Epigenética
Fenómeno Epigenético
• Qualquer actividade reguladora de genes
que não envolve mudanças na sequência do
DNA (código genético) e que pode persistir
por uma ou mais gerações
Territórios cromossómicos
Espaços intercromáticos
Territórios cromossómicos e
Espaços intercromáticos
O início da epigenética
• 1990’s
– Descobertas metilases de DNA em C
– Metilação representada na maioria dos animais,
vegetais e fungos
• 1993
– Stephen Baylin et al
• Metilação do Gene de Supressão Tumoral p16 numa variedade
de tumores humanos
• Tratamento destas células com agentes desmetilantes repõe a
actividade do gene
– Extensa metilação em promotores de outros genes de
supressão tumoral
Mecanismos conhecidos de
regulação epigenética
• Metilação do DNA
• Modificação das Histonas
– Metilação
– Acetilação
– Fosforilação
• Silenciamento do RNA
– RNA directed DNA methylation
– Postranscriptional gene silencing
– RNA interference (RNAi)
• Imprinting
• A Epigenética em Análises Clínicas
Metilação
• A 5ª base 5-metil citosina
A metilação inactiva os genes
Papel da Metilação/desacetilação na repressão do
genoma
Mecanismos conhecidos de regulação
epigenética
• Metilação do DNA
• Modificação das Histonas
– Metilação
– Acetilação
– Fosforilação
• Silenciamento do RNA
– RNA directed DNA methylation
– Postranscriptional gene silencing
– RNA interference (RNAi)
• Imprinting
• A Epigenética em Análises Clínicas
Código das histonas (I)
• 1993 Alan Wolffe
– Acetilação das histonas altera o acesso de outras
proteínas ao DNA (abre o cromossoma)
• Acetilases/Desacetilases formam complexos com factores de
transcrição que ligam/desligam os genes
• 1998 Adrian Bird et al.
– Mostrou que as desacetilases podem funcionar em
conjunto com metilases: se a desacetilase for inibida, a
metilação não inactiva os genes
Código das histonas (II)
• 2000 Thomas Jenuwein
– Identificou uma metilase de histonas, mostrando que
actuam sobre o mesmo local das histonas que as
acetilases
• 2001 Tony Kouzarias
– Metilação de histonas desliga os genes
Metilação da H3
permite a ligação
da HP1, o que
silencia os genes
Modelos de modificação eu/heterocromática por alteração de histonas
Formation of heterochromatin silences gene
expression at telomeres and other regions
Silent genes in mating-type control in yeast
Several genes encode proteins that bind specifically to
silent loci at yeast telomeres
Schematic model of silencing at yeast telomeres
Repressors and activators can direct histone
deactylation at specific genes
Mecanismos conhecidos de regulação
epigenética
• Metilação do DNA
• Modificação das Histonas
– Metilação
– Acetilação
– Fosforilação
• Silenciamento do RNA
– RNA directed DNA methylation
– Postranscriptional gene silencing
– RNA interference (RNAi)
• Imprinting
• A Epigenética em Análises Clínicas
Silenciamento do RNA
-RdDM = RNA directed DNA methylation
-PTGS = Post translational gene silencing
-RNAi = RNA interference
siRNA= small interfering RNA
RISC = RNA induced silencing complex
CMT = chromomethylase
DNMT= DNA methyltransferase
IR = inverted DNA repeats
SC = single copy genes
cRdRP= cellular RNA dependent RNA pol
DICER/CAF = RNAse III type enzimes
Epigenética
• Metilação do DNA
• Modificação das Histonas
– Metilação
– Acetilação
– Fosforilação
• Silenciamento do RNA
– RNA directed DNA methylation
– Postranscriptional gene silencing
– RNA interference (RNAi)
• Imprinting
• A Epigenética em Análises Clínicas
Imprinting (I)
• Marcação permanente dos genes passados por
cada um dos progenitores
• Fenómeno conhecido há pelo menos 3,000 anos
– Égua+Burro  Mula
– Cavalo+Burra  Macho
há efeitos específicos do
genero nos cruzamentos
Imprinting (II)
• 1991
– Igf2r
– H19 Activos só se herdados da mãe
– Igf2 (activo só se herdado do pai)
• 2001
– Mais de 40 genes com efeito de imprinting
•
•
•
•
•
•
mecdin
UBE3A Prader-willi e Angelman syndromes
p53 (gene de supressão tumoral envolvido no neuroblastoma)
peg3
Afectam o desenvolvimento embrionário
igf2
... ...
Imprinting (III)
• Metilação está habitualmente envolvida quer activando
quer inactivando os genes
• Genes imprinted estão presentes em clusters
– Ex:
• H19/Igf2 (11p15.5)
• DKK1/GTL2 (14q32)
• Um dos genes origina 1 proteína o outro RNA não traduzido (cerca de
25% dos genes imprinted não originam proteínas)
• Os genes são separados por ilhas CpG as quais são locais de ligação de
CTCF, formando uma fronteira cromossómica
Imprinting (IV)
Implicações do imprintig
• Necessidade de:
– Remover as marcas de imprinting cedo na
gametogénese
– Criar novas marcas de imprinting durante a
gametogénese
A epigenética em análises clínicas(I)
•
Bibliografia crescente implicando epigenética em patologias (ex: tumores)
– Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic
deregulation Eric Lander, Rudolf Jaenisch Nature Genetics, vol 27, January 2001
– Cancer epigenetics comes of age. Jones PA, Laird PW. Nat Genet. 1999
Feb;21(2):163-7.PMID: 9988266; UI: 99140765
– DNA methylation in health and disease.Robertson KD, Wolffe AP Nature Reviews
Genetics. 2000 October, Vol.1:11-19
– DNA methylation. Singal R, Ginder GD. Blood. 1999 Jun 15;93(12):4059-70.
PMID: 10361102; UI: 99290759
– DNA methylation: past, present and future directions. Robertson KD, Jones PA.
Carcinogenesis. 2000 Mar;21(3):461-7. PMID: 10688866; UI: 20156136
– Current Topics in Microbiology and Immunology. Vol. 249: DNA Methylation and
Cancer edited P. A. Jones, P. K. Vogt Springer-Verlag (2000) pp. 170.
– Behind the Scenes of Gene Expression Elizabeth Pennisi, Science Aug 10 2001:
1064-1067
A epigenética em análises clínicas(II)
• Patologias com envolvimento da Epigenética
– Sindroma do X frágil
– Sindroma de Rett
– Sindroma ICF (Imunodeficiencias,Instabilidade centromérica
e Anomalias Faciais) (Mutações na DNA metiltransferase 3B (DNMT3B))
– Genes de supressão tumoral em tumores
– Deficiencias de imprinting genético
– Envelhecimento
– Doenças cardiacas
Métodos para o Estudo Epigenético
1 -Alteração de Histonas
Analysis of the acetylation state of histones in chromatin
associated with a specific region of the genome
Métodos para o Estudo Epigenético
2 –Metilação do DNA
Diagrama geral dos Métodos para estudo de mCpG
Determinação de conteudo global de mCpG
• Hidrólise
– Química
– Enzimática
Leitura por HPLC / HPCE
• Marcação fluorescente c/ cloroacetaldeído
*=ethenocytosine / ethenoadenine (Fluorescentes)
• Metilação in vitro com SssI e Leitura por southern Blot
In Situ DNA methylation
• Metilação in vitro seguida de imunoprecipitação
• Utilização de anticorpos anti-mCpG
Métodos baseados no bissulfito ou
enzimáticos
Métodos enzimáticos
Southern Blot and PCR
• Utilizar uma enzima de restrição que distingue
a sequencia metilada da não metilada
Métodos baseados no bissulfito ou
enzimáticos
Tratamento com bissulfito
• C U
• mC  mC
Methylation specific PCR
• Tratamento com bissulfito
• Duas reacções de PCR
– 1 primer terminando na sequencia complementar de C
– 1 primer terminando na sequencia complementar de U
Sequenciação / Pyrosequenciação
• Tratamento com bissulfito  Sequenciação
• Tratamento sem bissulfito  Sequenciação
• As diferenças (CT) correspondem a C
• As semelhanças (CC) correspondem a mC
pirosequenciação
• Razão entre altura dos
picos C/T é
proporcional á
metilação
Detecção de mudança na Tm
• Tratamento com Bissulfito
• Leitura por:
– DGGE
– TTGE
Detecção de Alterações de conformação
• Tratamento com bissulfito
• Desnaturação
• Leitura por:
–
–
–
–
HA
DGGE
SSCP
DHPLC
Primer extension (PE)
Real-Time-PCR followed By Tm analysis
Methylight
• Tratamento com bissulfito
– Ex: CpG genome DNA modification kit (QBiogene)
• Real-Time-PCR
• Uso de sondas FRET ou Taqman:
– 1 específica para a sequencia terminada em C
• Se produz sinal há metilação
– 1 específica para a sequência terminada em U
• Se produz sinal não há metilação
PE-DHPLC ou PE-CE (Electroforese Capilar)
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Metilação do DNA