AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA EM LEITE
PASTEURIZADO TIPO “C”
Carlos Adriano de Santana Leal1, Cristine Espíndola Agra da Silva 2, Lúcia Sadae2, Andressa Ana de Paiva
Santana3, Williams Napoleão dos Santos3, Maria Idalina de Lima Callado4, Ana Mércia Mendes
Vasconcelos5, Maria José de Sena6

Introdução
Entende-se por leite, sem outra especificação, o
produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta,
em condições de higiene, de vacas sadias, bem
alimentadas e descansadas.
O Leite Pasteurizado tipo C é o produto classificado
quanto ao teor de gordura como integral, padronizado a
3% m/m, semidesnatado ou desnatado, submetido à
temperatura de 72 a 75ºC durante 15 a 20s, em
equipamento de pasteurização a placas [1].
O leite pasteurizado tipo “C” vem perdendo
mercado, uma vez que sua qualidade microbiológica
não possui um controle tão rigoroso durante seu
processamento. Isso propicia a ocorrência de
constantes denúncias quanto à sua qualidade, fazendo
com que o consumidor dê preferência para outros tipos
de leite [2].
O controle microbiológico em amostras de leite é
realizado, principalmente, através da pesquisa de
microrganismos indicadores que, quando presentes,
podem fornecer informações sobre as condições
sanitárias da produção, do processamento, ou
armazenamento, assim como a possível presença de
patógenos e estimativa da vida de prateleira do
produto. Os principais grupos de microrganismos
indicadores de qualidade do leite são os aeróbios
mesófilos e os coliformes [3].
Diante do exposto o presente trabalho teve como
objetivo avaliar as condições higiênicas do leite
pasteurizado tipo “C” através da análise microbiológica
para mesófilos, coliformes e Salmonella.
Material e métodos
Foram analisadas 92 amostras de leite tipo “C”, no
período de 01 de janeiro a 31 de março de 2009,
provenientes de todo o Estado de Pernambuco.
As análises foram feitas no setor de Microbiologia
de Alimentos, do Laboratório Nacional Agropecuário
em Pernambuco – LANAGRO/PE, baseadas na
metodologia analítica da Instrução Normativa n° 62
[4], que dispõe sobre os Métodos Analíticos Oficiais
para Análises Microbiológicas para Controle de
Produtos de Origem Animal e Água.
Coliformes
Teste Presuntivo
Baseou-se na inoculação de 1 ml da amostra em 9 ml de
caldo lauril sulfato de sódio (concentração simples),
diluição 10-1, ou seja, diretamente da amostra (100),
inoculou-se volumes de 1 mL em uma série de 3 tubos
contendo caldo lauril sulfato de sódio, em concentração
simples. Transferiu-se também 1 mL da amostra para tubos
contendo solução salina peptonada 0,1% de forma a obter a
diluição 10-1.
A partir da diluição 10-1 efetuou-se as demais diluições
em solução salina peptonada 0,1%, repetindo-se o processo
anteriormente descrito até obtenção da diluição desejada.
Ao final incubou-se os tubos a 36  1ºC por 24 a 48
horas.
Após esse período a presença de coliformes foi
evidenciada pela formação de gás nos tubos de Durhan,
produzido pela fermentação da lactose contida no meio.
Teste Confirmativo
Para coliformes totais: A confirmação da presença de
coliformes totais foi feita por meio da inoculação dos tubos
positivos para a fermentação de lactose em caldo verde
brilhante bile lactose 2% e posterior incubação a 36 ± 1ºC
por 24 a 48 horas. A presença de gás nos tubos de Durhan
do caldo verde brilhante evidenciou a fermentação da
lactose presente no meio.
Para coliformes termotolerantes: A confirmação da
presença de coliformes termotolerantes foi feita por meio
da inoculação em caldo EC, com incubação em temperatura
seletiva de 45 ± 0,2ºC por 24 a 48 horas, a partir dos tubos
positivos obtidos na prova presuntiva. A presença de gás
nos tubos de Durhan evidenciou a fermentação da lactose
presente no meio.
Mesófilos
A contagem padrão de microrganismos aeróbios
mesófilos, estritos e facultativos viáveis baseou-se na
semeadura em ágar padrão para contagem (PCA) seguida
de incubação em temperatura de 36 ± 1ºC por 48 horas.
________________
1. Aluno do 11° Período de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros s/n. Dois Irmãos –
Recife- PE. E-mail: [email protected]
2. Analista de Laboratório Pleno do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, LANAGRO/PE.
3. Assistente de Laboratório Jr. do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, LANAGRO/PE.
4. Técnico em química do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, LANAGRO/PE.
5. Supervisora do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, LANAGRO/PE.
6. Professor (a) Adjunto do Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco.
Inoculação em placas
Foi pipetado 1 ml da amostra e inoculado em 9 ml de
solução salina peptonada 0,1 %, para obtenção da
diluição 10-1, que após ter sido homogeneizada em
agitador automático, retirou-se 1 ml para inoculação
em placa de Petri estéril devidamente identificada
(meio, diluição, nº da amostra e data da análise) e 1 ml
para inoculação em outro tubo contendo solução salina
peptonada 0,1 % (9 ml), obtendo assim a diluição 10-2.
Seguindo-se dessa forma até a obtenção da diluição
10-5, para logo após serem adicionados cerca de 15 a
20 mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a
46-48ºC. Homogeneizou-se adequadamente o ágar com
o inoculo, deixando-o solidificar em superfície plana,
para em seguida incubar as placas invertidas à 36  1°C
por 48 horas.
Após esse intervalo as placas foram retiradas da
estufa para a realização da leitura, onde foram contadas
todas as colônias presentes.
Salmonella
Pré-enriquecimento
Baseou-se na incubação, a 36 ± 1ºC por 16 a 20
horas, de 25 + 0,2 g ou 25 + 0,2 mL da amostra,
adicionada de 225 mL do diluente específico para cada
caso, no caso do leite pasteurizado tipo “C” foi
utilizada a solução salina peptonada tamponada a 1%,
após 1 hora de inoculação.
Esse procedimento visou minimizar os efeitos do
processamento industrial dos alimentos, capaz de
promover stress nas células de Salmonella, sem inativálas biologicamente.
Quando foi utilizada solução salina peptonada
tamponada, esta favoreceu a manutenção do pH,
evitando que as bactérias acompanhantes acidificassem
o meio, prejudicando a recuperação das células de
Salmonella.
Detecção de Salmonella spp pelo Sistema BAX®
Enriquecimento
As amostras foram enriquecidas de acordo com os
procedimentos padrões do laboratório.
Preparo
As amostras enriquecidas foram recultivadas e
depois aquecidas com uma solução de lise para quebra
da parede da célula bacteriana e liberação do DNA
genômico (37°C por 20 minutos, depois 95°C por 10
minutos e por fim 5 minutos no refrigerador, 4-7°C).
Amplificação e Detecção
Os tabletes de PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase) foram hidratados com o lisado (amostra
após etapa de lise). Os tubos de PCR foram então
colocados no termociclador/detector, que amplificou o
DNA alvo. O DNA amplificado gera sinais
fluorescentes, que são automaticamente analisados para
determinação dos resultados (presente ou ausente).
Com tempo total para amplificação e identificação
do microrganismo em torno de 3h e 30 min.
Resultados e Discussão
Os resultados das análises microbiológicas das 92
amostras de leite pasteurizado tipo C estão representados
na Tabela1. Os resultados foram comparados com os
parâmetros microbiológicos para Leite Pasteurizado tipo C,
conforme Instrução Normativa nº. 51 do Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA [5]
apresentados na Tabela 2.
De acordo com os resultados obtidos, onde 17,4% das
amostras analisadas para contagem de Mesófilos, 60,9%
para coliformes totais e 41,3% para coliformes fecais
(termotolerantes) estavam fora dos parâmetros estipulados
pela legislação vigente, pode-se dizer que as condições
higiênico-sanitárias de processamento e/ou armazenamento
do produto estão aquém das necessárias. Não foi
encontrada Salmonella em nenhuma das amostras
analisadas.
Estes resultados são superiores aos encontrados por
Bricio et al. [6], em que apenas 4,4%, 24,4% e 11,1% das
amostras estavam fora do padrão para mesófilos,
coliformes totais e termotolerantes, respectivamente. Porém
também não encontraram nenhuma Salmonella nas
amostras analisadas.
Mas assemelham-se aos encontrados por Silva et al. [7]
que foram de 55,7% para coliformes totais, 52,3% para
fecais e 25% para mesófilos em amostras de leite tipo “C”
destinado ao programa do leite no Estado de Alagoas.
Também não detectaram Salmonella nas amostras
analisadas.
Leite et al [8] obtiveram resultados bem parecidos
quando avaliaram leite integral tipo “C” comercializado em
Salvador – Bahia, com 55% das amostras fora dos padrões
para coliformes totais e 35% das mesmas para coliformes
fecais.
Conclusão
Considerando os resultados obtidos, pode-se concluir
que o tratamento térmico não está sendo adequado, devido
à alta carga microbiana inicial, denotando-se assim a
necessidade de melhoria e implantação de medidas de
controle higiênico-sanitárias nas fazendas leiteiras, no que
diz respeito à ordenhadeiras, ordenhadores, assepsia do
úbere e tetos, além de boa higienização dos utensílios e
equipamentos, seja por parte das fazendas, como também
da Indústria.
Referências
[1]
[2]
[3]
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal.
Instrução Normativa nº 51, de 18 de setembro de 2002. Aprova e
oficializa o Regulamento Técnico de identidade e qualidade de leite
pasteurizado tipo C refrigerado. Diário Oficial da União, Brasília,
20 de setembro de 2002.
PIETROWSKI, G. A. M.; OTT, A. P.; SIQUEIRA, C. R.;
SILVEIRA, F. J.; BAYER, K. H.; CARVALHO, T. Avaliação da
Qualidade Microbiológica de Leite Pasteurizado Tipo C
Comercializado na Cidade de Ponta Grossa-PR. VI Semana de
Tecnologia em Alimentos. Universidade Tecnológica Federal do
Paraná – UTFPR. Campus Ponta Grossa - Paraná – Brasil. ISSN:
1981-366X / v. 02, n. 36, 2008.
TAMANINI, R.; SILVA, L. C. C.; MONTEIRO, A. A.; MAGNANI,
D. F.; BARROS, M. A. F.; BELOTI, V. Avaliação da qualidade
microbiológica e dos parâmetros enzimáticos da pasteurização de
[4]
[5]
leite tipo “C” produzido na região norte do Paraná. Semina:
Ciências Agrárias, Londrina, v. 28, n. 3, p. 449-454, jul./set.
2007.
BRASIL.
Ministério
da
Agricultura,
Pecuária
E
Abastecimento. Secretaria
de Defesa Agropecuária (DISPOA).
0
Instrução Normativa n 62, de 26 de agosto de 2003. Oficializa
os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas
para Controle de Produtos de Origem Animal e Água. Diário
Oficial da União, Brasília, 26 de agosto de 2003.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal.
Instrução Normativa nº 51, de 18 de setembro de 2002. Aprova
e oficializa o Regulamento Técnico de identidade e qualidade
de leite pasteurizado tipo C refrigerado. Diário Oficial da
União, Brasília, 20 de setembro de 2002.
[6]
[7]
[8]
BRICIO, S. M. L.; SILVA, C. G.; FINGER, R. M. Qualidade
bacteriológica do leite pasteurizado tipo C produzido no estado do
Rio de Janeiro. R. bras. Ci. Vet., v. 12, n. 1/3, p. 124-126, jan./dez.
2005.
SILVA, M. C. D.; SILVA, J. V. L.; RAMOS, A. C. S.; MELO, R.
O.; OLIVEIRA, J. O. Caracterização microbiológica e físicoquímica de leite pasteurizado destinado ao programa do leite no
Estado de Alagoas. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(1):
226-230, jan.-mar. 2008.
LEITE,C.C.; GUIMARÃES, A.G.; ASSIS, P. N.; SILVA, M.D.;
ANDRADE, C. S.0. Qualidade bacteriológica do leite integral (tipo
C) comercializado em Salvador – Bahia. Rev. Bras. Saúde Prod.
3
(1):
21-25,
2002.
An.
Tabela 2 – Parâmetros microbiológicos para Leite
Pasteurizado tipo C da Instrução Normativa nº. 51 – MAPA.
Tabela 1 – Número de amostras de leite pasteurizado tipo C
que não atenderam aos parâmetros microbiológicos da
Instrução Normativa nº. 51 – MAPA.
Análises
Contagem de
Mesófilos
NMP de
coliformes totais
NMP de
coliformes fecais
Salmonella /25ml
Total
92
Número de
amostras
fora dos
parâmetros
16
17,4
92
56
60,9
92
38
41,3
92
0
0
%
Microrganismos
Contagem de Mesófilos
(UFC/mL)
Coliformes totais
(NMP/mL)
Coliformes fecais
(NMP/mL)
Salmonella /25ml
Parâmetros
Máx. de 3,0x105
Máx. de 4
Máx. de 2
Ausência