Microbiologia - Microbiologia Aplicada
Atividade Anti-HCV e Citotóxica de Hidroxichalconas
Gabriela M. Ayusso1, Mariana B. Santos1,Beatriz C. Marques1,Jacqueline F. Shimizu1, Ana C. Jardim1,
Cintia Bittar1,Paula Rahal1, Luis O. Regasini1
1
Universidade Estadual Paulista "Julio Mesquita Filho" - câmpus São José do Rio Preto
Introdução
A hepatite C é uma doença infecciosa causada pelo vírus HCV. Este pertence ao
gênero Hepacivirus da família Flaviridae e sua partícula é constituída por uma fita de RNA
simples (Ferreira et al., 2004).Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de 3% da
população mundial, ou seja, o equivalente a mais de 170 milhões de indivíduos estão infectados
pelo vírus da hepatite C (HCV), um número sete vezes superior aos portadores do HIV (Ghany
et al., 2009). A terapia mais eficaz para o tratamento da hepatite C crônica é a associação de
interferon peguilado e ribavirina, porém esse tratamento possui custo elevado e desencadeia
efeitos adversos severos que podem levar a complicações durante o tratamento. Além disso, o
interferon convencional se mantém ainda como monoterapia em países em desenvolvimento
devido às dificuldades de importação (Munir et al., 2010).
Chalcona é uma das maiores classes de flavonoides, com distribuição ampla nos
vegetais, sendo precursores biossintéticos dos demais flavonoides (Di Carlo et al., 1999).
Segundo a Química dos Produtos Naturais, as chalconas podem ser definidas como flavonoides
de cadeia aberta, sendo formadas por duas subunidades benzênicas (anéis A e B) espaçadas por
uma cetona α,β-insaturada, compondo um esqueleto C6C3C6 (Dhar, 1981). As chalconas
mostram-se uma fonte de grande interesse farmacológico, sendo reconhecidas como importantes
bióforos por apresentarem inúmeras atividades biológicas, destacando-se suas propriedades
antitumorais e antimicrobianas, incluindo atividade antibacteriana, leishmanicida, antimalárica e
antifúngica que variam de acordo com os diferentes substituintes (Nowakowska, 2007; Ghany et
al., 2009). Porém, a ação de chalconas sobre vírus demonstra-se escassamente explorada, sendo
os primeiros estudos com vírus de plantas no qual houve a descrição da atividade de hidroxi- e
metoxichalconas contra ToRSV (tomato ringspot virus), agente causador da mancha anelar do
tomateiro (Onyilagha et al., 1997).
Objetivos do Trabalho
O presente trabalho objetivou a síntese e avaliação da atividade de doze chalconas
hidroxiladas na replicação do HCV e citotoxicidade.
Metodologia
Procedimento Químico
As hidroxichalconas foram sintetizadas por meio de reações de condensação aldólica
entre acetofenonas e derivados benzaldeídicos; essas reações foram realizadas sob catálise ácida
utilizando o ácido sulfurico (Figura 1). As hidroxichalconas foram purificadas por precipitação,
extração líquido-líquido e cromatografia em coluna. As estruturas das mesmas foram
confirmadas pela análise dos seus espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio 1
e de Carbono 13.
Figura 1.Reação de Condensação Aldólica realizada sob catálise ácida
O
A
O
CH3
H
+
O
H2SO4
B
A
B
EtOH, refluxo
Procedimento Biológico
Os testes de replicação do HCV e citotoxicidade foram integralmente desenvolvidos
no Laboratório de Estudos Genômicos nas dependências do Departamento de Biologia, Instituto
de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Unesp – Campus de São José do Rio Preto, Estado de
São Paulo, Brasil.
A avaliação da citotoxicidade foi realizada por ensaio de MTT, utilizando células
Huh-7.5 provenientes de hepatoma humano, contendo o replicon subgenômico SGR-FEO. Uma
suspensão de 5x103 células Huh-7.5 foi transferida para microplacas de 96 poços e foram
incubadas em estufa a 37 ºC, com atmosfera a 5% de CO2,overnight. Soluções com
concentrações de 50, 10, 2.0 e 0.4 μmol L-1 de cada substância em meio de cultura foram
adicionadas às células em triplicatas. As microplacas foram incubadas por 72 horas a 37 ºC e
atmosfera a 5% de CO2. Em seguida, o sobrenadante foi removido sendo adicionada solução de
MTT (brometo de [3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]; Sigma®) a 1 mg/mL de meio
de cultura às células, as quais foram incubadas a 37 °C por 30 minutos. A solução de MTT foi
removida, substituída pelo mesmo volume de DMSO para solubilização dos cristais de
formazana e as soluções foram submetidas à leitura em 570 nm.
A avaliação na replicação do HCV foi realizada usando células Huh-7.5-SGR-FEO.
Uma suspensão de 5x103 células foi transferida para microplacas de 96 poçose foram incubadas
em estufa a 37 ºC, com atmosfera a 5% de CO2, overnight. As substâncias foram adicionadas
como descrito no ensaio de MTT.Após 72 horas de incubação, o meio de cultura contendo os
compostos foi descartado, as células foram lavadas em tampão fosfato salino (PBS) e
adicionadas de tampão de lise passiva (PLB; Promega) por 30 min. A atividade de luciferase foi
medida utilizando o reagente para ensaio de luciferase (LAR; Promega) em leitor de placa
(FLUOstar Omega – BMG Labtech®).
Todos os experimentos foram realizados em triplicatas e em dois eventos
independentes. Como controles, foram utilizados a ciclosporina A e DMSO.
Resultados
Na concentração de 50 µmol L-1, as hidroxichalconas avaliadas exibiram
citotoxicidade alta ao apresentarem viabilidade celular inferior a 50%. Na concentração de 10
µmol L-1, a hidroxichalcona que apresentou uma maior inibição na replicação foi a chalcona 2,
porém o resultado pode ser decorrente da alta citotoxicidade apresentada pela mesma. Nessa
mesma concentração, a hidroxichalcona 1 mostrou um resultado promissor ao apresentar
viabilidade celular de 90% e inibição de replicação do vírus de 50%.
Figura 2. Hidroxichalconas que apresentaram atividade anti-HCV
OH
F
HO
O
O
1
2
Conclusões
Em linhas gerais, nos ensaios anti-HCV e de citotoxicidade, as hidroxichalconas
demonstraram potente efeito citotóxico ao apresentar viabilidade celular inferior a 50% na
concentração de 50 µmol L-1. Em concentrações inferiores, as mesmas não demonstraram
resultados significativos quanto à inibição da replicação do vírus. Na concentração de 10 µmol
L-1, a hidroxichalcona 1mostrou-se promissor agente anti-HCV com viabilidade celular de 90%
e inibição de replicação do vírus de 50%.
Bibliografia
Dhar, D. N. The Chemistry of chalcones and related compounds. Ed. John Wiley, New York,
1981.
Di Carlo, G. et al. Flavonoids: Old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs. Life
Sci., v. 65, p. 337-53, 1999.
Ferreira, C.T.; Silveira, T. R.Viral Hepatitis: epidemiological andpreventive aspects. Rev. Bras.
Epideomol., Porto Alegre, v. 7, n. 4, p. 473-87, 2004.
Ghany, M. G. et al. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C: na update.
Hepatology, v. 49, p. 1335-74, 2009.
Munir, S. et al. Hepatitis C treatment: current and futures perspectives. Virol. J., v. 7, p. 296,
2010.
Nowakowska, Z. A review of anti-infective and anti-inflammatory chalcones. Eur. J. Med.
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Onyilagha, J. C. et al. Comparative studies of inhibitory activities of chalcones on tomato
ringspot vírus ToRSV. Plant Pathol.,v. 19, p. 133-7, 1997.