Descoberta de novos genes no
genoma de Saccharomyces
cerevisiae
Enio Felipe da Rocha
Vinicio Tavares de Melo Costa da Silva
S. Cerevisiae Genome Project
• Fungos unicelulares
• Primeiro genoma eucariota completamente
sequenciado (1996)
– DNA cromossômico: 12,07 mb
– Apenas 3,8% dos ORFs contém introns.
– Cerca de 5.400 genes codificam proteínas com
mais de cem aminoácidos
Falhas na anotação inicial
• Não foram levados em conta os ncRNA
• Os métodos aplicados subestimaram o
número de genes.
– Alguns genes são transcritos em ncRNAs
– Desde 1997 já sabia-se que existiriam smORFs
que não foram anotados originalmente.
Homologia
Objetivos
• Análise comparativa do genoma de S.
Cerevisiae para identificar novos ORFs não
encontrados anteriormente
• Validar este método para que ele possa ser
usado na atualização da anotação de outros
genomas já seqüenciados.
Metodologia
• Partir da seqüência genômica original
• Remover todos ORFs identificados
originalmente
• Usando o resultado do passo anterior (3,45
mb) encontrar todos os stop-to-stop ORFs
com mais de 18 códons.
– Baseado no número de códons dos genes de E.
Coli
Metodologia
• Comparação dos resultados (140.000
possíveis genes) com um banco de dados de
seqüências contendo genes de todo o reino
fungi mais outros organismos selecionados
• Cutoff de p < 10-4
• Com essa busca foram encontrados 1.057
possíveis ORFs com homólogos no banco de
dados
Metodologia
• A partir desses resultados retirou-se todos os
genes que já tinham sido anotados depois de
1997.
• Descartou-se também os genes que
sobrepunham-se com rRNAs, tRNAs, etc.
• Produto = 558 smORFs em regiões antes
consideradas intergênicas
– Tamanho dos ORFs variam de 18 a 190 códons
Metodologia
Resultados
• Escolha de 117 smORFs para validação
• Verificação da expressão destes ORFs em
organismos
• Primers construídos para a amplificação de
três smORFs e de ACT1.
– Uso de PCR
– Sucesso na amplificação destes genes.
Polymerase Chain Reaction
Resultados
• Verificação da expressão destes genes
– RT-PCR
– Produto para os quatro ORFs foram encontrados
– Garantia de que estes smORFs são expressos nas
células
• Ampliação deste estudo para os outros 114
smORFs
– Achou-se mRNAs para 81 smORFs
– smORF 68 tinha sido retirado do SGD
Resultados
• Apenas 1 smORF foi encontrado mais de uma
vez
– Ele está incluído nos smORFs para os quais não foi
encontrado produto depois da RT-PCR
• Possibilidade de read through?
– A RNA polimerase não se desacopla da fita de
DNA e sintetiza RNA mesmo depois do stop códon
Resultados
• Mediu-se o tamanho dos transcritos de smORF2 e
smORF31 (Northern analysis)
– Ambos os ORFs apresentaram tamanho de 460nt
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Região traduzida = 250 nt
Região não-traduzida 5’ = 20-30 nt
Região não-traduzida 3’ = 100 nt
Cauda Poli-A = 100 nt
• Forte indício de que não se trata de read through já
que o gene “anterior” a smORF2 está a 1700 nt
upstream
– A transcrição deste gene é originada no seu promotor.
Resultados
• Caracterização de smORF2
– A proteína codificada por este gene está presente
em muitos organismos, até mesmo humanos
• Nos humanos este ORF está presente em 2 loci
– Detecção da proteína codificada
• Marcação do gene (HA inserido no final do gene)
• Resultados experimentais confirmam que o gene
smORF2 realmente codifica uma proteína produzida
• smORF2p é essencial para o organismo?
Resultados
Presença de smORF2 em várias espécies de diferentes
reinos
Resultados
• Vetores sem este gene foram incapazes de
crescer com temperaturas de 37o C
Análise
• Criação de novo método para a identificação
de genes em genomas já seqüenciados
• Método simples acelerará a anotação destes
genomas
– ORFs que não tenham homólogos em outras
espécies (orfãos) não serão encontrados
Referências
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Referências
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