ENOLOGIA NA ERA
GENÔMICA
SERGIO ECHEVERRIGARAY
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL
O QUE É GENÔMICA?
- Numa definição ampla:
Decifrar o genoma (a informação genética) dos organismos
vivos, visando compreender a evolução, metabolismo e
adaptação dos organismos.
PORQUE ESTUDAR O GENOMA DE LEVEDURAS ?
MATÉRIA PRIMA
BIOTRANSFORMAÇÃO
PRODUTO
GENOMA DE LEVEDURAS – APÓS 20 ANOS.
Genomas de leveduras
Genoma de S. cerevisiae
Goffeau et al.,
1996
Science 274: 563-7
8 anos, 19 paises,
94 labs,
641 pessoas
12.495.682 pb
5770 ORFs
Ashbya gossypii – completo
Brettanomyces bruxellensis – parcial
Candida albicans – parcial
Candida dubliniensis – completo
Candida glabrata – completo
Candida lusitaniae – parcial
Candida parapsilosis – parcial
Candida tropicalis – parcial
Cryptococcus neoformans – parcial
Debaryomyces hansenii – completo
Hanseniaspora uvarum - parcial
Hanseniaspora vineae - parcial
Kluyveromyces aestuarii – parcial
Kluyveromyces lactis – completo
Kluyveromyces marxianus – parcial
Kluyveromyces thermotolerans – completo
Kluyveromyces waltii – parcial
Kluyveromyces wickerhamii – parcial
Lodderomyces elongisporus – parcial
Malassezia globosa – parcial
Pichia guillerrmondii – parcial
Pichia pastoris – parcial
Pichia sorbitophila – completo
Pichia stipitis – completo
Saccharomyces bayanus var uvarum – parcial
Saccharomyces castelli – parcial
Saccharomyces cerevisiae – completo
Saccharomyces exiguus – parcial
Saccharomyces kluyveri – completo
Saccharomyces kudriawzevii – parcial
Saccharomyces mikatae – parcial
Saccharomyces paradoxus – parcial
Saccharomyces pastorianus – parcial
Saccharomyces servazzii – parcial
Schizosaccharomyces cryophilus – parcial
Schizosaccharomyces japonicus – paricial
Schizosaccharomyces octosporus – parcial
Schizosaccharomyces pombe – completo
Torulaspora delbrueckii - completo
Yarrowia lipolytica – completo
Zygosaccharomyces rouxii - completo
EVOLUÇÃO DO
METABOLISMO DE
LEVEDURAS
Modificação
do
fluxo
preferencial respiração vrs.
fermentação.
“Aumento do efeito Crabtree –
fluxo glicolítico preferencial e a
fermentação alcoólica como
forma competitiva”.
Efeito Crabtree aumentado
Alto consumo de glicose
Alta capacidade de produção de energia
Catabolismo do etanol (ADH2, etc)
Modificação da regulação da respiração
Surgimento das plantas
com frutos (~150 M anos)
Efeito Crabtree
Aumento de glicolise em
relação a respiração
 Clado Saccharomyces:
Estratégia:
“make-accumulate-consume”
(produzir-acumular-consumir)
Respiração obrigatória ou
preferencial
Fluxo glicolítico baixo
Piskur et al. (2006)
Marsit e Dequim (2015) FEMS
Saccharomycotina
A EVOLUÇÃO DOS GENOMAS EM LEVEDURAS
Duplicação do genoma
-
Aumento de transportadores
Aumento de desidrogenases, etc
Ganho de Megasatelites
(100.000.000 anos)
Ganho de gene HO
(150-300.000.000 anos)
Ganho de reação sexual
e pequenos centrômeros
(300 milhões a 1 bilhão de anos)
Duplicações em tandem
Perda de transpossons e de
introns
- Genomas condensados
Berbee and Taylor, 2006; James et al., 2006
Saccharomyces paradoxus
Saccharomyces mikatae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces kudriavzevii
Saccharomyces bayanus
Saccharomyces pastorianus
Saccharomyces exiguus
Saccharomyces servazzii
Saccharomyces castellii
Candida glabrata
Vanderwaltozyma polyspora
Zygosaccharomyces rouxii
Lachancea thermotolerans
Lachancea waltii
Lachancea kluyveri
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces marxianus
Eremothecium gossypii
Saccharomycodes ludwigii
Brettanomyces bruxellensis
Pichia angusta
Candida lusitaniae
Debaryomyces hansenii
Pichia stipitis
Pichia sorbitophila
Candida guilliermondii
Candida tropicalis
Candida parapsilosis
Lodderomyces elongisporus
Candida albicans
Candida dubliniensis
Arxula adeninivorans
Yarrowia lipolytica
Schizosaccharomyces pombe
SEQUENCIAMENTO DE SACCHAROMYCES
Genomas Saccharomyces
 1996 – Sequenciamento de S288c – linhagem de laboratório – derivada de isolado de figo CA
16
Número de genomas
14
12
 2005 – Sequenciamento de RM11-1a - segregante de Bb32 (levedura selvagem isolada de
10
vinhedo da California).
8
 2007 – Sequenciamento de YJM789 – segregante de patógeno oportunista de paciente
6
imuno-comprometido.
4
 2008 – Sequenciamento de M22 – isolado de vinhedo italiano.
2
YPS163 – isolado de solo de um carvalho americano – Pensilvânia
0
AWRI1631 – segregante da levedura enológica sul-africana N96
 2009 - Sequenciamento de JAY291 – haploide segregante de PE-2 – bioetanol – Brasil
EC1118 – Pris-de-Mousse – S. cerevisiae var bayanus – levedura
enológica diploide
Sigma 1278 b - linhagem de laboratório
 2010 – Sequenciamento de Foster’s O – levedura de cerveja -Ale beer
CEPAS ENOLÓGICAS
Foster’s B – levedura de cerveja - Ale beer
AWRI 1631 – segr. comercial S Africa
Vin13 – Levedura de vinho tolerante a baixa temperatura
AWRI 796 - vinho tinto S Africa
AWRI 796 – Levedura enológica sul-africana (vinho tinto)
BC 187 – segr. vinho tinto California
CLIB 215 – Levedura de panificação
 2011 – 15 genótipos de Saccharomyces cerevisiae
HOJE >80 GENOMAS NO Saccharomyces Genome Database
EC 1118 – lev. comercial
L 1528 – vinho tinto Chile
QA23 – comercial (vinho verde)
T73 – vinho tinto Espanha
VIN 13 – vinho branco S Africa
VL 3 – vinho branco França
Síntese de compostos aromáticos
Regulação
Estresse
Transporte
desconhecido
O GENOMA DE SACCHAROMYCES – O QUE ELES NOS DIZ?
Duplicação genômica
DO GENOMA AO METABOLISMO DE
Saccharomyces
A “teia metabólica” e suas interações.
GLUTAMATO SINTASE GENE
atggctgaagcaagcatcgaaaagactcaaattttacaaaaatatctagaactggaccaa
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GLUTAMATO SINTASE
MAEASIEKTQILQKYLELDQRGRIIAEYVWIDGTGNLRS
KGRTLKKRITSIDQLPEWNFDGSSTNQAPGHDSDIYLK
PVAYYPDPFRRGDNIVVLAACYNNDGTPNKFNHRHEA
AKLFAAHKDEEIWFGLEQEYTLFDMYDDVYGWPKGG
YPAPQGPYYCGVGAGKVYARDMIEAHYRACLYAGLEIS
GINAEVMPSQWEFQVGPCTGIDMGDQLWMARYFLH
RVAEEFGIKISFHPKPLKGDWNGAGCHTNVSTKEMRQ
PGGMKYIEQAIEKLSKRHAEHIKLYGSDNDMRLTGRHE
TASMTAFSSGVANRGSSIRIPRSVAKEGYGYFEDRRPA
SNIDPYLVTGIMCETVCGAIDNADMTKEFERESS
RESPOSTA DA LEVEDURAS A DISTINTAS CONDIÇÕES
AMBIENTAIS: EXPRESSÃO GÊNICA
Microarray: controle vrs. acetaldeido -1g/L (6310 genes)
Aranda e del Olmo, 2004
Expressão gênica em resposta a distintas fontes de nitrogênio.
Godard et al. 2007
As leveduras evoluíram se adaptando
geneticamente as condições industriais?
?
Condição natural
Condição industrial
-
-
Principalmente aeróbica
Limitação de açúcar, etc.
Alta competição com outros microrganismos
Formação de biofilmes
Principalmente anaeróbica
Alta concentração de açúcares.
Estresse osmótico, etanólico, oxidativo, etc.
Alta concentração celular
Limitação de nitrogênio, etc.
Relação entre cepas de Saccharomyces
baseada em 7544 SNPs.
% dos marcadores no cluster
1 a 1,4 substituições por kb entre leveduras
de vinho e
5 a 6 substituições por kb entre leveduras de
vinho e outras.
Adaptados de Liti et al, 2009
vinhedos
cerveja
Bioetanol
Laboratório
vinho
Distância baseada em genomas completos de Saccharomyces
(Nijkamp et al. 2012)
Analise baseada em 60331 SNPs –
146 linhagens de Saccharomyces
Vermelho- fermentações
Verde- carvalhos
Laranja- frutos
Cinza- outros
Almeida et al. (2015)
SABEMOS:
-
AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS REPRESENTAM UM GRUPO MONOFILÉTICO E
CONSEQUENTEMENTE TEM UMA MESMA ORIGEM.
-
PARECE EVIDENTE QUE AS LEVEDURAS EVOLUIRAM SE ADEQUANDO À
UTILIZAÇÃO HUMANA.
NÃO SABEMOS:
-
HOUVE UM PROCESSO DE DOMESTICAÇÃO PROPRIAMENTE DITO?
-
ESTA ORIGEM COMUM ESTÁ ASSOCIADA A ORIGEM RESTRITA DAS VIDEIRAS?
-
COMO EVOLUIRAM TÃO RAPIDAMENTE? (Genome Renewal –Mortimer, 2000)
-
COMO SE ESPALHARAM PELO MUNDO?
-
QUAL É O PAPEL DE OUTROS ORGANISMOS NO PROCESSO?
PARA TENTAR RESPONDER ALGUMAS DESTAS
PERGUNTAS VAMOS VER O QUE AS LEVEDURAS
ENOLÓGICAS TEM EM COMUM!!!
?
O QUE AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS APRESENTAM DE DIFERENTE
DO RESTANTE?
Análise
discriminante
do
comportamento fermentativo de
cepas de S. cerevisiae de várias
origens em mosto vínico sintético.
- DW (peso seco)
- Produção de gás carbônico
- Tempo para consumir 75% do açúcar
- Produção de acetato de butila
- Produção de butirato de etila
Camarasa et al. 2011
O QUE AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS APRESENTAM DE DIFERENTE
DO RESTANTE?
VÁRIAS CEPAS DE SACCHAROMYCES INDUSTRIAIS APRESENTAM ORFs (POTENCIAIS GENES) AUSENTES
NA CEPA REFERÊNCIA S288C E VICE-VERSA (Engel e Cherry, 2013)
- QUE GENES SÃO ESSES?
- COMO AFETAM O COMPORTAMENTO DAS LEVEDURAS?
120
Número de ORFs
100
JAY291- Bioetanol
genes de termotolerância, tolerância a
estresse e capacidade fermentativa.
80
60
40
20
0
EC1118- vinho
Genes relacionados ao metabolismo e
transporte de açúcar e nitrogênio,
produção de ésteres, tolerância ao
estresse, entre outros.
O QUE AS LEVEDURAS ENOLÓGICAS APRESENTAM DE DIFERENTE
DO RESTANTE?
EXEMPLOS DE CONJUNTOS GÊNICOS E GENES INDIVIDUAIS CARACTERÍSTICOS DE LEVEDURAS
ENOLÓGICAS
1- Inativação de AQY2 e AQY1 (aquaporina) – tolerância a estresse osmótico
2- Translocação VIII-XVI e/ou XV-XVI com geração do alelo SSU-R1 (resistência aumentada ao sulfito)
3- Aumento do número de cópias de CUP1 – resistência a cobre.
4- Duas mutações no promotor de FLO11- características de leveduras de véu.
5- Variante alélico de HXT3- alta capacidade de transporte de frutose.
6- Duplicação e translocação de regiões (QTLs) associadas ao metabolismo de nitrogênio e uso de
aminoácidos
7- Hiper-expressão de genes associados a estresse oxidativo.
8- Modificação da regulação de genes (>50 genes) associados a autofagia e apoptose.
E muitas outras, mais de 5000 alterações em regiões gênicas e regulatórias!!!!
ALTERAÇÕES GENÔMICAS EM LEVEDURAS ENOLÓGICAS – ex. EC1118
Comparação de polimorfismos
nucleotídicos (EC1118 vrs):
- 46825 com S288C
- 19142 com RM11-1A
- 18315 com AWRI1631
A análise do genoma de EC1118 mostra que esta apresenta:
- 77 genes ausentes em S288C dos quais 35 localizados em três
regiões particulares.
-
KHR1 (toxina killer resistente ao calor)
MPR1 (acetiltransferase – estresse oxidativo e etanol)
- >100 genes presentes em S288C estão ausentes em EC1118
-
MST27 (formação de vesículas) e PTM8 (proteína de membrana regulada
por ferormônio)- ausente em várias cepas de vinho.
Novo et al., 2009
TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES: EVENTOS MÚLTIPLOS
NA EVOLUÇÃO DAS LEVEDURAS ENOLÓGICAS.
Vários dos genes (blocos gênicos) presentes em leveduras enológicas S. cerevisiae tem
origem em transferência horizontal de genes (HTG) de:
-
Kluyveromyces (Lachancea) thermotolerans – transportadores de açúcares e nitrogênio.
Torulaspora microellipsoides – simporter com alta afinidade por frutose, xilitol desidrogenase, transporte de
oligopeptídeos ricos em glutamato (FOT1-2).
Lachancea kluyveri - ?
Zygosaccharomyces bailli e Z. rouxii – pseudogenes, genes relacionados com transporte e metabolismo de
açúcares e nitrogênio, genes relacionados com estresse osmótico.
Eremothecium gossypii - tranpossase
Saccharomyces paradoxus – SUC2, HPF1 (alfa-1,4-glucosidase), AWA1 (GPI-anchored protein) aumento da
hidrofobicidade de parede celular
Saccharomyces kudiawzevii – tolerância a estresse entre os quais baixas temperaturas, liberação de tióis
(4-MMP)
Saccharomyces mikatae - ?
Saccharomyces uvarum – metabolismo de nitrogênio (asparaginase, oxiprolinase), tolerância a baixas
temperaturas.
ISTO É SÓ O INÍCIO
“CABE A NOS EXPLORARMOS E
INCORPORARMOS ESTES, E OUTROS
CONHECIMENTOS, NA PRÁTICA
ENOLÓGICA!!!!”
BIBLIOGRAFIA PRINCIPAL
--- (acesso 2015) Saccharomyces genome database (SGD). (www.yeastgenome.org)
Almeida, P. et al. (2015) A population genomics insight into the Mediterranean origins of wine yeast domestication. Molec. Ecol.
24: 5412-5427.
Ambroset, C. et al. (2011) Deciphering the molecular basis of wine yeast fermentation traits using a combined genetic and
genomic approach. G3 (Genes/genomes/genetics) 1: 263- 281.
Borneman, A. R. et al. (2008) Comparative genome analysis of a Saccharomyces cerevisiae wine strain. Yeast Res. 8: 1185-1195.
Borneman, A. R. et al. (2011) Whole-genome comparison reveals novel genetic elements that characterize the genome of
industrial strains of Saccharomyces cerevisiae PloS Genetics 7: e1001287.
Brice, C. et al. (2014) A genetic approach of wine yeast fermentation capacity in nitrogen-starvation reveals the key role of
nitrogen signaling. BMC Genomics 15: 495.
Engel, S.R.; Cherry, J.M. (2013) The new modern area of yeast genomics: community sequencing and the resulting annotation of
multiple Saccharomyces cerevisiae strains at the Saccharomyces Genome Database. Database 12: 1-9.
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(Genes/genomes/genetics) 4\; 389-398.
Hagman, A.; Piskur, J. (2015) A Study on the Fundamental Mechanism and the Evolutionary Driving Forces behind Aerobic
Fermentation in Yeast. PloS-One 10: e0116942.
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Rolland, T. et al. (2009) Insertion of horizontally transferred genes within conserved syntenic regions of yeast genomes. PloS-One
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