UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DESENVOLVIMENTO DE UM FOTÔMETRO COM
FINS DIDÁTICOS
FÁBIO ALEXANDRE COSTA MOTA
MANAUS
2010
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
FÁBIO ALEXANDRE COSTA MOTA
DESENVOLVIMENTO DE UM FOTÔMETRO COM FINS DIDÁTICOS
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal do
Amazonas, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre
em Química, área de concentração
Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. Genilson Pereira Santana
MANAUS
2010
ii
À Israel Ribeiro do Nascimento,
Maria Valdeíza Costa de Oliveira e
Carlos Henrique Zampollo (in memoriam)
iii
AGRADECIMENTOS
Especialmente ao meu orientador, Prof. Dr. Genilson Pereira Santana, que com sua
experiência e paciência soube esperar acordar o estudante que dorme em mim.
A CAPES E FAPEAM pelo financiamento concedido.
A UFAM pela utilização de seus laboratórios, tornando possível a realização das
análises.
Ao meu eterno amigo Luiz Boccia, que sempre soube oferecer a mão em todas as horas,
mesmo estando fisicamente tão longe.
A Israel Ribeiro pela ajuda com fotos nos locais de coleta.
A Zenildo Pereira pelas dicas como eletrônico.
Aos colegas de laboratório Marcondes Silva da Silva, Mauro Célio Pio e João Vitor por
ajudas diversas em momentos complicados.
Às colegas de mestrado Alcinei Lopes Pereira e Relem Cativo pelas camaradagens
durante o curso.
Enfim, agradeço a todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
realização dessa pesquisa.
iv
RESUMO
Desenvolvimento de um fotômetro com fins didáticos
Foi
desenvolvido
um
fotômetro
para
fins
didáticos
para
uso
na
contextualização de temas químicos sociais, como química ambiental, e em aulas de
instrumentação analítica, com determinação de ortofosfato total em águas. Para sua
construção foram usados materiais de baixo custo e de fácil aquisição. O aparelho
consiste basicamente de um LED (Diodo Emissor de Luz) amarelo como fonte e LDR
(Resistor Dependente de Luz) como detector. O sinal do fotômetro é dado em valores de
resistividade, medida com uso de multímetro digital. Para a determinação do ortofosfato
foi usado o método do azul de molibdênio, sendo águas de um igarapé poluído usados
como amostras teste. Para procedimentos de validação analítica, foram feitos testes para
configuração mais adequada, optando-se por cubeta de acrílico, escala de 200kΩ de
resistividade e uso de cobertura no aparelho, assim como verificação da estabilidade da
fonte. O aparelho foi validado usando critérios de precisão, exatidão, recuperação e
linearidade. A precisão intermediária e repetibilidade apresentaram coeficientes de
variação médios de 3,0 e 2,8, respectivamente. A exatidão do fotômetro foi verificada
com comparação estatística baseadas nos testes F e t para p < 0,05, sendo as mesmas
medidas feitas no fotômetro e espectrofotômetro UV-Vis, para fins de comparação.
Com 95% de nível de confiança foi revelado que há diferenças significativas entre os
valores de concentração, sendo que os resultados foram considerados satisfatórios com
o uso de um fator de correção. Os testes de recuperação foram satisfatórios com
variações entre 97,6 e 107,3%. A linearidade foi considerada satisfatória no intervalo de
8 a 48 µmol l-1, apresentando valores de r2 acima de 0,99.
Palavras-chave: Ferramenta didática, Fotômetro, Instrumentação analítica
v
ABSTRACTS
Development of a photometer for didactic purpose
In this work was developed a photometer for didactic purposes for use in the
context of social themes chemicals, such as environmental chemistry and classes of
analytical instrumentation, with total determination of total orthophosphate in water.
The instrument was developed using cheap materials and easy disposal. The instrument
consists of a yellow LED and LDR; the first is the source and the former the detector.
The signal of the photometer is available by values in resistivity, within is measured
with assistance of the digital multimeter. For the determination of the orthophosphate
was used the Molybdenum Blue Colorimetric Method, using river waters as test
samples. Procedures for analytical validation tests were for the most suitable
configuration, choosing a bucket acrylic, range from 200 kΩ resistivity and use of cover
to the apparatus, as well as checking the stability of the source. Accuracy, precision,
recovery and linearity of the photometer were checked. The repeatability and
intermediate precision had coefficients of variation average 3.0 and 2.8, respectively.
Accuracy was examined with statistical comparison based upon test F and t for p <
0.05, with same measures evaluated in the photometer and spectrophotometer UV-Vis,
for comparison. With 95% confidence level was revealed that there are significant
differences between the values of concentration, and the results were satisfactory with
the use of a correction factor The recovery tests were satisfactory, with variations
between 97.6 and 107.3%. The linearity is satisfactory in the range 8-48 µmol l-1, with
r2 values above 0.99.
Keywords: Teaching tool, Photometer, Analytical instrumentation
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 – Processo de absorção de radiação por um analito....................................... 6
Figura 1.2 – Espectro eletromagnético ........................................................................... 6
Figura 1.3 – Atenuação de um feixe de radiação por uma solução absorvente .............. 8
Figura 1.4 – Curva de calibração de cinco soluções-padrão .......................................... 9
Figura 2.1 – Desenhos de instrumentos fotométricos e espectrofotométricos UV/Vis..16
Figura 2.2 – Diagrama esquemático de um fotômetro Multi-LED............................... 20
Figura 2.3 – Esquema do fotômetro desenvolvido por CHAGAS (2006) ................... 21
Figura 4.1 – Parte fixa do fotômetro em ângulos diferentes ........................................ 37
Figura 4.2 – Partes móveis do fotômetro ...................................................................... 38
Figura 4.3 – Acessórios do fotômetro .......................................................................... 39
Figura 5.1 – Gráficos de resistividade elétrica, Ω, versus concentração, µmol l-1 ....... 54
Figura 5.2 – Gráficos de resistividade elétrica, 200 kΩ versus tempo, s ..................... 55
Figura 5.3 – Gráficos de resistividade elétrica, 2 MΩ versus tempo, s ........................ 55
Figura 5.4 – Gráficos de resistividade elétrica, 20 MΩ versus tempo, s ...................... 56
Figura 5.5 – Gráficos de resistividade elétrica, Ω, versus tempo, s ............................. 57
Figura 5.6 – Gráficos de concentração versus resíduos padronizados ......................... 63
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 – Cores da luz visível..................................................................................... 7
Tabela 2.1 – Sistemas home-made para diversos fins analíticos................................... 19
Tabela 3.1 – Sistemas home-made com uso de teste t pareado .................................... 31
Tabela 3.2 – Aplicações de validação analítica............................................................. 32
Tabela 5.1 – Valores médios de resistividade elétrica para avaliação de linearidade .. 50
Tabela 5.2 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, com uso de cobertura ... 52
Tabela 5.3 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, sem uso de cobertura ... 52
Tabela 5.4 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, com cubeta de vidro .... 53
Tabela 5.5 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, com cubeta de acrílico 54
Tabela 5.6 – Valores de média e desvio-padrão de linearidade ................................... 58
Tabela 5.7 – Variáveis estatísticas de valores médios de curvas de fosfato.................. 59
Tabela 5.8 – Valores de x e y médios e resíduos padronizados de soluções-padrões .. 60
Tabela 5.9 – Trabalhos de quantificação de fosfato em diversos ambientes ................ 62
Tabela 5.10 – Valores médios de curvas analíticas para avaliação da repetibilidade .. 63
Tabela 5.11 – Valores médios de curvas analíticas para avaliação da precisão
intermediária .............................................................................................................. 63
Tabela 5.12 – Média de valores de CV de repetibilidade e precisão intermediária...... 64
Tabela 5.13 – Valores experimentais e calculados de concentrações de ortofosfato de
soluções-padrão, em µmol l-1 e dados de recuperação ................................................. 64
Tabela 5.14 - Dados referentes à ortofosfato dissolvido de 10 amostras medidas em
espectrofotômetro e fotômetro ................................................................................... 65
Tabela 5.15 – Valores de concentração, em µmol l-1, em fotômetro medido em Ω e
espectrômetro, medido em A, e respectivos valores de razão ....................................... 66
Tabela 5.16 - Resultados de testes estatísticos a 95% de confiança ............................. 66
viii
SUMÁRIO
Resumo ................................................................................................................ v
Abstracts ............................................................................................................ vi
Lista de Figuras ............................................................................................... vii
Lista de Tabelas .............................................................................................. viii
Apresentação ........................................................................................................ 1
Objetivos .................................................................................................... 3
Capítulo 1 – Espectroscopia ............................................................................... 4
1.1 – Fundamentos de espectroscopia ............................................................ 5
1.2 – Lei de Beer ............................................................................................ 8
Capítulo 2 – Aplicações didáticas e fotômetros ............................................... 10
2.1 – Aplicações didáticas ........................................................................... 11
2.2 – Fotômetros .......................................................................................... 16
2.2.1 – Usos de LEDs em fotômetros .................................................... 17
2.3 – Sistemas home-made para análises químicas usando LED ................ 18
2.4 – Sistemas home-made para análises químicas usando LDR ................ 24
Capítulo 3 –Abordagem estatística e validação analítica ................................ 26
3.1 – Tratamentos estatísticos ...................................................................... 27
3.1.1 – Teste t de Student ....................................................................... 28
3.1.2 – Teste F ....................................................................................... 31
3.2 – Validação de métodos analíticos ......................................................... 32
3.2.1 – Recuperação ou eficiência de extração ...................................... 33
3.2.2 – Linearidade ................................................................................ 33
3.2.3 – Precisão ...................................................................................... 34
3.2.4 – Exatidão ..................................................................................... 35
ix
Capítulo 4 – Parte Experimental ....................................................................... 36
4.1 – Construção do fotômetro .................................................................... 37
4.1.1 – Acessórios para uso com o fotômetro construído....................... 39
4.2 – Avaliação de parâmetros para posterior uso em validação analítica ... 39
4.3 – Metodologia azul de molibdênio ........................................................ 40
4.4 Avaliação de parâmetros ....................................................................... 41
4.4.1 – Avaliação de linearidade de curvas analíticas ........................... 41
4.4.2 – Uso de cobertura ........................................................................ 42
4.4.3 – Materiais das cubetas ................................................................. 42
4.4.4 – Estabilidade da fonte ................................................................. 42
4.5 – Amostragem ....................................................................................... 43
4.6 Validação do fotômetro ......................................................................... 43
4.6.1 – Linearidade ................................................................................ 43
4.6.2 – Precisão ..................................................................................... 45
4.6.3 – Recuperação ............................................................................... 46
4.6.4 – Exatidão ..................................................................................... 47
Capítulo 5 – Resultados e Discussão ................................................................ 48
5.1 – Construção do fotômetro .................................................................... 49
5.2 – Avaliação de parâmetros .................................................................... 49
5.2.1 – Avaliação de linearidade entre curvas analíticas ....................... 49
5.2.2 – Uso de cobertura ........................................................................ 51
5.2.3 – Materiais das cubetas ................................................................. 53
5.2.4 – Estabilidade da fonte ................................................................. 54
5.3 - Validação do fotômetro ....................................................................... 58
5.3.1 – Linearidade ................................................................................ 58
5.3.2 – Precisão ..................................................................................... 62
5.3.3 - Recuperação ............................................................................... 64
x
5.3.4 – Exatidão ..................................................................................... 65
Capítulo 6 – Conclusões ................................................................................... 67
Capítulo 7 – Referências .................................................................................. 70
ANEXO ............................................................................................................. 83
xi
Apresentação
A aplicabilidade de princípios teóricos expostos pelo professor, vistos em sala
de aula ou laboratórios didáticos, tende a aproximar os mesmos, às vezes, de teor muito
abstrato, à realidade dos alunos. Conceitos que, se vistos só textualmente, não são
plenamente compreendidos por graduandos, surgindo, fatalmente, lacunas de
conhecimento na formação educacional dos mesmos. Entre os conceitos mais
aproveitados por docentes para este fim estão os de espectroscopia, como na construção
de sistemas instrumentais (CALIXTO et al., 2008; VAZ et al., 2008) e/ou realização de
experimentos didáticos (PENTEADO et al., 2008; BAPTISTELLA et al., 2009). Com
isso, espera-se que o aluno tenha uma visão mais abrangente e prática dos fenômenos
espectroscópicos, além de poder interferir nos mesmos para aproveitamentos didático
e/ou comercial. Alguns aspectos vantajosos dos métodos espectroscópicos a serem
considerados seriam a aplicabilidade a diversos fins e sua simplicidade instrumental
frente à outras técnicas analíticas, como as cromatográficas, destacando neste contexto a
construção de fotômetros (FONSECA, 2004; CHAGAS, 2006; NASCIMENTO, 2008).
Os fotômetros são ferramentas simples e relativamente baratas para a
realização de medidas da concentração de diversos analitos (SKOOG et al., 2009). Com
o avanço da tecnologia, observou-se na química analítica a tendência de diminuir suas
dimensões físicas, sendo comum o uso de dispositivos eletrônicos com dimensões cada
vez menores, como LED (DASGUPTA et al., 2003; GAIÃO et al., 2008) e LDR
(MATIAS et al., 2003; TUBINO E QUEIROZ, 2006), ambos apresentando-se como
boas alternativas para a confecção de instrumentos analíticos.
1
Um dos analitos que poderia ser monitorada por esses instrumentos é o
ortofosfato, um dos responsáveis pela eutrofização de águas naturais devido descarte de
esgoto doméstico in natura (ESTEVES, 1998; ROCHA et al., 2004).
Após a confecção de um sistema instrumental, escolha de método e amostras,
geralmente a última etapa deste ciclo são os procedimentos para verificação da
confiabilidade dos dados, sendo chamados de validação analítica, caracterizada por
diversos parâmetros, chamados genericamente de figuras de mérito (HARRIS, 2008;
CASSIANO et al., 2009; SKOOG et al., 2009).
Neste trabalho, desenvolveu-se um sistema fotométrico home-made para uso
didático, oferecendo ao professor de nível universitário uma ferramenta ao se trabalhar,
por exemplo, princípios básicos de espectroscopia, instrumentação analítica, tratamento
estatístico de dados e validação analítica, assim como outros temas em química que
julgar adequados, como por exemplo, princípios de química ambiental, dependendo do
tipo de amostra que escolher. Para verificar a confiabilidade dos dados, foram feitos
procedimentos de validação analítica com determinação de ortofosfato total em águas
de igarapé, empregando o método azul de molibdênio (PARANHOS, 1996).
Para o melhor entendimento do trabalho, o texto foi dividido em 7 capítulos.
No Capítulo 1 é apresentada uma revisão bibliográfica tratando de alguns conceitos de
espectroscopia, englobando os tópicos relevantes ao entendimento desta dissertação.
Abordagens sobre educação, feitos por profissionais da área de química, são
expostos no Capítulo 2, assim como aplicações didáticas de experimentos. Também é
apresentada uma revisão bibliográfica de aplicações de fotômetros, com foco didático
e/ou pesquisa.
No Capítulo 3 são apresentados conceitos de tratamentos e testes estatísticos de
dados, além de conceitos de validação analítica e figuras de mérito.
2
A parte experimental, englobando a construção do fotômetro, tratamentos e
testes estatísticos dos dados e procedimentos de validação, é apresentada no Capítulo 4.
Resultados e discussão são expostos no Capítulo 5 e conclusões e referências são
apresentadas, respectivamente, nos capítulos 6 e 7. Em anexo é relatada a preparação de
reagentes utilizados no método azul de molibdênio.
Objetivos
Geral:
Construir um fotômetro para uso didático e sugeri-lo como ferramenta para
abordagem de temas químicos sociais, como química ambiental, e instrumentação
analítica, fazendo-se uso de validação analítica para caracterizar o instrumento proposto.
Específicos:
- Construir um fotômetro, priorizando facilidade na construção e manutenção
do mesmo para uso em salas de aula ou laboratórios didáticos.
- Sugerir o uso do fotômetro como ferramenta didática para contextualização
de temas químicos sociais adequados e instrumentação analítica.
- Testar a viabilidade do fotômetro para determinação do ortofosfato total em
águas eutrofizadas.
- Comparar a confiabilidade dos dados medidos de amostras reais no
instrumento construído a espectrômetro UV-Vis, assim como a realização de outros
procedimentos de modo a validá-lo analiticamente.
3
CAPÍTULO 1
ESPECTROSCOPIA
4
1.1 Fundamentos de espectroscopia
Os métodos espectroscópicos de análise química são baseados na medição da
quantidade de radiação eletromagnética produzida ou absorvida por um analito de
interesse (SKOOG et al., 2009). As interações da radiação eletromagnética com a
matéria são objeto de estudo em diversas áreas, como na área farmacêutica, na
quantificação de princípios ativos (FREGONEZY-NERY et al., 2008; FRIEDRICH et
al., 2009); na área ambiental, na determinação de macronutrientes e elementos-traço em
matrizes ambientais (COTTA et al., 2006; SUSSULINI E ARRUDA, 2006) e na área
industrial, na determinação de compostos de interesse nutricional (NUNES et al., 2008;
PRESOTO E ALMEIDA-MURADIAN, 2008).
Quando uma fonte de radiação eletromagnética emite fótons, de frequência υ
qualquer, incidindo sobre uma amostra, uma parte de sua energia pode ser absorvida,
promovendo a excitação de espécies, sendo esse excesso energético emitido em seguida
(OHWEILER, 1976; MENDHAN et al., 2002; HARRIS, 2008). A energia de um fóton,
E, é proporcional á frequência da radiação, υ, de acordo com a equação 1.1:
sendo h a constante de Planck (h = 6,626 x 10-34 J.s-1) (HARRIS, 2008).
Em termos de comprimento de onda, λ, têm-se a equação 1.2:
sendo c a velocidade da luz no vácuo (c = 2,998 x 108 m.s-1) (HARRIS, 2008).
A absorção da radiação eletromagnética é um tipo de interação da radiação
com o meio material, que depende da estrutura das espécies atômicas ou moleculares
envolvidas. Quando um feixe de radiação eletromagnética atravessa uma camada de um
analito, Po, certas freqüências da radiação podem ser seletivamente retidas pelo
5
material, logo há transmissão de um feixe de radiação, P, de menor intensidade que o
feixe incidente (Figura 1.1) (OHWEILER, 1976; HARRIS, 2008):
FIGURA 1.1: Processo de absorção de radiação por um analito.
FONTE: MODIFICADO DE SKOOG et al., 2009.
Outra característica importante da radiação eletromagnética é seu espectro,
dividido em várias regiões, de acordo com características da radiação, abrangendo um
intervalo muito amplo de comprimentos de onda e freqüências. Esse intervalo é
empregado para estabelecer as divisões dos métodos espectroscópicos (Figura 1.2).
FIGURA 1.2: Espectro eletromagnético destacando componentes da região visível
FONTE: MODIFICADO DE SBF, 2009.
Técnicas Espectroscópicas: DIF RX (Difração de Raios X); RAMAN (Ressonância
Magnética); Vis (visível); FT-IV (Infravermelho Transformada de Fourier); ESCA
(Espectroscopia de fotoelétrons excitados por Raios X); ICP (Plasma Indutivamente
Acoplado); RPE (Espectroscopia de Radiofreqüência).
Os nomes das regiões possuem natureza histórica, não existindo mudanças
abruptas nas características da radiação eletromagnética quando se passa de uma região
para outra (SKOOG et al., 2009). Percebe-se que a porção do espectro visível ao olho
humano é muito estreita quando comparada com as outras regiões espectrais.
6
A radiação complexa que compreende os diferentes comprimentos de onda,
dentro da região visível do espectro eletromagnético, é conhecida como luz branca. A
Tabela 1.1 mostra os intervalos de comprimentos de onda correspondentes a cada cor. A
percepção da cor resulta da absorção seletiva de certos comprimentos de onda da luz
incidente pelos objetos materiais. Os demais comprimentos de onda são transmitidos ou
refletidos e percebidos como cor do objeto. Quando a luz branca atravessa um meio, por
exemplo, um vidro, transparente a certos comprimentos de onda, mas capaz de absorver
outros comprimentos, o meio aparece corado ao observador (HARRIS, 2008).
Tabela 1.1: Cores da luz visível
Cor
Intervalo de
comprimento de onda (nm)
380 – 435
Absorvida
Violeta
Observada
Verde-amarelo
435 – 480
Azul
Amarelo
480 – 490
Azul-verde
Alaranjado
490 – 500
Verde-azul
Vermelho
500 – 560
Verde
Púrpura
560 – 580
Verde-amarelo
Violeta
580 – 595
Amarelo
Azul
595 – 650
Alaranjado
Azul-verde
650 – 780
Vermelho
Verde-azul
FONTE: OHLWEILER, 1976.
Cor complementar é a cor que seria percebida se os comprimentos de onda
absorvidos pudessem ser observados; a complementaridade significa que a luzes
transmitida e absorvida seriam capazes de decompor a luz branca. Semelhantemente,
um objeto opaco corado absorve certos comprimentos de onda e refletem outros quando
7
iluminados com luz branca. Finalmente, quando um objeto aparece como branco, é
porque ele reflete todos os comprimentos de onda; o objeto é preto quando absorve
todos os comprimentos de onda (OHLWEILER, 1976, SKOOG et al., 2007).
1.2 Lei de Beer
Um feixe de luz incidindo em uma solução contendo um analito capaz de
absorvê-lo, Po, será atenuado, ou seja, a sua potência transmitida, devido absorção, será
menor que a incidida, P (Figura 1.3), e quanto maior for o caminho, b, através do qual a
luz passa, há mais centros absorventes e maior será a atenuação (HARRIS, 2008).
FIGURA 1.3: Atenuação de um feixe de radiação por uma solução absorvente
FONTE: HARRIS, 2008.
A radiação incidente transmitida, Transmitância, T, é representada pela
equação 1.3 (OHLWEILER, 1976; SKOOG et al., 2007; HARRIS, 2008):
sendo Po a potência do feixe incidente e P a potência do feixe transmitida.
A absorbância da solução, A, está relacionada com T de forma logarítmica,
como mostra a equação 1.4:
8
De acordo com a Lei de Beer, a absorbância é diretamente proporcional à
concentração da espécie absorvente, c, e ao caminho óptico, b, do meio absorvente, de
acordo com a equação 1.5:
sendo Ɛ a constante absortividade molar da substância absorvente, em mol l-1 cm-1 .
Cabe salientar que, na derivação da Lei de Beer, considera-se: 1) a radiação
incidente
como
monocromática;
2)
os
centros
absorventes
como
atuando
independentemente uns dos outros no processo de absorção e 3) a absorção como
ocorrendo em um volume de seção transversal uniforme. A Lei de Beer pode ser
empregada usando uma série de soluções padrão do analito para construir uma curva
analítica (Figura 1.4) (HARRIS, 2008).
FIGURA 1.4: Curva analítica de cinco soluções padrão.
FONTE: CASSIANO et al., 2009.
A curva analítica é tratada matematicamente, usando-se geralmente regressão
linear simples e método dos mínimos quadrados, sendo satisfatório na maioria dos
casos. A partir daí, estima-se a concentração de amostras reais, de posse da equação da
reta obtida e coeficiente de determinação obtidos com o tratamento (CASSIANO et al.,
2009).
9
CAPÍTULO 2
APLICAÇÕES DIDÁTICAS E
FOTÔMETROS
10
2.1 Aplicações didáticas
A função do ensino de química deve considerar a necessidade de vinculação do
conteúdo trabalhado com o contexto social em que o aluno está inserido. De forma
geral, a idéia sugerida é contextualizar o conteúdo visto em salas de aula com o
cotidiano do aluno, e também usar práticas didáticas em que o mesmo seja solicitado a
participar ativamente de experimentos, de forma que o mesmo adquira intimidade com
o conteúdo, logo, retendo melhor conteúdos úteis ao entendimento de tal tópico exposto.
De forma geral, um perfil da educação atual é (SCHNETZLER E ARAGÃO,
1995; SILVA, 2003; SCHNETZLER, 2004; VIEIRA et al., 2007):
- O ensino atual não tem atendido ao objetivo de formação da cidadania.
- O tratamento dos conteúdos programáticos não tem sido adequado para
propiciar aprendizagem significativa e nem para formação da cidadania.
- Devido diversos fatores, os professores não têm assumido uma postura
comprometida com a formação da cidadania.
- O processo de avaliação atual não está adequado.
- Os alunos atualmente têm uma postura passiva e dogmática.
Para os educadores citados a forma atual do ensino é acrítica, estanque,
dogmática, distante e alheia ás necessidades da comunidade escolar. No que se refere à
química, muitas vezes, as aulas são desenvolvidas por meio de atividades nas quais há
predominância de um verbalismo teórico/conceitual em que parece não haver relação
entre ambiente, ser humano e tecnologia. O ensino tradicional concebe que para ensinar
basta saber um pouco do conteúdo específico e utilizar algumas técnicas didáticas.
Esses mesmos autores sugerem que é essencial a existência de propostas de ensino com
objetivo de formação da cidadania. Os educadores justificaram a necessidade do ensino
11
de química para formar o cidadão apresentando argumentos relativos às influências da
química na sociedade. Tais influências passam a exigir do cidadão comum um mínimo
de conhecimento químico para poder participar da sociedade tecnológica atual. Um dos
objetivos do ensino de química citados por tais educadores é desenvolver a capacidade
de participação crítica do aluno, fazendo-o compreender os processos químicos
relacionados com a vida cotidiana e realidade social em que está inserido, para que
possa transformá-la.
O objetivo básico desta proposta de ensino da química compreende a
abordagem de informações químicas fundamentais que permitam ao aluno participar
ativamente da sociedade, tomando decisões conscientes. Isso implica que o
conhecimento químico aparece não como um fim em si mesmo, mas com objetivo
maior de desenvolver as habilidades básicas que caracterizam o cidadão: participação e
julgamento, e para isso há necessidade de vinculação entre o conteúdo trabalhado e o
contexto social em que o aluno está inserido (SILVA, 2003; SCHNETZLER, 2004;
VIEIRA et al., 2007).
Na aplicação de técnicas didáticas adequadas a essa visão de ensino, alternativa
em relação ao ensino dito “tradicional”, os temas químicos sociais desempenham papel
fundamental no ensino de química. Inicialmente deve haver uma discussão crítica das
implicações sociais do assunto a se trabalhar, logo, no ensino para o cidadão, a
abordagem dos temas tem que ser fundamentada na integração entre conceitos químicos
e na discussão dos aspectos sociais, principalmente, usando-se temas regionais,
vinculados diretamente ao cotidiano do aluno. Levando em conta tais considerações,
pode-se concluir que os temas químicos sociais não têm um fim em si mesmo, mas sim
uma função de contextualizar o conhecimento químico. É importante mostrar ao aluno
12
uma concepção de ciência como um processo em construção e que ele pode ser ativo
nesta construção (VIEIRA et al., 2007).
A necessidade de vincular conceitos teóricos às suas aplicabilidades práticas
tem motivado muitos pesquisadores/professores a confeccionar sistemas instrumentais
de caráter qualitativo (AZEVEDO E NUNES, 2008; VAZ et al., 2008) e quantitativo
(ASSUMPÇÃO et al., 2008; CALIXTO et al., 2008), sendo os custos de confecção
desses sistemas bem inferiores ao valor de equipamentos equivalentes disponíveis no
mercado, apresentando também facilidades em manutenção e troca de peças mecânicas
e eletrônicas.
Devido à aplicabilidade em diversas áreas científicas e certa simplicidade
operacional e instrumental frente á outras técnicas, como as cromatográficas, a
espectroscopia tem recebido atenção especial quando da confecção de sistemas
instrumentais e/ou uso de experimentos. O estudo da interação da radiação com a
matéria é uma das formas mais eficazes de se obter informações sobre propriedades
microscópicas de sólidos, líquidos e gases. O entendimento dos conceitos fundamentais
envolvidos nos diferentes métodos espectroscópicos é parte fundamental dos currículos
de todos os cursos de graduação em Química e Física e em algumas modalidades de
Engenharia.
Um elemento curricular de suma importância em química é a experimentação.
Essa atividade contribui para a caracterização do método investigativo. A importância
da inclusão da experimentação está na caracterização de seu papel investigativo e de sua
função didática em auxiliar o aluno na compreensão dos fenômenos químicos. Para isso,
não há necessidade de laboratórios sofisticados nem uma ênfase exagerada em sua
utilização, priorizando o que for mais acessível e eficaz. A experimentação é uma
atividade de ensino-aprendizagem, pois é caracterizada pela participação ativa dos
13
alunos, que estimulam o desenvolvimento da participação crítica e da capacidade de
tomada de decisão. Isso nos leva a concluir que, na concepção dos educadores, as
atividades mais recomendadas são aquelas que propiciem uma participação efetiva do
aluno e que desencadeiem seu processo de construção de conhecimento. É uma
atividade desenvolvida com alunos que tem como perspectiva o rompimento com a
fragmentação e linearidade dos conteúdos químicos, visando a contextualização e à
significação das aprendizagens na formação escolar. De forma geral, conceitos e
conteúdos não devem ter um fim em si mesmo, mas sim serem trabalhados a partir de
idéias gerais que lhes dêem um contexto (LIMA et al., 1995; MALDANER E
PIEDADE, 1995; LIMA, 1996).
Os experimentos de espectroscopia de luz visível são particularmente
importantes devido versatilidade e facilidade de realização. A utilização desses
experimentos na caracterização de substâncias está baseada no fato dos níveis de
energia dos átomos e moléculas se comportarem como sua impressão digital (HARRIS,
2008). Outras técnicas espectroscópicas (Ressonância Magnética Nuclear e Eletrônica,
Fluorescência de raios X, etc.) também permitem a obtenção dessas informações, mas
para a maioria das aplicações, as técnicas ópticas têm maior sensibilidade e baixo custo.
Okumura et al. (2004) adaptaram uma série de experimentos de fotometria de
chama usando amostras facilmente encontradas no comércio, como água mineral, soro
fisiológico e bebidas isotônicas para quantificação dos teores de sódio, potássio e cálcio,
especificamente para ensino de princípios de espectrometria atômica em cursos de
química analítica, sendo que alunos participantes desse projeto concordaram que a
iniciativa ajudou na assimilação do conteúdo programático em questão.
Substâncias naturais que exibem ampla gama de atividades biológicas e grande
importância comercial e industrial, como é o caso do (+)-α-terpineol, tendem a
14
despertar a atenção dos estudantes. Se, aliado a isso, elas puderem ser obtidas por etapas
sintéticas simples a partir de outras substâncias naturais facilmente disponíveis, com
certeza podem se tornar excelentes alvos de estudo em disciplinas experimentais de
cursos de graduação em Química. Baptistella et al. (2009) desenvolveram uma
metodologia para obtenção do (+)-α-terpineol a partir do (+)-limoneno, constituinte
majoritário da casca da laranja. Procedimentos simples como extração líquido-líquido,
agitação magnética e destilação foram utilizados para obtenção do composto.
Maestrin et al. (2009) relataram um experimento econômico, eficiente e
didático para extração e purificação da clorofila a, a partir da alga Spirulina maxima.
Este experimento permite aos estudantes utilizar técnicas de extração de produtos
naturais e realizarem purificações cromatográficas, bem como a identificação dos
mesmos por espectros UV-Vis. Segundo os autores, a Spirulina maxima foi escolhida
com o objetivo de evitar os tediosos processos de separações cromatográficas dos
variados tipos de clorofila e facilidade de acesso em casas comerciais de produtos
naturais, fitoterápicos ou de distribuição de insumos para farmácias de manipulação.
Azevedo e Nunes (2008) construíram um espectrógrafo de projeção baseado
em um retroprojetor. O aparato permite a realização de demonstrações qualitativas e
quantitativas do fenômeno de difração da luz e espectroscopia de emissão e absorção de
luz visível. Especificamente foi demonstrada a decomposição espectral da luz
proveniente de lâmpadas de filamento de tungstênio (espectro contínuo) e de vapor de
mercúrio (espectro discreto).
Vaz et al. (2008) construíram um reator fotoquímico de luz UV equipado com
seis lâmpadas fluorescentes de 15 W. Levando em consideração todos os custos, a
montagem da câmara não ultrapassou a quantia de R$ 300,00. Os autores ressaltam que
uma câmara comercial importada equipada, com funções semelhantes foi cotada em
15
US$ 1,650.00 na época de construção. Além disso, algumas modificações podem ser
feitas, como número, tipo e potência das lâmpadas, geometria e tamanho da caixa e até
janela para observação, de acordo com a conveniência e propósito da aplicação desejada
para o fotoreator.
2.2 Fotômetros
No
mercado
existem
diversos
equipamentos,
como
fotômetros,
espectrofotômetros e espectrômetros de absorção atômica, que são capazes de medir a
absorção de radiação eletromagnética de uma espécie química, dentre os quais os
fotômetros são os mais simples.
As configurações de fotômetros são muito semelhantes. Em geral, são
constituídos por uma fonte de radiação eletromagnética, um seletor de comprimento de
onda, um porta-amostra, um detector, um processador e um leitor de sinal. Esses
dispositivos são arranjados de diversas formas, muito embora existam apenas duas
classificações: feixe simples ou duplo (HARRIS, 2008; SKOOG et al., 2009), conforme
mostrado nos esquemas apresentados na Figura 2.1:
FIGURA 2.1: Desenhos de instrumentos fotométricos e espectrofotométricos UV-Vis.
FONTE: SKOOG et al., 2007.
16
A fonte de radiação eletromagnética deve gerar um feixe de radiação que seja
suficientemente potente para permitir fácil detecção e medida. Além disso, sua potência
de saída deve ser estável por períodos razoáveis de tempo. O seletor de comprimento de
onda melhora muito a seletividade e sensibilidade de um instrumento de absorção. As
bandas estreitas de radiação reduzem bastante a chance de desvios instrumentais da Lei
de Beer. O detector deve codificar a informação de interesse e processá-la como um
sinal elétrico, tratando-se neste caso de um transdutor. O processador de sinal é um
dispositivo eletrônico que amplifica o sinal elétrico proveniente de um detector
(HARRIS, 2008; SKOOG et al., 2009).
2.2.1 Usos de LEDs (Light Emitting Diode) em fotômetros
Os LEDs vêm ocupando lugar de destaque em instrumentação analítica na
região do visível, oferecendo uma maior compactação dos instrumentos sem perda de
qualidade nos resultados (DASGUPTA et al., 2003). A utilização de um LED como
fonte de radiação visível, além de dispensar o emprego de lâmpadas de tungstênio,
filtros e lentes óticas devido estreita banda de emissão, permite construir fotômetros
simples, baratos, duráveis e de pequeno tamanho, além de outras vantagens.
O grande interesse de LEDs em aplicações analíticas é atestado pelo número
crescente de artigos publicados, incluindo artigos de revisão (DASGUPTA et al, 2003;
O’TOOLE E DIAMOND, 2008) e Teses de doutorado (CHAGAS, 2006;
NASCIMENTO, 2008; NETO, 2008; SILVA, 2008a).
As principais características que permitiram que os LEDs fossem largamente
utilizados são (DASGUPTA et al, 2003; CHAGAS, 2006; NASCIMENTO, 2008;
NETO, 2008; O’TOOLE E DIAMOND, 2008; SILVA, 2008a):
17
•
Compactabilidade – podem ser encontrados comercialmente em
diversos formatos e com dimensões da ordem de milímetros a poucos centímetros;
•
Robustez – capacidade de utilização em diversas condições e
configurações dos circuitos eletrônicos;
•
Tempo de vida elevado – geralmente de 20.000 a 100.000 horas, bem
maior que o de lâmpadas incandescentes, que podem variar de 1000 a 2000 horas.
•
Baixo consumo de energia – os LEDs convencionais consomem de 20 a
100 mA de corrente. Porém, existem LEDs de potência que podem consumir cerca de
700 mA, obtendo intensidade luminosa muito maior em relação aos convencionais.
•
Baixo custo e fácil aquisição – variando de centavos a poucos reais, de
acordo com as características desejadas para o LED;
•
Potência elevada – na faixa de 10 a 150 mW, que corresponde à cerca de
cinco vezes a radiação de uma lâmpada de tungstênio de 40 W e a proveniente da fenda
de saída de um monocromador.
•
Largura efetiva de banda estreita – na faixa de 20 a 30 nm na região
do visível, comparável aos filtros ópticos encontrados comercialmente.
•
Ruído associado baixo – com o uso de baterias, da ordem de 0,002% da
intensidade total de emissão.
2.3 Sistemas home-made para análises químicas utilizando LEDs
Iniciativas para construção de sistemas em laboratório para análises químicas
(Tabela 2.1), chamados de home-made, utilizando LEDs, são comumente encontradas
na literatura. Vinculados à espectrometria, alguns trabalhos têm fins didáticos
(ASSUMPÇÃO et al., 2008; CALIXTO et al., 2008), outros trabalhos visam sistemas
para fins de pesquisa (FONSECA, 2004; SILVA, 2008a).
18
Tabela 2.1: Sistemas home-made para diversos fins
Analito/matriz
Fonte/Detector
Referência
Sb(V)/medicamentos antileishmanióticos
LED/Diodo
Trivelin, 2003
Zn(II) e Cu(II)/ligas e medicamentos
8 LEDs/Diodo
Fonseca, 2004
Albumina e proteínas totais
2 LEDs/Diodo
Luca e Reis, 2004
Fe(II)/xarope e parâmetros bioclínicos
LED/Transistor
Gaião et al., 2005
Surfactantes
2 LEDs/Diodo
Lavorante et al., 2007
Gasolina
LED/Resistor
Gaião et al., 2008
Querosene e solvente de tintas/gasolina
*LED NIR/ Resistor
Nascimento, 2008
Corantes alimentícios/amostras sintéticas
e Fe2+/polivitamínicos
Ortofosfato dissolvido/águas
LED branco/
Fototransistor
LED/LED
Neto, 2008
Silva, 2008a
*LED Near InfraRed (infravermelho próximo).
Os sistemas fotométricos estão entre os sistemas home-made mais comumente
construídos em laboratórios devido sua ampla aplicabilidade a diversas metodologias e
facilidade de manuseio e transporte, manutenção do equipamento, fácil aquisição e troca
de peças mecânicas e eletrônicas, resultados analíticos satisfatórios e similares a
técnicas mais sofisticadas.
Fotômetros baseados em LEDs na região do visível têm uma configuração
mais simples que seus similares que usam outros tipos de fonte e seu uso dispensa lentes
e filtros. Desse modo, um fotômetro baseado em LEDs pode ser uma alternativa viável
aos espectrofotômetros, apresentando um custo relativamente baixo e um desempenho
aceitável para diversas aplicações.
Alguns sistemas fotométricos home-made são compactados em uma única
estrutura física, inclusive o dispositivo de leitura, e alguns usam dois ou mais LEDs
com máximos de emissão em diferentes comprimentos de onda, o que os tornam
potencialmente aplicáveis a análises de multicomponentes.
19
A Figura 2.2 mostra o diagrama de um fotômetro construído por Gaião et al.
(2005). Esse instrumento é compacto, usa 6 LEDs emitindo radiação do violeta (λmáx =
430 nm) ao laranja (λmáx = 660 nm). Os LEDs foram montados em um suporte circular
adaptado ao eixo de uma chave eletro-mecânica de seis posições, o que permite, ao
mesmo tempo, ligar e posicionar o LED desejado em frente ao detector. Um display de
cristal líquido, microcontrolado, é usado como dispositivo de leitura, dispensando
totalmente o uso de um microcomputador, facilitando sua portabilidade e apresentando
resultados em transmitância e absorbância. A cela de detecção pode ser do tipo
convencional ou em fluxo. Opcionalmente, o aparelho pode usar periféricos de saída,
como impressora e microcomputador. O aparelho precisa ser calibrado com soluçõesbranco a cada bateria de análise e os valores de concentração são calculados
manualmente. Sua estabilidade foi investigada por um período de 8 h de funcionamento
e nenhuma variação considerável do sinal produzido foi observada.
FIGURA 2.2: Diagrama esquemático de um fotômetro Multi-LED
FONTE: GAIÃO et al., 2005
Os LEDs multiemissores deram maior versatilidade aos fotômetros baseados
nesses componentes, dispensando a troca física dos mesmos para a realização de leituras
em mais de um comprimento de onda. Porém, a faixa de comprimento de onda, ainda
limitada, torna necessária a escolha de uma metodologia adequada.
20
Chagas (2006) desenvolveu vários fotômetros NIR (Infravermelho próximo)
usando lâmpadas de W como fonte, até chegar a uma configuração satisfatória. Fez
testes com potências, uso de radiação contínua e pulsada e frequência de fontes de 18 a
333 Hz e testes de desempenho de dois tipos de detectores: um fotoresistor de PbS e um
fotodiodo de InGaAs. Foram feitos testes com filtros de interferência, nas regiões de
1060, 1300, 1480 e 1925 nm e cubetas de face plana e cilíndrica em regime de fluxo e
batelada, de 2 e 5 mm de caminho óptico. E finalmente três tipos de processadores
foram testados: um microcomputador interfaceado com o fotômetro através de uma
porta USB; um circuito comparador com 2 LEDs, verde e vermelho, exclusivamente
usados como indicativos de conformidade e não-conformidade, respectivamente, da
amostra e um microcontrolador PIC (Controlador de Interrupção Programável) com
display de cristal líquido. A configuração que apresentou o melhor desempenho é
composta de uma fonte com 20 W de potência, emissão pulsada e 25 Hz de frequência,
fotodiodo como fotodetector, uso de uma lente colimadora e filtro de 1480 nm e um
microcontrolador com display, e materiais como blocos de PVC e placas de alumínio
usadas como suporte. A Figura 2.3 mostra um esquema do aparelho usado exceto o
microcontrolador. O microcontrolador usado possui todas as funcionalidades básicas
que um PC oferece, tendo como vantagens informar diretamente no display o teor dos
analitos nas amostras, além de ser pequeno, prático e portátil.
FIGURA 2.3: Esquema do fotômetro desenvolvido por CHAGAS (2006)
FONTE: CHAGAS, 2006
21
Nascimento (2008) desenvolveu um fotômetro usando um LED-NIR como
fonte de radiação e fotoresistor de PbSe como detector, sendo usado na verificação de
adulteração da gasolina tipo C por dois dos seus principais adulterantes: solvente de
tintas e querosene. Para a escolha dos dispositivos utilizados na construção do
fotômetro, foi realizado um estudo prévio das amostras de gasolinas e dos adulterantes
usando um espectrômetro FT-NIR, visando saber a melhor região de absorção por parte
dos analito e contaminantes, constatando ser a emissão nominal de 1550 nm. O
instrumento usa como único parâmetro de medida a absorção da radiação com
comprimento de onda em 1550 nm. O fotodetector apresenta um refrigerador térmico
para resfriamento do fotoresistor e um termistor para controle de temperatura. Uma das
vantagens observadas é que o analito e os adulterantes têm intensidades de absorção
muito diferentes na região estudada, melhorando a seletividade do método. Os
resultados são dados em um painel de LCD em absorbância e LEDs indicadores de
conformidade, não conformidade ou incerteza quanto ao resultado.
Neto (2008) construiu um fotômetro microcontrolado baseado em LED branco
como fonte de radiação e mídia de CD como grade de difração. Didaticamente, o
equipamento construído pode ser dividido em duas partes: o sistema óptico-mecânico e
o circuito eletrônico. O primeiro é composto pela lente focalizadora e pela grade de
difração. Uma lente focaliza o feixe de radiação na grade de difração e esta tem como
finalidade dispersar a radiação proveniente da fonte de radiação em direção ao
fototransdutor, sendo confeccionada de uma mídia de CD e encontra-se posicionada a
uma distância de 21 cm em relação à cela de detecção. O circuito eletrônico do aparelho
é formado por oito módulos. O sinal de intensidade luminosa do LED branco foi
monitorado durante um período de oito horas, com intervalo de medição de cinco
minutos, constatando-se uma pequena variação do sinal como se atestou pelo desvio-
22
padrão relativo de apenas 0,61 %, mostrando que o instrumento proposto possui em sua
fonte de radiação estabilidade suficiente para ser utilizado em análises químicas
rotineiras envolvendo jornadas habituais de trabalho.
Periféricos como microcomputadores e impressoras são comumente acoplados
a sistemas fotométricos e, também, sistemas externos como análise por injeção em fluxo
(FIA) oferecendo maior versatilidade e independência operacional do sistema.
Trivelin (2003) desenvolveu um instrumento de determinação de Sb(V) em
medicamentos antileishmanióticos que incluiu uma adaptação do sistema de extração
líquido-líquido do Sb em batelada para operação em fluxo usando uma câmara de
extração de vidro e posterior detecção fotométrica usando LED e fotodiodo como fonte
e detector, respectivamente, sendo chamado ELL-AF (Extração líquido-líquido por
análise em fluxo). Todo o sistema é controlado por computador usando uma interface
comercial e programa em VisualBasic. As entradas e saídas laterais da câmara
consistem de tubos capilares. Todo o sistema de fluxo foi montado utilizando tubos de
teflon. Uma bomba peristáltica foi usada para propulsão dos reagentes. Um agitador
magnético foi utilizado para promover a mistura da fase orgânica e aquosa.
Fonseca (2004) desenvolveu um instrumento multicanal baseado em um
arranjo de oito LEDs como fontes, empregando um sistema FIA monossegmentado,
sendo projetado para medidas em um único comprimento de onda continuamente ou em
vários (470, 500, 525, 562, 590, 612, 636 e 654 nm) de maneira seqüencial, permitindo
sua aplicação em métodos de análise multivariada. Fibras ópticas foram empregadas
para guiar a radiação dos LEDs até a cela de detecção e desta ao detector, um fotodiodo.
LEDs ultrabrilhantes foram adaptados ao sistema por meio de lixamento e polimento até
as proximidades do chip semicondutor para minimizar possíveis perdas de radiação.
23
Cada LED foi fixado em um conector metálico com todo o arranjo montado em uma
placa de acrílico.
Garcia e Reis (2006) desenvolveram um titulador fotométrico, para
determinação de acidez total em vinho tinto. O sistema consiste de um processo com
detecção fotométrica usando LED e fototransistor como fonte e detector. Foram usadas
três válvulas solenóides para inserção das amostras, assim como software Quick BASIC
para monitoramento. O compartimento de mistura e o fotômetro foram acoplados com a
câmara de titulação de modo a formar um sistema compacto, sendo adequado para
outras matrizes complexas dispensando adaptações de hardware ou software.
Pires et al. (2007) desenvolveram um fotômetro a base de LED empregando
microbombas multicomutáveis para especiação de Cr em águas naturais. Para isso,
quatro microbombas solenóides foram utilizadas para propulsão e comutação dos
fluidos. O sistema de detecção inclui um LED verde como fonte de radiação, um
fotodiodo como detector e uma cela de fluxo com 100 mm de caminho óptico e
diâmetro interno de 2 mm.
2.4 Sistemas home-made que utilizam LDR (Light Dependent Resistor)
O LDR é um resistor que varia sua resistência de acordo com a incidência de
luz. Esse componente não só informa se há ou não luz sobre ele, mas o quanto de luz
há: pequenas variações na intensidade da luz irão provocar pequenas variações no valor
da resistência, permitindo, assim, saber exatamente o quanto de intensidade luminosa há
sobre um LDR. É também chamado de fotoresistor (TORRES, 2002). Em
espectrometria, o LDR é tratado como um dispositivo de estado sólido que tem como
propriedade a variação da resistência elétrica em função da absorção de radiação
eletromagnética (TUBINO E QUEIROZ, 2007).
24
O LDR é um dispositivo eletrônico acessível comercialmente, mas, apesar do
LED ter largo uso em sistemas fotométricos, o LDR tem uso menos popular, sendo
usado como fotodetector (ROSSI e TUBINO, 1991; MATIAS et al., 2003; LAU et al.,
2006; TUBINO e SOUZA, 2006; SENG e KITA, 2007; TUBINO e QUEIROZ, 2007).
Matias et al. (2003) desenvolveram um reflectômetro de baixo custo para
medidas de reflectância difusa colorimétrica usando um LED verde como fonte e um
LDR como detector. O desempenho do aparelho foi testado com quantificação de Ni(II),
com formação do complexo do metal com dimetilglioxina. A precisão observada foi de
aproximadamente 6% e os resultados foram comparados com método gravimétrico de
referência havendo similaridade nos resultados.
Tubino e Souza (2006) desenvolveram um instrumento de reflectância difusa
para determinação de diclofenaco em preparações farmacêuticas sólidas e líquidas na
região do visível. A reação ocorre diretamente na célula de medida. LED vermelho foi
usado como fonte e LDR como fotodetector. A precisão variou entre 2 e 4% e os
resultados foram comparados com método de referência CLAE, havendo similaridade
nos resultados.
Lau et al. (2006) construíram sensores de pH usando membrana de verde de
bromocresol. Dois sensores usando LED e LDR foram comparados. Ambos os sensores
responderam a variações de pH de soluções tampão de forma similar obtendo-se curvas
sigmodais. Os valores de pKa obtidos com estes sensores foram concordantes com o
valor oficial disponível na literatura. Ambos apresentaram baixo consumo de energia,
alta sensibilidade e baixo custo para confecção.
25
CAPÍTULO 3
ABORDAGEM ESTATÍSTICA
E VALIDAÇÃO ANALÍTCA
26
3.1 Tratamentos estatísticos
Resultados experimentais raramente concordam com aqueles previstos por um
modelo teórico. Como conseqüência, é necessário julgar se diferenças numéricas
verificadas devem-se a erros aleatórios, inevitáveis de todas as medidas, ou ocorreram
devido erros sistemáticos.
Em muitos casos testes estatísticos são úteis para fazer análise desses erros,
possibilitando analisá-los e julgá-los, usando os chamados testes de hipóteses. Dessa
forma, para explicar uma observação, um modelo hipotético é proposto e testado
experimentalmente. Se os resultados desses experimentos não dão suporte para o
modelo, ele é rejeitado e investiga-se uma nova hipótese. Se houver concordância, o
modelo hipotético serve como base para experimentos posteriores. Ao aplicar tais testes,
a concordância dos resultados experimentais com os de um modelo teórico é
transformada em duas hipóteses, ou seja, é escrita na forma de duas afirmativas que se
contradizem – como nos testes de falso/verdadeiro. Os resultados experimentais são
representados por uma média, µ1, de valor geralmente próximo à média do modelo
teórico, µ0 (MILLER e MILLER, 1993; MENDHAN et al., 2002; SKOOG et al., 2007;
HARRIS, 2008; VIEIRA, 2008).
Nestes testes, a primeira hipótese é chamada de hipótese nula, H0, e considera
que não há diferença entre os dois grupos de dados, de acordo com a equação 3.1:
(3.1)
H0: µ0 = µ1
A segunda hipótese contradiz a primeira e é, por isso, chamada de hipótese
alternativa, H1. Pode ser descrita de duas formas: i) significando que os resultados são
diferentes, sendo chamado de teste de duas caudas, de acordo com a equação 3.2:
(3.2)
H1: µ0 ≠ µ1
27
e ii) significando que os resultados são menores (equação 3.3) ou maiores (equação 3.4)
que os resultados do modelo teórico, sendo chamados, de testes de uma cauda:
(3.3)
H1: µ0 > µ1
(3.4)
H1: µ0 < µ1
Esses testes estão baseados em probabilidades. Normalmente, se a diferença
observada for maior ou igual á diferença que ocorreria cinco vezes em 100 (5%), devido
a fatores aleatórios, a hipótese nula é considerada questionável e a diferença, como
significativa. Outros valores de probabilidade, como 0,1, 1,0 e 10% podem ser usados,
sendo chamados de níveis de significância, α. Por conseguinte, nível de confiança é a
diferença entre 100% e o nível de significância. Independente do α escolhido, corre-se o
risco de aceitar uma hipótese falsa como correta ou vice-versa, sendo que, testes de
hipóteses fornecem maior segurança para se chegar a resultados corretos. Para realizálos, um teste estatístico deve ser usado, tendo como elementos cruciais a adequação ao
tipo de estudo realizado e escolha do nível de significância (MENDHAM et al., 2002;
SKOOG et al., 2007; HARRIS, 2008; VIEIRA, 2008).
3.1.1 Teste t de Student
O teste t é usado para comparar um grupo de medidas com outro a fim de
decidir se são ou não similares (VIEIRA, 2008).
Existem três casos em que se trabalha de maneira ligeiramente:
1 – Medem-se uma quantidade várias vezes, obtendo um valor médio e um
desvio-padrão. Compara-se o resultado obtido com um determinado valor que é
conhecido e aceito, e os dados não são idênticos. Nesse caso, se compara um resultado
medido com um valor “conhecido”. Por exemplo: uma amostra de carvão foi adquirida
28
como sendo um Material Padrão de Referência certificada contendo 3,19% de enxofre.
Está se testando um novo método analítico para se verificar se o valor conhecido pode
ser reproduzido ou não. Os valores medidos pelo método proposto apresentam um valor
médio de 3,26% de enxofre com desvio-padrão de 0,041. Para verificar se as duas
respostas concordam entre si calcula-se o intervalo de confiança de 95%, de acordo com
a equação 3.5 para a resposta obtida e verifica-se se essa faixa inclui a resposta
conhecida (HARRIS, 2008).
sendo n o número de medidas e valor de t encontrado em tabelas estatísticas com n - 1
graus de liberdade.
Se a resposta conhecida não está dentro do intervalo de confiança de 95%, os
dois resultados são considerados diferentes. Portanto, conclui-se que há menos do que
uma chance de 5% de que o método proposto concorde com a resposta conhecida,
fornecendo então um resultado “diferente” do valor conhecido (MILLER e MILLER,
1993; MENDHAN et al., 2002; SKOOG et al., 2007, HARRIS, 2008; VIEIRA, 2008).
2 – Uma quantidade que é medida várias vezes pode ser avaliada por dois
métodos distintos. Assim, têm-se dois grupos de dados, com seus respectivos valores de
média e desvio-padrão. Neste caso, as médias obtidas são equivalentes entre si e os dois
grupos de dados consistem em n1 e n2 medidas (com médias x1 e x2). Dessa forma, o
desvio-padrão agrupado e valor de t são determinados pelas equações 3.6 e 3.7,
respectivamente:
29
Neste caso sagrupado é um desvio-padrão que faz uso de ambos os grupos de
dados. O valor de tcalculado é comparado com o tteórico disponível em tabelas estatísticas
(MILLER E MILLER, 1993; VIEIRA, 2008) para n1 + n2 graus de liberdade. Se o
tcalculado for maior do que o tteórico no nível de confiança escolhido, os dois resultados são
considerados diferentes (MILLER e MILLER, 1993; MENDHAN et al., 2002; SKOOG
et al., 2007, HARRIS, 2008; VIEIRA, 2008).
3 - A amostra 1 é medida uma vez pelo método sugerido e uma vez pelo
método referencial, que não fornecem exatamente o mesmo resultado. Neste caso, os
dados são medidos e avaliados em pares, sendo este teste chamado de teste t pareado.
Os dois métodos são usados para fazer medidas simples em várias amostras diferentes.
O cálculo do desvio-padrão das diferenças entre os pares de dados, sd, e o valor de t são
calculados pelas equações 3.8 e 3.9, respectivamente:
sendo di a diferença entre valores, sinais analíticos ou concentrações, da mesma amostra
pelos dois métodos, d é a média dessas diferenças, n é o número de pares de dados e sd o
desvio-padrão das diferenças. O valor tcalculado é então comparado com um valor de
tteórico (MILLER e MILLER, 1993; MENDHAN et al., 2002; SKOOG et al., 2007,
HARRIS, 2008; VIEIRA, 2008).
O teste t pareado tem sido extensivamente usado para verificar a confiabilidade
de dados de sistemas home-made. Assim sendo as amostras são analisadas tanto no
sistema proposto quanto em outro considerado padrão, geralmente o aparelho similar
comercialmente disponível. A idéia é verificar se há ou não diferença na resposta, ou no
desempenho dos pares. É uma etapa de validação.
30
A Tabela 3.1 exemplifica sistemas home-made que tiveram seus resultados
comparados com sistemas referenciais de modo a verificar a exatidão usando o teste t
pareado:
Tabela 3.1 – Sistemas home-made com uso de teste t pareado
Aparelho proposto
Sistema de multicomutação e FIA
Aparelho de referência
Referência
Espectrofotômetro UV-Vis Kronka et al., 1997
Câmara de extração e fotômetro
*ICP e Polarografia
Trivelin, 2003
Fotômetro/FIA e multicomutação
Espectrofotômetro UV-Vis
Luca e Reis, 2004
Fotômetro multicanal
**FAAS
Fonseca, 2004
Fotômetro
Espectrofotômetro UV-Vis
Gaião et al., 2005
Titulador Biamperométrico
***HPLC
Fotômetro microcontrolado
Espectrofotômetro UV-Vis
Assumpção et al.,
2008
Neto, 2008
*ICP (Plasma Indutivamente Acoplado); ** FAAS (Espectrômetro de Absorção
atômica por Chama); ***HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
3.1.2 Teste F
Na seção 3.1.1 foram expostas três situações diferentes, no entanto algumas
suposições são feitas arbitrariamente, como supor que dois grupos de dados têm valores
de desvios-padrão populacionais equivalentes. Para confirmar ou não essa afirmação, há
testes estatísticos específicos, como o teste F, que permite saber se dois desvios-padrão
ou duas variâncias de grupos de dados são significativamente diferentes entre si. F é o
quociente entre os quadrados dos desvios-padrão, de acordo com a equação 3.10 e
comparado então com um valor teórico, disponíveis em tabelas estatísticas (MILLER E
MILLER, 1993; VIEIRA, 2008). Se Fcalculado > Fteórico ao nível de significância
escolhido, então a diferença é significativa.
(3.10)
sendo s12a variância de maior valor e s22, de menor valor.
31
3.2 Validação de métodos analíticos
A validação visa conhecer a confiabilidade analítica de dados de metodologia
otimizada, desenvolvida ou instrumento construído. Procedimentos de validação
analítica verificam uma série de parâmetros, figuras de mérito, de modo a caracterizar o
instrumento ou método e, diante de valores pré-estabelecidos sugeridos por órgãos
reguladores, confirmar se os dados podem ser considerados válidos (SKOOG et al.,
2007; HARRIS, 2008; CASSIANO et al., 2009; SKOOG et al., 2009). A tabela 3.2
relata uma série de trabalhos de validação com diversos parâmetros analisados.
Tabela 3.2: Aplicações de validação analítica
Analito/matriz
*Parâmetros
Referência
Lamivudina e Zidovudina
Re, P, Es, P
Beck et al., 2007
Piretróides/inseticidas
P, E, LD, LQ
Vieira et al., 2007
Bupivacaína/drágeas
E, P, R
Moraes et al., 2008
Cetonas/Esmalte de unhas
Es, L, P, E, LQ
Nunes et al., 2008
Timina e Timidina/estaduvina
E, P, Re, Es, LQ
Silva et al, 2008
Ácido úsnico/lipossomas
L, P, E, R, LD, LQ
Siqueira-Moura et al., 2008
*Parâmetros: P (Precisão); L (Linearidade); LQ (Limite de Quantificação); E
(Exatidão); Es (Especificidade); LD (Limite de Detecção); R (Robustez); Re
(Recuperação).
São vários os parâmetros a serem analisados em um processo de validação, no
entanto, não há uma sugestão definitiva de nenhum orgão oficial de quantos ou quais
parâmetros são adequados para cada tipo de validação, salvo a Resolução n° 899 de
2003 de ANVISA que regulamenta validação para métodos bioanalíticos. Logo, a seguir
são conceituados alguns desses parâmetros:
32
3.2.1 Recuperação ou eficiência de extração
Qualquer que seja a manipulação que possa levar á perda da substância a
analisar, esta deve ter seu valor determinado. Para a avaliação da recuperação, devem-se
utilizar concentrações em três níveis: baixo, médio e alto, de acordo com a curva
analítica. Embora altos valores de recuperação sejam desejáveis para maximizar a
sensibilidade do método, não é necessário que este valor seja de 100% e, sim, que a
recuperação seja consistente, precisa e reprodutiva (LEITE, 2002; CASSIANO et al.,
2009).
3.2.2 Linearidade
Pode ser resumida pelas respostas de sinais analíticos recebidos pelas
concentrações da substância analisada. Normalmente buscam-se sinais de respostas para
concentrações diferentes. A linearidade mede o quanto um gráfico da curva analítica
segue uma linha reta. Se for conhecido o valor da concentração desejada do analito na
formulação de uma droga, por exemplo, pode-se verificar a linearidade da curva de
calibração com cinco soluções-padrão, compreendendo o intervalo de 0,5 a 1,5 vezes a
concentração esperada do analito. Cada padrão deve ser preparado e analisado três
vezes para esse objetivo, além de três soluções-branco (LEITE, 2002; CASSIANO et
al., 2009).
Uma medida superficial, mas de uso muito comum, da linearidade é o
quadrado do coeficiente de correlação, r2 (Equação 3.11). Esse parâmetro deve ser o
mais próximo possível de 1 para representar um verdadeiro ajuste linear. Para o
principal constituinte presente em uma amostra desconhecida, um valor de r2 acima de
0,995, ou talvez 0,999 corresponde a um bom ajuste na maioria dos casos (HARRIS,
2008).
33
onde x é a média de todos os valores de xi e y é a média de todos os valores de yi.
3.2.3 Precisão
É um ponto importante para expressão do resultado. A precisão determina o
erro de uma medida analítica e é um dos principais critérios usados para julgar a
qualidade de um método analítico. A precisão de um método analítico é a medida dos
erros aleatórios e representa a proximidade dos resultados obtidos a partir de medidas
independentes de amostragens múltiplas de uma amostra homogênea. Possibilita decidir
se o método analítico é confiável ou não para o objetivo da análise.
A precisão pode ser avaliada, entre outras formas, através da repetibilidade
(precisão intra-dia) e precisão intermediária (precisão inter-dias)
A precisão pode ser expressa como uma estimativa do desvio-padrão (Equação
3.12), s, ou desvio-padrão relativo (DPR), também conhecido como coeficiente de
variação (Equação 3.13), CV, de uma série de repetições da mesma amostra, em
diferentes preparações:
onde xi é o valor individual de uma determinação, x é a média aritmética das
determinações e n é o número de determinações (LEITE, 2002).
A precisão intra-dias define a precisão do método em repetir, em um curto
intervalo de tempo, os resultados obtidos nas mesmas condições de análise, ou seja,
com o mesmo analista, com o mesmo equipamento, no mesmo laboratório e fazendo
uso dos mesmos reagentes. É importante ressaltar que a precisão do método avaliada
através da repetibilidade é investigada pela análise das amostras controle de qualidade
34
preparadas em replicatas para cada concentração. A precisão inter-dias define a
habilidade do método em fornecer os mesmos resultados quando as análises são
conduzidas no mesmo laboratório, mas em diferentes dias, por diferentes analistas e
diferentes equipamentos. Para a determinação da precisão intermediária, recomenda-se
um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes e, na maioria das validações
analíticas, adotam-se três dias não consecutivos (LEITE, 2002; CASSIANO et al.,
2009).
3.2.4 Exatidão
A exatidão representa a concordância entre os resultados obtidos pelo método e
os valores nominais, aceitos como referência. Para a exatidão, pode-se expressar a
relação do resultado obtido com o resultado esperado. A exatidão de um método
analítico é a medida dos erros aleatórios e sistemáticos. No entanto, o termo exatidão é
freqüentemente empregado para descrever somente os erros sistemáticos do método em
questão e é melhor expresso com o desvio em porcentagem bias do valor de referência
(Equação 3.14):
(3.14)
onde xi é o valor de concentração experimental e x é o valor de concentração nominal da
determinação.
É importante salientar que a exatidão é obtida através da aproximação de
resultados, ou seja, devido à impossibilidade de se trabalhar com amostras certificadas
do analito na matriz de interesse, as amostras padrão são obtidas pela adição do analito
na amostra branco. Desta forma, a exatidão é determinada para cada concentração dos
três controles de qualidade através da concordância das concentrações medidas e
nominais do analito na amostra adicionada. Avaliar o coeficiente de recuperação é uma
forma de avaliar a exatidão (LEITE, 2002; CASSIANO et al., 2009).
35
CAPÍTULO 4
PARTE EXPERIMENTAL
36
4.1 Construção do fotômetro
A construção do fotômetro foi baseada na configuração de instrumentos
analíticos de feixe único (Figura 2.1).
Um bloco plano de compensado de 25 x 10 x 2 cm (comprimento x largura x
altura) foi usado como suporte estrutural do fotômetro, sendo parafusadas, ao mesmo,
duas garras de encaixe de plástico semicirculares em paralelo entre si, com diâmetro
interno de 3 cm, a uma distância de 4 cm entre si. Em seguida, um transformador de
127V/9V e um interruptor também foram parafusados, diagonalmente entre si, na parte
lateral do bloco, oposta ás garras de plástico. Essa etapa consistiu na construção da parte
fixa do fotômetro (Figura 4.1).
FIGURA 4.1 – Parte fixa do fotômetro em ângulos diferentes
Em um bloco cilíndrico de PVC, para uso em encanamento, de 5 cm de
comprimento e 1,6 e 2 cm de diâmetro interno e externo, respectivamente, foram feitas
duas aberturas em faces opostas, quadrangulares, de 3 cm2 de área, de modo que estas
aberturas possam acomodar uma cubeta de 1 cm de caminho óptico. Aberturas
quadrangulares de 2,4 cm2 foram feitas em papel emborrachado preto e, posteriormente,
os mesmos foram colados com cola Power Glue nas aberturas feitas ao bloco
cilíndrico, de modo a proteger as faces da cubeta quando encaixada ao bloco, e garantir
que não haja entrada de luz externa. Paralelamente, dois pequenos furos de cerca de 0,1
cm de diâmetro, com 0,5 cm de distância entre si, foram feitos na base de dois tampos
37
de PVC de 1 ½ polegada com auxílio de um prego de 2 polegadas previamente
aquecido, permitindo a acomodação dos terminais de um LED amarelo de 5 mm e um
LDR (sensor fotoelétrico) com duas faces paralelas com 0,8 cm de distância entre si e
duas faces côncava com 1 cm de distância entre si. Em seguida, estes últimos foram
fixados aos tampos de PVC com auxílio de cola epóxi (Araldite R), com repouso de 30
minutos para secagem. Ao bloco cilíndrico foram encaixados os tampos de PVC com
LED e LDR. Esta etapa consistiu na construção da parte móvel do fotômetro (Figura
4.2).
a
d
b
c
FIGURA 4.2 – Partes móveis do fotômetro. a) bloco cilíndrico. b) e c) tampos de PVC
com LED e LDR colados. d) parte móvel completa com cubeta encaixada
Com as partes fixa e móvel do fotômetro prontas, o bloco cilíndrico com os
tampos de PVC foram encaixados nas garras de plástico estando o fotômetro, então,
apto ao uso nos procedimentos analíticos.
38
4.1.1 Acessórios para uso com o fotômetro construído
Acessório é a denominação geral usada neste trabalho aos componentes usados
com o fotômetro, que não está durante os procedimentos analíticos, fisicamente fixo ao
mesmo, sendo descritos a seguir: cubeta de 1 cm de caminho óptico, de material acrílico
e outra de corpo cilíndrico, de material vidro; um multímetro digital Minipa Modelo
ET-2082; quatro garras de metal, conhecidas como “jacarés”; uma caixa de papelão
duro, chamada de cobertura, internamente pintada com tinta preta para PVC, de 9,2 x
9,5 x 6,5 cm (comprimento, largura x altura). (Figura 4.3).
a
d
b
c
FIGURA 4.3 – Acessórios do fotômetro: a) cobertura. b) garras de metal. c)
cubeta de acrílico. d) multímetro digital.
4.2 Avaliação de parâmetros para posterior uso em validação analítica
Alguns parâmetros foram avaliados antes dos procedimentos de validação
analítica, de modo a conhecer a melhor configuração de trabalho do fotômetro. Os
parâmetros avaliados são descritos a seguir: uso ou não de cobertura sob o fotômetro;
uso de cubetas de vidro ou acrílico; comparação entre escalas de medição de
39
resistividade elétrica, já que o multímetro usado possui seis opções de escala;
verificação de desempenho do detector, LDR, frente à emissão da fonte, para
verificação de provável comportamento linear; testes de estabilidade da intensidade da
fonte no decorrer do tempo e faixa de trabalho de ortofosfato com linearidade
satisfatória, para posteriores procedimentos de validação analítica.
Alguns parâmetros foram avaliados em uma mesma sequência de medições,
sendo um total de quatro seqüências: a primeira faz uma avaliação de linearidade de três
curvas analíticas com intervalo de concentrações diferentes; a segunda, a verificação do
uso ou não de cobertura; a terceira compara o desempenho de cubetas de vidro e
acrílico. Todas essas medições permitiam avaliar também o comportamento linear do
LDR e escalas do multímetro. Por último, as estabilidades de emissão de quatro LEDs,
amarelo, laranja, vermelho e verde, foram testadas em função de tempo de emissão.
4.3 Metodologia azul de molibdênio
Para verificação do desempenho do fotômetro, procedeu-se á determinação de
ortofosfato, usando amostras de águas de igarapé.
O ortofosfato é quantificado, neste trabalho, pelo método azul de (fosfo)
molibdênio (PARANHOS, 1996). A preparação dos reagentes está descrita no ANEXO.
A partir da solução-estoque (SE) de 100 mmol l-1, são preparadas as soluçõestrabalho (ST). A partir de uma avaliação de linearidade entre curvas analíticas, uma ST
de 400 µmol l-1 foi utilizada em todos os procedimentos, sendo preparada pela retirada
de alíquotas de 4 ml de SE transferindo-se para balões volumétricos de 100,0 ml e
avolumando-se.
Os reagentes molibdato de amônio, tartarato antimônio de potássio, ácido
sulfúrico e ácido ascórbico foram preparados, em duas soluções: uma solução de ácido
40
ascórbico em ácido sulfúrico e a segunda solução, chamada mix, de molibdato de
amônio e tartarato antimônio de potássio em ácido sulfúrico, sendo usadas alíquotas de
0,2 ml de cada uma das soluções em todos os procedimentos.
Em todos os procedimentos descritos foram usados cubeta de acrílico, escala
de 2MΩ de resistividade elétrica, uso de cobertura e solução-trabalho de 400 µmol l-1 e
as concentrações de amostras se referem a ortofosfato total em µmol l-1, assim como
concentrações de soluções-padrão se referem a ortofosfato em µmol l-1.
4.4 Avaliação de parâmetros
4.4.1 Avaliação de linearidade de curvas analíticas.
A partir da solução-estoque (SE) de 100 mmol l-1, com transferências de
alíquotas de 1, 4 e 5 ml para balões volumétricos de 100,0 ml, obtiveram-se três
soluções-trabalho (ST): 100 (PARANHOS, 1996), 400 e 500 µmol l-1. A partir de
alíquotas de 1, 3 e 5 ml de cada uma das três ST, avolumando-se em balões
volumétricos de 50,0 ml, foram preparadas soluções-padrão de 2,0 a 10,0 µmol l-1 (100
µmol l-1); 8,0 a 40 µmol l-1 (400 µmol l-1) e 10 a 50 µmol l-1 (500 µmol l-1). Todas as
soluções-padrão e soluções-branco foram feitas em triplicata. Em todas as soluções,
adicionaram-se, em sequência, 0,2 ml de solução de ácido ascórbico e 0,2 ml de solução
mix, com agitação manual e repouso de 15 minutos, para posterior medição no
fotômetro, em valores de resistividade elétrica. As soluções-branco constavam de 10,0
ml de água destilada.
Os resultados foram plotados em gráficos de resistividade elétrica, em 200 kΩ,
2 MΩ e 20 MΩ, versus concentração, em µmol l-1.
41
4.4.2 Uso de cobertura
A partir da solução-trabalho (ST) 400 µmol l-1, prepararam-se três soluçõespadrão de 8, 24 e 40 µmol l-1, a partir da retirada de alíquotas de 1, 3 e 5 ml de ST e
transferência para balões volumétricos de 50,0 ml, avolumando-se. Em seguida, adição
às soluções de 0,2 ml de solução de ácido ascórbico e 0,2 ml de solução mix. Todo o
procedimento foi feito em triplicata. Após 15 minutos de repouso, todas as medições
foram feitas sem e com o uso de cobertura, em escala de 200kΩ, 2MΩ e 20MΩ.
4.4.3 Materiais das cubetas
Usando-se as mesmas soluções-padrão e soluções-branco descritas no item
anterior, todas as medições foram feitas com cubeta de vidro de corpo cilíndrico, assim
como com cubeta de acrílico de corpo quadrangular, em escala de 200kΩ, 2MΩ e
20MΩ.
Os resultados foram plotados em gráficos de resistividade elétrica, em 200kΩ,
2MΩ e 20MΩ, versus concentração, em µmol l-1.
4.4.4 Estabilidade da fonte
O monitoramento dos valores de resistividade elétrica em função do tempo,
sem uso de cubeta, apenas a fonte emitindo diretamente sobre a superfície do detector,
em um período de 1800s, ininterruptamente foram usados para testar a estabilidade de
emissão da fonte. Este procedimento foi realizado para os LEDs amarelo, laranja, verde
e vermelho, usando valores de resistividade elétrica em escalas de 200 kΩ, 2 MΩ e 20
MΩ, com valores registrados em intervalos de 10 minutos com multímetro ligado.
Particularmente o LED amarelo, usado nos demais procedimentos analíticos, foi
monitorado também por um período de tempo de 4200 s.
42
Os resultados foram dispostos em gráficos de resistividade elétrica, nas três
escalas mencionadas, versus tempo (s).
4.5 Amostragem
Amostras de águas de igarapé foram coletadas no chamado “igarapé do
quarenta”, que pertence a Bacia do Educandos (SILVA, 2008b), em um trecho
localizado no Distrito Industrial, Zona Sul de Manaus, na Rua General Rodrigo Otávio,
a poucos metros do hipermercado DB. As amostras foram coletadas ao longo de 15 m
do igarapé, na profundidade de 10 a 20 cm, em frascos de polietileno com capacidade
de 1 l, com um total de 10 amostras. Em seguida, a mesma foi transferida para garrafas
de água mineral de polietileno de 600 mL para transporte até laboratório. Todo o
material utilizado para coleta foi previamente lavado com solução de ácido nítrico 20%
(SILVA, 2008b). A coleta foi realizada em período matutino, por volta das 9:00 hs e
analisadas, em média, 30 minutos após a coleta.
O igarapé e seus arredores recebem despejo de efluentes domésticos e
industriais, condição já verificada em trabalhos anteriores (MENDONÇA, 2004;
SILVA, 2008b). Possui margens desmatadas, algumas vegetações secundárias e leito
alterado.
4.6 Validação do fotômetro
4.6.1 Linearidade
A partir da ST de fosfato, 400 µmol l-1, obteve-se soluções-padrão no intervalo
de 8,0 a 64 µmol l-1, em triplicata, retirando-se alíquotas de 1, 3, 5, 6, 7 e 8 ml de ST
para balões volumétricos de 50,0 mL e completado com água deionizada, sendo 10 ml
de cada uma das soluções-padrão foram transferidos para erlenmeyers de 125 ml,
43
juntamente com 0,2 ml de ácido ascórbico e 0,2 mL de solução mix. As soluções-branco
constavam de 10 mL de água destilada com adição de 0,2 ml de ácido ascórbico e 0,2
ml de solução mix, em triplicata. Em seguida, agitação manual e repouso de 15 minutos.
Em seguida, todas as soluções-padrão e soluções-branco foram medidas no fotômetro
construído, em 2MΩ.
Tratamento estatístico utilizado na avaliação de linearidade.
Análises de regressão linear de todas as curvas obtidas foram realizadas usando
o método dos mínimos quadrados.
A partir dos valores médios dos sinais analíticos lidos no fotômetro foram
calculados uma série de parâmetros matemáticos necessários para obtenção das
variáveis estatísticas abaixo (VIEIRA, 2003; SKOOG et al., 2007; HARRIS, 2008):
Estimativa da variância,
:
Desvio-padrão da inclinação, sm:
=
=
Desvio-padrão do intercepto, sb:
Resíduos padronizados, spadronizado:
Soma dos quadrados residuais, SSresíduos:
Soma dos quadrados totais, SStotal:
Soma dos quadrados da regressão, SSregressão:
Os valores de resíduos padronizados foram dispostos em um gráfico de
resíduos padronizados versus concentração.
44
Testes estatísticos aplicados na avaliação da linearidade.
As variáveis estatísticas calculadas foram utilizadas nos testes estatísticos t e F,
para verificação das seguintes hipóteses:
O teste t foi usado para testar a hipótese nula de que a inclinação da curva
obtida com os valores médios é igual a zero, logo:
H0: a inclinação é igual a zero, m = 0.
H1: a inclinação não é igual a zero, m ≠ 0.
Para uso do teste t, para n-2 graus de liberdade, usou-se a equação 4.8:
(4.8)
sendo m a inclinação da curva analítica e sm o desvio-padrão da inclinação.
O valor de tteórico com 3 graus de liberdade é 3,18 com 95% de nível de
confiança (MILLER e MILLER, 1993; VIEIRA, 2008).
O teste F foi usado para avaliar a qualidade da regressão feita, sendo usada a
equação 4.9:
sendo SSregressão a soma dos quadrados da regressão; SSresíduo a soma dos quadrados dos
resíduos e gl o número de graus de liberdade.
O valor de Fteórico com 1 x 3 graus de liberdade é 10,1 com 95% de nível de
confiança (MILLER e MILLER, 1993; VIEIRA, 2008).
4.6.2 Precisão
A precisão foi avaliada em função da repetibilidade (intra-dias), precisão
instrumental e precisão intermediária (inter-dias).
45
Todo o procedimento de preparação de solução-trabalho 400 µmol l-1 e
preparação de soluções-padrão descrito no item 4.6.1, linearidade, foi repetido duas
vezes, exceto que somente soluções-padrão nas concentrações de 8, 24 e 40 µmol l-1
foram preparadas, além de soluções-branco, com intervalo de 60 minutos entre as três
seqüências de leituras, para avaliação também da repetibilidade.
Para avaliação da precisão intermediária, todo o procedimento relatado para
avaliação da repetibilidade foi repetido duas vezes, em intervalo de tempo de 3 dias,
entre a primeira e segunda sequência de leituras e de 4 dias, entre a segunda e terceira
sequência de leituras.
Para avaliação da precisão instrumental, 10 ml de amostra de águas de igarapé
com pré-adição de 0,2 ml de ácido ascórbico e 0,2 ml de solução mix foi medida 12
vezes em um intervalo de tempo de 1 minuto entre as leituras no fotômetro construído.
4.6.3 Recuperação:
Este item foi avaliado a partir dos valores de concentrações calculados de
curvas analíticas.
Uma sequência de soluções-padrão, em triplicata, nas concentrações de
soluções-padrão de 8, 24 e 40 µmol l-1, tiveram suas concentrações calculadas a partir
dos parâmetros da equação da reta obtida usando análise de regressão linear e método
dos mínimos quadrados.
Os valores de recuperação em cada concentração foram calculados a partir da
fórmula 4.10:
sendo [ ] calculada a concentração obtida com os parâmetros da curva analítica e [ ]
experimental a concentração teórica das soluções-padrão preparadas.
46
4.6.4 Exatidão
Foram realizadas 10 medições de amostras de águas de igarapé no fotômetro
proposto e paralelamente em um espectrofotômetro da marca SHIMADZU modelo:
UV-Vis 160PC, para avaliação da concordância existente entre os valores de
concentrações obtidos nos dois aparelhos. No caso do espectrofotômetro, o aparelho foi
configurado para operar em absorbância em 595 nm, sendo obtidas então duas séries de
dados, em valores de resistividade elétrica, em 2MΩ e absorbância em 595 nm.
A preparação das amostras consistiu na adição de 0,2 ml de solução de ácido
ascórbico e 0,2 ml de solução mix.
Comparações estatísticas de resultados do fotômetro e espectrofotômetro
As avaliações entre os dados dos dois aparelhos foram feitas comparando os
resultados de concentrações obtidos, já que os sinais analíticos são de grandezas
diferentes, não podendo ser comparados. Primeiramente foi realizado o teste F a partir
da equação 3.10:
(3.10)
sendo s12 o maior valor de variância dos dois grupos de dados e s22 o menor valor de
variância.
Para o teste t pareado, são necessários o valor de desvio-padrão agrupado, sd,
sendo calculado pela equação 3.8:
sendo sd o desvio-padrão agrupado; di a diferença entre os valores de concentração, d o
valor médio de di e n o número de dados.
e o valor de tcalculado, pela equação 3.9:
47
CAPÍTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
48
5.1 Construção do fotômetro
Durante a construção do fotômetro, priorizaram-se materiais baratos e
facilmente encontrados em casas comerciais (o fotômetro e acessórios utilizados
tiveram um orçamento de aproximadamente R$ 300,00, tanto em infra-estrutura quanto
nos dispositivos eletrônicos utilizados), sendo que se optou por uma configuração
instrumental de feixe simples pela sua simplicidade estrutural, considerando-se também
que para uso didático, essa configuração pode ser mais adequada para estudos iniciais
de instrumentação analítica, sem nenhum impedimento para uso de feixe duplo em
aprimoramentos posteriores. A adequabilidade da construção do fotômetro aos
propósitos didáticos foi verificada durante todos os procedimentos analíticos.
.
5.2 Avaliação de parâmetros
Este item avaliou a melhor configuração possível para os trabalhos de
validação analítica posteriores.
5.2.1 Avaliação de linearidade entre curvas analíticas
Neste item, três parâmetros são avaliados: avaliação de linearidade entre curvas
analíticas, escalas de resistividade elétrica e comportamento linear do detector.
A avaliação de linearidade entre curvas analíticas foi feita entre as
concentrações de soluções-trabalho de 100, 400 e 500 µmol l-1. Para estimar a
linearidade foram usados como parâmetros os valores de coeficiente de correlação das
curvas analíticas e inspeção visual nos gráficos de resistividade elétrica, em 200kΩ,
2MΩ e 20MΩ, versus concentração, em µmol l-1. Os valores médios de resistividade,
correspondentes a cada nível de concentração, assim como os devidos valores de
coeficiente de correlação, são mostrados na Tabela 5.1.
49
Tabela 5.1 – Valores médios de resistividade elétrica para avaliação de linearidade.
Escalas de
resistividade
elétrica, Ω
100
ST = µmol l-1
400
500
Soluções-padrão = µmol l-1
10
8
24
40
10
30
Solução-branco
0
2
6
200 k
54,3
58,9
67,5
2M
0,054
20 M
0,05
80,3
119,5 145,4
0,059 0,067 0,079 0,073 0,108 0,141
0,08
0,119 0,145
0,05
0,07
0,11
0,06
79,1
0,07
73,7
0,07
107,8
0,1
141
50
0,13
*r2 (200 k)
0,9947
0,9993
0,9822
r2 (2 M )
0,9938
0,9992
0,9824
r2 (20 M)
0,9497
0,9982
0,9943
*coeficiente de correlação; n=3.
Segundo INMETRO (2003) e ANVISA (2003), o valor de r2, deve ser maior
que 0,90 e 0,99, respectivamente, para a linearidade ser considerada satisfatória, logo se
considerou que as curvas analíticas obtidas a partir de ST 100 e 400 µmol l-1
apresentaram resultados mais satisfatórios que a ST de 500 µmol l-1, apesar das
exceções (r2 de 100 µmol l-1 e 500 µmol l-1 em 20 MΩ). Os resultados de r2 obtidos a
partir da ST de 400 µmol l-1 são claramente mais satisfatório devido as três escalas de
resistividade em função da concentração apresentarem valores acima de 0,99. Dessa
forma, apenas os gráficos referentes aos dados de ST = 400 µmol l-1 são mostrados na
figura 5.1. A inspeção visual confirma o comportamento linear entre as variáveis, já que
os pontos se distribuem em uma linha reta. Todos os gráficos da Figura 5.1 são dados
em resistividade elétrica versus concentração, em µmol l-1.
50
0,14
140
b)
0,14
a)
0,14
120
0,12
0,12
100
0,10
0,10
80
0,08
0,08
60
0,06
0,06
0,04
40
0
10
20
30
40
c)
0,04
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
Figura 5.1 – Gráficos de resistividade elétrica, Ω, versus concentração, µmol l-1 (ST=
400). a) resistividade em 200 k. b) resistividade em 2 M. c) resistividade em 20 M.
No multímetro usado há 6 opções de escalas de resistividade elétrica, no
entanto, as escalas 200 Ω, 2 kΩ e 20 kΩ não apresentaram nenhum valor durante os
procedimentos analíticos. Apenas três já citadas, 200 kΩ, 2 MΩ e 20 MΩ, puderam ser
usadas nas medições. Dentre estas, percebe-se, pela inspeção visual dos gráficos da
figura 5.1, que todas apresentam adequação para fazer tais medições, no entanto, de
forma geral, o uso da escala de 2 MΩ, é sugerido para procedimentos futuros. A escala
200 kΩ possui o inconveniente de variar muito a primeira casa decimal, necessitando,
em média, dois minutos para ocorrer estabilização satisfatória do valor, e a escala de 20
MΩ, como apresenta apenas um algarismo significativo, tende a ser menos sensível a
diferenças de concentração.
O comportamento linear do LDR durante todos os procedimentos foi
verificado, sendo considerado satisfatório o uso deste dispositivo eletrônico para as
condições experimentais utilizadas.
5.2.2 Uso de cobertura
Neste item, três parâmetros são avaliados: medição no fotômetro sem o uso de
cobertura, escalas de resistividade elétrica e comportamento linear do detector.
51
A avaliação dos parâmetros acima citados foi feita no intervalo de 8 a 40 µmol
l-1. Para estimar a linearidade foi usado como parâmetro o valor de coeficiente de
correlação das curvas analíticas. Os valores médios de resistividade, correspondentes a
cada nível de concentração, assim como os devidos valores de coeficiente de correlação
das medições feitas com e sem o uso de cobertura, são mostrados, respectivamente, nas
tabelas 5.2 e 5.3.
Tabela 5.2 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, com uso de cobertura.
µmol l
-1
Resistividade elétrica, Ω
200 k
2M
20 M
0
47,5
0,047
0,04
8
59,7
0,059
0,05
24
89,3
0,089
0,09
40
112,2
0,112
0,11
*r2
0,997
0,9971
0,9839
*coeficiente de correlação.
Tabela 5.3 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, sem uso de cobertura.
µmol l
-1
Resistividade elétrica, Ω
200 k
2M
20 M
0
34,8
0,035
0,03
8
45,6
0,045
0,04
24
68,8
0,068
0,06
40
79,7
0,079
0,07
r2
0,9742
0,9776
0,9705
Como se nota nas tabelas 5.2 e 5.3 que os valores médios de resistividade,
independente da escala usada, são bem distintos com e sem o uso de cobertura, e apesar
do valor de r2 indicar que o uso de cobertura fornece dados com comportamento linear
satisfatório, o seu uso já é previamente recomendado, devido o fato de isolar a emissão
52
da fonte, logo a detector só tem acesso a esta emissão, em detrimento da ausência da
cobertura, em que luz externa em grande quantidade interfere no valor de resistividade,
como se percebe na diferença entre os valores de resistividade com e sem o uso de
cobertura na medição de uma mesma solução. O comportamento linear do detector foi
similar ao verificado no item anterior, chegando-se a mesma conclusão de que o LDR
possui comportamento considerado linear frente á exposição da luz emitida pelo LED
amarelo no intervalo de concentração considerado. As escalas de resistividade elétrica
do multímetro também foram verificadas neste item, e novamente, a escala de 2 MΩ foi
considerada a mais adequada pelos mesmos motivos que no item anterior.
5.2.3 Materiais das cubetas
Neste item, três parâmetros são avaliados: uso de cubetas de vidro de corpo
cilíndrico e de cubetas de acrílico de corpo quadrangular, escalas de resistividade
elétrica e comportamento linear do detector.
A avaliação dos parâmetros acima citados foi feita no intervalo de 8 a 40 µmol
l-1. A cubeta de vidro de corpo cilíndrico foi usada em comparação com os dados da
cubeta de acrílico. Os valores médios de resistividade elétrica, em três escalas, nas
cubetas de vidro e de acrílico estão disponíveis, respectivamente, nas tabelas 5.4 e 5.5.
Tabela 5.4 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, com cubeta de vidro.
µmol l
-1
Resistividade elétrica, Ω
200 k
2M
20 M
0
42,1
0,042
0,04
8
53,4
0,053
0,05
24
75,5
0,075
0,07
40
97,8
0,098
0,09
r2
1
1
0,9989
53
Tabela 5.5 – Valores médios, em triplicata, de resistividade, com cubeta de acrílico
µmol l-1
Resistividade elétrica, Ω
200 k
2M
20 M
0
47,5
0,047
0,04
8
62,7
0,062
0,06
24
90,4
0,09
0,09
40
112,6
0,112
0,11
r2
0,9959
0,9959
0,9899
Os valores de r2 são claramente satisfatórios independente do material das
cubetas (exceção de r2 de 0,9899), apesar dos valores com uso de cubeta de vidro serem
considerados ideais, no caso de escalas de 200 kΩ e 2 MΩ. No entanto, o uso de cubeta
de acrílico é sugerido frente ao uso de cubeta de vidro devido o material ser frágil e
quebradiço frente ao acrílico, e devido constante manipulação em aulas didáticas, o
acrílico seria mais adequado, além do fator preço, em que cubetas de vidro tendem a
serem, em média, trinta vezes superior, que cubetas de acrílico.
5.2.4 Estabilidade da fonte
Esta avaliação permite inferir sobre a estabilidade da fonte usada, LEDs, de
quatro cores diferentes, em um intervalo de tempo de 1800 s. Os gráficos mostrados na
Figuras 5.2, 5.3 e 5.4 mostram o comportamento da emissão dos LEDs em escalas de
resistividade elétrica diferentes.
54
34,3
20,8
34,2
a)
20,6
b)
34,1
20,4
34,0
33,9
20,2
33,8
20,0
33,7
-200
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
-200
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
9,7
50,4
50,2
9,6
c)
50,0
d)
9,5
49,8
49,6
9,4
49,4
9,3
49,2
9,2
49,0
48,8
9,1
48,6
-200
0
200
400
600
800
-200
1000 1200 1400 1600 1800 2000
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
Figura 5.2 – Gráficos de resistividade elétrica, 200 kΩ, versus tempo, s.
a) LED verde; b) LED laranja; c) LED amarelo; d) LED vermelho.
0,0340
0,0200
0,0338
0,0198
0,0336
0,0196
0,0334
0,0194
0,0332
0,0192
b)
a)
0,0190
-200
0
200
400
600
800
0,0330
1000 1200 1400 1600 1800 2000
-200
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
1,0
0,8
0,0500
0,6
0,4
0,0495
0,2
0,0
0,0490
-0,2
-0,4
0,0485
-0,6
c)
0,0480
-200
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
d)
-0,8
-200
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
Figura 5.3 – Gráficos de resistividade elétrica, 2 MΩ, versus tempo, s.
a) LED verde; b) LED laranja; c) LED amarelo; d) LED vermelho.
55
1,0
1,0
0,8
0,8
a)
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
-0,2
-0,2
-0,4
-0,4
-0,6
-0,6
-0,8
-0,8
-200
b)
0,6
0,6
0
200
400
600
800
-200
1000 1200 1400 1600 1800 2000
0
200
400
600
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
1,0
c)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
-200
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800 2000
Figura 5.4 – Gráficos de resistividade elétrica, 20 MΩ, versus tempo, s.
a) LED verde; b) LED laranja; c) LED amarelo
Como se nota nos gráficos da figura 5.2, usando-se as escalas de 200 kΩ há
significativa variação no sinal disponibilizado pelo multímetro, sugerindo-se o não uso
desta escala. Pelos gráficos da figura 5.3, parece haver uma tendência em uma melhor
estabilização dos valores disponibilizados pelo multímetro com uso de escalas de maior
magnitude, já que a escala de 2 MΩ apresentou resultados mais constantes que a escala
citada anteriormente, e essa tendência foi confirmada com os gráficos da figura 5.4 com
escala 20 MΩ, com gráficos semelhantes a uma função linear, no entanto, deve-se
atentar que a estabilização da emissão do LED é a mesma independente da escala
utilizada, o que altera é a sensibilidade da mesma em detectar essa variação, no caso,
além do fato da instabilidade verificada, mais perceptível nos gráficos da Figura 5.2
serem devido variações não na emissão do LED devido à características do mesmo,
56
mas, da disponibilidade de corrente elétrica da rede local. Nota-se que na Figura 5.4 não
está disponível o gráfico de estabilidade de emissão do LED vermelho, devido o mesmo
não apresentar valor mensurável na escala em questão, 20 MΩ.
Como o LED amarelo foi usado durante os procedimentos seguintes de
validação analítica, o mesmo foi submetido então ao mesmo teste de estabilidade,
porém, com um intervalo de tempo maior, 4200s, com gráficos mostrados na figura 5.5.
O comportamento foi similar ao verificado com outros LEDs em tempo menor.
35,0
0,0340
34,5
34,0
0,0335
33,5
0,0330
33,0
0,0325
32,5
0,0320
32,0
0
1000
2000
3000
1,0
4000
5000
0
1000
2000
3000
4000
5000
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
0
1000
2000
3000
4000
5000
Figura 5.5 – Gráficos de resistividade elétrica, Ω, versus tempo, s de LED amarelo em
4200 s. a) 200 kΩ; b) 2 MΩ; c) 20 MΩ
É um teste bastante simples, facilmente aplicável, porém não foi possível ter
certeza se a instabilidade se referia a emissão do LED ou da rede elétrica local.
57
5.3 Validação do fotômetro
5.3.1 Linearidade
Os dados apresentados na Tabela 5.6 mostram valores de r2 acima de 0,99,
característicos de comportamento linear, mostrando que há uma correlação muito forte
entre as concentrações medidas e os valores de resistividade medidas no fotômetro,
sendo que os coeficientes de correlação encontrados se situam satisfatoriamente dentro
do recomendado por órgãos reguladores como ANVISA (2003) e INMETRO (2003),
que estabeleceram como requisito, respectivamente, o coeficiente ser maior ou igual a
0,99 e 0,90, respectivamente.
Os valores de CV foram considerados satisfatórios até a concentração de 48
µmol l-1, já que o limite de 5% é o valor máximo aceito pelos órgãos reguladores citados
acima, logo, apesar dos valores de r2 terem sido satisfatórios até 64 µmol l-1, os valores
de CV acima de 48 µmol l-1 não são satisfatórios.
A curva analítica obtida com os valores dispostos na Tabela 5.6 assume a
forma y = 0,0017x + 0,05.
Tabela 5.6 – Valores de média e desvio-padrão de linearidade
µmol l-1
0
média ± desvio-padrão
0,053 ± 5,8 . 10-4
CV
1,1
8
0,070 ± 1,2.10-3
1,7
24
0,092 ± 4,6 . 10-3
5,0
40
0,118 ± 3,0.10-3
2,5
0,9959
48
0,138 ± 6,7.10-3
4,8
0,9927
56
0,143± 1,1.10-2
7,4
0,992
64
0,167± 1,7.10-2
10,0
0,9911
**r2
*coeficiente de variação; **coeficiente de correlação
58
Os valores disponíveis na Tabela 5.6 foram usados para calcular algumas
variáveis estatísticas (Tabela 5.7). A baixa variedade em y (variância de 1,17x10-5)
sugere que a concentração de ortofosfato é linearmente proporcional aos seus
respectivos valores de resistividade elétrica, ou seja, à intensidade da cor azul de cada
solução, sendo de boa qualidade os ajustes feitos.
Semelhantemente à medida da variância, os valores de desvios-padrão de m
(1,7x10-3 ± 8,39x10-5) e b (5,33x10-2 ± 2,53x10-3) sugerem que os resíduos têm pouca
relevância frente aos dados explicados pela regressão. Os valores de soma dos
quadrados de resíduos e regressão, também mostrados na Tabela 5.7, corroboram essa
tendência, mostrando boa adequabilidade do modelo aos dados reais. Além disso, os
resultados mostram que a soma dos quadrados dos resíduos são muito inferiores, ou até
mesmo, irrelevantes em relação à soma dos quadrados da regressão. De forma geral,
quanto mais próximos os pontos de y estão da linha prevista pela análise dos mínimos
quadrados, menores são os resíduos.
Tabela 5.7 – Variáveis estatísticas de valores médios de curvas de fosfato.
Variáveis estatísticas
Estimativa da variância de resíduos,
1,17. 10-5
Desvio-padrão da inclinação, sm
8,39. 10-5
Desvio-padrão do intercepto, sb
2,53.10-3
Soma dos quadrados dos resíduos, SSresíduos
3,51.10-5
Soma dos quadrados da regressão, SSregressão
4,81.10-3
Soma dos quadrados total, SStotal
4,85.10-3
Para verificar se os resíduos se distribuem de forma aleatória, sem tendências, a
dispersão dos resíduos pode ser verificada por meio de gráficos. Nesse caso, são
59
necessários os resíduos padronizados, parâmetros calculados a partir da razão entre
valores previstos e medidos de y e estimativa da variância dos resíduos, sendo
calculados utilizando a equação 4.4, e são mostrados na Tabela 5.8. A dispersão dos
resíduos em relação à concentração é caracterizada por ter um comportamento aleatório,
não apresentando tendência nem positiva nem negativa. Observa-se uma variância
praticamente constante ao longo da faixa de concentração investigada, indicando um
comportamento homocedástico dos dados para o fotômetro. Portanto, o modelo usado
se ajusta bem aos dados já que não há valores discrepantes. Os resíduos padronizados,
de forma geral, distribuem-se em torno da média com pouca variabilidade (Figura 5.6).
Tabela 5.8 – Valores de x e y médios e resíduos padronizados de soluções-padrões.
x
y
*spadronizado
0
0,053
-0,193
8
0,070
0,8
24
0,092
-0,623
40
0,118
-0,975
48
0,138
0,991
resíduos padronizados
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
0
10
20
30
40
50
concentração, micromol l-1
Figura 5.6 - Gráfico de concentração versus resíduos padronizados.
60
O teste t foi usado para avaliar a hipótese nula de que o valor da inclinação da
curva é igual a zero. Com 95% de confiança e 3 graus de liberdade, o valor de tcalculado
foi de 20,26 com tteórico igual a 3,18, descartando-se a hipótese nula. Logo, a inclinação
da reta não é igual a zero, sendo a concentração da solução uma variável que é
diretamente proporcional aos valores de resistividade. O valor de tcalculado sugere o fato
da inclinação não ser igual a zero, logo havendo uma relação linear e proporcional entre
as variáveis, concentração de analito e resistividade elétrica.
Para avaliar a qualidade da regressão feita, foi usado o teste F, a 95% de
confiança. O valor de F é usado para testar a hipótese nula de que a variação total em y
é igual a variância decorrente do erro. Como n = 5, a soma dos quadrados devido aos
resíduos possui três graus de liberdade, porque dois parâmetros, m e b, são estimados.
Além disso, a soma dos quadrados devido à regressão tem apenas um grau de liberdade,
pois corresponde à diferença entre SStotal e SSresíduos. O valor de Fcalculado foi de 410,73,
com Fteórico de 10,1. O valor alto de Fcalculado indica que a hipótese nula deve ser
rejeitada e que a regressão é significativa, ou seja, um valor de F muito elevado tem
uma pequena chance de ocorrer de forma aleatória, logo, a regressão feita é bastante
significativa.
Os resultados mostram que a concentração de ortofosfato é diretamente
proporcional à intensidade da cor azul de cada solução. Portanto, a linearidade do
aparelho no intervalo de 0 a 48 µmol l-1 é considerada satisfatória.
A faixa de trabalho de 8 a 48 µmol l-1 pode ser considerada adequada, pois o
(orto) fosfato em trabalhos de monitoramento ambiental têm sido quantificado em
diversos ambientes em teores dentro desta faixa como pode ser verificado na Tabela 5.9.
61
Tabela 5.9 – Trabalhos de quantificação de fosfato em diversos ambientes.
Fosfato solúvel
Ambiente/Impacto antrópico
Referências
(µ
µmol l-1)
Souza, 2005
5,26
Fluvial/Agricultura
Eschrique, 2007
1,93
Marinho e fluvial/Turismo e pesca
Santos et al., 2007
0,31
Marinho/Porto e turismo
Horbe e Oliveira, 2008
0,010
Fluvial/Floresta intacta
Silva, 2008b
1,58
Fluvial/Despejo de esgoto doméstico
Este trabalho
20,58
Fluvial /Despejo de esgoto doméstico
5.3.2 Precisão
Na avaliação da precisão, a mesma foi verificada através da repetibilidade,
precisão intermediária e instrumental.
Na repetibilidade (intra-dias), soluções-padrões de 8, 24 e 40 µmol l-1 foram
analisadas em intervalos de tempo de 1 hora, em triplicata. Os valores médios de cada
triplicata estão mostrados na Tabela 5.10, em 2 MΩ. A repetibilidade permite inferir
sobre a precisão entre análises realizadas em curto espaço de tempo, usando desviopadrão ou coeficiente de variação. Nas análises de repetibilidade, os valores de CV
apresentam valores máximos de 5%, indicando boa precisão. Como já citado na
discussão da linearidade, os valores de CV estão dentro de um intervalo aceitável de até
5%, logo os dados tem boa repetibilidade.
62
Tabela 5.10 – Valores médios de curvas analíticas para avaliação da repetibilidade.
µmol l -1
0
0,053 ± 1,1
2 MΩ
Ω ± CV
0,053 ± 1,1
0,047 ± 2,4
8
0,070 ± 1,7
0,069 ± 2,9
0,066 ± 1,8
24
0,092 ± 5,0
0,1 ± 3,0
0,096 ± 4,2
40
0,118 ± 2,5
0,123 ± 4,1
0,120 ± 3,9
Os resultados de precisão intermediária estão expostos na Tabela 5.11.
Semelhantemente aos resultados de repetibilidade, os resultados de precisão
intermediária também apresentaram valores máximos próximos ao limite de 5%
(ANVISA, 2003), porém, podem ser considerados resultados satisfatórios.
Tabela 5.11 – Valores médios de curvas analíticas para avaliação da precisão
intermediária.
-1
µmol l
2 MΩ
Ω ± CV
0
0,047 ± 3,0
0,048 ± 2,4
0,047 ± 2,4
8
0,059 ± 1,2
0,062 ± 1,9
0,066 ± 1,8
24
0,089 ± 4,8
0,09 ± 4,8
0,093 ± 3,8
40
0,113 ± 3,8
0,112 ± 3,4
0,116 ± 3,3
A avaliação da precisão instrumental foi feita mediante 12 leituras de uma
mesma amostra depois de devida preparação, apresentando um valor médio ± desviopadrão de 0,064 ± 1,51x10-3, com CV de 0,23, valor satisfatório, sendo que o intervalo
de leitura entre as medidas foi de aproximadamente 180 s.
O conjunto de resultados (repetibilidade, precisão intermediária e precisão
instrumental) demonstra que o fotômetro possui precisão satisfatória dentro da faixa de
concentração avaliada, como ser atestado nos valores médios de CV expostos na Tabela
5.12. Os valores médios da estimativa de desvio-padrão e coeficiente de variação
63
demonstraram que os resultados possuem boa precisão quando analisado no mesmo dia
e em dias diferentes.
Tabela 5.12 – Média de valores de CV de repetibilidade e precisão intermediária.
Repetibilidade Precisão Intermediária
2,58x10-3
2,56x10-3
Desvio-padrão
CV
2,8
3,0
5.3.3 Recuperação
Este item foi utilizado para avaliação da exatidão do método, estando os
valores encontrados na Tabela 5.13.
Tabela 5.13: Valores experimentais e calculados de concentrações de ortofosfato de soluçõespadrão, em µmol l-1 e dados de recuperação.
[ ]experimental
[ ]calculada
% Recuperação
8
9,5
8,1
8,9
7,1
8,4
9,0
107,3
24
23,5
25,5
25,5
24,6
25,7
26,8
105,8
40
39,8
37,9
38,9
38,5
39,6
38,4
97,6
*m
0,00159
0,00176
0,00180
0,00166
0,00162
0,00171
**b
0,05442
0,05446
0,04971
0,04720
0,04891
0,05043
*coeficiente angular; **coeficiente linear.
Embora altos valores de recuperação sejam desejáveis para maximizar a
sensibilidade do método, não é necessário que este valor seja de 100% e, sim, que a
recuperação seja consistente e precisa. O grau de recuperação médio variou entre 97,6 e
107,3% o que está dentro das especificações esperadas para matrizes complexas (80120%) recomendados pela ANVISA (2003).
64
5.3.4 Exatidão
A exatidão foi avaliada através da comparação de valores de concentração
encontrados em medições de amostras de águas de igarapés medidas em dois aparelhos,
o fotômetro sugerido neste trabalho e um espectrofotômetro da marca SHIMADZU
modelo: UV-Vis 160PC, sendo que este foi operado em absorbância em 595 nm. Os
valores médios referentes às 10 amostras de águas de igarapé, medidos nos dois
aparelhos, são mostrados na Tabela 5.14, evidenciando a não similaridade dos
resultados apresentados por ambos os aparelhos.
Tabela 5.14 - Dados referentes à ortofosfato dissolvido de 10 amostras medidas em
espectrofotômetro e fotômetro.
Sinais analíticos Concentração, µmol l-1
média ± CV
média ± CV
Resistividade elétrica, 2 MΩ
Ω
0,06 ± 0,01
7,8 ± 0,6
Absorbância, A
0,294 ± 0,05
20,6 ± 0,05
*dp: desvio-padrão
No entanto há a possibilidade do uso de um fator de correção que pode ser
usado na comparação dos valores de concentração encontrados no fotômetro e
espectrofotômetro. O uso deste fator é recomendado no uso do fotômetro sugerido para
que os valores de concentração de ortofosfato estejam próximos aos valores de
concentração do aparelho de referência, considerados como valores adequados. O uso
deste fator não descarta a necessidade de aperfeiçoamentos na configuração do
fotômetro para seu uso como instrumento analítico. A Tabela 5.15 fornece os valores de
concentração encontrados para as 10 amostras usando os dois aparelhos, assim como as
razões entre as concentrações de mesma amostra medidas nos dois aparelhos, notandose que, apesar da não similaridade dos dois grupos de dados de valores de concentração,
65
há uma razão constante entre as mesmas, considerando-se o valor médio de 2,63 como
fator de correção.
Tabela 5.15 – Valores de concentração, em µmol l-1, em fotômetro medido em Ω e
espectrômetro, medido em A, e respectivos valores de razão.
Amostras a = [ ] medida em A b = [ ] medida em Ω
a/b
A1
19
7,1
2,7
A2
19,3
7,1
2,7
A3
21,4
8,3
2,6
A4
20,50
7,7
2,7
A5
19,80
7,7
2,6
A6
21,70
8,3
2,6
A7
21,60
8,3
2,6
A8
20,30
7,7
2,6
A9
21,60
8,3
2,6
A10
20,50
7,7
2,7
média
2,63
Na tabela 5.16, nota-se que usando-se este fator, os resultados de teste t
pareado permitem que a hipótese nula de que os resultados entre os aparelhos são
similares possa ser aceita, o que não ocorre com a comparação direta.
testes
Tabela 5.16 - Resultados de testes estatísticos a 95% de confiança.
valores teóricos valores calculados valores calculados graus de
estatísticos
a α = 5%
sem fator
com fator
liberdade
Teste F
3,18
4,46
1,2
9x9
Teste t
2,26
3,00
0,34
9
66
CAPÍTULO 6
CONCLUSÕES
67
6.0 Conclusões
O fotômetro construído tem montagem muito simples e adequada para ser feita
sem maiores dificuldades por professores e estudantes de nível de graduação, é de baixo
custo e faz uso de materiais facilmente encontrados em casas comerciais especializadas
em eletrônica. Todos os materiais usados na confecção do instrumento podem ser
substituídos facilmente. Além disso, o instrumento proposto é uma alternativa
economicamente viável, já que é orçado em aproximadamente R$ 300,00, para
laboratórios de ensino, como uma boa ferramenta didática em diversos tópicos do
conteúdo programático no qual sua utilização seria adequada, como em aulas de
introdução á instrumentação analítica, em conceitos de espectroscopia e suas aplicações,
assim como no vasto campo da química ambiental.
Aproveitando o foco da química ambiental, tão presente no cotidiano geral, a
viabilidade do instrumento na determinação de ortofosfato dissolvido em águas de
igarapé eutrofizado foi testada, não apresentando resultados satisfatórios, sendo
necessária uma série de ajustes para que o mesmo possa operar como instrumento
analítico além de ferramenta pedagógica, no entanto o uso de um fator de correção
viabiliza a aproximação dos valores de concentração encontrados em aparelho de
referência, de modo que testes estatísticos sugiram a similaridade dos dados fornecidos
pelos dois aparelhos.
Como perspectiva, há possibilidade de adaptação de LEDs que emitam
radiação em outras regiões do visível e a implantação de um feixe de luz de referência
para ampliar a faixa de aplicação, melhorando a precisão das medidas, uso de diversos
tamanhos de caminho óptico, uso de LEDs na região do infravermelho próximo, entre
outras otimizações possíveis. Além disso, novas modificações, aprimoramentos e
intervenções podem ser realizados de tal forma que o aluno possa ter uma idéia mais
68
clara de instrumentação espectroscópica, pelo menos de forma inicial, considerando a
simplicidade estrutural do fotômetro.
A confiabilidade dos resultados do fotômetro foi testada e confirmou-se que o
mesmo ainda não apresenta condições para uso em instrumentação analítica, no entanto,
as perspectivas apresentadas por procedimentos de validação analítica sugerem que o
mesmo, após devidas intervenções, pode vir a ser útil em procedimentos de
quantificação. Até o presente momento, o seu uso é sugerido exclusivamente para uso
didático.
Tendo em vista sua construção, manutenção e potencial analítico, o fotômetro
pode ser uma boa opção didática na contextualização de diversos temas químicos
sociais, facilitando a aproximação do conteúdo programático a ser trabalhar com a
realidade dos alunos.
69
CAPÍTULO 7
REFERÊNCIAS
70
7.0 Referências
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária: Guia para Validação de
Métodos Analíticos e Bioanáliticos, RE n° 899, de 29 de maio de 2003.
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82
Anexo - Preparação dos reagentes
As preparações dos reagentes estão de acordo com as sugestões de Paranhos
(1996), exceto a substituição de água deionizada por água destilada. Todas as soluções
foram armazenadas em frascos de vidro pyrex âmbar em refrigerador.
Solução estoque (SE) de fosfato (P-PO43- = 10 mmol l-1).
Pesados 0,1368g de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4 seco em estufa a
110°C por 2 horas e esfriado em dessecador) e dissolvidos em água destilada contendo
0,2 ml de H2SO4 4,5 mol l-1 e diluído em 100,0 ml.
Solução de ácido sulfúrico
Transferidos 250,0 ml de água destilada para uma proveta em banho de gelo.
Adicionado vagarosamente e sob constante agitação e resfriamento 250,0 ml de ácido
sulfúrico concentrado (d = 1,84). Após esfriado, diluiu-se a solução a 1000,0 ml.
Solução mix
a) Pesados 12,50 g de molibdato de amônia e dissolvidos em 125,0 ml de água
destilada. Adicionado 350,0 ml de H2SO4 4,5 mol l-1 e homogeneizado.
b) Pesados 0,50g de tartarato de antimônio e potássio, K(SbO)C6H4O6 e
dissolvidos em 20,0 ml de água destilada e misturado à solução a.
Solução de ácido ascórbico
Pesados 10,0g de ácido ascórbico, C6H5O6, e dissolvê-los em 50,0 ml de H2SO4
4,5 mol l-1 e 50,0 ml de água destilada. A solução era preparada a cada semana de
análise.
83