante de Flavonóides 8
YANG, B.; KOIANI, A.; ARAI, K.; KUSU, F.. Relationship of electrochemical oxidation of
catechins on their antioxidant activity in microsomal lipid peroxidation. Chemical Pharmaceutical
Bulletin v. 49, p. 747-751, 2001.
VALE, A. E. Do; DAVID, J. M. ; BRANDÃO, H. N. ; DAVID, J. P.. A New Flavonol Glycoside
Derivative from Leaves of Moldenhawera nutans. Zeitschrift Für Naturforschung C-A Journal Of
Biosciences v. 60c, p. 45-49, 2005.
MARCO, G.J. A rapid method for evaluation of antioxidants. Journal of the American Oil
Chemists’ Society v.45, p.594-598, 1968.
MILLER, H.E. A simplified method for the evaluation of antioxidants. Journal of the American
Oil Chemists’ Society v. 48, p.91, 1971.
BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M.E.; BERSET, C. Use of free radical method to evaluate
antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie v. 28, p. 25-30, 1995.
DUARTE-ALMEIDA, J. M.; SANTOS, R. J. Dos; GENOVESE, M. I.; LAJOLO, F. M. Avaliação
da atividade antioxidante, Ciência e Tecnologia de Alimentos v. 26, p. 446-452, 2006.
Agradecimentos
Os autores agradecem a FAPESB, CNPq e CAPES pelos auxílios financeiros e bolsas de estudos
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