1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE
PORTO ALEGRE – UFCSPA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEPATOLOGIA
Carlos Eduardo Becker
Utilização da Curva de Melting como
Screening para Análise dos Genótipos
A, D e F do Vírus da Hepatite B em
Pacientes de um Hospital Geral do Sul
do Brasil
Porto Alegre
2012
2
Carlos Eduardo Becker
Utilização da Curva de Melting como
Screening para Análise dos Genótipos
A, D e F do Vírus da Hepatite B em
Pacientes de um Hospital Geral do Sul
do Brasil
Tese submetida ao Programa de PósGraduação em Hepatologia da Fundação
Universidade Federal de Ciências da
Saúde de Porto Alegre como requisito para
a obtenção do grau de Doutor
Orientadora: Drª Ana Beatriz Gorini de Veiga
Co-Orientador: Dr. Ângelo Alves de Mattos
Porto Alegre
2012
3
Catalogação na Publicação
B395u Becker, Carlos Eduardo
Utilização da curva de melting como screening para análise dos
genótipos A, D e F da hepatite B em pacientes de um hospital geral
do Brasil / Carlos Eduardo Becker. – 2012.
84f. : graf., Il., tab.; 30 cm.
Tese (doutorado) – Fundação Universidade Federal de Ciências
da Saúde de Porto Alegre, Programa de Pós-Graduação em
Hepatologia, 2012.
“Orientadora: Prof.ª Drª. Ana Beatriz Gorini de Veiga”.
“Co-orientador: Dr. Ângelo Alves de Mattos”.
1. Hepatite B. 2. Vírus da hepatite B. 3. Genótipos. 4. Curva de
Melting. I. Título.
CDD 616.362.3
CDU 616 16 002
Bibliotecária Ruth Borges Fortes de Oliveira- CRB 10/501
4
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Onofre Jorge e Maria Ignez, por
terem me transmitido sua força de trabalho e
determinação.
À minha avó, Holanda, quem destinou sua vida à
minha educação, ensinando-me a bravura e
superação, sendo meu exemplo de transpor as
dificuldades cotidianas. A minha referência em
todos os momentos.
À
Juliana,
pelo
amor,
compreensão,
companheirismo e cumplicidade. Sempre presente,
me incentiva todos os dias para que eu conquiste
todos os meus objetivos de vida.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar
as dificuldades, mostrar o caminho nas horas incertas e me suprir em todas as minhas
necessidades.
Aos pacientes, sem os quais este trabalho não seria possível.
À Universidade Federal Ciências da Saúde de Porto Alegre, pela oportunidade de
realizar este Doutorado.
À Drª Ana Beatriz Gorini da Veiga, pela orientação, gentileza, colaboração, presteza.
Agradeço
pelas
conversas
construtivas
que
tivemos
e
pelo
conhecimento
no
desenvolvimento desta Tese.
Ao Dr. Angelo Alves de Mattos, pelo apoio, paciência, compreensão, incentivo,
amizade, confiança e ensinamentos recebidos por esse que é, sem dúvida, um exemplo de
conduta e postura profissional.
Ao Dr. Nelson Kretzman, à Drª Fernanda Schild Branco de Araújo, à Drª Lísia
Hoppe e à Drª Gabriela Perdomo Coral, pela amizade, ensinamentos, ideias e
colaboração incondicional transmitidas durante toda a etapa deste trabalho.
Ao Dr. Rafael Sommer e à Drª Sílvia Dal’Alba pela busca de informações e auxílio
que, sem dúvida alguma, contribuíram para a elaboração deste trabalho.
Ao Laboratório Central do Complexo Hospitalar Santa Casa, representado na
pessoa do Dr. Carlos Franco Voegeli, pelo auxílio na fase inicial do estudo e na coleta e
armazenamento das amostras dos pacientes.
Ao Laboratório de Técnicas Especiais do Hospital Albert Einstein, em São
Paulo - SP, pela dedicação e colaboração na parte prática.
6
Ao Laboratório DB - Diagnósticos do Brasil, em Curitiba - PR, em especial ao seu
diretor Dr. Marcelo Ruiz, pelo incentivo e valorização à capacitação dos seus profissionais.
Aos professores e pesquisadores do Centro de Biologia Genômica e Molecular da
PUCRS que me auxiliaram no desenvolvimento desta Tese.
À equipe de Gastroenterologia e Hepatologia do Complexo Hospitalar Santa Casa
que permitiu que os pacientes, sob seus cuidados, fossem incluídos neste estudo.
E a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização e
conclusão deste trabalho.
1
RESUMO
Introdução: O Vírus da Hepatite B (VHB) pode causar hepatite fulminante,
cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC), sendo uma das causas mais frequentes de
doença aguda e crônica do fígado. As variantes genéticas do VHB podem ser
determinantes para a evolução da doenças assim como para a eleição da
terapêutica. Objetivos: O objetivo deste estudo foi padronizar e avaliar uma
metodologia in house, através da utilização da curva de melting de PCR em tempo
real (qPCR), como rastreamento para análise dos genótipos A, D e F do vírus da
hepatite B em pacientes do Rio Grande do Sul. Metodologia: Foram avaliados 104
pacientes com infecção crônica pelo Vírus da Hepatite B (VHB). O DNA foi extraído
com kit comercial, os genótipos e as mutações foram determinados utilizando
diferentes protolocos baseados em PCR. Resultados: Foi padronizada uma
metodologia baseada em PCR para a análise dos genótipos A, D e F do VHB. A
técnica consistiu de uma PCR Nested incluindo uma etapa final de PCR em tempo
real Multiplex, utilizando a curva de melting como ferramenta para a definição dos
fragmentos. Foi observada uma maior frequência do genótipo D (44,2%), seguido do
genótipo A (22,1%) e do genótipo F (3,8%) na amostra analisada. Conclusão: O
ensaio padronizado fornece um método rápido e preciso para diferenciar genótipos
do VHB mais frequentes no Sul do Brasil – A, D e F – usando um PCR Nested
Multiplex com primers específicos, o qual apresenta potencial aplicação na prática
clínica.
2
ABSTRACT
Introduction: Hepatitis B Virus (HBV) can cause fulminant hepatitis, cirrhosis
and hepatocellular carcinoma (HCC), and is one of the most common causes of
acute and chronic liver failure. The genetic variants of HBV can be decisive for the
evolution of these diseases as well as for the election of therapy. Objectives: The
aim of this study was to evaluate an in house methodology based on the melting
curve of real-time PCR (qPCR) analysis to screen for genotypes A, D and F of
hepatitis B virus in patients of Rio Grande do Sul, Brazil. Methodology: We
evaluated 104 patients with HBV chronic infection. The DNA was extracted with a
commercial kit, genotypes and different mutations were determined using PCRbased protocols. Results: A PCR-based methodology was standardized for the
analysis of genotypes A, D and F of HBV. The technique was based in a Nested PCR
with the final step consisting of a Multiplex real-time PCR, using the melting curve as
a tool for the differentiation of fragments. We observed a higher frequency of
genotype D (44.4%), followed by genotype A (22.2%) and genotype F (3.7%).
Conclusion: The standardized test, a Nested PCR-Multiplex qPCR using specific
primers, provides a rapid and accurate method for the differentiation of HBV
genotypes that are more frequent in Southern Brazil – A, D and F. This method can
be applied in the clinical practice.
3
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT
Alanina Aminotransferase
AST
Aspartato Aminotransferase
Anti-HBeAg
Anticorpo contra o antígeno HBe
Anti-HBsAg
Anticorpo contra o antígeno HBs
CHC
Carcinoma Hepatocelular
ddNTPs
Di-deoxinucleotídeos
DNA
Ácido desoxiribonucleioco
EtBr
Brometo de Etídeo
EXO I
Exonuclease I
HBcAg
Antígeno Core do VHB
HBeAg
Antígeno e do VHB
HBsAg
Antígeno de superfície do VHB
mL
Mililitros
µL
Microlitros
pb
Pares de base
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
qPCR
Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real
RNA
Ácido ribonucleico
4
RS
Rio Grande do Sul
SAP
Shrimp Alkaline Phosphatase
SINAN
Sistema de Informação de Agravos de Notificação
Tm
Temperatura de Melting
VHB
Vírus da Hepatite B
VHC
Vírus da Hepatite C
5
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Gráfico 1 - Detecção do VHB no Rio Grande do Sul por faixa etária em 2009.................................
5
Figura 1 - Mapa do Coeficiente de Detecção da Hepatite B, por região (CRS) 2009.......................
5
Tabela 1 – Número de casos confirmados de Hepatite B no RS no período 1999-2008..................
6
Figura 2 - Genoma do VHB...............................................................................................................
7
Figura 3 - Gráfico de amplificação de ácidos nucleico por PCR em tempo real..............................
13
Figura 4 - Curvas de Melting. Fragmentos de tamanhos distintos e Tm distintas.............................
14
Figura 5 - Fluxograma do desenvolvimento método-científico..........................................................
18
Tabela 2 - Descrição dos primers utilizados.....................................................................................
20
Tabela 3 - Características Clínicas dos pacientes e Genótipos do VHB...........................................
27
Figura 6 - Curvas de Melting para genotipagem do VHB. (A) Curvas de Melting normalizadas.
(B) Curvas de Melting derivadas. Genótipos A, D e F........................................................................
28
Tabela 4 - Características Clínicas e Moleculares dos Pacientes de acordo com o Genótipo VHB.... 29
Figura 7 - Frequência dos subtipos do VHB......................................................................................
30
6
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................
1
1.1 História Natural da Infecção pelo VHB....................................................................
2
1.2 Epidemiologia do VHB.............................................................................................
3
1.2.1 O Vírus da Hepatite B............................................................................................
6
1.2.2 Genótipos do VHB................................................................................................
8
1.3 Diagnóstico do VHB ...............................................................................................
9
1.3.1 Diagnóstico Molecular do VHB.............................................................................
10
1.3.1.1 PCR em tempo real .....................................................................................
12
2 JUSTIFICATIVA..............................................................................................................
15
3 OBJETIVOS...................................................................................................................
16
3.1 Objetivo Primário.....................................................................................................
16
3.2 Objetivos Secundários............................................................................................
16
4 PACIENTES E MÉTODOS.............................................................................................
17
4.1 Casuística..................................................................................................................
17
4.2 Métodos.....................................................................................................................
17
4.2.1 Determinação dos Genótipos e das Mutações......................................................
19
4.2.1.1 Extração de Ácidos Nucleicos..........................................................................
19
4.2.1.2 Reações de PCR .............................................................................................
19
4.2.1.2.1 PCR Nested para o sequenciamento e para PCR em tempo real.................
20
4.2.1.3 Identificação dos Produtos das Reações..........................................................
22
4.2.1.4 Reação de Purificação (controle)......................................................................
23
4.2.1.5 Reação de Sequenciamento (controle)..............................................................
23
4.2.1.6 Análise das Sequências (controle).....................................................................
25
4.3 Análise Estatística...............................................................................................
25
5 RESULTADOS.............................................................................................................
26
7
6 DISCUSSÃO...................................................................................................................
31
7 CONCLUSÃO..................................................................................................................
40
8 ANEXOS..........................................................................................................................
41
8.1 Protocolo...................................................................................................................
41
8.2 Consentimento Pós-Informação..............................................................................
42
8.3 Manuscrito.................................................................................................................
43
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................
62
1
1 INTRODUÇÃO
A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um grave problema de saúde
pública mundial(1). A infecção pode ser transmitida através de contato parenteral ou,
ainda, transmissão vertical (mãe/filho), podendo levar à doença hepática crônica,
incluindo a cirrose e o carcinoma hepatocelular (CHC). Com base na distribuição dos
casos de hepatite B, podemos dividir o mundo em três regiões: alta [África, região
sudeste da Ásia, incluindo a China, Coréia, Indonésia e as Filipinas; o Oriente Médio,
exceto Israel; as ilhas do Pacífico Sul e Ocidental; as áreas no interior da bacia
hidrográfica do Rio Amazonas e em certas partes do Caribe (Haiti e República
Dominicana)], média (região centro-sul e sudoeste da Ásia, Israel, Japão, regiões
leste e sul da Europa, Rússia, na maior parte das áreas ao redor da bacia
hidrográfica do Rio Amazonas, Honduras e Guatemala) e baixa endemicidade
(Oeste da Europa, América do Norte, Austrália, Nova Zelândia, México e na região
sul da América do Sul)(2).
Algumas medidas podem contribuir para a diminuição dos índices de infecção
pelo VHB, tais como: mudança de comportamento sexual de risco, aumento dos
níveis educacionais, teste laboratorial em doadores de sangue, técnicas assépticas
na prática clínica e, ainda, aumentando o rastreamento populacional de diagnóstico
para infecção pelo VHB(3). As vacinas são também muito eficazes na prevenção da
hepatite B e de suas consequências, como a cirrose e o CHC. Desta forma, as
políticas públicas de vigilância epidemiológica favorecem o controle e o tratamento
das infecções pelo VHB.
2
As
características
moleculares
do
VHB
são
responsáveis
pelo
desenvolvimento não somente da hepatite B aguda, mas também pelas diferentes
manifestações da doença hepática crônica, portanto a identificação do genótipo viral
contribui para o tratamento adequado e estudo epidemiológico do VHB(4).
1.1 História Natural da Infecção pelo VHB
O fígado atua de forma fundamental na manutenção da homeostase
metabólica, no processamento de aminoácidos, carboidratos, lipídios e vitaminas da
dieta, no metabolismo do colesterol e das toxinas, na produção de fatores de
coagulação e no armazenamento da glicose(5).
As doenças hepáticas são classificadas geralmente em duas categorias:
hepatocelular e colestática (obstrutiva). Nas doenças hepatocelulares (como a
hepatite viral ou a doença hepática alcoólica), inflamação e necrose hepáticas
predominam como características do dano celular. Dentre as causas mais comuns
de doença hepática aguda, o VHB entra em primeiro plano junto com o vírus da
hepatite C (VHC). Em relação à doença hepática crônica, o VHB ocupa a quarta
posição como fator etiológico(5). A classificação se refere à avaliação da gravidade
ou à atividade da doença hepática – se aguda ou crônica, ativa ou inativa, e leve,
moderada ou grave. Os níveis séricos de aminotransferases são usados como meio
conveniente e não-invasivo de acompanhar a atividade da doença. Essas enzimas
são liberadas em grandes quantidades no sangue quando há dano nas células
hepáticas. Entretanto, nem sempre são confiáveis para exprimir a real dimensão da
enfermidade, uma vez que a doença hepática pode não estar acompanhada por
necrose(5).
3
A injúria ao parênquima hepático, de variadas etiologias, associada com um
influxo de células inflamatórias, é um evento denominado hepatite. A cirrose é o
resultado do processo inflamatório onde há o estímulo crônico à fibrogênese, com a
consequente fibrose difusa e a desarquiteturização do parênquima, com a formação
de nódulos(6). A fibrose hepática sempre foi considerada um processo irreversível;
contudo, evidências recentes sugerem que possa ser reversível, como demonstrado
em alguns pacientes com hepatite crônica viral submetidos a terapias anti-virais(7).
As injúrias crônicas ao fígado podem evoluir para a cirrose por mecanismos
fisiopatológicos diversos em que há uma persistente tentativa de reconstituição do
parênquima, resultando em fibrose e nodulações difusas. Estima-se que, para que
ocorram complicações como a disfunção hepatocelular e outras manifestações
clínicas, que configuram a descompensação do paciente com doença hepática,
aproximadamente 80% a 90% do parênquima hepático deve estar modificado(7).
A associação entre doença hepática crônica causada pela infecção pelo VHB
e alterações morfológicas das células hepáticas, como os tumores primários, foi
reconhecida há mais de 30 anos onde 65% dos pacientes com CHC tinham
cirrose(8). Atualmente, estima-se que em 80% dos casos há associação de cirrose
com CHC, e consideram-se as alterações nas células indiferenciadas hepáticas
como possível evento relacionado ao aparecimento de tumores(9).
1.2 Epidemiologia do VHB
A hepatite viral B é uma doença comum e grave causada pelo VHB, um vírus
de DNA parcialmente fita dupla, da família Hepadnaviridae. Quatro principais
sorotipos (adw, ayw, adr e ayr) e nove menores foram identificados para o antígeno
4
de superfície do VHB, o HBsAg. O sequenciamento completo do genoma do VHB
levou à identificação de oito genótipos (de A a H), mostrando uma distribuição
etnogeográfica diferente para cada um dos genótipos. Os genótipos do VHB também
têm sido associados com diferentes desfechos clínicos e com resposta à terapêutica
com interferon(10). O VHB é uma das principais causas da cirrose e do CHC. A
doença aguda ocorre geralmente quando a resposta imune é bem preservada,
enquanto que pacientes com imunodeficiência são mais propensos a desenvolver
uma doença crônica, tornando-se uma fonte de transmissão da doença. A
probabilidade de que uma infecção pelo VHB se torne crônica depende da idade em
que uma pessoa é infectada; além disso, lactantes e crianças jovens são os mais
propensos a desenvolver uma infecção crônica(10).
Globalmente, estima-se que cerca de um terço da população mundial já tenha
sido infectada pelo VHB; 6% são portadores crônicos e mais de 600.000 pessoas
morrem a cada ano de doença aguda ou crônica, secundária à infecção pelo
VHB(2). Com base na taxa de portadores do VHB, o mundo pode ser dividido
em regiões de endemicidade alta, média e baixa. A grande preocupação está em
países de alta endemicidade, especialmente na Ásia e na África, onde as rotas mais
comuns de infecção permanecem a transmissão vertical (de mãe para filho) e a
transmissão horizontal entre crianças(2).
No Brasil, o Ministério da Saúde estima que pelo menos 15% da população já
tenha sido contaminada com o VHB, sendo que os casos crônicos correspondem a
cerca de 1% da população brasileira e a taxa de mortalidade é de 0,6 por 100.000
habitantes(11). A literatura médica refere a Região Sul como área de baixa
endemicidade; as regiões Centro-Oeste, Nordeste e Sudeste de intermediária
5
endemicidade; a região da Amazônia, o estado do Espírito Santo e a região oeste do
estado de Santa Catarina constituem regiões de alta endemicidade(11-14).
No Estado do Rio Grande do Sul e em Porto Alegre, as notificações de
hepatite pelo VHB em 2009 são apresentadas no Gráfico 1 e na Figura 1.
Gráfico 1. Detecção do VHB no Rio Grande do Sul por faixa etária em 2009. Fonte: Secretaria
Estadual da Saúde / RS SINAN/DVE/CEVS/SES-RS.
Figura 1. Mapa do Coeficiente de Detecção da Hepatite B, por região (CRS), 2009 (por 100.000
habitantes). Fonte: Secretaria Estadual da Saúde / RS SINAN/DVE/CEVS/SES-RS.
A Tabela 1 mostra o número de casos confirmados de hepatite B no RS no período
de 1998 a 2008.
6
Tabela 1. Número de casos confirmados de Hepatite B no RS no período 1999-2008.
Ano
Casos confirmados
1999
618
2000
1.068
2001
1.017
2002
885
2003
1.100
2004
1.211
2005
1.399
2006
1.274
2007
1.106
2008
1.191
Fonte: MS/SVS – Sistema de Informação de Agravos de Notificação – SINAN
1.2.1 O vírus da Hepatite B
O vírus da hepatite B (VHB) possui um nucleocapsídeo icosaédrico e
apresenta um envelope externo lipídico. O capsídeo envolve o DNA viral e uma DNA
polimerase com atividade de transcriptase reversa. A camada externa contém
proteínas envolvidas na entrada e fixação do vírus nas células susceptíveis à
infecção. O VHB é um dos menores vírus envelopados conhecidos, embora
haja formas pleiomórficas, incluindo filamentos esféricos e sem núcleo (core). Estas
partículas não são infecciosas e são constituídas simplesmente de lipídios e
proteínas que formam parte da superfície do vírus, isto é, os antígenos de superfície
(HBsAg), os quais são produzidos em excesso durante o ciclo de vida do vírus(15).
7
A partícula denominada Dane é a partícula viral completa. Sua estrutura é
complexa e com um envoltório duplo. O envoltório externo contém proteínas
antigênicas denominadas de HBsAg; o interno, junto com o DNA e a enzima DNApolimerase, constitui o core, que apresenta uma outra proteína antigênica – o
antígeno do core (HBcAg) – e um antígeno solúvel, antígeno “e” do vírus da hepatite
B (HBeAg)(16, 17).
Figura 2. Genoma do VHB. Fonte: Naito et al.,2001.
O genoma do VHB é composto por uma molécula de DNA circular dupla fita
descontínua (Figura 2). O genoma contém entre 3020-3320 pares de bases
(perímetro máximo) e entre 1700-2800 pb em sua fita interna. O DNA viral pode ser
encontrado no núcleo das células hospedeiras logo após a infecção(18). Existem
quatro genes conhecidos no genoma, chamados C, X, P e S.
A proteína do núcleo (core) é codificada pelo gene C (HBcAg) e seu códon de
início é precedido por outro códon ATG, a partir do qual é codificada a proteína précore. O processamento desta proteína pré-core, por proteólise, produz o antígeno ‘e’
8
(HBeAg). A DNA polimerase é codificada pelo gene P. O gene S é o que codifica o
antígeno de superfície HBsAg. O gene do HBsAg compreende uma extensa fase de
leitura aberta dentro da qual existe um códon de início ATG que divide sua
sequência em três secções: pré-S1+pré-S2+S, pré-S2+S e S. A função da proteína
codificada pelo gene X ainda não é completamente conhecida(19).
1.2.2 Genótipos do Vírus da Hepatite B
A progressão da doença hepática, assim como a resposta às terapias
antivirais, têm sido relacionadas aos diferentes genótipos do VHB(20). O curso da
infecção pelo VHB depende de muitos fatores que podem influenciar a interação
vírus-hospedeiro, sendo provavelmente de relevância a variabilidade genética do
vírus, incluindo os genótipos, os quais podem influenciar a expressão dos antígenos
virais(21). São conhecidos oito diferentes genótipos do VHB (A-H) com distinta
distribuição
geográfica
mundial(16).
Em
estudo
anterior
de
nosso
grupo,
evidenciamos a presença dos genótipos A, D e F no estado do Rio Grande do
Sul(13). No Brasil, os genótipos A e D são mais prevalentes, assim como na Europa,
América do Norte, Índia e África; os genótipos B e C são encontrados com maior
frequência no Sudeste da Ásia, China e Japão; o genótipo E é restrito à África; o
genótipo F é encontrado na população nativa das Américas do Sul e Central; o
genótipo G foi descrito na França, Estados Unidos e México; e o genótipo H foi
encontrado na América Central(13, 22-24).
O comportamento de risco e também a migração e origem étnica podem
influenciar a distribuição geográfica dos genótipos(16). Os estudos sobre os
diferentes subtipos de VHB de acordo com a distribuição populacional nos diferentes
continentes ainda estão incompletos, havendo poucos dados, por exemplo, da
9
América do Sul(25, 26). Além disso, a distribuição genotípica do VHB e sua
correlação com o curso clínico da doença hepática ainda não estão bem
esclarecidos(27).
Estudos indicam que o genótipo C promove uma doença hepática crônica
com maior gravidade comparado com os demais genótipos. Estudos com pacientes
de Taiwan mostraram que a cirrose e o CHC são mais frequentes em portadores do
genótipo C do que B(28, 29). O genótipo C é mais prevalente em pacientes HBeAg
positivos do que o genótipo B(42). O risco de desenvolver o CHC, além de estar
relacionado com o aumento da carga viral dos pacientes, também está relacionado
com o genótipo do VHB. No Japão e na China, o genótipo C do VHB está
diretamente relacionado com o desenvolvimento do CHC(20, 30).
O genótipo D, por sua vez, está associado com maior gravidade da doença
hepática quando comparado ao genótipo A e pode também favorecer a ocorrência
de CHC em pacientes jovens(17, 31, 32), dado esse relevante para o
acompanhamento clínico dos pacientes no estado do Rio Grande do Sul sendo um
dos três genótipos presentes neste estado. Uma avaliação geral dos genótipos do
VHB nestes pacientes favorece uma melhor conduta no tratamento desta
população(13).
1.3 Diagnóstico da Hepatite B
Utilizam-se habitualmente marcadores sorológicos como indicadores de
diagnóstico e/ou prognóstico de infecção aguda ou crônica por VHB. O marcador
mais frequente de infecção por VHB consiste na presença do antígeno de superfície
do VHB (HBsAg)(33). No entanto, a utilização deste marcador para monitorar a
10
progressão da doença pode ter uma utilidade limitada, pois o vírus é frequentemente
alvo de alterações genéticas(13).
Foi referido que a capacidade para detectar DNA do VHB no soro possui
valor prognóstico para a evolução de infecções agudas e crônicas por VHB. A
metodologia pode permitir a detecção do DNA do VHB após o desaparecimento de
HBsAg ou a detecção do VHB sem marcadores sorológicos(34).
A eficácia da terapêutica antiviral utilizada no tratamento de doentes com VHB
também pode ser avaliada por marcadores sorológicos ou por medição da função
das enzimas hepáticas(35). Todavia, acredita-se que a medida mais direta e
fidedigna replicação viral consiste na quantificação do DNA viral em soro ou plasma.
Uma descida rápida e mantida dos níveis de DNA do VHB em doentes submetidos a
tratamento constituiu um fator de previsão para um resultado favorável do mesmo. A
monitorização dos níveis de DNA do VHB, assim como a identificação dos
genótipos, pode predizer o desenvolvimento de resistência à terapêutica. Por
conseguinte, um teste quantitativo para a determinação do DNA do VHB constitui
uma importante ferramenta que pode ser utilizada em conjunto com outros
marcadores sorológicos no tratamento da infecção por VHB. No plasma, o DNA do
VHB pode ser identificado através de tecnologias de amplificação de ácidos
nucleicos, como é o caso da reação em cadeia da polimerase (PCR)(36, 37).
1.3.1 Diagnóstico Molecular do Vírus B
O conhecimento dos genomas virais pode revelar variações entre genótipos
que podem representar uma predisposição a desenvolver um prognóstico ruim
ou até mesmo opções de tratamento que podem ser mais eficazes. Testes de
11
diagnóstico moleculares analisam o conteúdo genético para obter informações dos
vírus. Estes testes podem analisar sequências de regiões específicas do material
genético dos vírus para identificar mutações ou quantificar os níveis de certos
materiais genéticos que podem ser expressos(34).
Sequências características de ácidos nucleicos – no caso do VHB, uma
sequência de DNA – podem apresentar mutações antigas ou novas, as quais podem
fazer com que o paciente desenvolva uma doença hepática crônica de uma maneira
mais agressiva. A identificação de uma mudança genética para um comportamento
mais agressivo no genoma do VHB ou para uma condição específica pode servir
como alerta para a equipe médica e auxiliar na escolha de determinadas condutas, a
fim de evitar ou controlar o desenvolvimento ou descompensação da doença
hepática.
Certos genótipos e mutações podem influenciar, assim, as opções de
tratamento, pois afetam a resposta terapêutica, como por exemplo o tratamento com
a Lamivudina(38). Algumas terapias possuem respostas distintas se o alvo da droga
contém mutações críticas(39). Portanto, esta informação da composição genética do
VHB pode ser utilizada para selecionar a melhor estratégia terapêutica para para
cada indivíduo e sua infecção de forma personalizada.
O diagnóstico molecular é considerado atualmente o método mais adequado
para fins de avaliação de tratamento e acompanhamento da replicação viral em
sangue periférico. Valores de carga viral acima de 100.000 cópias/mL indicam
replicação ativa, enquanto valores mais baixos indicam paciente portador do vírus,
porém com pouca atividade do VHB. A PCR quantitativa realizada previamente ao
tratamento, com dados de carga viral, pode ser utilizada na avaliação de prognóstico
12
em resposta ao tratamento. A genotipagem do VHB é realizada geralmente por
sequenciamento do DNA(13).
1.3.1.1 PCR em tempo real
Na biologia molecular, a PCR em tempo real quantitativa (real time PCR ou
qPCR) é uma técnica laboratorial baseada PCR para amplificar ácidos nucleicos. A
qPCR combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de
detecção e quantificação através da emissão de fluorescência, permitindo o
monitoramento da reação em tempo real. Desta forma, a cada ciclo de amplificação
são gerados dados, os quais podem ser analisados em tempo real, ao contrário da
PCR convencional, em que a análise é realizada somente ao final da reação,
geralmente por eletroforese em gel(40).
A qPCR permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação
de DNA sejam realizados em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados,
diminuindo o risco de contaminação da amostra e garantindo maior precisão. Os
testes diagnósticos para o VHB que envolvem métodos moleculares de amplificação
geralmente compreendem as etapas de extração dos ácidos nucleicos de amostras
biológicas, seguido da amplificação de um segmento específico e detecção do
fragmento amplificado (amplicon)(40).
Fluorescência
13
Figura 3. Gráfico de amplificação de ácidos nucleico por PCR em tempo real.
A detecção da amplificação na qPCR pode estar baseada no uso de sondas
fluorescentes específicas para uma região da molécula que está sendo amplificada,
ou com o uso de reagentes fluorescentes que se intercalam na molécula de DNA.
Dentre estes últimos, o sistema Sybr Green é um dos mais utilizados para detecção
do VHB e outros vírus por qPCR(41, 42). O Sybr Green possui ligação altamente
específica ao DNA dupla-fita sendo utilizado para detectar o produto da PCR do VHB
conforme ele se acumula durante os ciclos da reação. Para todas as reações
utilizando este sistema de detecção deve-se realizar a análise da curva de melting
como controle de especificidade para o fragmento amplificado de acordo com o
tamanho do fragmento(43).
A análise de curva de melting permite a identificação do fragmento do VHB
amplificado através de uma temperatura específica (temperatura de melting, Tm),
podendo também distinguir sequencias de composições semelhantes com bases na
diferença de suas temperaturas de dissociação. A Tm é a temperatura na qual
14
metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade na forma
de dupla hélice. A Tm é dependente da composição do DNA, de modo que um
aumento do conteúdo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo
maior número de ligações de ponte de H(43, 44). No caso do VHB este tipo de
análise também pode ser utilizada(36, 42), assim como para o VHC(41).
Figura 4. Curva de Melting. Fragmentos de tamanhos distintos e Tm distintas.
Outro tipo de PCR, a PCR Multiplex, utiliza iniciadores (primers) múltiplos para
a
amplificação de vários
fragmentos dentro
de
uma única
reação
de PCR
convencional. No entanto, a sua transferência de uma plataforma convencional para
a plataforma da PCR em tempo real confundiu sua terminologia tradicional. O
termo PCR Multiplex PCR em tempo real é mais comumente usado para descrever
o uso de múltiplas sondas fluorogênicas na discriminação de vários amplicons(45,
46). Melhorias recentes na análise dos fragmentos através de curva de melting
permitem a utilização desta metodologia também para o sistema que utiliza o Sybr
Green no diagnóstico do VHB. Nesta metodologia os distintos fragmentos possuem
Tm diferentes apresentando picos característicos de cada alvo selecionado através
da utilização de primers específicos(36, 37, 42).
15
2. JUSTIFICATIVA
Tendo em vista a gravidade potencial da doença hepática em pacientes com
VHB e as características genéticas virais como determinantes do curso da doença
hepática, torna-se necessário desenvolver uma metodologia prática, rápida e de
baixo custo para o rastreamento das infecções pelo VHB no estado do Rio Grande
do Sul.
16
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Primário
Estabelecer uma metodologia in house, através da utilização da curva de
melting de PCR em tempo real (qPCR), para análise dos genótipos A, D e F do vírus
da hepatite B em amostras de pacientes com infecção crônica pelo Vírus da Hepatite
B do Complexo Hospitalar Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre,
Rio Grande do Sul, Brasil.
3.2 Objetivos Secundários

Estabelecer um teste molecular único para pesquisa dos genótipos A, D e
F do VHB na população do estado do Rio Grande do Sul baseado em PCR Nested
qPCR Multiplex;

Avaliar a prevalência dos genótipos do VHB em uma população geral;

Avaliar a presença das mutações no promotor basal do core e no pré-Core
e sua associação com a resistência aos antivirais;

Avaliar a correlação das mutações estudadas com os genótipos do VHB.
17
4 PACIENTES E MÉTODOS
4.1 Casuística
Foram avaliados 104 pacientes com infecção crônica pelo VHB que estavam
em acompanhamento no Ambulatório de Gastroenterologia e na Unidade de
Transplante Hepático do Complexo Hospitalar Irmandade Santa Casa de
Misericórdia de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.
Os critérios de inclusão foram: pacientes com pesquisa solicitada para HBsAg
no soro, independente dos níveis séricos de ALT (Alanina Aminotransferase) e AST
(Aspartato Aminotransferase).
Os critérios de exclusão foram: pacientes com anti-HCV positivo, anti-HIV
positivo, presença de co-infecção com o vírus delta (VHD), ingesta de bebida
alcoólica acima de 40 g/dia, uso de medicamentos potencialmente hepatotóxicos,
como ácido valpróico, carbamazepina, fenitoína, metotrexato e paracetamol.
Foi preenchido o protocolo pré-estabelecido no Setor de Transplante ou no
Ambulatório de Gastroenterologia (Anexo 8.1). Foram coletados dados dos
seguintes exames laboratoriais: ALT e AST, anti-HBc total, anti-HBs, anti-HBe e
HBeAg, anti-HIV e anti-HCV.
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFCSPA,
registrado na Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) sob o n° 09-443.
4.2 Métodos
De cada paciente foram coletados, a vácuo, dois frascos de sangue total com
EDTA gel (PPT) (2 x 5 mL - Vacutainer BD / Becton Dickinson UK Ltda). Após
18
centrifugação a 500 g, os plasmas foram separados e estocados em freezer a -80ºC
no Laboratório de Biologia Molecular da UFSCPA.
Após a coleta, as amostras receberam um número sequencial, de maneira
que a identificação dos pacientes fosse conhecida apenas pelo autor do projeto.
A Figura 5 mostra o fluxograma do desenvolvimento método-científico do
trabalho desenvolvido.
Figura 5. Fluxograma do desenvolvimento método-científico.
19
4.2.1 Determinação dos Genótipos e das Mutações Virais
Os genótipos do VHB foram determinados através do sequenciamento e pela
reação de PCR em tempo real (qPCR); as mutações foram determinadas por
sequenciamento segundo Sitnik et al (2004) (50). Cada procedimento será detalhado
a seguir.
A extração do DNA, a realização da reação em cadeia da polimerase em
tempo real (qPCR) in house e o sequenciamento das amostras foram realizados no
laboratório de Biologia Molecular da UFCSPA, na Simbios Biotecnologia (Canoas,
RS) e no Laboratório Weinmann Ltda (Porto Alegre, RS).
4.2.1.1 Extração de Ácidos Nucleicos
Para a extração do DNA viral foi utilizado o kit PureLink™ Viral
RNA/DNA Mini kit (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
Resumidamente, as amostras foram incubadas com proteinase K e tampão eluente
por 20 min a 56ºC; após a adição de etanol 100%, transferiu-se para a coluna de
extração. A coluna foi lavada com tampão e, após, foi transferida para um novo tubo
coletor. Por fim, foi realizada a eluição com 30 µL de H2O livre de RNAses e
DNAses. A coluna foi centrifugada novamente e o material do tubo coletor foi
armazenado em freezer a -80ºC.
4.2.1.2 Reações de PCR
O DNA extraído foi inicialmente amplificado por reação em cadeia da
polimerase Nested (PCR Nested) com primers específicos (Tabela 2), para ser
posteriormente empregado tanto para a reação de sequenciamento quanto para o
20
rastreamento pela reação de qPCR com discriminação dos genótipos pela análise da
curva de melting.
Tabela 2. Descrição dos primer utilizados.
Primer
Sequências
Temp. Anel.
Utilização
Primers PCR Nested e Sequenciamento (controle)*
FHBS1
5’-GAG TCT AGA CTC GTG GTG GAC TTC-3’
56ºC
Forward Externo-seq
RHBS1
5’-AAA TKG CAC TAG TAA ACT GAG CCA-3’
56ºC
Reverse Externo-seq
FHBS2
5’-CGT GGT GGA CTT CTC TCA ATT TTC-3’
56ºC
Forward Interno-seq
RHBS2
5’-GCC ARG AGA AAC GGR CTG AGG CCC-3’
56ºC
Reverse Interno -seq
Primers PCR Nested e qPCR (Tempo Rea)l **
FGEN
5′-TCA CCA TAT TCT TGG GAA CAA GA-3′
56ºC
Forward Genotipagem
RGEN
5′-CGA ACC ACT GAA CAA ATG GC-3′
56ºC
Reverse Genotipagem
FMA
5′-GGC TCM AGT TCM GGA ACA GT-3′
58ºC
Forward GEN A
RMA
5′-CTC GCG GAG ATT GAC GAG ATG T-3′
58ºC
Reverse GEN A
FMD
5′-GCC AAC AAG GTA GGA GCT-3′
58ºC
Forward GEN D
FMF
5′-GYT ACG GTC CAG GGT TAC CA-3′
58ºC
Forward GEN F
RMD/F
5′-GGA GGC GGA TYT GCT GGC AA-3′
58ºC
Reverse GEN D
* Sitnik et al. (2004); ** Naito et al. (2001).
4.2.1.2.1 PCR Nested para o sequenciamento e para a PCR em tempo real
O tipo de PCR realizado no estudo foi a PCR Nested na qual, para melhorar a
especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado
21
primeiramente de forma abrangente com um par de primers e, depois, este primeiro
produto de amplificação é utilizado em uma segunda reação com primers específicos
mais internos ao primeiro par de primers. Estas duas etapas (rodadas) foram
realizadas concomitantemente. O limite de sensibilidade de detecção viral do teste
da PCR utilizado foi de 400 cópias/mL, conforme Becker et al., 2010 (13).
Os soros dos pacientes foram tratados como descrito acima e submetidos a
duas rodadas de amplificação (PCR convencional), usando os primers externos
FHBS1 e RHBS1 e internos FHBS2 e RHBS2 para a reação de sequenciamento
(Tabela 2). Para cada PCR foi utilizado o kit Hot-Start (Promega) com 12,5 µl de
GoTaq® Hot Start Green Master Mix, 2X, 1,25 µl do primer Foward, 1,25 µl do primer
Reverse, 2 µL de DNA template e 10 µL de Nuclease-Free Water. A concentração
final dos primers foi de 0,5 µM(13).
A amplificação nas duas rodadas da PCR ocorreu com os seguintes ciclos em
um termociclador PTC-200 (MJ Research, Watertown, MA, USA): desnaturação
inicial a 94ºC por 20 s; 30 ciclos de 94ºC por 20 s, anelamento a 56ºC por 20 s,
extensão a 72ºC por 30 s; extensão final a 72ºC por 1 min; as amostras foram
mantidas a 4ºC até a etapa seguinte.
Para a qPCR utilizando a curva de melting como ferramenta de análise dos
fragmentos, foi realizada uma nova PCR Nested, combinada com Multiplex, baseada
em Naito et al. (2001), com algumas modificações. A primeira etapa da reação foi
realizada em plataforma de PCR convencional (primers externos) e a segunda etapa
da reação foi realizada em termociclador de PCR em tempo real (Applied Biosystem
7500), utilizando o kit GoTaq® qPCR Master Mix (Promega) com 12,5 µl de GoTaq®
Hot Start Green Master Mix, 2X, 1 µl de cada primer e 8,5 µl de Nuclease-Free
Water.
22
Na primeira etapa foram utilizados os primers (0,5 µM, concentração final)
FGEN (nt 2823-2845) e RGEN (nt 685-704) (Tabela 2), nas seguintes condições de
reação: desnaturação inicial a 94ºC por 20 s; 50 ciclos de 94ºC por 20 s, 56ºC por 30
s e 72ºC por 30 s; extensão final a 72ºC por 1 min.
A segunda reação foi uma PCR Multiplex (triplex) empregando os primers
FMA (nt 67–86); RMA (nt 113–134); FMD (nt 2979–2996); FMF (nt 3032–3051);
RMD/F (nt 3078–3097), todos com na concentração final de 0,1 µM (Tabela 2). As
condições de reação foram: desnaturação inicial a 95ºC por 50 s; 20 ciclos de 94ºC
por 15 s, 58ºC por 20 s, 72ºC por 30 s; extensão final a 72ºC por 1 min.
4.2.1.3 Identificação dos Produtos das Reações
A detecção dos produtos amplificados pela segunda reação de PCR
(convencional) Nested para o sequenciamento foi feita através de eletroforese em
gel de agarose.
Para a separação em gel dos produtos das reações da PCR, aplicou-se uma
voltagem que variou entre 70 V e 110 V, dependendo do tamanho da cuba utilizada.
Foram utilizadas concentrações de 0,5% a 1,5% de agarose no gel. A visualização
dos produtos no gel após a corrida foi realizada com brometo de etídio (EtBr) a 0,5
mg/mL. Esse composto tem a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de
DNA e emite fluorescência quando excitado com radiação ultravioleta. Adicionou-se
o EtBr no gel de agarose liquefeito antes da corrida.
As amostras foram aplicadas no gel; como controle negativo foi utilizada água
bidestilada
estéril,
e
como
controle
positivo
foi
aplicada
uma
amostra
23
conhecidamente positiva para cada produto de amplificação. As bandas foram
observadas em transiluminador com luz ultravioleta.
A detecção da amplificação dos produtos da qPCR foi realizada pela
observação das curvas de melting, conforme demonstrado na Figura 5.
4.2.1.4 Reação de Purificação para o sequenciamento (controle)
Os produtos da PCR foram purificados enzimaticamente. A reação de
purificação tem, como objetivo, deixar apenas o DNA íntegro, degradando os demais
componentes para que estes não interfiram no sequenciamento.
Os reagentes utilizados na purificação dos amplificados foram: clorofórmio,
exonuclease I (EXO I) e fosfatase alcalina (Shrimp alkaline phosphatase, SAP).
Para a reação de purificação, 2,0 µL de enzima SAP/EXO foram adicionados
a 2,0 µL do produto amplificado extraído com clorofórmio; as amostras foram
incubadas em termociclador por 15 min a 37ºC e 15 min a 80ºC.
4.2.1.5 Reação de Sequenciamento (controle)
Para o sequenciamento, foi utilizada a técnica derivada da metodologia de
Sanger et al. (13) utilizando-se didesoxinucleotídeos (ddNTPs) contendo marcadores
fluorescentes (Kit ABI PrismR BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). O sequenciador automático
utilizado foi o ABI 3130 (Applied Biosystems).
Para a reação utilizou-se 3-10 ng do DNA amplificado e purificado, 2,5 µL (3,2
pmol) de primer (primers FHBS2 ou RHBS2), 4 µL da mistura de reação do kit de
24
sequenciamento, 4 µL de tampão Tris-HCI (pH 9,0) e MgCI2 5X e 7,5 µL de água
destilada estéril para um volume final de 20 µL.
Em seguida, as amostras foram submetidas à reação de extensão e
marcação (Cycle sequencing) com BigDye Terminator (Applied Biosystens), (4 µL de
Reaction Premix , 5 µL de BigDye Sequencing Buffer, 3,2 pmols de Primer e 10 ng
de amostra) volume final de 20 µL, em um termociclador (PTC-200, MJ Research,
Watertown, MA, USA) com um programa específico para a síntese da fita e
incorporação dos ddNTPs marcados (25 ciclos de 96ºC por 30 s, 50ºC por 15 s e
60ºC por 4 min).
Após a reação de marcação, as amostras foram precipitadas com isopropanol
para a retirada dos ddNTPs marcados não incorporados. Aos 20 µL de reação,
foram adicionados 80 µL de isopropanol 75%. Os microtubos foram submetidos à
forte agitação por 10 segundos e incubados à temperatura ambiente por 15 minutos.
Após incubação, as amostras foram centrifugadas por 20 minutos a 600 g, à
temperatura ambiente. Em seguida, removeu-se o isopropanol e adicionaram-se
1000 µL de etanol 70% ao precipitado. As amostras foram novamente centrifugadas
por 15 min a 600 g, à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o etanol foi
retirado e as amostras foram incubadas a 90ºC por 2 min para a retirada total do
etanol.
Às amostras foram adicionados 6 µL de tampão de amostra (5 partes de
formamida: 1 parte de blue dextran (Applied Biosystems), homogeneizou-se várias
vezes, centrifugou-se por 15 s e incubou-se a 95ºC por 5 min para desnaturação. As
amostras foram analisadas no analisador genético ABI 3130 (Applied Biosystems).
25
4.2.1.6 Análise das Sequências (controle)
As análises dos genótipos e subtipos virais foram realizadas através da
comparação das sequências nucleotídicas, obtidas com sequências já conhecidas
dos diferentes genótipos do VHB, depositadas em bancos genômicos. Para análise
das sequências foi utilizado o programa Chromas Versão 2.31 (Technelysium Pty
Ltd), para tradução da sequência o programa DNA for Windows Versão 2.2 (David
Dixon) e, para comparação da sequência encontrada com as já conhecidas, ou seja,
para identificar o genótipo e subtipo viral, foi utilizado o programa GeneMapper
Versão 3.7 (Applied Biosystems).
4.3 Análise Estatística
Para análise dos dados resultantes foi utilizado o tratamento da estatística
descritiva (Média, Mediana, Frequência e Desvio Padrão). A ferramenta utilizada foi
o software SPSS versão 18. Para uma melhor visualização os resultados foram
dispostos em tabelas e gráficos.
26
5 RESULTADOS
A idade média dos pacientes foi 47,9 anos e a maior frequência de indivíduos
foi do sexo masculino (73%) (Tabela 3). A mediana das avaliações das enzimas
transaminases hepáticas foi 34,5 U/L (ALT) e 32,0 U/L (AST), sendo consideradas
dentro da normalidade (ALT < 50 U/L e AST < 40 U/L). O perfil sorológico dos
pacientes foi caracterizado por 82,7% de pacientes HBsAg positivos, 20,5% AntiHBsAg positivos, 29,7% HBeAg positivos, 66,2% Anti-HBeAg positivos, 95,3% AntiHBC Total positivos.
27
Tabela 3. Características Clínicas dos pacientes e Genótipos do VHB.
Variável
Valores
Idade, anos (média-Desvio
47,9+13,1
padrão)
Sexo n(%)
Masculino
73 (70,3%)
Feminino
31 (29,7%)
ALT mediana (p25-p50)
34,5 (22,2-52,75)
AST
32,0 (23,0-57,0)
HBsAg (n=104)
Positivo
86 (82,7%)
Negativo
18 (17,3%)
Anti-HBsAg (n=73)
Positivo
15 (20,5%)
Negativo
58 (79,5%)
HBeAg (n=74)
Positivo
22 (29,7%)
Negativo
52 (70,3%)
Anti-HBeAg (n=71)
Positivo
47 (66,2%)
Negativo
24 (33,8%)
Anti-HBC Total (n=64)
Positivo
61 (95,3%)
Negativo
3 (4,7%)
Genótipos (n=104)
A
23 (22,1%)
D
46 (44,2%)
F
4 (3,8%)
Indetectável
31 (29,8%)
28
A técnica utilizada, PCR Nested-qPCR Multiplex (em tempo real), possibilitou
a identificação dos distintos fragmentos e a temperatura de melting específica para
cada um dos genótipos (p<0,001). Cada genótipo possui tamanhos de fragmentos
diferentes, bem como a sua Tm: genótipo A possui 68 pares de base e a sua Tm é
de 76,1ºC; o genótipo D possui 119 pares de base e a sua Tm é de 82,4ºC e o
genótipo F possui 97 pares de base e a sua Tm é de 79,9ºC (Figura 6). A
confirmação dos resultados encontrados foi realizada pela genotipagem das
amostras pela técnica de sequenciamento.
A
B
Figura 6. Curvas de Melting para genotipagem do VHB. (A) Curvas de Melting normalizadas. (B)
Curvas de Melting derivadas. Genótipos A, D e F.
Com relação às frequências genotípicas, podemos observar uma maior
frequência do genótipo D (44,2%), seguido do genótipo A (22,1%) e do genótipo F
(3,8%). Cabe ressaltar que a frequência de casos onde o PCR para o VHB foi
indetectável (negativo) foi de 29,8%. Considerando os dados detectáveis, a
frequência do genótipo A foi de 32%, do genótipo D de 63% e do genótipo F de 5%.
29
A tabela 4 descreve a distribuição dos dados relacionando as características
dos pacientes com os genótipos do VHB das amostras dos pacientes (apenas os
genótipos detectáveis).
Tabela 4. Características Clínicas e Moleculares dos Pacientes de acordo com o Genótipo do VHB.
Variável
Genótipos
A
D
F
48,7+16,7
45,69+12,4
35,3+2,5
Masculino
15 (65,3%)
14 (30,5%)
4 (100%)
Feminino
8 (34,7%)
32 (69,5%)
-
30 (14-43,5)
42 (23,7-71,7)
49 (33-52)
34 (26,7-42,2)
36,5 (22,2-59,7)
39 (28-60)
Normal
18 (78,3%)
24 (52,2%)
3 (75,0%)
Elevada
5 (21,7%)
22 (47,8%)
1 (25,0%)
Normal
20 (86,9%)
35 (76,1%)
3 (75,0%)
Elevada
3 (13,1%)
11 (23,9%)
1 (25,0%)
Positivo
16 (69,5%)
43 (93,4%)
3 (75,0%)
Negativo
7 (30,5%)
3 (6,6%)
1 (25,0%)
Positivo
6 (55,5%)
2 (8,0%)
-
Negativo
5 (45,5%)
23 (92,0%)
-
Positivo
5 (50,0%)
8 (30,8%)
3 (100%)
Negativo
5 (50,0%)
18 (69,2%)
-
Idade, anos (média-Desvio padrão)
Sexo n(%)
AST mediana (p25-p50)
ALT
AST
ALT
HBsAg
Anti-HBsAg
HBeAg
30
Anti-HBeAg
Positivo
3 (30,0%)
18 (66,7%)
1 (50,0%)
Negativo
7 (70,0%)
9 (33,3%)
1 (50,0%)
Positivo
9 (81,8%)
21 (100%)
1 (100%)
Negativo
2 (18,2%)
-
Anti-HBC Total
Ao analisarmos as frequências dos subtipos virais nas 81 amostras
genotipadas, encontramos 34 (42,0%) pacientes ayw, 19 (23,5%) pacientes adw, 3
(3,7%) pacientes adw4 e 1 (1,2%) paciente aym, sendo que em 24 (29,6%)
pacientes os subtipos do VHB foram indetectáveis.
Figura 7. Frequência dos subtipos do VHB.
Por fim, através do sequenciamento realizado para confirmar na sua
totalidade os genótipos encontrados na reação de PCR em tempo real, foi realizada
a análise das mutações no VHB, assim como as características de resistência, para
os tratamentos disponíveis, em cada mutação. Nas 104 amostras estudas e
genotipadas, foram encontradas apenas 2 mutações, sendo estas mutações não
relacionadas com resistência ao tratamento convencional dos pacientes com VHB.
31
6 DISCUSSÃO
A genotipagem do VHB é importante para esclarecer a rota e patogenia do
vírus. Em particular, a análise da sequência dos diferentes isolados virais é
importante, porque as variantes podem diferir nos seus padrões de reatividade
sorológica, patogenicidade, virulência e resposta ao tratamento. Além disso, o VHB
possui variações genéticas com distribuição geográfica específica(13).
Os portadores de doença crônica pelo VHB chegam a cerca 400 milhões de
indivíduos sendo que aproximadamente 30% da população mundial já foi infectada
segundo dados da Organização Mundial de Saúde. No Brasil e no Rio Grande do
Sul, a prevalência da infecção pelo VHB é baixa, estando ao redor de 0,4%(14, 4750). A partir da década de 1990, iniciaram-se os estudos que revelaram a
diversidade genômica do VHB, com o isolamento de 8 genótipos (A-H)(16).
Posteriormente,
alguns
autores
demonstraram
que
o
amplo
espectro
de
manifestações clínicas que envolvem a doença hepática pelo VHB, bem como a
resposta ao tratamento antiviral, poderiam estar relacionados aos genótipos do vírus
B(13, 16, 51).
No Brasil, ainda são poucos os estudos que demonstram a prevalência dos
genótipos e subtipos do VHB(11, 13, 14, 49); para tanto existem algumas razões que
poderiam ser aventadas, como a pouca oferta de kits comerciais para genotipagem e
subtipagem do VHB, o que faz com que as técnicas da PCR sejam realizadas in
house, e o alto custo dos equipamentos e reagentes que envolvem a realização das
técnicas de biologia molecular, aumentando consideravelmente a dificuldade na
realização dos estudos nessa linha de pesquisa. Porém, a utilização da PCR em
32
tempo real com SybrGreen pode reduzir consideravelmente esses custos e o tempo
necessário para realizar esse procedimento. A nova técnica comparada com a
convencional (Sequenciamento) é 15 vezes mais barata e 10 vezes mais rápida(43).
Para realizar o diagnóstico molecular do VHB é de costume que a equipe
médica tenha acesso aos dados solicitados de sorologia(1, 33, 52). Existem vários
tipos de exames moleculares para o diagnóstico do VHB, dois deles utilizados neste
trabalho: o sequenciamento e a PCR. A PCR para o VHB é um dos métodos mais
utilizados, sendo o sequenciamento do genoma completo ou parcial do VHB
utilizado clinicamente para a verificação dos genótipos do VHB, porém com um custo
de insumos e mão de obra especializada elevados(13, 37, 53). Na pesquisa o
sequenciamento é utilizado para análise de mutações no genoma do VHB.
A replicação do VHB em um paciente infectado chega a 1011 novas
partículas por dia. A vida média do VHB no sangue é menor que 3 dias, porém,
dentro do hepatócito, o VHB pode sobreviver por mais de 100 dias(54). A alta
capacidade replicativa do VHB e o frequente desenvolvimento de uma infecção
crônica tornam necessário um tratamento prolongado. Por outro lado o
conhecimento do genótipo viral faz com que seja poupado tempo e recursos
financeiros, ao evitar um tratamento não adequado para um determinado
genótipo(22).
Os testes moleculares e sorológicos diferem em sua sensibilidade e
especificidade para detectar os diferentes alvos diagnósticos do VHB, sua
disponibilidade comercial, o tempo desde a obtenção da amostra e a obtenção do
resultado, no status de aprovação pelas autoridades e na sua habilidade de
distinguir os achados entre os distintos genótipos virais(15). Neste panorama, a
forma mais adequeda de pesquisa do VHB é a detecção do material genético do
33
vírus. Os testes sorológicos rápidos normalmente detectam antígenos (proteínas) do
vírus e são pouco sensíveis quando se relaciona com um polimorfismo e até mesmo
uma mutação pré-core(50, 55).
Define-se a classificação dos genótipos do vírus da hepatite B com base na
comparação de genomas completos designando os genótipos pelas letras A-H. A
genotipagem do VHB é importante para elucidar as diferenças na diversidade das
sequências
e
da
filogenia viral(25).
Vários
métodos
têm
sido aplicados
para genotipagem do VHB, incluindo sequenciamento, PCR com sondas, análise
de RFLP, ensaio de mutação de ponto colorimétrico, ensaio de reação em cadeia de
ligase, espectrometria de massa e ensaio imunoenzimático para os epitopos
genótipo-específicos(53, 56). Os principais sistemas de genotipagem que foram
desenvolvidos são baseados na reação em cadeia da polimerase, sendo que o de
Naito et al. (2001), baseado em PCR seguida por sequenciamento, utiliza primers
específicos para cada tipo do VHB, possibilitando a identificação dos genótipos de A
a F(57), mas não G e H; já o outro sistema, de Liu et al.(2008), é baseado em PCR
Multiplex para diferenciação dos genótipos A-G do VHB(58).
A utilização de uma metodologia como a qPCR fornece dados de maneira
rápida; uma qPCR que permita a diferenciação genotípica dispensa, para fins de
diagnóstico
e
tratamento,
as
etapas
de
sequenciamento
e
análise
das
sequências(59). O diagnóstico molecular do VHB pode ser realizado em soro,
plasma ou até mesmo fluido oral(60). Para cada uma das amostras, padronizações e
melhorias na qualidade e quantidade de DNA devem ser realizadas. Neste
panorama, Portilho et al. salientam que cada centro de diagnóstico deve realizar a
sua padronização de acordo com as rotinas de coleta e processamento das
amostras(60). Com esse objetivo, o estudo aqui apresentado utilizou tanto para a
34
reação de sequenciamento quanto para a padronização da PCR em tempo real
Multiplex para os genótipos do VHB, uma PCR prévia promovendo aumento da
qualidade e quantidade do DNA viral. Seguido da primeira reação, na segunda
reação foi realizada a PCR Multiplex com o sistema Sybr Green. A utilização do Sybr
Green indispensavelmente necessita da análise da curva de melting para verificar o
fragmento amplificado quanto a sua especificidade. Diversos estudos utilizam esta
metodologia em Multiplex por possuir um custo operacional muito menor que o
sistema Taqman. As sondas Taqman requerem marcação específica com
fluoróforos, acarretando em maiores custos tanto no que diz respeito à síntese de
óligos para a sonda, como para a marcação com o quencher ou com o repórter da
sonda(43).
No Rio Grande do Sul, até o presente estudo, nenhum centro havia realizado
a técnica de PCR Multiplex para a determinação da genotipagem do vírus B da
hepatite. A utilização da curva de melting no presente estudo obteve especificidade
e reprodutibilidade semelhante àquelas obtidas e demonstradas para a detecção de
outros vírus(41, 43, 44).
Diversos trabalhos visam a utilização da reação de PCR em tempo real para a
identificação de cepas, porém com uma abordagem generalista. Daniel et al.(2009)
desenvolveram um ensaio in house para a quantificação do VHB, sugerindo a
utilização de uma reação Multiplex para a identificação de co-infecções com o vírus
de hepatite C e o vírus da imunodeficiência humana(37). Liu et al. (2006) utilizaram a
curva de melting como ferramenta para definição dos genótipos do VHB após a
utilização de um pré-PCR com sondas, dividindo os genótipos em dois grupos(61).
No presente estudo foi utilizado um conjunto de primers em Multiplex visando
35
detectar os genótipos mais frequentes em nosso país, principalmente no Rio Grande
do Sul, diferente do estudo citado anteriormente.
Uma vantagem deste novo conjunto de primers é que o genótipo é obtido
diretamente na PCR, sem tratamento posterior. Além disso, o método foi desenhado
para ter uma maior precisão na genotipagem e sensibilidade para genótipos mistos
de detecção igual ou maior do que a das reações que utilizam o sequenciamento, as
quais são as metodologias mais frequentemente aplicadas nos laboratórios de
diagnóstico de nossa região. Em recente estudo de Yin et al., foi demonstrada a
importância de uma co-infecção dos genótipos do VHB, o que promoveu o aumento
da carga viral, assim como maior risco para o desenvolvimento do CHC (62). Uma
possível limitação do método é que o genótipo não é identificado por uma
reação única.
Esse estudo objetivou, primariamente, a implementação de uma técnica ainda
não realizada em nossa região, combinando um desempenho fácil com boa
sensibilidade e especificidade. Além disso, a análise de genotipagem utilizando um
PCR Multiplex pode detectar infecções por dois ou mais genótipos. Portanto, este
método é muito conveniente e poderá ajudar pesquisadores na realização de
estudos
epidemiológicos
em grande
escala. Investigações
adicionais,
utilizando amostras de soro a partir de outras regiões geográficas, são necessárias
para a classificação e caracterização do VHB.
Uma vez alcançado o objetivo primário, analisamos a soroprevalência dos
genótipos e subtipos do VHB em uma população de pacientes com marcadores
sorológicos da infecção viral B, que estavam em acompanhamento ambulatorial e
em uma unidade de gastroenterologia de um hospital geral. Uma limitação do
trabalho foi a presença de 29,8% de amostras com genótipos não detectáveis. Este
36
fato pode estar relacionado a uma limitação dos testes moleculares laboratoriais
porem, salienta-se que não foi realizado o acompanhamento dos pacientes em
relação ao tratamento onde se constata que em alguns casos uma possível
soroconversão(51, 63).
As razões para a ausência do DNA do VHB no soro, em pacientes com
HBsAg positivo, permanecem desconhecidas, no entanto, a presença de variantes
do VHB com um baixo nível de replicação, neste estudo traduzidas pela ausência do
HBeAg,
podem
e
devem
ser
consideradas
como
mecanismos
inibitórios
relacionados ao sistema imunológico dos pacientes infectados ou resultado falsopositivo do antígeno viral. No entanto, deve ser ressaltado que foi possível identificar
o VHB e seus genótipos em pacientes HBeAg negativos e com aminotransferases
normais, sugerindo que a metodologia utilizada possa apresentar melhor
sensibilidade mesmo nesta população de portadores inativos do VHB. Outros
parâmetros relacionados à detecção do DNA do VHB devem ser analisados, tais
como o método diagnóstico utilizado, as condições de armazenamento das amostras
e o tipo de material biológico analisado (soro, células mononucleares do sangue
periférico e tecido hepático).
A presença de 80% (em HBsAg positivos) de positividade do DNA viral em
nossa amostra corroboram resultados de estudos anteriores, de 79,1% e 76%(13,
64, 65). Um cenário semelhante foi encontrado por outros autores em uma
população de pacientes em hemodiálise de Goiânia, nos quais o VHB-DNA pela
PCR foi positivo entre 67% e 88% dos pacientes HBsAg positivos(12, 66, 67).
Os resultados encontrados nesta análise demonstram uma prevalência
elevada do genótipo D (63%) seguido do genótipo A (32%). O genótipo F foi
encontrado em apenas 5% da população genotipada, dados semelhantes ao estudo
37
realizado no Brasil, de Haddad, e também semelhante à um estudo anterior de
nosso grupo(13, 38).
A distribuição dos genótipos na população brasileira correlaciona-se à origem
dos nossos ascendentes. A presença dos genótipos A e D sugere a influência da
afrodescendência, ocorrida por conta do período da escravidão passada, além da
influência da colonização européia. O Instituto Oswaldo Cruz (IOC), pioneiro em
estabelecer os genótipos do vírus que circulam no Brasil, identificou que cerca de
50% dos vírus encontrados no país são do genótipo A, subtipo africano,
possivelmente relacionado à introdução dos africanos no Brasil pelo comércio
escravo. Um estudo realizado na Bahia com 120 indivíduos com diagnóstico de
hepatite B crônica demonstrou que o genótipo mais frequente foi o A, seguido do
genótipo F(50).
Já no Rio Grande do Sul, há um predomínio de descendentes europeus. Na
presente análise, o genótipo D foi o mais prevalente no grupo dos pacientes com
hepatite B crônica, indo ao encontro de resultados já publicados(13), sendo que os
subgenótipos D têm distribuição mundial não seletiva. Outro estudo realizado na
região Sul(68) demonstrou a mesma frequência dos genótipos do VHB que
encontramos, sendo o genótipo D o mais frequente, em seguida o genótipo A, e o
menos frequente o genótipo F. O genótipo D é encontrado, principalmente, na região
do Mediterrâneo, local de uma importante leva de imigrantes que se dirigiram à
região Sul do Brasil, como italianos, espanhóis e portugueses(69), o que pode
explicar os achados descritos. O genótipo F é, por sua vez, característico da
população nativa das Américas, com um aumento desse genótipo na Argentina(70),
o que então não surpreende de ter sido encontrado neste estudo. No estudo em
foco, os genótipos B, C, E, G e H não foram encontrados na análise dos pacientes.
38
A presença do HBsAg na maioria das amostras indica infecção aguda ou
quadros ativos de hepatite crônica pelo VHB. A maior parte dos pacientes em nosso
estudo apresentaram positividade para HBsAg independente do genótipo, porém,
em alguns pacientes, mesmo com HBsAg negativo foi possível fazer a identificação
do VHB e sua genotipagem. A frequência da positividade do HBsAg nos pacientes
em que foi possível identificar o genótipo vai de encontro com a literatura(12, 35, 66).
Os marcadores sorológicos podem apresentar comportamento de janela
imunológica independente do genótipo do VHB. Foi encontrada, em nosso estudo,
uma maior frequência de pacientes negativos para Anti-HBsAg e também para
HBeAg no genótipo D, não apresentando diferença no genótipo A. Podemos inferir
que estes pacientes não estavam em processo de infectividade. Sendo assim,
observamos também que 18 pacientes com o genótipo D apresentaram positividade
para o HBeAg, sugerindo fase ativa. Sitnik e colaboradores encontraram que
mutações pre-core podem fazer com que o teste diagnóstico para o HBeAg possa
apresentar resultado negativo, de forma que mais estudos comparando as
sorologias dos pacientes e os genótipos do VHB devem ser realizados(50). O
desconhecimento do estado de tratamento de cada paciente dificulta uma
abordagem mais detalhada, fazendo com que alterações nos padrões sorológicos
sejam erroneamente interpretadas. Poucos estudos relacionam os marcadores
sorológicos da hepatite B com os genótipos do VHB.
O sequenciamento direto de um fragmento relativamente curto do genoma do
VHB parece ser eficiente para a determinação tanto do genótipo quanto do subtipo
viral, bem como as mutações com potencial impacto sobre a antigenicidade do VHB
e resposta ao tratamento. Porém, para uma triagem populacional e um rápido
diagnóstico, outras metodologias devem ser avaliadas. Muitos estudos buscam
39
estabelecer metodologias abertas para a avaliação dos parâmetros moleculares do
VHB. Por fim, este estudo estabeleceu uma metodologia visando a rápida
determinação dos genótipos de VHB mais frequentes na população brasileira,
principalmente no Rio Grande do Sul.
40
7 CONCLUSÃO
O ensaio de PCR descrito no presente estudo fornece um método rápido e
preciso para diferenciar genótipos do VHB (A, D e F) usando uma PCR Nested
combinada com uma PCR Multiplex em tempo real (PCR Nested – qPCR Multiplex)
com primers específicos. Este método pode ser útil para a genotipagem do VHB
em larga
escala clínica
e para
estudos
epidemiológicos,
especialmente
em
regiões com alta prevalência de infecção pelo VHB. A simplicidade e a rapidez do
presente ensaio de PCR pode reduzir o custo e complexidade de reconhecer estes
genótipos.

Foi possível estabelecer um teste molecular único para detecção e
diferenciação dos genótipos A, D e F do VHB na população do estado do
Rio Grande do Sul;

Foi descrita a prevalência dos genótipos do VHB em uma população
geral metropolitana de Porto Alegre, sendo o genótipo D o mais
frequente;

Apenas 2 amostras possuíam mutações no promotor basal do core e na
pré-Core e não foi encontrada associação com a resistência aos
antivirais;

Não foi possível avaliar a correlação das mutações estudadas com os
genótipos do VHB.
Os resultados apresentados neste trabalho foram utilizados para a
preparação de um manuscrito a ser submetido para publicação como artigo
científico (Anexo 8.3).
41
8 ANEXOS
8.1 Protocolo
Data: __/__/__
No: ________
PROTOCOLO
Nome do paciente: ______________________________________________________
Idade: _______ anos
Sexo: ( ) 1 - Feminino / 2 - Masculino
Cor: ( ) 1 - Branco / 2 - Negro
Endereço: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________
Cidade: ___________________ Fone: ________________ Celular: ______________
Grupo:
(
)
1 – pacientes ambulatoriais que não receberam tratamento para o VHB;
2 – pacientes ambulatoriais que receberam tratamento para o VHB;
3 – pacientes submetido a TOF (transplante ortotópico de fígado).
Exames:
AST: _______
BD:_______
Plaquetas: ________
anti-HBE: ___________
ALT: _______
TP:_______
AFP: ____________
anti-HBc total: _______
BT: ________
FA: _______
HBeAg __________
anti-HBs:___________
42
8.2
Consentimento Pós-Informação
Data: __/__/__
o
N : ____
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO
Estamos realizando, neste hospital um trabalho de pesquisa sobre o Vírus da Hepatite B (VHB) e
gostaríamos de saber se o senhor(a) se dispõe a ajudar-nos.
Muitas pessoas são atendidas diariamente, depois de saber que têm o VHB após fazer exames de
laboratório. Elas podem ter-se contaminado através de relações sexuais, uso de drogas, após ter feito
cirurgia ou durante o parto.
Já se sabe que existem diferentes tipos de vírus, por nós chamados de genótipos que, através de uma
detecção, poderemos saber quais os tipos de vírus da Hepatite B existem na cidade de Porto Alegre – RS, a
relação destes com a evolução da doena do fígado e quais pessoas responderam melhor ao tratamento.
Muitos estudos estão sendo feitos por todo o mundo, mas muito poucos em nossa região, por isso
estamos realizando esse trabalho.
Para colaborar conosco, você terá que responder poucas perguntas e coletar sangue como você
sempre fez nos exames de rotina. Com esse estudo, o senhor(a) saberá o tipo (genótipo), e se há ou não
mutações. As informações referentes aos resultados encontrados neste estudo, seu nome e outros dados
pessoais serão mantidos em absoluto segredo. Desta maneira realizará um exame que ainda não é
disponível no nosso meio sem nenhum custo.
A sua decisão em participar ou não desta pesquisa não irá influenciar de forma nenhuma na qualidade
do atendimento oferecida pela equipe médica deste hospital, e serão realizados os exames laboratoriais
usuais. Essa pesquisa não terá nenhum custo extra a você.
Caso queira retirar-se do estudo, estará livre para fazê-lo em qualquer momento que desejar. Se tiver
alguma dúvida em relação à pesquisa, por favor, entre em contato para que possamos explicá-la.
PACIENTE
(letra de forma)
PESQUISADOR
CARLOS EDUARDO BECKER
Fone: 51 99997240
Assinatura do Paciente
Assinatura do Pesquisador
43
8.3
Manuscrito
Melting Curve Analysis for the Screening of Hepatitis B Virus Genotypes A, D
and F in Patients from a General Hospital in Southern Brazil
1
Carlos Eduardo Becker, 1Nelson Alexandre Kretzmann Filho, 1Ângelo Alves de
Mattos, 1,2,*Ana Beatriz Gorini da Veiga
1 Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre – Programa de Pós-Graduação em Medicina: Hepatologia
2 Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre – Programa de Pós-Graduação em Patologia
* Corresponding author. A.B.G.Veiga. Email [email protected]. Tel +55 51 3303 8763
Key words: Hepatitis B Virus, Melting Curve Analysis, Genotypes, Nested-Multiplex
qPCR
ABSTRACT: Introduction: Hepatitis B virus (HBV) can cause fulminant
hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC), and is one of the most
common causes of acute and chronic liver failure. The genetic variants of HBV can
be decisive for the evolution of these diseases as well as for the election of therapy.
Objectives: The aim of this study was to evaluate and standardize an in house
methodology based on the analysis of the melting curve of real-time PCR (qPCR) to
screen for genotypes A, D and F of hepatitis B virus in patients from a hospital in Rio
Grande do Sul, Brazil. Methodology: We evaluated 104 patients with HBV chronic
infection. Viral DNA was extracted from plasma and viral genotypes and different
mutations were determined using PCR-based protocols. Results: A PCR-based
methodology was standardized for the analysis of genotypes A, D and F of HBV. The
technique was based in a nested PCR with the final step consisting of a multiplex
44
real-time PCR, using the melting curve as a tool for the differentiation of fragments. A
higher frequency of genotype D (44.4%), followed by genotype A (22.2%) and
genotype F (3.7%) was observed. Conclusion: The standardized assay, a nested
PCR-multiplex qPCR using specific primers, provides a rapid and accurate method
for the differentiation of HBV genotypes that are more frequent in Southern Brazil –
A, D and F. This method can be applied in the clinical practice.
1. INTRODUCTION
Infection by hepatitis B virus (HBV) is a serious global public health problem
(1). The infection can be transmitted through sexual intercourse, parenteral contact or
vertical transmission (mother-to-child), and can lead to chronic liver disease,
including cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC) (2).
In Brazil, the Ministry of Health estimates that at least 15% of the population
has already been infected with HBV, with chronic disease in about 1% of the
Brazilian population and a mortality rate of 0.6 per 100,000 inhabitants (3). The
medical literature refers to the southern region as an area of low endemicity; the
Midwest, Northeast and Southeast regions as intermediate endemicity; and the
Amazon region, the State of Espírito Santo and the Western region of the State of
Santa Catarina as regions of high endemicity (3-6).
The molecular characteristics of the virus are responsible for the development
not only of acute hepatitis B, but also for various manifestations of chronic liver
disease, accounting for an important percentage of liver diseases (7).
45
The progression of liver disease, as well as the response to antiviral therapy,
are dependent on the HBV genotype (8). The course of HBV infection is influenced
by many factors that affect the virus-host interaction, including genetic factor such as
the viral genotype, which can influence the expression of the viral antigens (9). Eight
different HBV genotypes (A-H), with distinct geographic distribution, are known (10).
The investigation of the distribution of viral genomes may reveal variations
between genotypes, which might be associated, for instance, with bad prognosis or
even with more effective treatment options. Molecular diagnostic tests analyze the
genetic content for information of the virus. These tests allow the analysis of
sequences of specific regions of the viral genetic material, to identify mutations or
quantify the levels of genetic material that can be expressed (11). Viral load data
obtained by quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) prior to
treatment can be used in the evaluation of prognosis in response to treatment. HBV
genotyping is generally carried out by DNA sequencing (5).
In view of the severity of liver disease in HBV patients, and the viral genetic
characteristics as determinants of liver disease progression, the present study aimed
to develop a practical, rapid and low cost methodology for the screening of HBV
genotypes A, D and F in patients of Rio Grande do Sul, through the use of the
melting curve analysis of real time PCR (qPCR) products.
46
2. PATIENTS AND METHODS
2.1. Patients
The study included 104 patients with chronic infection by hepatitis B virus
attended to in the Gastroenterology Center and Liver Transplant Unit of the
Complexo Hospitalar Irmandade Santa Casa de Misericórdia in Porto Alegre, Rio
Grande do Sul, Brazil.
The inclusion criteria were: patients with requested search for HBsAg in
serum, independent of serum levels of ALT and AST. The exclusion criteria were:
patients with positive anti-HCV or anti-HIV serum, presence of co-infection with the
delta virus (HDV), daily alcohol intake higher than 40 g, and use of potentially
hepatotoxic drugs.
A pre-established form was filled at the Gastroenterology Center or Liver
Transplant. The results of the following laboratory tests were registered: ALT and
AST, total anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe and HBeAg. This study was approved by the
Research Ethics Committee of Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto
Alegre (UFCSPA), and registered at the National Ethics Research Committee
(CONEP) under number 09-443.
2.2 Methods
2.2.1. Determination of Genotypes and Viral Mutations
The HBV genotypes were determined by sequencing and qPCR reaction; the
mutations were determined by sequencing, according to Sitnik et al (2004) (12).
47
2.2.1.1. PCR
The viral DNA was extracted with PureLink™ Viral RNA/DNA Mini kit
(Invitrogen, CA), according to the manufacturer's instructions.
The DNA was first amplified by nested PCR with two pairs of specific primers
(Table 1) for each reaction (sequencing reaction and screening by qPCR with
discrimination of genotypes by melting curve analysis).
Table 1. Description of primers.
Primer
Sequences
Annealing
temperature
Use
Primers for Nested PCR and Sequencing (control)*
FHBS1
5’-GAG TCT AGA CTC GTG GTG GAC TTC-3’
56ºC
Forward External-seq
RHBS1
5’-AAA TKG CAC TAG TAA ACT GAG CCA-3’
56ºC
Reverse External-seq
FHBS2
5’-CGT GGT GGA CTT CTC TCA ATT TTC-3’
56ºC
Forward Internal-seq
RHBS2
5’-GCC ARG AGA AAC GGR CTG AGG CCC-3’
56ºC
Reverse Internal-seq
Primers for Nested PCR and qPCR (Real Time) **
FGEN
5′-TCA CCA TAT TCT TGG GAA CAA GA-3′
56ºC
Forward Genotyping
RGEN
5′-CGA ACC ACT GAA CAA ATG GC-3′
56ºC
Reverse Genotyping
FMA
5′-GGC TCM AGT TCM GGA ACA GT-3′
58ºC
Forward GEN A
RMA
5′-CTC GCG GAG ATT GAC GAG ATG T-3′
58ºC
Reverse GEN A
FMD
5′-GCC AAC AAG GTA GGA GCT-3′
58ºC
Forward GEN D
FMF
5′-GYT ACG GTC CAG GGT TAC CA-3′
58ºC
Forward GEN F
RMD/F
5′-GGA GGC GGA TYT GCT GGC AA-3′
58ºC
Reverse GEN D
* Sitnik et al. (2004); ** Naito et al. (2001).
2.2.1.2. Nested PCR for sequencing and for qPCR
Sera of patients underwent two rounds of amplification using external (FHBS1
and RHBS1) and internal primers (FHBS2 and RHBS2) for the sequencing reaction.
The Hot-Start mix (Promega, Brazil) was used for each PCR reaction, with a final
48
primer concentration of 0.5 µM (7). The PCR was performed with the following
cycles: initial denaturation at 94ºC for 20 s; 30 cycles of 20 s at 94ºC, annealing at
56ºC for 20 s, extension at 72ºC for 30 s; and final extension at 72ºC for 1 min.
A nested triplex PCR reaction was performed for the melting curve analysis,
according to Naito et al (2001), with modifications. The first step of the reaction was
performed by conventional PCR (external primers), and the second step of the
reaction was performed in a qPCR system (Applied Biosystem 7500), using the
GoTaq® qPCR Master Mix kit (Promega, Brazil).
The FGEN and RGEN primers (final concentration 0.5 µM each) were used for
the first step of amplification, with the following conditions: initial denaturation at 94ºC
for 20 s; 50 cycles at 94ºC for 20 s, 56°C for 30 s and 72ºC for 30 s; final extension at
72ºC for 1 min. The second PCR step used the FMA, RMA, FMD, FMF and RMD/F
primers, all in the final concentration of 0.1 µM. The reaction conditions were: initial
denaturation at 95ºC for 50 s; 20 cycles of 94ºC for 15 s, 58ºC for 20 s, 72ºC for 30 s;
final extension at 72ºC for 1 min.
The sensitivity of the lower limit of viral detection was established at 400
copies/mL.
2.2.1.3. Sequencing Reaction
The amplified fragments were sequenced based on the methodology
described by Sanger et al. (13), using dideoxinucleotides (ddNTPs) labeled with
fluorescent markers (Kit ABI PrismR BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The automatic ABI 3130 DNA
analyzer (Applied Biosystems) was used in a commercial molecular laboratory as
control. Sequences were analyzed with the Chromas program (Version 2.31,
49
Technelysium Pty Ltd) and translated with the DNA program for Windows (Version
2.2, David Dixon). The GeneMapper program Version 3.7 (Applied Biosystems) was
used for comparison of the sequence found with known sequences, to identify the
viral genotype and subtype.
2.2.2. Statistical Analysis
The results were analyzed using descriptive statistical methods (mean,
median, frequency and standard deviation), with the software SPSS version 18.
Results were arranged in tables and charts, for best visualization.
3. RESULTS
This study was conducted with 104 HBV patients, attended at the Complexo
Hospitalar Santa de Misericórdia de Porto Alegre. A nested PCR method with a final
step consisting of a multiplex real time PCR (Nested-Multiplex qPCR), using melting
curve analysis for the identification of genotype-specific fragments, was standardized
for analysis of HBV genotypes.
The average age of patients was 47.9 years, and males accounted for 70.3%
of the sample (Table 2). Median values of liver transaminases were 34.5 U/L (ALT)
and 32.0 U/L (AST), considered within the normal range (ALT, 50 U/L and AST, 40
U/L). The serological analysis showed that 82.6% of the blood samples were positive
for HBsAg, 20.5% for anti-HBsAg, 29.7% for HBeAg, 66.2% for anti-HBeAg, and
95,3% for HBC-Total.
50
Table 2: Clinical Characteristics of Patients and HBV Genotypes.
Variable
Age in years
deviation)
Values n (%)
(mean-standard
47.9+13.1
Gender n (%)
Male
73 (70.3%)
Female
31 (29.7%)
ALT median (p25-p50)
34.5 (22.2-52.75)
AST
32.0 (23.0-57.0)
HBsAg (n=104)
Positive
86 (82.6%)
Negative
18 (17.4%)
Anti-HBsAg (n=73)
Positive
15 (20.5%)
Negative
58 (79.5%)
HBeAg (n=74)
Positive
22 (29,7%)
Negative
52 (70,3%)
Anti-HBeAg (n=71)
Positive
47 (66,2%)
Negative
24 (33,8%)
HBC-Total (n=64)
Positive
61 (95,3%)
Negative
3 (4,7%)
Genotypes (n=104)
A
23 (22,1%)
D
46 (44,2%)
F
4 (3,8%)
Undetectable
31 (29,8%)
After extraction of DNA, samples were amplified by PCR and the fragments
were analyzed by agarose gel electrophoresis, with detection of HBV. After
confirmation of the presence of the fragment, each amplification product was used for
the second amplification reaction with genotype-specific primers.
The second reaction, performed using the reagent Sybr Green, allows
evaluation of the specificity of the reaction by melting curve analysis, with a specific
melting temperature (Tm) for each fragment amplified. As already mentioned, the
melting curve analysis is based on the Tm, in which half of the DNA molecules are in
51
the form of single strand and the other half in the form of a double helix. The Tm is
dependent on DNA composition, and is directly related to the G+C content in DNA –
which, in turn, involves a higher number of H bonds. Since each amplified fragment
has a specific size and base composition, they can be identified by melting curve
analysis. In the present study, this analysis was also used for identification of HBV
genotypes: A (68 bp), D (119 bp) and F (97 bp).
The technique used, Nested-Multiplex qPCR, allowed the identification of
fragments with the expected melting temperature for each of the specific viral
genotypes (p<0.001) (Figure 1). The genotypes were confirmed by DNA sequencing
(data not shown).
A
B
Figure 1: Melting curve analysis for HBV genotyping. (A) Normalized melting curves. (B)
Derived melting curves. Genotypes A, D and F.
The results showed a higher frequency of genotype D (44.2%), followed by
genotype A (22.1%) and genotype F (3.8%). It should be noted that, in 29.8% of the
samples, HBV was undetectable (negative) by PCR. Considering the remaining
samples, the frequency of the genotypes A, D and F was 32%, 63% and 5%,
respectively.
52
Table 3 describes the molecular characteristics of patients according to HBV
genotypes, as well as other clinical data.
Table 3: Clinical and Molecular Characteristics of Patients According to HBV Genotypes.
Variable
Genotype
A
D
F
48.7+16.7
45.69+12.4
35.3+2.5
Male
15 (65.3%)
14 (30.5%)
4 (100%)
Female
8 (34.7%)
32 (69.5%)
-
ALT median (p25-p50)
30 (14-43.5)
42 (23.7-71.7)
49 (33-52)
AST
34 (26.7-42.2)
36.5 (22.2-59.7)
39 (28-60)
Normal
18 (78.3%)
24 (52.2%)
3 (75.0%)
High
5 (21.7%)
22 (47.8%)
1 (25.0%)
Normal
20 (86.9%)
35 (76.1%)
3 (75.0%)
High
2 (13.1%)
11 (23.9%)
1 (25.0%)
Positive
16 (71.4%)
43 (93.5%)
3 (66.7%)
Negative
7 (28.6%)
3 (6.5%)
1 (33.3%)
Positive
6 (55.5%)
2 (8.0%)
-
Negative
5 (45.5%)
23 (92.0%)
-
Positive
5 (50.0%)
8 (30.8%)
3 (100%)
Negative
5 (50.0%)
18 (69.2%)
-
Positive
3 (30.0%)
18 (66.7%)
1 (50.0%)
Negative
7 (70.0%)
9 (33.3%)
1 (50.0%)
Positive
9 (81.8%)
21 (100%)
1 (100%)
Negative
2 (18.2%)
-
Age in years (mean-standard
deviation)
Gender n (%)
AST
ALT
HBsAg
Anti-HBsAg
HBeAg
Anti-HBeAg
HBC-Total
Finally, DNA sequencing performed to confirm the genotypes found by qPCR
reaction allowed also the analysis of mutations presented by HBV, as well as the
associated resistance to the treatments available (data not shown). Only two
mutations, unrelated with resistance to conventional treatment of patients with HBV,
were observed in the 104 samples studied and genotyped.
53
4. DISCUSSION
Genotyping of HBV is important to investigate the route of infection and
pathogenicity of the virus. In particular, the analysis of the DNA sequence in different
viral isolates may identify their patterns of serological reactivity, pathogenicity,
virulence and response to treatment. In addition, genetic variations of HBV have
specific geographical distribution (5).
In Brazil, yet there are few investigations on the prevalence of HBV genotypes
and subtypes (3, 5, 6, 14). Some of the reasons for that are related to the short
supply of commercial kits for genotyping and subtyping of HBV, which causes the
PCR techniques to be conducted in house, and the high cost of equipment and
reagents necessary for molecular biology techniques, which greatly increase the
difficulty in conducting studies in this line of research. However, the use of real-time
PCR with Sybr Green can dramatically reduce these costs (15).
In clinical practice, the molecular diagnosis of HBV usually includes serological
analyses (1, 16, 17). Two of the several types of molecular tests available for HBV
diagnosis were used in this work: sequencing and PCR. The PCR for HBV is one of
the most used methods, with complete or partial genome sequencing as a clinical
tool for the determination of HBV genotypes. The costs of reagents and labor,
however, are high (5, 18, 19). In research activities, sequencing is used for analysis
of mutations in the genome of HBV.
Molecular and serological tests differ in their sensitivity and specificity to detect
the different HBV diagnostic targets, as well as in their commercial availability, time
between receiving the samples and producing the result, approval status by the
authorities and in their ability to distinguish between viral genotypes (20, 21). In this
context, the molecular techniques used to investigate HBV infection enable the
54
detection of viral genetic material and are considered more adequate for diagnosis.
On the other hand, rapid serologic tests generally detect viral antigens (proteins) and
have low sensitivity for identification of polymorphisms and even pre-core mutations
(12, 22).
Genotyping of HBV is important to elucidate the differences in diversity of
sequences and viral phylogeny (23). Several methods have been used for
genotyping of HBV, including sequencing, PCR with probes, RFLP analysis,
colorimetric test for detecting point mutations, ligase chain reaction, mass
spectrometry and enzyme-linked immunosorbent assay for genotype-specific
epitopes (18, 24). The main genotyping systems that have been developed are
based on the polymerase chain reaction. The system described by Naito et al. (2001)
uses primers specific to each type of HBV, allowing the identification of genotypes AF (25), but not G and H. The system described by Liu et al. (2008), on the other
hand, is based on multiplex PCR (26).
The use of real-time PCR provides rapid results. With a real time PCR method
that allows genotyping, sequencing and analysis of sequences for diagnostics and
treatment are not necessary (27). The molecular diagnosis of HBV can be
accomplished with serum, plasma, or even oral fluid samples (28). Standardization
and improvement in the quality and quantity of DNA must be performed for each
sample. In this context, Portilho et al. observed that laboratories should standardize
their own procedures according to the routines of collecting and processing of
samples (28). With this objective, in the present study a previous PCR was
conducted to increase the quality and quantity of the viral DNA, both for the
sequencing reaction and for the standardization of the multiplex real-time PCR to
study HBV genotypes. After the first reaction, a multiplex PCR with the Sybr Green
55
system was performed. The use of Sybr Green must be followed by melting curve
analysis to determine the specificity of the amplified fragment. Several studies use
this multiplex methodology, due to its lower operating cost when compared to the
Taqman system, whose higher costs are related to the need of synthetic fluorescent
probes consisting of fluorochrome and quencher, in addition to primers (15).
This is the first study using a multiplex PCR technique for the genotyping of
hepatitis B virus in the state of Rio Grande do Sul, Southern Brazil. The use of
melting curve analysis showed that the specificity and reproducibility were similar to
previously published results for other viruses (15, 29, 30).
Several reports have described the use of real-time PCR for the identification
of strains, however with a generalist approach. Daniel et al. (2009) have developed
an in house assay for the quantification of HBV, suggesting the use of a multiplex
reaction for the identification of co-infections with hepatitis C virus and human
immunodeficiency virus (19). Liu et al. (2006) used melting curve analysis as a tool
for definition of HBV genotypes; in that study, a pre-PCR step using specific probes
separated the genotypes in two groups prior to the PCR (26, 31). In the present
study, a set of multiplex primers was used for detection of the most common HBV
genotypes in our country, especially in Rio Grande do Sul; therefore, our
methodology was faster and did not require specific probes, which usually implies in
higher costs.
The set of primers designed in the present study has the advantage to
determine the genotype directly in the PCR, without further methodological steps. In
addition, the method was designed to have greater accuracy in genotyping and
greater sensitivity to identify mixed genotypes when compared to sequencing
reactions, which are usually employed in diagnostic laboratories in our region. A
56
recent study by Yin et al. demonstrated the importance of a co-infection of HBV
genotypes, resulting in increased viral load as well as increased risk for the
development of HCC (32). A possible limitation of their method is that the genotype is
not identified by a single reaction, requiring further analytical steps.
The reasons for the absence of HBV DNA in the serum of HBsAg-positive
patients in our study remain unknown. However, the presence of HBV variants with a
low level of replication, which in the present study resulted in absence of HBeAg, can
and should be considered as inhibitory mechanisms related to the immune system of
infected patients or false-positive results of viral antigen. However, it should be
pointed out that HBV and its genotypes could be identified in HBeAg-negative
patients with normal aminotransferase levels, suggesting that adjustments in the
methodology used could provide better sensitivity even in this population of inactive
carriers of HBV. Other parameters related to the detection of HBV DNA should be
examined, such as the diagnostic method used, the storage conditions of the
samples and the type of biological material analyzed (serum, peripheral blood
mononuclear cells and hepatic tissue).
In this study, a high prevalence of genotype D (63%), followed by genotype A
(32%) was found in patients of Rio Grande do Sul. Genotype F was found in only 5%
of the population investigated. Similar results were reported in Brazil by Haddad and
also by a previous study of our group (5, 33).
The distribution of genotypes in the Brazilian population correlates with the
origin of our ancestors. The frequency of genotypes A and D suggests the influence
of African ancestry, resulting from the period of slavery, as well as the influence of
European colonization. Studies conducted at Instituto Oswaldo Cruz (IOC), a pioneer
in establishing the genotype of viruses in Brazil, showed that about 50% of the
57
viruses found in the country have the A genotype, which is the African subtype,
possibly related to the introduction of Africans in Brazil by the slave trade.
A study in Bahia with 120 patients with chronic hepatitis B showed that the
most frequent genotype was A, followed by genotype F (4, 34). In Rio Grande do Sul,
there is a predominance of European descendants. In this study, genotype D, which
has a global distribution, was the most prevalent in the group of patients with chronic
hepatitis B, similar to previous reports (5). The frequencies of HBV genotypes
observed in the present study, with prevalence of genotype D, followed by A and F,
are similar to a previous investigation conducted in the southern region (35). The D
genotype is found mainly in the Mediterranean region, from where a major wave of
immigrants, including Italians, Spaniards and Portuguese, came to southern Brazil
(34), which may explain the present findings. The F genotype is characteristic of the
native population of the Americas, and has increased frequency in Argentina (35),
which explains the frequency found in the present study. We did not observe the
genotypes B, C, E, G and H in the patients included in this investigation.
The time course of detection of serologic markers can be related to
immunological windows, regardless of HBV genotype. In this study, an increased
frequency of patients with the C-genotype HBV, but not with the A genotype, were
negative for anti-HBsAg and HBeAg. These results suggested that these patients
were not in the infectious stage. We also observed that 18 patients with C-genotype
HBV were positive for HBeAg, suggesting active phase. Sitinik and collaborators
found that pre-core mutations can cause negative results for HBeAg, showing the
need for further studies comparing the serology of patients and HBV genotypes (12).
Lack of information about the stage of treatment of each patient hampers a more
58
detailed investigation, and may lead to erroneous interpretation of serological
patterns. Few studies relate serological markers of hepatitis B with HBV genotypes.
5. CONCLUSION
The PCR assay described in this study provides a rapid and accurate method
to differentiate HBV genotypes (A, D and F) using a Nested-Multiplex qPCR with
specific primers. This method can be useful for HBV genotyping in large clinical scale
and epidemiological studies, especially in regions with high prevalence of HBV
infection. The simplicity and speed of this PCR assay can reduce the cost and
complexity of genotype identification.
6. REFERENCES
1.
El-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterology.
2012 May;142(6):1264-73.e1. PubMed PMID: 22537432. Pubmed Central PMCID: PMC3338949. eng.
2.
Franco E, Bagnato B, Marino MG, Meleleo C, Serino L, Zaratti L. Hepatitis B: Epidemiology and
prevention in developing countries. World J Hepatol. 2012 Mar;4(3):74-80. PubMed PMID: 22489259. Pubmed
Central PMCID: PMC3321493. eng.
3.
Ferreira RC, Teles SA, Dias MA, Tavares VR, Silva SA, Gomes SA, et al. Hepatitis B virus
infection profile in hemodialysis patients in Central Brazil: prevalence, risk factors, and genotypes. Mem Inst
Oswaldo Cruz. 2006 Sep;101(6):689-92. PubMed PMID: 17072485. eng.
4.
Ribeiro NR, Campos GS, Angelo AL, Braga EL, Santana N, Gomes MM, et al. Distribution of
hepatitis B virus genotypes among patients with chronic infection. Liver Int. 2006 Aug;26(6):636-42. PubMed
PMID: 16842318. eng.
5.
Becker C, Mattos A, Bogo M, Branco F, Sitnik R, Kretzmann N. Genotyping of hepatitis B virus
in a cohort of patients evaluated in a hospital of Porto Alegre, South of Brazil. Arq Gastroenterol. 2010
Mar;47(1):13-7. PubMed PMID: 20520969. eng.
6.
Carrilho FJ, Moraes CR, Pinho JR, Mello IM, Bertolini DA, Lemos MF, et al. Hepatitis B virus
infection in Haemodialysis Centres from Santa Catarina State, Southern Brazil. Predictive risk factors for infection
59
and molecular epidemiology. BMC Public Health. 2004 Apr;4:13. PubMed PMID: 15113436. Pubmed Central
PMCID: PMC419975. eng.
7.
Beasley RP. Rocks along the road to the control of HBV and HCC. Ann Epidemiol. 2009
Apr;19(4):231-4. PubMed PMID: 19344859. eng.
8.
Liu CJ, Kao JH, Chen DS. Therapeutic implications of hepatitis B virus genotypes. Liver Int.
2005 Dec;25(6):1097-107. PubMed PMID: 16343058. eng.
9.
Perrillo RP. Acute flares in chronic hepatitis B: the natural and unnatural history of an
immunologically mediated liver disease. Gastroenterology. 2001 Mar;120(4):1009-22. PubMed PMID: 11231956.
eng.
10.
Kim BK, Revill PA, Ahn SH. HBV genotypes: relevance to natural history, pathogenesis and
treatment of chronic hepatitis B. Antivir Ther. 2011;16(8):1169-86. PubMed PMID: 22155900. eng.
11.
Mackay IM. Real time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect. 2004
Mar;10(3):190-212. PubMed PMID: 15008940. eng.
12.
Sitnik R, Pinho JR, Bertolini DA, Bernardini AP, Da Silva LC, Carrilho FJ. Hepatitis B virus
genotypes and precore and core mutants in Brazilian patients. J Clin Microbiol. 2004 Jun;42(6):2455-60. PubMed
PMID: 15184419. Pubmed Central PMCID: PMC427827. eng.
13.
Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis
with DNA polymerase. J Mol Biol. 1975 May;94(3):441-8. PubMed PMID: 1100841. eng.
14.
Teles SA, Martins RM, Vanderborght B, Stuyver L, Gaspar AM, Yoshida CF. Hepatitis B virus:
genotypes and subtypes in Brazilian hemodialysis patients. Artif Organs. 1999 Dec;23(12):1074-8. PubMed
PMID: 10619925. eng.
15.
Paudel D, Jarman R, Limkittikul K, Klungthong C, Chamnanchanunt S, Nisalak A, et al.
Comparison of real time SYBR green dengue assay with real time taqman RT-PCR dengue assay and the
conventional nested PCR for diagnosis of primary and secondary dengue infection. N Am J Med Sci. 2011
Oct;3(10):478-85. PubMed PMID: 22363089. Pubmed Central PMCID: PMC3271430. eng.
16.
Elamin S, Abu-Aisha H. Prevention of hepatitis B virus and hepatitis C virus transmission in
hemodialysis centers: review of current international recommendations. Arab J Nephrol Transplant. 2011
Jan;4(1):35-47. PubMed PMID: 21469594. eng.
17.
Hui CK, Lau GK. Treatment of Hepatitis B e Antigen-negative Patients. Curr Treat Options
Gastroenterol. 2007 Dec;10(6):474-82. PubMed PMID: 18221608. eng.
18.
Farazmandfar T, Haghshenas MR, Janbabai G, Azadeh H, Sharifian R, Taghipour M. A rapid
and reliable genotyping method for hepatitis B virus genotypes (A-H) using type-specific primers. J Virol Methods.
2012 Feb. PubMed PMID: 22342443. ENG.
60
19.
Daniel HD, Fletcher JG, Chandy GM, Abraham P. Quantitation of hepatitis B virus DNA in
plasma using a sensitive cost-effective "in-house" real time PCR assay. Indian J Med Microbiol. 2009 2009 AprJun;27(2):111-5. PubMed PMID: 19384032. eng.
20.
Locarnini S. Molecular virology of hepatitis B virus. Semin Liver Dis. 2004;24 Suppl 1:3-10.
PubMed PMID: 15192795. eng.
21.
Locarnini S, Zoulim F. Molecular genetics of HBV infection. Antivir Ther. 2010;15 Suppl 3:3-14.
PubMed PMID: 21041899. eng.
22.
Carman WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. J Viral
Hepat. 1997;4 Suppl 1:11-20. PubMed PMID: 9097273. eng.
23.
Norder H, Hammas B, Lee SD, Bile K, Couroucé AM, Mushahwar IK, et al. Genetic relatedness
of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the
surface antigen. J Gen Virol. 1993 Jul;74 ( Pt 7):1341-8. PubMed PMID: 8336122. eng.
24.
Ganova-Raeva L, Ramachandran S, Honisch C, Forbi JC, Zhai X, Khudyakov Y. Robust
hepatitis B virus genotyping by mass spectrometry. J Clin Microbiol. 2010 Nov;48(11):4161-8. PubMed PMID:
20810764. Pubmed Central PMCID: PMC3020871. eng.
25.
Naito H, Hayashi S, Abe K. Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus
corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers. J Clin Microbiol. 2001 Jan;39(1):362-4.
PubMed PMID: 11136801. Pubmed Central PMCID: PMC87732. eng.
26.
Liu WC, Lindh M, Buti M, Phiet PH, Mizokami M, Li HH, et al. Genotyping of hepatitis B virus--
genotypes a to g by multiplex polymerase chain reaction. Intervirology. 2008;51(4):247-52. PubMed PMID:
18812698. eng.
27.
Tichopad A, Bar T, Pecen L, Kitchen R, Kubista M, Pfaffl M. Quality control for quantitative PCR
based on amplification compatibility test. Methods. 2010 Jan. PubMed PMID: 20109549. ENG.
28.
Portilho MM, Martins PP, Lampe E, Villar LM. A comparison of molecular methods for hepatitis
B virus (HBV) DNA detection from oral fluid samples. J Med Microbiol. 2012 Jun;61(Pt 6):844-51. PubMed PMID:
22403138. eng.
29.
Shahzamani K, Sabahi F, Merat S, Sadeghizadeh M, Lashkarian HE, Rezvan H, et al. Rapid
low-cost detection of hepatitis C virus RNA in HCV-infected patients by real time RT-PCR using SYBR Green I.
Arch Iran Med. 2011 Nov;14(6):396-400. PubMed PMID: 22039844. eng.
30.
Pérez LJ, Díaz de Arce H, Tarradas J, Rosell R, Perera CL, Muñoz M, et al. Development and
validation of a novel SYBR Green real time RT-PCR assay for the detection of classical swine fever virus
evaluated on different real time PCR platforms. J Virol Methods. 2011 Jun;174(1-2):53-9. PubMed PMID:
21458490. eng.
61
31.
Liu WC, Mizokami M, Buti M, Lindh M, Young KC, Sun KT, et al. Simultaneous quantification
and genotyping of hepatitis B virus for genotypes A to G by real time PCR and two-step melting curve analysis. J
Clin Microbiol. 2006 Dec;44(12):4491-7. PubMed PMID: 17021067. Pubmed Central PMCID: PMC1698380. eng.
32.
Haddad R, Martinelli AeL, Uyemura SA, Yokosawa J. Hepatitis B virus genotyping among
chronic hepatitis B patients with resistance to treatment with lamivudine in the City of Ribeirão Preto, State of São
Paulo. Rev Soc Bras Med Trop. 2010 2010 May-Jun;43(3):224-8. PubMed PMID: 20563485. eng.
33.
Gonçalves C, Pereira F, Gayotto L. Hepatocellular carcinoma in Brazil: report of a national
survey (Florianópolis, SC, 1995). Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1997 1997 May-Jun;39(3):165-70. PubMed
PMID: 9460258. eng.
34.
Realdi G, Fattovich G, Hadziyannis S, Schalm SW, Almasio P, Sanchez-Tapias J, et al. Survival
and prognostic factors in 366 patients with compensated cirrhosis type B: a multicenter study. The Investigators of
the European Concerted Action on Viral Hepatitis (EUROHEP). J Hepatol. 1994 Oct;21(4):656-66. PubMed
PMID: 7814813. eng.
35.
Telenta PF, Poggio GP, López JL, Gonzalez J, Lemberg A, Campos RH. Increased prevalence
of genotype F hepatitis B virus isolates in Buenos Aires, Argentina. J Clin Microbiol. 1997 Jul;35(7):1873-5.
PubMed PMID: 9196213. Pubmed Central PMCID: PMC229861. eng.
62
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.
El-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma.
Gastroenterology. 2012 May;142(6):1264-73.e1. PubMed PMID: 22537432.
Pubmed Central PMCID: PMC3338949. eng.
2.
Franco E, Bagnato B, Marino MG, Meleleo C, Serino L, Zaratti L. Hepatitis B:
Epidemiology and prevention in developing countries. World J Hepatol. 2012
Mar;4(3):74-80.
PubMed
PMID:
22489259.
Pubmed
Central
PMCID:
PMC3321493. eng.
3.
Nicolardi E, Grieco A, Rapaccini GL, Pompili M. [Natural history, diagnosis and
treatment of chronic hepatitis B and C in hemodialysis patients]. G Ital Nefrol.
2010 2010 May-Jun;27(3):262-73. PubMed PMID: 20540019. ita.
4.
Beasley R. Rocks along the road to the control of HBV and HCC. Ann
Epidemiol. 2009 Apr;19(4):231-4. PubMed PMID: 19344859. eng.
5.
Anty R, Lemoine M. Liver fibrogenesis and metabolic factors. Clin Res Hepatol
Gastroenterol. 2011 Jun;35 Suppl 1:S10-20. PubMed PMID: 21742296. eng.
6.
Schiano TD. Hepatotoxicity and complementary and alternative medicines. Clin
Liver Dis. 2003 May;7(2):453-73. PubMed PMID: 12879994.
7.
Heidelbaugh JJ, Bruderly M. Cirrhosis and chronic liver failure: part I. Diagnosis
and evaluation. Am Fam Physician. 2006 Sep 1;74(5):756-62. PubMed PMID:
16970019.
8.
Sherlock S. Diseases of the Liver and Biliary System. 6 ed. London: Blackwell
Scientific Publications; 1981. 537 p.
9.
Wu XZ, Chen D. Origin of hepatocellular carcinoma: role of stem cells. J
Gastroenterol Hepatol. 2006 Jul;21(7):1093-8. PubMed PMID: 16824058.
63
10.
Zanetti AR, Van Damme P, Shouval D. The global impact of vaccination
against hepatitis B: a historical overview. Vaccine. 2008 Nov;26(49):6266-73.
PubMed PMID: 18848855. eng.
11.
Ferreira RC, Teles SA, Dias MA, Tavares VR, Silva SA, Gomes SA, et al.
Hepatitis B virus infection profile in hemodialysis patients in Central Brazil:
prevalence, risk factors, and genotypes. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006
Sep;101(6):689-92. PubMed PMID: 17072485. eng.
12.
Ribeiro NR, Campos GS, Angelo AL, Braga EL, Santana N, Gomes MM, et al.
Distribution of hepatitis B virus genotypes among patients with chronic
infection. Liver Int. 2006 Aug;26(6):636-42. PubMed PMID: 16842318. eng.
13.
Becker C, Mattos A, Bogo M, Branco F, Sitnik R, Kretzmann N. Genotyping of
hepatitis B virus in a cohort of patients evaluated in a hospital of Porto Alegre,
South of Brazil. Arq Gastroenterol. 2010 Mar;47(1):13-7. PubMed PMID:
20520969. eng.
14.
Carrilho FJ, Moraes CR, Pinho JR, Mello IM, Bertolini DA, Lemos MF, et al.
Hepatitis B virus infection in Haemodialysis Centres from Santa Catarina State,
Southern
Brazil.
Predictive
risk
factors
for
infection
and
molecular
epidemiology. BMC Public Health. 2004 Apr;4:13. PubMed PMID: 15113436.
Pubmed Central PMCID: PMC419975. eng.
15.
Locarnini S. Molecular virology of hepatitis B virus. Semin Liver Dis. 2004;24
Suppl 1:3-10. PubMed PMID: 15192795. eng.
16.
Kim BK, Revill PA, Ahn SH. HBV genotypes: relevance to natural history,
pathogenesis
and
treatment
of
chronic
hepatitis
2011;16(8):1169-86. PubMed PMID: 22155900. eng.
B.
Antivir
Ther.
64
17.
Kao JH. Hepatitis B viral genotypes: clinical relevance and molecular
characteristics. J Gastroenterol Hepatol. 2002 Jun;17(6):643-50. PubMed
PMID: 12100608. eng.
18.
Locarnini S. Molecular virology and the development of resistant mutants:
implications for therapy. Semin Liver Dis. 2005;25 Suppl 1:9-19. PubMed
PMID: 16103977. eng.
19.
Kay A, Zoulim F. Hepatitis B virus genetic variability and evolution. Virus Res.
2007 Aug;127(2):164-76. PubMed PMID: 17383765. eng.
20.
Liu CJ, Kao JH, Chen DS. Therapeutic implications of hepatitis B virus
genotypes. Liver Int. 2005 Dec;25(6):1097-107. PubMed PMID: 16343058.
eng.
21.
Perrillo RP. Acute flares in chronic hepatitis B: the natural and unnatural history
of an immunologically mediated liver disease. Gastroenterology. 2001
Mar;120(4):1009-22. PubMed PMID: 11231956. eng.
22.
Tanwar S, Dusheiko G. Is there any value to hepatitis B virus genotype
analysis? Curr Gastroenterol Rep. 2012 Feb;14(1):37-46. PubMed PMID:
22105466. eng.
23.
Thursz M, Yee L, Khakoo S. Understanding the host genetics of chronic
hepatitis B and C. Semin Liver Dis. 2011 May;31(2):115-27. PubMed PMID:
21538279. eng.
24.
Cao GW. Clinical relevance and public health significance of hepatitis B virus
genomic variations. World J Gastroenterol. 2009 Dec;15(46):5761-9. PubMed
PMID: 19998495. Pubmed Central PMCID: PMC2791267. eng.
25.
Norder H, Couroucé AM, Magnius LO. Complete genomes, phylogenetic
relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of
65
which represent two new genotypes. Virology. 1994 Feb;198(2):489-503.
PubMed PMID: 8291231. eng.
26.
Norder H, Hammas B, Lee SD, Bile K, Couroucé AM, Mushahwar IK, et al.
Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin
and natural variations in the primary structure of the surface antigen. J Gen
Virol. 1993 Jul;74 ( Pt 7):1341-8. PubMed PMID: 8336122. eng.
27.
Ishikawa K, Koyama T, Masuda T. Prevalence of HBV genotypes in
asymptomatic carrier residents and their clinical characteristics during longterm follow-up: the relevance to changes in the HBeAg/anti-HBe system.
Hepatol Res. 2002 Sep;24(1):1. PubMed PMID: 12243786. ENG.
28.
Yang H, Lu S, Liaw Y, You S, Sun C, Wang L, et al. Hepatitis B e antigen and
the risk of hepatocellular carcinoma. N Eng J Med. 2002;347:168-74.
29.
Huang K, Lin S. Nationwide vaccination: a success story in Taiwan. Vaccine.
2000 Feb;18 Suppl 1:S35-8. PubMed PMID: 10683542. eng.
30.
Pan TL, Wang PW, Chen ST, Fang JY, Hsu TK, Sintupisut N, et al. Prospective
highlights of serum glycoproteins in spontaneous tolerance after orthotopic liver
transplantation. Clin Chim Acta. 2010 Dec. PubMed PMID: 21167827. ENG.
31.
Kao JH. Appropriate use of interferon for treatment of chronic hepatitis B.
Hepatol Res. 2007 Jul;37(s1):S47-S54. PubMed PMID: 17627636. ENG.
32.
Kao JH, Liu CJ, Chen DS. Hepatitis B viral genotypes and lamivudine
resistance. J Hepatol. 2002 Feb;36(2):303-4. PubMed PMID: 11830346. eng.
33.
Elamin S, Abu-Aisha H. Prevention of hepatitis B virus and hepatitis C virus
transmission
in
hemodialysis
centers:
review
of
current
international
recommendations. Arab J Nephrol Transplant. 2011 Jan;4(1):35-47. PubMed
PMID: 21469594. eng.
66
34.
Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect.
2004 Mar;10(3):190-212. PubMed PMID: 15008940. eng.
35.
Fylaktou A, Asimina F, Papaventsis D, Dimitrios P, Daoudaki M, Maria D, et al.
Molecular epidemiology of chronic hepatitis B virus infection in Greece. J Med
Virol. 2011 Feb;83(2):245-52. PubMed PMID: 21181918. eng.
36.
Li G, Li W, Guo F, Xu S, Zhao N, Chen S, et al. A novel real-time PCR assay
for determination of viral loads in person infected with hepatitis B virus. J Virol
Methods. 2010 Apr;165(1):9-14. PubMed PMID: 20026193. eng.
37.
Daniel HD, Fletcher JG, Chandy GM, Abraham P. Quantitation of hepatitis B
virus DNA in plasma using a sensitive cost-effective "in-house" real-time PCR
assay. Indian J Med Microbiol. 2009 2009 Apr-Jun;27(2):111-5. PubMed PMID:
19384032. eng.
38.
Haddad R, Martinelli AeL, Uyemura SA, Yokosawa J. Hepatitis B virus
genotyping among chronic hepatitis B patients with resistance to treatment with
lamivudine in the City of Ribeirão Preto, State of São Paulo. Rev Soc Bras Med
Trop. 2010 2010 May-Jun;43(3):224-8. PubMed PMID: 20563485. eng.
39.
Locarnini S, Zoulim F. Molecular genetics of HBV infection. Antivir Ther.
2010;15 Suppl 3:3-14. PubMed PMID: 21041899. eng.
40.
Kubista M, Andrade J, Bengtsson M, Forootan A, Jonák J, Lind K, et al. The
real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 2006 2006 AprJun;27(2-3):95-125. PubMed PMID: 16460794. eng.
41.
Shahzamani K, Sabahi F, Merat S, Sadeghizadeh M, Lashkarian HE, Rezvan
H, et al. Rapid low-cost detection of hepatitis C virus RNA in HCV-infected
patients by real-time RT-PCR using SYBR Green I. Arch Iran Med. 2011
Nov;14(6):396-400. PubMed PMID: 22039844. eng.
67
42.
Wang CY, Giambrone JJ, Smith BF. Detection of duck hepatitis B virus DNA on
filter paper by PCR and SYBR green dye-based quantitative PCR. J Clin
Microbiol. 2002 Jul;40(7):2584-90. PubMed PMID: 12089280. Pubmed Central
PMCID: PMC120600. eng.
43.
Paudel D, Jarman R, Limkittikul K, Klungthong C, Chamnanchanunt S, Nisalak
A, et al. Comparison of real-time SYBR green dengue assay with real-time
taqman RT-PCR dengue assay and the conventional nested PCR for diagnosis
of primary and secondary dengue infection. N Am J Med Sci. 2011
Oct;3(10):478-85. PubMed PMID: 22363089. Pubmed Central PMCID:
PMC3271430. eng.
44.
Pérez LJ, Díaz de Arce H, Tarradas J, Rosell R, Perera CL, Muñoz M, et al.
Development and validation of a novel SYBR Green real-time RT-PCR assay
for the detection of classical swine fever virus evaluated on different real-time
PCR platforms. J Virol Methods. 2011 Jun;174(1-2):53-9. PubMed PMID:
21458490. eng.
45.
Chen J, Yin J, Tan X, Zhang H, Chen B, Chang W, et al. Improved multiplexPCR to identify hepatitis B virus genotypes A-F and subgenotypes B1, B2, C1
and C2. J Clin Virol. 2007 Mar;38(3):238-43. PubMed PMID: 17224304. eng.
46.
Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids
Res. 2002 Mar;30(6):1292-305. PubMed PMID: 11884626. Pubmed Central
PMCID: PMC101343. eng.
47.
Moraes MT, Gomes SA, Niel C. Sequence analysis of pre-S/S gene of hepatitis
B virus strains of genotypes A, D, and F isolated in Brazil. Arch Virol.
1996;141(9):1767-73. PubMed PMID: 8893798. eng.
68
48.
Gonçalves C, Pereira F, Gayotto L. Hepatocellular carcinoma in Brazil: report
of a national survey (Florianópolis, SC, 1995). Rev Inst Med Trop Sao Paulo.
1997 1997 May-Jun;39(3):165-70. PubMed PMID: 9460258. eng.
49.
Teles SA, Martins RM, Vanderborght B, Stuyver L, Gaspar AM, Yoshida CF.
Hepatitis B virus: genotypes and subtypes in Brazilian hemodialysis patients.
Artif Organs. 1999 Dec;23(12):1074-8. PubMed PMID: 10619925. eng.
50.
Sitnik R, Pinho JR, Bertolini DA, Bernardini AP, Da Silva LC, Carrilho FJ.
Hepatitis B virus genotypes and precore and core mutants in Brazilian patients.
J Clin Microbiol. 2004 Jun;42(6):2455-60. PubMed PMID: 15184419. Pubmed
Central PMCID: PMC427827. eng.
51.
Hansen BE, Rijckborst V, Ter Borg MJ, Janssen HL. HBV DNA suppression in
HBeAg-positive chronic hepatitis B patients treated with peginterferon or
placebo. J Med Virol. 2011 Nov;83(11):1917-23. PubMed PMID: 21915866.
eng.
52.
Hui CK, Lau GK. Treatment of Hepatitis B e Antigen-negative Patients. Curr
Treat
Options
Gastroenterol.
2007
Dec;10(6):474-82.
PubMed
PMID:
18221608. eng.
53.
Farazmandfar T, Haghshenas MR, Janbabai G, Azadeh H, Sharifian R,
Taghipour M. A rapid and reliable genotyping method for hepatitis B virus
genotypes (A-H) using type-specific primers. J Virol Methods. 2012 Feb.
PubMed PMID: 22342443. ENG.
54.
Payne RJ, Nowak MA, Blumberg BS. The dynamics of hepatitis B virus
infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun;93(13):6542-6. PubMed PMID:
8692852. Pubmed Central PMCID: PMC39060. eng.
69
55.
Carman WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B
virus. J Viral Hepat. 1997;4 Suppl 1:11-20. PubMed PMID: 9097273. eng.
56.
Ganova-Raeva L, Ramachandran S, Honisch C, Forbi JC, Zhai X, Khudyakov
Y. Robust hepatitis B virus genotyping by mass spectrometry. J Clin Microbiol.
2010 Nov;48(11):4161-8. PubMed PMID: 20810764. Pubmed Central PMCID:
PMC3020871. eng.
57.
Naito H, Hayashi S, Abe K. Rapid and specific genotyping system for hepatitis
B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific
primers. J Clin Microbiol. 2001 Jan;39(1):362-4. PubMed PMID: 11136801.
Pubmed Central PMCID: PMC87732. eng.
58.
Liu WC, Lindh M, Buti M, Phiet PH, Mizokami M, Li HH, et al. Genotyping of
hepatitis B virus--genotypes a to g by multiplex polymerase chain reaction.
Intervirology. 2008;51(4):247-52. PubMed PMID: 18812698. eng.
59.
Tichopad A, Bar T, Pecen L, Kitchen R, Kubista M, Pfaffl M. Quality control for
quantitative PCR based on amplification compatibility test. Methods. 2010 Jan.
PubMed PMID: 20109549. ENG.
60.
Portilho MM, Martins PP, Lampe E, Villar LM. A comparison of molecular
methods for hepatitis B virus (HBV) DNA detection from oral fluid samples. J
Med Microbiol. 2012 Jun;61(Pt 6):844-51. PubMed PMID: 22403138. eng.
61.
Liu WC, Mizokami M, Buti M, Lindh M, Young KC, Sun KT, et al. Simultaneous
quantification and genotyping of hepatitis B virus for genotypes A to G by realtime PCR and two-step melting curve analysis. J Clin Microbiol. 2006
Dec;44(12):4491-7. PubMed PMID: 17021067. Pubmed Central PMCID:
PMC1698380. eng.
70
62.
Yin J, Zhang H, Li C, Gao C, He Y, Zhai Y, et al. Role of hepatitis B virus
genotype mixture, subgenotypes C2 and B2 on hepatocellular carcinoma:
compared with chronic hepatitis B and asymptomatic carrier state in the same
area. Carcinogenesis. 2008 Sep;29(9):1685-91. PubMed PMID: 18192693.
eng.
63.
Buster EH, Janssen HL. Antiviral treatment for chronic hepatitis B virus
infection--immune modulation or viral suppression? Neth J Med. 2006
Jun;64(6):175-85. PubMed PMID: 16788215. eng.
64.
Carrilho FJ, Kikuchi L, Branco F, Goncalves CS, Mattos AA, Group BHS.
Clinical and epidemiological aspects of hepatocellular carcinoma in Brazil.
Clinics (Sao Paulo). 2010;65(12):1285-90. PubMed PMID: 21340216. Pubmed
Central PMCID: PMC3020338. eng.
65.
Chu CJ, Keeffe EB, Han SH, Perrillo RP, Min AD, Soldevila-Pico C, et al.
Prevalence of HBV precore/core promoter variants in the United States.
Hepatology. 2003 Sep;38(3):619-28. PubMed PMID: 12939588. eng.
66.
Gomes-Gouvêa MS, Pereira Soares MoC, Guedes de Carvalho Mello IM, Brito
EM, Pereira Moia LeJ, Bensabath G, et al. Hepatitis D and B virus genotypes in
chronically infected patients from the Eastern Amazon Basin. Acta Trop. 2008
Jun;106(3):149-55. PubMed PMID: 18420172. eng.
67.
Souto FJ, Fontes CJ, Gaspar AM. Prevalence of hepatitis B and C virus
markers among malaria-exposed gold miners in Brazilian Amazon. Mem Inst
Oswaldo Cruz. 2001 Aug;96(6):751-5. PubMed PMID: 11562696. eng.
68.
Realdi G, Fattovich G, Hadziyannis S, Schalm SW, Almasio P, Sanchez-Tapias
J, et al. Survival and prognostic factors in 366 patients with compensated
cirrhosis type B: a multicenter study. The Investigators of the European
71
Concerted
Action
on
Viral
Hepatitis
(EUROHEP).
J
Hepatol.
1994
Oct;21(4):656-66. PubMed PMID: 7814813. eng.
69.
Zoulim F, Trépo C. Drug therapy for chronic hepatitis B: antiviral efficacy and
influence of hepatitis B virus polymerase mutations on the outcome of therapy.
J Hepatol. 1998 Jul;29(1):151-68. PubMed PMID: 9696505. eng.
70.
Telenta PF, Poggio GP, López JL, Gonzalez J, Lemberg A, Campos RH.
Increased prevalence of genotype F hepatitis B virus isolates in Buenos Aires,
Argentina. J Clin Microbiol. 1997 Jul;35(7):1873-5. PubMed PMID: 9196213.
Pubmed Central PMCID: PMC229861. eng.