Epigenética Fenómeno Epigenético • Qualquer actividade reguladora de genes que não envolve mudanças na sequência do DNA (código genético) e que pode persistir por uma ou mais gerações Territórios cromossómicos Espaços intercromáticos Territórios cromossómicos e Espaços intercromáticos O início da epigenética • 1990’s – Descobertas metilases de DNA em C – Metilação representada na maioria dos animais, vegetais e fungos • 1993 – Stephen Baylin et al • Metilação do Gene de Supressão Tumoral p16 numa variedade de tumores humanos • Tratamento destas células com agentes desmetilantes repõe a actividade do gene – Extensa metilação em promotores de outros genes de supressão tumoral Mecanismos conhecidos de regulação epigenética • Metilação do DNA • Modificação das Histonas – Metilação – Acetilação – Fosforilação • Silenciamento do RNA – RNA directed DNA methylation – Postranscriptional gene silencing – RNA interference (RNAi) • Imprinting • A Epigenética em Análises Clínicas Metilação • A 5ª base 5-metil citosina A metilação inactiva os genes Papel da Metilação/desacetilação na repressão do genoma Mecanismos conhecidos de regulação epigenética • Metilação do DNA • Modificação das Histonas – Metilação – Acetilação – Fosforilação • Silenciamento do RNA – RNA directed DNA methylation – Postranscriptional gene silencing – RNA interference (RNAi) • Imprinting • A Epigenética em Análises Clínicas Código das histonas (I) • 1993 Alan Wolffe – Acetilação das histonas altera o acesso de outras proteínas ao DNA (abre o cromossoma) • Acetilases/Desacetilases formam complexos com factores de transcrição que ligam/desligam os genes • 1998 Adrian Bird et al. – Mostrou que as desacetilases podem funcionar em conjunto com metilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inactiva os genes Código das histonas (II) • 2000 Thomas Jenuwein – Identificou uma metilase de histonas, mostrando que actuam sobre o mesmo local das histonas que as acetilases • 2001 Tony Kouzarias – Metilação de histonas desliga os genes Metilação da H3 permite a ligação da HP1, o que silencia os genes Modelos de modificação eu/heterocromática por alteração de histonas Formation of heterochromatin silences gene expression at telomeres and other regions Silent genes in mating-type control in yeast Several genes encode proteins that bind specifically to silent loci at yeast telomeres Schematic model of silencing at yeast telomeres Repressors and activators can direct histone deactylation at specific genes Mecanismos conhecidos de regulação epigenética • Metilação do DNA • Modificação das Histonas – Metilação – Acetilação – Fosforilação • Silenciamento do RNA – RNA directed DNA methylation – Postranscriptional gene silencing – RNA interference (RNAi) • Imprinting • A Epigenética em Análises Clínicas Silenciamento do RNA -RdDM = RNA directed DNA methylation -PTGS = Post translational gene silencing -RNAi = RNA interference siRNA= small interfering RNA RISC = RNA induced silencing complex CMT = chromomethylase DNMT= DNA methyltransferase IR = inverted DNA repeats SC = single copy genes cRdRP= cellular RNA dependent RNA pol DICER/CAF = RNAse III type enzimes Epigenética • Metilação do DNA • Modificação das Histonas – Metilação – Acetilação – Fosforilação • Silenciamento do RNA – RNA directed DNA methylation – Postranscriptional gene silencing – RNA interference (RNAi) • Imprinting • A Epigenética em Análises Clínicas Imprinting (I) • Marcação permanente dos genes passados por cada um dos progenitores • Fenómeno conhecido há pelo menos 3,000 anos – Égua+Burro Mula – Cavalo+Burra Macho há efeitos específicos do genero nos cruzamentos Imprinting (II) • 1991 – Igf2r – H19 Activos só se herdados da mãe – Igf2 (activo só se herdado do pai) • 2001 – Mais de 40 genes com efeito de imprinting • • • • • • mecdin UBE3A Prader-willi e Angelman syndromes p53 (gene de supressão tumoral envolvido no neuroblastoma) peg3 Afectam o desenvolvimento embrionário igf2 ... ... Imprinting (III) • Metilação está habitualmente envolvida quer activando quer inactivando os genes • Genes imprinted estão presentes em clusters – Ex: • H19/Igf2 (11p15.5) • DKK1/GTL2 (14q32) • Um dos genes origina 1 proteína o outro RNA não traduzido (cerca de 25% dos genes imprinted não originam proteínas) • Os genes são separados por ilhas CpG as quais são locais de ligação de CTCF, formando uma fronteira cromossómica Imprinting (IV) Implicações do imprintig • Necessidade de: – Remover as marcas de imprinting cedo na gametogénese – Criar novas marcas de imprinting durante a gametogénese A epigenética em análises clínicas(I) • Bibliografia crescente implicando epigenética em patologias (ex: tumores) – Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation Eric Lander, Rudolf Jaenisch Nature Genetics, vol 27, January 2001 – Cancer epigenetics comes of age. Jones PA, Laird PW. Nat Genet. 1999 Feb;21(2):163-7.PMID: 9988266; UI: 99140765 – DNA methylation in health and disease.Robertson KD, Wolffe AP Nature Reviews Genetics. 2000 October, Vol.1:11-19 – DNA methylation. Singal R, Ginder GD. Blood. 1999 Jun 15;93(12):4059-70. PMID: 10361102; UI: 99290759 – DNA methylation: past, present and future directions. Robertson KD, Jones PA. Carcinogenesis. 2000 Mar;21(3):461-7. PMID: 10688866; UI: 20156136 – Current Topics in Microbiology and Immunology. Vol. 249: DNA Methylation and Cancer edited P. A. Jones, P. K. Vogt Springer-Verlag (2000) pp. 170. – Behind the Scenes of Gene Expression Elizabeth Pennisi, Science Aug 10 2001: 1064-1067 A epigenética em análises clínicas(II) • Patologias com envolvimento da Epigenética – Sindroma do X frágil – Sindroma de Rett – Sindroma ICF (Imunodeficiencias,Instabilidade centromérica e Anomalias Faciais) (Mutações na DNA metiltransferase 3B (DNMT3B)) – Genes de supressão tumoral em tumores – Deficiencias de imprinting genético – Envelhecimento – Doenças cardiacas Métodos para o Estudo Epigenético 1 -Alteração de Histonas Analysis of the acetylation state of histones in chromatin associated with a specific region of the genome Métodos para o Estudo Epigenético 2 –Metilação do DNA Diagrama geral dos Métodos para estudo de mCpG Determinação de conteudo global de mCpG • Hidrólise – Química – Enzimática Leitura por HPLC / HPCE • Marcação fluorescente c/ cloroacetaldeído *=ethenocytosine / ethenoadenine (Fluorescentes) • Metilação in vitro com SssI e Leitura por southern Blot In Situ DNA methylation • Metilação in vitro seguida de imunoprecipitação • Utilização de anticorpos anti-mCpG Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos Métodos enzimáticos Southern Blot and PCR • Utilizar uma enzima de restrição que distingue a sequencia metilada da não metilada Métodos baseados no bissulfito ou enzimáticos Tratamento com bissulfito • C U • mC mC Methylation specific PCR • Tratamento com bissulfito • Duas reacções de PCR – 1 primer terminando na sequencia complementar de C – 1 primer terminando na sequencia complementar de U Sequenciação / Pyrosequenciação • Tratamento com bissulfito Sequenciação • Tratamento sem bissulfito Sequenciação • As diferenças (CT) correspondem a C • As semelhanças (CC) correspondem a mC pirosequenciação • Razão entre altura dos picos C/T é proporcional á metilação Detecção de mudança na Tm • Tratamento com Bissulfito • Leitura por: – DGGE – TTGE Detecção de Alterações de conformação • Tratamento com bissulfito • Desnaturação • Leitura por: – – – – HA DGGE SSCP DHPLC Primer extension (PE) Real-Time-PCR followed By Tm analysis Methylight • Tratamento com bissulfito – Ex: CpG genome DNA modification kit (QBiogene) • Real-Time-PCR • Uso de sondas FRET ou Taqman: – 1 específica para a sequencia terminada em C • Se produz sinal há metilação – 1 específica para a sequência terminada em U • Se produz sinal não há metilação PE-DHPLC ou PE-CE (Electroforese Capilar)
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