1
2,3,4
Zimmermann LA , Marson FAL
2,4
, Bertuzzo CS
1
Graduando em Medicina, Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, Unicamp [email protected]
2
Departamento de Genética Médica, Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, Unicamp
3
Departamento de Pediatria, Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, Unicamp
4
Laboratório Multiusuário do Departamento de Genética Médica, Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, Unicamp www.laboratoriomultiusuario.com.br
Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, CEP 13083-887, Campinas, SP, Brasil.
Palavras-chave: CFTR - Íleo meconial - ADIPOR2
INTRODUÇÃO
A fibrose cística (FC) é a doença genética
autossômica recessiva mais frequente na população
caucasóide. É causada por mutações no gene CFTR. O
fenótipo da doença inclui sintomas respiratórios,
gastrintestinais e no aparelho reprodutor. Apresenta
expressividade variável, sendo influenciado por fatores
ambientais e genéticos secundários, a exemplo do gene
ADIPOR2. Esse gene está localizado no cromossomo 12,
codifica um receptor para a adiponectina,
desempenhando papel metabólico e anti-inflamatório, e é
considerado provável modificador para o íleo meconial
(IM). O IM é uma obstrução intestinal devido ao aumento
da viscosidade do muco, e acomete 15 a 20% dos
pacientes com FC. Assim, o objetivo foi verificar a
associação entre duas variações no número de cópias
(CNVs) no gene ADIPOR2, a deleção de 315 pb no íntron
2 e a inserção de 134 pb no íntron 3, e a presença de IM em
pacientes com FC, junto a outros marcadores de
gravidade clínica da doença, ainda não estudados em
pacientes com FC.
enzima Taq DNA polimerase, levam ao acúmulo
exponencial da sequência de DNA alvo. A amplificação
das duas regiões (a inserção de 134 bp no íntron 3 e a
deleção de 315 bp no íntron 2) foi feita em reações
separadas. O resultado foi analisado em eletroforese em
agarose 1,5% e coloração com brometo de etídio.
MÉTODOS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da FCM/Unicamp. Foram selecionados 215
pacientes com FC. Todos tiveram resultado alterado em
pelo menos dois testes do suor, com valores de cloro ≥ 60
mEq/L e/ou o duas mutações no gene CFTR identificadas.
Dentre estes pacientes, a análise genética para os
polimorfismos foi realizada em 169, sendo os outros 46
excluídos da análise estatística mediante a falta de dados
clínicos, não amplificação das amostras ou não aceite do
termo de compromisso.
Foram analisadas 27 variáveis clínicas no prontuário
médico desses pacientes, além das alterações no gene
ADIPOR2 através da técnica da reação em cadeia da
polimerase (PCR). Neste método, repetidos ciclos de
desnaturação térmica do DNA, anelamento dos
iniciadores (primers) e extensão destes promovida pela
A. xylosoxidans
-/-
7
12
19
+/+
1
12
13
0,042
6,474
1,615-29,09
1
-
-: ausência do polimorfismo, +: deleção presente; OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
Tabela 3. Associação do polimorfismo de inserção de 134 pares de bases no gene ADIPOR2
com a primeira bactéria P. aeruginosa isolada dos pacientes com FC atendidos na Unicamp
com duas mutações no gene CFTR identificadas
Primeira P. aeruginosa
-/-
Figura 2: Revelação de PCR para polimorfismo de deleção de 315pb
no gene ADIPOR2.
15
38
53
0,048
0,169
0,039-0,742
-: ausência do polimorfismo, +: deleção presente; OR: odds ratio; IC: intervalo de confiança.
A análise estatística foi realizada pelo teste de MannWhitney para as variáveis com distribuição numérica e
pelo Teste Exato de Fisher para as variáveis com
distribuição categórica. O valor de p corrigido para
múltiplos testes foi obtido pelo teste FDR (“False
Discovery Rate”), sendo considerado p menor que 0,05
como estatisticamente significante.
RESULTADOS
Com relação ao genótipo do CFTR, houve maior
prevalência de alelos com a mutação F508del (64,6%).
Para o polimorfismo de 315 pb no gene ADIPOR2, foram
encontrados 51 -/- (homozigotos normais), 79 -/+
(heterozigotos) e 30 +/+ (homozigotos mutados), sendo
possível observar associação com a raça dos pacientes,
primeira Pseudomonas aeruginosa isolada e presença do
Achromobacter xylosoxidans. Já para o polimorfismo de
134 pb, os genótipos encontrados foram 132 -/- e 37 -/+,
também havendo associação com a primeira P.
aeruginosa e com a saturação de oxigênio transcutânea
(SaO2).
Figura 1: Variabilidade clínica na Fibrose Cística
Tabela 2. Associação do polimorfismo de deleção de 315 pares de bases no gene
ADIPOR2
com a cultura para o A. xylosoxidans dos pacientes com F C atendidos na Unicamp com duas
mutações no gene CFTR identificadas
Variável clínica
Sexo feminino
Raça caucasóide
Idade
Inicio dos sintomas
Inicio da doença pulmonar
Inicio da doença digestiva
Tempo para o diagnóstico
Escore de Bhalla
Escore de Kanga
Escore de Shwachman-Kulczycki
SaO2
CVF(%)
VEF1 (%)
VEF1 /CVF(%)
FEF25-75%
IMC – magreza e magreza acentuada
Polipose nasal
Diabetes melittus
Osteoporose
Ileo meconial
Insuficiência pancreática
Primeira P. aeruginosa
P. aeruginosa mucóide status
P. aeruginosa não mucóide status
A. xylosoxidans status
S. aureus status
B. cepacia status
N
169
169
168
159
154
140
162
122
131
144
162
126
124
123
124
167
166
166
166
168
168
122
169
169
169
169
169
Distribuição dos dados
87 (51,5%)2
158 (93,5%)2
154 / 206,50 ± 14,065 (7 a 1274)1
3 / 28,90 ± 7,711 (0 a 720)1
1
5,50 / 36,95 ± 8,668 (0 a 720)
4 / 39,89 ± 8,931 (0 a 720)1
1
21,50 / 85,38 ± 12,085 (0 a 833)
8 / 8,59 ± 0,503 (0 a 25)1
1
17 / 18,76 ± 0,510 (10 a 40)
65 / 66,14 ± 1,374 (20 a 95)1
96 / 94,99 ± 0,329 (66 a 99)1
82,50 / 80,76 ± 2,055 (19 a 135)1
74 / 72,73 ± 2,452 (17 a 132)1
86 / 60,29 ± 3,212 (5 a 150)1
60,50 / 60,29 ± 3,212 (5 a150)1
34 (20,4%)2
32 (19,3%)2
30 (18,1%)2
28 (16,9%)2
25 (14,9%)2
136 (81%)2
30,50 / 93,66 ± 14,458 (2 a 872)1
70 (41,9%)2
91 (53,8%)2
17 (10,1%)2
23 (13,6%)2
134 (9,3%)2
1. mediana / média ± desvio padrão (mínimo máximo). 2. Número de pacientes com a característica
descrita (frequência).
Figura 3. Boxplot da associação do polimorfismo de inserção de 134
pb no gene ADIPOR2 com a Saturação de Oxigênio Transcutânea
(SaO2), sem considerar a distribuição dos pacientes pelo genótipo do
gene CFTR.
Os resultados não demonstraram associação
significativa entre as duas CNVs e o IM. Como a
população brasileira tende a ser miscigenada e a
casuística ficou limitada por falta de dados clínicos, outras
possíveis associações positivas deixaram de ser
observadas no estudo.
CONCLUSÃO
A deleção de 315 pb no íntron 2 e a inserção de 134
pb no íntron 3 do gene ADIPOR2 podem influenciar na
gravidade clínica da FC. Embora não tenha sido
estatisticamente significativa a relação entre essas CNVs
e a presença de IM em pacientes com FC, outros
marcadores analisados demonstraram seu potencial de
associação com a gravidade da doença, confirmando o
papel de modificador atribuído ao gene ADIPOR2.
APOIO
D.A.D.C.C.
FCM-UNICAMP