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iv
Ofereço
À minha esposa Maria Helena e minha filha Clara, e aos meus pais,
Florisvaldo e Valdelice, pelo amor, confiança e apoio dispensados em todos esses
anos de vida e estudos. Por terem sempre me acompanhado, sofrendo e
sonhando junto comigo, muitas vezes deixando de lado seus compromissos e não
medindo esforços para contribuírem nas realizações de meus sonhos, da mesma
forma, sempre acreditando nos meus objetivos e nunca duvidando da minha
capacidade e dedicação.
Aos meus irmãos Ari, Carlos, Cida, Gal, Con e Rogério por sempre terem
me incentivado a buscar meus sonhos e, por vocês serem sempre tão especiais
para mim.
Obrigado por tudo e lembrem-se que Amo muito vocês!
v
Dedico
À Dona Lili
Não poderia deixar de expressar o amor e a gratidão que tenho pela mulher
guerreira, mãe e esposa dedicada, que mesmo diante das adversidades
enfrentadas, não poupou esforços para criar de forma exemplar os sete filhos e
netos, e que nos dias de hoje, demonstra a força e a garra de continuar viva
enfrentando a doença que lhe acomete.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus pai todo poderoso, criador do céu e da terra
Ao meu guia e protetor, sempre presente em minha vida
À minha esposa e minha filha pela compreensão e apoio diante das dificuldades
impostas pela distância e pelo tempo de afastamento
Aos meus pais que enxergaram a educação, como base para o crescimento
pessoal e para a conquista da liberdade, pautando sempre na dignidade e na
honestidade.
Aos meus irmãos e cunhados presentes em todos os momentos da minha vida.
À minha sogra Dona Nice, a quem tenho muita estima e consideração
À Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia -UESB e ao Departamento de
Tecnologia Rural e Animal-DTRA, pela liberação e apoio para cursar o doutorado.
À Universidade Estadual Paulista Campus de Jaboticabal a ao Departamento de
Zootecnia pela oportunidade de realização do doutorado.
Ao meu orientador Prof Humberto Tonhati pela confiança, apoio, ensinamentos,
aconselhamentos e principalmente pela amizade.
Ao meu co-orientador Prof Renato Caparroz e família, pelos ensinamentos, pela
amizade, atenção e ajuda que prestou durante a execução deste trabalho.
À Embrapa Sudeste, na pessoa da Dra Luciana Regitano, onde galguei os
primeiros passos na Biologia Molecular
Ao CBMEG/UNICAMP, na pessoa da professora Anete Pereira, que contribuiu de
forma significativa na obtenção dos resultados alcançados
Ao ICB/UFG onde tive a oportunidade de dar seqüência ás minhas análises e
também de conhecer pessoas
Ao Professores Maurício Barbanti, Sandra Queiroz, Leonardo Seno, Marcelo
Cervini e Fabio Pablos pelas sugestões e correções da tese apresentada.
Aos funcionários João, Paulo Tosta, Iris, Beterraba e Turquinho
Ao amigo Severino Cavalcanti (Cabeção) pelos conselhos, amizade e atenção
dispensada sempre que solicitada.
vii
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viii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1
CONSIDERAÇÕES GERAIS ........................................................ 1
Objetivos ................................................................................................................. 5
Objetivo geral:......................................................................................................... 5
Objetivos específicos.............................................................................................. 5
Síntese bibliográfica ............................................................................................... 6
Descrição das espécies estudadas........................................................................ 6
Perdiz (
# TEMMINCK, 1815)............................................. 7
Macuco (!#!!# VIEILLOT, 1819) ..................................................... 8
Azulona (!# - TEMMINCK, 1815)........................................................... 8
Jaó ("# - TEMMINCK, 1815) .................................................. 9
Inhambu-xororó ("#!! WAGLER, 1827)................................. 9
Inhambu-xintã ("# - TEMMINCK, 1815) .................................... 10
Inhambu-guaçu ("# -TEMMINCK, 1815)................................ 10
Inhambu-chororão ("#! - GMELIN, 1789)............................... 10
Zabelê ("#! - WIED-NEUWIED, 1820)................................... 11
Marcadores moleculares na conservação de espécies ......................................... 12
Marcadores microssatélites (STRS)....................................................................... 14
Referências............................................................................................................. 17
CAPÍTULO 2
UTILIZAÇAO
DE
S
HETERÓLOGOS
NA
DETERMINAÇÃO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS EM
PERDIZES
(R
#
)
E
OUTROS
TINAMÍDEOS ............................................................................... 27
Introdução ............................................................................................................... 28
Materiais e método ................................................................................................. 30
Resultados e discussão.......................................................................................... 35
Conclusões ............................................................................................................. 37
ix
Referências............................................................................................................. 37
CAPÍTULO 3
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE PRIMERS
DE
MICROSSATÉLITES
PARA
AVALIAÇÃO
DE
POLIMORFISMOS GENÉTICOS EM PERDIZES (Rhynchotus
rufescens) E OUTROS TINAMÍDEOS ......................................... 41
Introdução ............................................................................................................... 42
Materiais e métodos ............................................................................................... 44
Resultados e discussão.......................................................................................... 49
Conclusão ............................................................................................................... 55
Referências............................................................................................................. 55
CAPITULO 4
ESTUDO
GENETICO-QUANTITATIVO
CARACTERISTICAS
MORFOLOGICAS,
PONDERAIS
DE
E
COMPORTAMENTAIS EM PERDIZES, UTILIZANDO DE
INFERÊNCIA BAYESIANA.......................................................... 61
Introdução ............................................................................................................... 62
Materiais e métodos ............................................................................................... 63
Resultados e discussão.......................................................................................... 65
Conclusões ............................................................................................................. 70
Referências............................................................................................................. 71
x
LISTA DE FIGURAS
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CAPÍTULO 3
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE PRIMERS
DE
MICROSSATÉLITES
PARA
AVALIAÇÃO
DE
POLIMORFISMOS GENÉTICOS EM PERDIZES (Rhynchotus
rufescens) E OUTROS TINAMÍDEOS
Figura 1 Corrida em gel de agarose 1,5 %, corado com Brometo de Etídeo Resultados de PCR primers de microssatélites para Perdizes 60º C.
A distribuição das amostras segue a seguinte ordem: L - ladder de
1kb; 1 e 2 - primer 8A; 3 e 4 - primer 12A ; 5 e 6 - primer 12B; 7 e 8
- primer 09D; 9 e 10 - primer 10D; 11 e 12 - primer 09C; 13 e 14 primer 03D; 15 e 16 - primer 11D; 17 18 - primer 04F; 19 e 20 primer 10F, 21 e 22 -primer 12F; 23 e 24 - primer 03G; 25 e 26 primer 06G; 27 e 28 - primer 11G; 29 e 30 - primer 12G e 31 e 32 primer 05H. ............................................................................................. 50
Figura 2 Freqüência dos alelos para cada primer de microssatélite: a)
RruGT12A; b) RruGT06G;c) RruGT12B e;d) RruGT10D. ...................... 53
xii
LISTA DE TABELAS
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xiv
TÍTULO:
DESENVOLVIMENTO
E
UTILIZAÇÃO
DE
MARCADORES
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xvi
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=D=N - The São Paulo State University UNESP, Jaboticabal campus
has for several years research with wild animals, contributing for the preservation
and production of the species threatened by extinction. One of these species is the
red-winged-tinamou (Rhynchotus rufescens), that has potential for production in
captivity. The aim of the study was to determine genetic microsatellite
polymorphisms in this species and other tinamous species. Sixteen microsatellite
primer pairs were developed for the red-winged-tinamou from a genomic library
enriched with microsatellites. In order to verify the cross amplification for the
tinamous species we used 10 pairs of primers designed for ostriches (Struthio
camelus) and 10 pairs developed for Tinamus major. From the 16 loci developed
for red-winged-tinamou, 8 amplified in this species and only five amplified in other
Tinamous. Genotyping was performed on 26 samples and estimates related to the
percentage of polymorphic loci (50%), average number of alleles per locus (5.75),
polymorphic information content (average 0.62) and expected genetic diversity
(0.69). In order to test the transferability of the primer pairs developed for T. major,
only one had a specific amplification in partridges, with observed rates of crossamplification of 100 and 70% for macuco (Tinamus solitarius) and the azulona
(Tinamus tao), respectively. The amplifications in other tinamous were restricted to
five microsatellite loci. With the use of computer programs and statistical analysis,
we estimated genetic and phenotypic parameters of morphometric characteristics
in red-winged-tinamou, in order to better understand the structure of these birds, as
well as for possible correlations with production traits.
;&!HKOB Bayesian inference, cloning, genetic polymorphisms, heterozygosity,
heritability and transferability
1
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A fauna silvestre como recurso natural sempre esteve presente em todo
processo de desenvolvimento da humanidade, sendo uma das principais razões
da condição nômade do homem primitivo, que na busca por alimentos e
vestimentas, acompanhava o movimento dos rebanhos.
Ainda hoje, a carne de animais silvestres pode ser considerada a principal
fonte de proteína animal para subsistência em regiões carentes da África, Ásia e
América Latina. No Brasil, principalmente nas zonas rurais, é muito utilizada por
populações carentes, tanto para a subsistência quanto para geração de renda
através da sua comercialização. REDFORD & ROBINSON (1987) estimaram um
total de 57 milhões de animais caçados e mortos na Amazônia brasileira,
considerando a caça de subsistência e comercial.
Além da caça predatória, outras atividades como a agricultura e a pecuária,
o desmatamento e a poluição de ambientes aquáticos e terrestres têm ocasionado
sérios impactos aos animais.
A
fragmentação
dos ecossistemas, promovendo
o isolamento de
populações naturais, tem como principal consequência, a diminuição da
variabilidade genética devido ao aumento dos acasalamentos endogâmicos.
Estudos realizados por FRANKHAM (1998) relacionam o aumento do risco de
extinção como consequência do aumento da endogamia. Este processo é mais
pronunciado em populações isoladas em ilhas e que apresentam menores taxas
reprodutivas do que as populações continentais, além disso, a baixa variabilidade
genética de populações isoladas as torna mais susceptíveis ao processo de deriva
genética, ou seja, as variações ambientais e demográficas de natureza estocástica
(FRANKHAM, 1997). A depressão endogâmica pode influenciar diretamente o
tamanho efetivo da população, que a depender da estrutura populacional pode
levar à extinção local ou completa da espécie (HEDRICK, 2001).
2
Com o uso de técnicas apropriadas é possível elaborar estratégias de
preservação e recuperação ambiental, visando retardar o processo de depressão
endogâmica ou reduzir as consequências catastróficas do mesmo (SANTOS et al.,
2004).
Neste sentido, o uso de produtos provenientes de espécies silvestres de
forma responsável e atentando aos aspectos da sustentabilidade, poderá agregar
valor á biodiversidade. Assim a criação de animais silvestres para fins comerciais
tem se constituído numa boa alternativa de conservação de espécies silvestres,
concorrendo com a caça ilegal, além de proporcionar a geração de emprego e
renda. A carne de espécies silvestres é considerada especiaria em muitos
restaurantes e supermercados, sendo muito valorizada, principalmente em
grandes centros consumidores (NOGUEIRA-FILHO & NOGUEIRA, 2000).
Não existem dados precisos sobre o total de carne de animais silvestres
comercializada no Brasil, nem do total de criatórios destinados à produção
comercial. Estimativas apontam a capivara como a espécie mais comercializada,
seguida da ema, jacaré, caititu, queixada, cutia e paca (GIANNONI, 2001).
SANTOS et al. (2009), trabalhando com criatórios de caititus (Pecari
tajacu), demonstraram ser viável economicamente a criação comercial destes
animais, desde que sejam atendidas condições básicas de legislação, criação e
comercialização.
Em estudos realizados no Canadá com uma espécie de Tinamídeo
(Nothoprocta perdicaria) nativo do Chile, AGGREY et al. (1992) constataram que
apesar do maior tempo para o abate em relação às aves comerciais, aquelas aves
apresentaram bom peso e excelente rendimento de carcaça. Esforços
semelhantes foram conduzidos por GARITANO-ZAVALA (2004) no sentido de
viabilizar a criação em cativeiro de outro tinamídeo encontrado na Bolívia,
denominado localmente de pisacca (Nothoprocta ornata).
Dentre as várias espécies que podem ser utilizadas em criatórios
comerciais,
encontra-se
a perdiz (Rhynchotus
rufescens). Características
3
relacionadas à produção e à reprodução vêm sendo pesquisadas desde 1989 no
Setor de Animais silvestres da FCAV/UNESP.
Em pesquisa realizada por MORO et al. (2006), comprovou-se que a carne
de peito da perdiz apresenta excelente valor nutritivo, com baixos níveis de
colesterol, rendimentos de carcaça de 74,37 % e de peito da ordem de 36,65%, o
que atende as exigências do mercado consumidor. Em trabalhos realizados com
perdiz (Rhynchotus rufescens), BRUNELI et al. (2005) estudaram fatores
relacionados ao ciclo reprodutivo destas aves, determinado época e horário de
maior postura de ovos.
Da mesma forma, CROMBERG et al. (2007), com o
objetivo de conhecer aspectos reprodutivos de perdizes, estudaram a relação
macho:fêmea,
a
estrutura
sócio-hierarquica
e
outras
características
comportamentais, com vistas à adaptação em cativeiro.
Apesar da grande potencialidade da criação comercial de perdizes, por se
tratar de uma espécie em processo de domesticação, algumas características
necessitam ser trabalhadas do ponto de vista zootécnico. Um estudo realizado por
HATA (2009) demonstrou a relação existente entre a adaptação das perdizes ao
cativeiro e o tempo de imobilidade tônica desses animais, característica esta
associada ao estresse.
Como podemos observar, diversas pesquisas foram realizadas nas áreas
de produção, nutrição, comportamento e bem estar pela Instituição, com o intuito
de levantar estas potencialidades. Neste sentido as pesquisas na área de genética
e melhoramento são necessárias para caracterização da espécie e determinação
da diversidade genética de populações naturais e cativas.
O capítulo dois do presente estudo aborda a utilização de marcadores
microssatélites em perdizes e outros tinamídeos, através do uso de primers
heterológos desenhados para avestrus (Struthio camelus) e para o inhambu de
cabeça vermelha (Tinamus major). No capítulo três foram desenvolvidos e
caracterizados primers de microssatélites especificamente para perdiz. Também
verificamos a transferabilidade destes marcadores em outros tinamídeos, como o
Macuco (Tinamus solitarius), o Zabelê (Crypturellus notivagus), a azulona
4
(Tinamus tao), o inhambu-chitã (Crypturellus tataupa), o inhambu-xororó
(Crypturellus
parvirostris),
o
inhambu-xororão
(Crypturellus
variegatus),
o
inhambu-guaçu (Crypturellus obsoletus) e o Jaó do interior (Crypturellus
undulatus).
Com o uso de programas computacionais e de análises estatísticas, no
capitulo quatro, estimamos parâmetros genéticos e fenotípicos das características
comprimento da asa, do bico e do tarso, assim como da largura e da altura do bico
e da cabeça em perdizes, visando conhecer melhor a estrutura morfométrica
dessas aves, assim como obter possíveis correlações com características de
interesse zootécnico.
5
Objetivos
Objetivo geral:
Selecionar conjunto de locos de microssatélites para realização de estudos
genéticos populacionais em perdiz e outros tinamídeos
Objetivos específicos
Analisar a tranferabilidade de pares de primers heterólogos para
amplificação de locos microssatélite em perdiz e outras espécies de
tinamídeos;
Identificar locos de microssatélite no genoma de perdiz
Desenhar pares de primers específicos para amplificação de locos
microssatélite em perdiz;
Verificar a transferabilidade desses pares de primers de perdiz na
amplificação cruzada em diferentes espécies de Tinamidae e
Estimar componentes de (co)variância e parâmetros genéticos em
características morfométricas de perdiz
6
Síntese bibliográfica
Descrição das espécies estudadas
Os tinamídeos, juntamente com as ratitas, são considerados as aves mais
antigas do continente sul americano, com registros fósseis de 10 milhões de anos
na Patagônia, e em registros encontrados em cavernas no Brasil, que datam 20
mil anos. São classificados taxonomicamente como pertencentes à classe Aves,
ordem Tinamiformes composta por uma única família Tinamidae, dividida em duas
subfamílias, a Tinaminae e a Rhynchotinae (SILVEIRA et al., 2001).
A subfamília Tinaminae compreende os gêneros Tinamus, Tinamotis,
Nothocercus e Crypturellus, tendo como habitat natural o chão de florestas
tropicais e subtropicais. A subfamília Rhynchotinae compreende espécies dos
gêneros Nothoprocta, Rhynchotus, Nothura, Eudromia e Taoniscus, habitando
principalmente
as
regiões
campestres
(DISLICH,
2007).
taxonômica da família Tinamidae está representada na figura 1.
Classe: Aves
Ordem: Tinamiformes
Família: Tinamidae
Tinaminae
Tinamus
Nothocercus
Crypturellus
Subfamília
Rhynchotinae
Figura 1 - Classificação taxonômica da família tinamidae (Myers et al., 2008).
Nothoprocta
Rhynchotus
Nothura
Taoniscus
Tinamotis
Eudromia
A
classificação
7
Em
decorrência
da
grande
variação
inter-específica
que
ocorre,
principalmente em gêneros como Tinamus, Crypturellus e Nothura, a taxonomia
da família é bastante complexa, levando muitas vezes a erros no estabelecimento
dos táxons (AMARAL & SILVEIRA, 2004).
Estudos realizados por BERTELLI & PORZECANSKI (2004), utilizando
análises morfológicas e marcadores moleculares, classificaram filogeneticamente
47 espécies distribuídas em nove gêneros. Apresentam como característica
principal a dificuldade de vôo. A sua distribuição geográfica abrangem o noroeste
do México ao sul da Argentina (SICK, 1997), ocupando os mais diferentes
ambientes terrestres, como as elevadas altitudes dos desertos andinos, até a Mata
Atlântica com baixas altitudes. Embora represente uma importante ordem nos
mais variados ecossistemas brasileiros, poucas pesquisas foram realizadas para
se conhecer melhor os tinamídeos brasileiros. A seguir são descritos os
tinamídeos utilizados no presente estudo de acordo com informações disponíveis
em SICK (1997), SIGRIST (2006) e IUCN (2010).
Perdiz (Rhynchotus rufescens TEMMINCK, 1815)
Considerado o maior tinamídeo campestre nacional com ampla distribuição
geográfica no continente americano, é também conhecida no Brasil como perdigão
(sul do Brasil) ou inhambupé (NE do Brasil). São aves de aparência galinácea
com plumagem de coloração castanho claro, salpicado de preto e branco com
forte mimetismo defensivo.
Os adultos medem entre 35 e 37 cm, com peso médio de 750 gramas,
podendo alguns indivíduos atingir 1000 gramas (WEEKS, 1973), sendo as fêmeas
mais pesadas do que os machos.
Possui hábito terrícola, habitando os campos sujos, cerrados e caatinga,
sendo que sua alimentação consiste de sementes, frutos e invertebrados do solo,
podendo utilizar-se do bico para alcançar raízes e tubérculos. Os machos são
8
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Macuco (Tinamus solitarius - VIEILLOT, 1819)
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Azulona (Tinamus tao - TEMMINCK, 1815)
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9
Apresenta coloração de tom cinza-ardósia, podendo atingir cerca de 1,9 kg e
medindo 52 cm.
Acredita-se que o macuco e a azulona venham de um mesmo ancestral
comum, com diferenças relacionadas ao peso maior da Azulona e ao fato dos
ovos, apesar de serem da mesma cor verde azulada, serem perfeitamente
esféricos na azulona, diferenciados da forma oblonga apresentada em Tinamus
solitarius.
Jaó (Crypturellus undulatus - TEMMINCK, 1815)
Ave cinegética típica do Brasil central, habita matas abertas e cerrados,
principalmente na beira de rios, também conhecida na Amazônia como Macucauá
e Sururina. Representante da avifauna primitiva apresenta registros fósseis
encontrados no continente que datam 10 milhões de anos. Possui plumagem
cinza amarronzada no dorso, finamente estriada, medindo cerca de 31 cm de
comprimento.
No sudeste e sul do Brasil, ocorre o Jaó-do-litoral (Crypturellus noctivagus
noctivagus), também chamado de Jaó-do-sul ou zabelê, encontrado na mata
atlantica primitiva, desde o nivel do mar, até cerca de 400 m de altitude.
Inhambu-xororó (Crypturellus parvirostris- WAGLER, 1827)
É a menor espécie do seu gênero, medindo cêrca de 19 cm, com vasta
distribuição geográfica no Brasil, habitando campos sujos, capoeiras, plantações e
pastos. Também conhecida popularmente no Brasil por inhambuzinho, inhambumirim, espanta-boiada, bico-de-lacre e xororó. Por ser uma ave cinegética
apresenta status de conservação de espécie em perigo. Ocorre ao sul do
Amazonas, Pará ao nordeste, sudeste e sul do Brasil, assim como no Peru,
Bolívia, Paraguai e Argentina. Adapta-se bem ao cativeiro, tendo ótima
capacidade de reprodução, o que favorece o repovoamento em áreas naturais.
10
Inhambu-xintã (Crypturellus tataupa - TEMMINCK, 1815)
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Inhambu-guaçu }Crypturellus obsoletus -TEMMINCK, 1815)
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Inhambu-chororão (Crypturellus variegatus - GMELIN, 1789)
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Zabelê (Crypturellus noctivagus - WIED-NEUWIED, 1820)
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Marcadores Moleculares na conservação de espécies
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14
analisar vinte indivíduos da espécie Triclara malchiatacea, criados em cativeiro,
utilizando nove primers de RAPD.
A variabilidade genética de duas espécies de araras silvestres Ara araruna
e Ara chloroptera, foi determinada por CAPARROZ et al. (2001), através da
técnica DNA fingerprint, utilizando sondas de minissatélites humanos. Os autores
encontraram índices de variabilidade genética maior na população de A.
chloroptera do que na população de A. araruna.
Espécies que apresentam menor diversidade genética são mais vulneráveis
a extinção. FARIAS & MYIAKI (2006) verificaram alta correlação entre
variabilidade genética e ameaça de extinção de três espécies de araras,
Anodorhinchus hyacinthinus, Ara araruna e A. chloroptera. A espécie A.
hyacinthinus, ameaçada de extinção, apresentou os mais baixos valores de
variabilidade
genética
(heterozigosidade
e
diversidade
alélica),
quando
comparados aos observados para as outras duas espécies, que não estão
ameaçadas de extinção.
A manutenção da diversidade genética é um dos principais objetivos na
conservação de pequenas populações, nas quais, o declínio da variabilidade
genética provoca a diminuição da capacidade de resposta à seleção natural e aos
efeitos da deriva genética na frequência de alelos (STOFER, 1996).
Marcadores Microssatélites (STRs)
No genoma dos organismos eucariotos, existe uma grande quantidade de
DNA repetitivo, sendo descritos pela primeira vez em leveduras e vertebrados por
HAMADA et al. (1982). Microssatélites são caracterizados por repetições em
tandem de mono, di, tri ou tetra nucleotídeo, localizadas dentro de regiões de
sequencia única. Cada bloco de repetições é normalmente menor que 100 pares
de nucleotídeos (TAUTZ, 1989).
Apresentam a vantagem de serem marcadores co-dominantes e se
encontram distribuídos por todo o genoma eucariota (TAUTZ, 1989). São menos
15
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16
podem ser considerados idênticos devido à condição de estado e não por
descendência (BALLOUX et al. , 2000).
A determinação do grau de parentesco entre indivíduos através destes
marcadores possibilita a diferenciação de animais que são produzidos legalmente
em criatórios comerciais daqueles coletados de forma ilegal na natureza. Com
este objetivo, PILLAY et al. (2009) caracterizaram 22 locos de microssatélites
polimórficos para uma espécie de papagaio Sul-Africano (Poicephalus robustus ).
Estimativas de exclusão de paternidade também podem ser obtidas com o uso
destes marcadores, conforme estudos realizados por ZOU et al. (2010) com uma
espécie de grou japonês (Grus japonensis).
A construção de bibliotecas de microssatélites pode ser realizada através
da técnica shotgun, que consiste na clivagem da molécula de DNA em milhares de
fragmentos,
sendo
estes
então
clonados
em
vetores
e
sequenciados
(FLEISCHMANN et al. 1995). Embora esta técnica permita a obtenção de um
grande número de microssatélites, é necessário o sequenciamento de inúmeros
fragmentos, o que implica em maiores custos.
Outra técnica, como a adotada no presente estudo, consiste na construção
dos primers de microssatélites através do enriquecimento de bibliotecas, com o
uso de sondas biotiniladas que seleciona os fragmentos por motivos de repetição
(CT e GT), para então proceder a clonagem nos vetores e sequenciamento,
conforme protocolo adaptado de BILLOTE et al. (1999).
Outro atributo interessante dos marcadores STRs é a transferabilidade, ou
seja a possibilidade de se utilizar pares de primers desenhados para uma
determinada espécie, na determinação de polimorfismos em outras espécies do
mesmo gênero (CIPRIANI et al., 1999) ou dentro da mesma família (ZUCHI et al.,
2002; Roa et al. ,2000).
Diversos estudos demonstraram que esta transferabilidade depende não
somente da proximidade filogenética entre as espécies, mas também de fatores
como o tamanho e a complexidade do genoma. LILLANDT et al. (2002),
trabalhando com aves e WILLIAMSON et al. (2002), com felinos, obtiveram
17
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D8LOE Considerada o maior tinamídeo campestre da fauna brasileira e
com ampla distribuição geográfica no continente americano, a perdiz (Rhynchotus
rufescens), juntamente com outros representantes desta ordem, encontram-se
atualmente com populações em declínio, principalmente pela destruição de
habitats e pela caça predatória. A conservação destas espécies se justifica não
somente por sua história evolutiva, como principalmente pela importância
ecológica que estas aves apresentam, contribuindo para a dispersão de sementes,
controle de insetos e predação, além da criação em cativeiro para fins comerciais.
Para tanto se torna necessário conhecer a estrutura genética destes animais a fim
de subsidiar estratégias conservacionistas. Neste sentido o presente estudo teve
como objetivo caracterizar o grau de polimorfismo genético em perdizes, utilizando
dez pares de primers de microssatélites, desenhados para avestruzes (Struthio
camelus) e dez pares de primers específicos para o inhambu-cabeça-vermelha
(Tinamus major). Nenhuma amplificação foi obtida em perdizes com a utilização
dos primers para avestruz. Dos primers desenvolvidos para T. major somente um
(E101)
apresentou
amplificação
específica
em
perdizes,
observando-se
amplificações inespecíficas para os primers A104, E118 e E119. Foram
observadas taxas de amplificação cruzada de 100 e 70% para macuco (Tinamus
solitarius) e para a azulona (Tinamus tao), respectivamente. De acordo com os
resultados obtidos no presente estudo, é possível a utilização desses marcadores
em pesquisas destinadas a conservação dessas duas espécies, sendo necessário
o desenvolvimento de primers específicos para a perdiz e os demais tinamídeos
estudados.
Palavras-chave: Conservação, PCR, variabilidade genética e transferabilidade
28
Introdução
A perdiz (Rhynchotus rufescens), maior tinamídeo campestre nacional,
juntamente com outros representantes desta ordem, encontra-se em algumas
regiões ameaçada de extinção, principalmente pela destruição de habitats e pela
caça predatória (BRESSAN et al., 2009). Sua distribuição geográfica abrange todo
o continente americano (SICK, 1985).
Segundo SICK (1985) são animais que pertencem a avifauna mais antiga
deste continente, com registros fósseis de 10 milhões de anos na Patagônia, e em
cavernas no Brasil, que datam de aproximadamente 20 mil anos.
O desenvolvimento de estratégias que visem à conservação destas
espécies se justifica não somente por sua história evolutiva, como também pela
importância ecológica que estas aves apresentam, contribuindo para a dispersão
de sementes, controle de insetos e predação.
Vale ressaltar ainda, que estes animais podem ser criados em cativeiro,
assumindo uma importância econômica na geração de emprego e renda em
comunidades carentes, desde que atendidas condições básicas de legislação,
criação e comercialização. Neste sentido torna-se importante a determinação da
estrutura genética das populações tanto em vida livre como em cativeiro,
principalmente no que se refere à variabilidade entre indivíduos e entre
populações, o que determina as estratégias de conservação e manejo de
espécies.
Com o desenvolvimento da técnica de reação em cadeia de polimerase
(PCR) na década de 80, marcadores STRs tem sido muito utilizada em pesquisas
às questões de evolução e de biologia da conservação.
Os STRs estão amplamente distribuídos no genoma dos diversos
organismos, de forma casual.
Em animais, verifica-se a ocorrência da
conservação de sítios de STRs em espécies relacionadas, o que permite em
alguns casos, a amplificação de locos de microssatélites de espécies do mesmo
gênero com o uso de primers heterólogos (MOORE et al., 1991).
29
Trabalhos realizados por MENOTTIRAYMOND & OBRIEN (1995) com
espécies
estreitamente
relacionadas,
tais
como
gado
bovino
e
ovino,
demonstraram ser possível a utilização de primers desenhados para uma espécie,
na análise de polimorfismos de microssatélites de outra espécie. ZUCOLOTO et
al. (2006), utilizando primers desenvolvidos para o crocodilo americano (Alligator
mississipiensis) e para o jacaré do papo amarelo (Caiman latirostris), conseguiram
a amplificação de produtos de PCR com relativo polimorfismo em outras três
espécies de crocodilianos sul americanos.
Para a determinação do número
populacional de onças pardas (Puma concolor) em duas unidades de conservação
do estado de São Paulo, MIOTTO (2006) utilizou-se de primers desenvolvidos
para o gato doméstico (Felis catus). Da mesma forma, DALTOÉ-INGLÊZ et al.
(2005) para a avaliação da variabilidade genética de bugios (Alouatta caraya),
utilizaram primers de espécies relacionadas.
A transferabilidade em aves também é descrita em diversos trabalhos,
apesar da frequência relativamente baixa de locos de microssatélites comparada
com outras espécies (LONGMIRE et al.1999; PRIMMER et al. 1997b). PANG et al
(1999) obtiveram taxa de 22,9 % de amplificação específica em codornas,
utilizando STRs desenhados para galinhas.
Em trabalho realizado por LILLANDT et al. (2002) com microssatélites
desenvolvidos
para
Siberian
Jay
(Perisoreus
infaustus),
foi
observada
transferabilidade destes primers em outras quatro espécies de pássaros, embora
os melhores resultados foram obtidos para a espécie do mesmo gênero.
Resultados semelhantes tiveram HUANG et al. (2005), que verificaram maior
transferabilidade em gansos do que em galinhas e pavões, quando utilizaram
primers para microssatélites desenhados para patos-de-pequim, ressaltando que
patos e gansos pertence a ordem Anseriforme, enquanto galinhas e pavões são
galiformes.
Diferentes estudos bioquímicos obtidos por hibridização de DNA colocam
os tinamíformes como parentes próximos de ratitas, como a ema (Rhea
americana) e o avestruz (Struthio camelus) (SIBLEY & AHLQUIST, 1981).
30
GARNERO et al. (2006) estudando a homeologia cromossômica de várias
espécies da família tinamidae, também constataram a proximidade do grupo
Rhynchotus e Nothura com as ratitas, porém com um grau de diferenciação entre
os cromossomos sexuais.
Por esta razão, para a verificação de transferabilidade em perdizes
(Rhynchotus rufescens) e outros tinamídeos, o presente estudo avaliou a
utilização de primers heterólogos de microssatélites, desenvolvidos para
avestruzes (Struthio camelus) e para o Inhambu-de-cabeça-vermelha (Tinamus
major).
Materiais e método
Coleta das amostras
Os estudos foram realizados utilizando amostras de sangue de perdizes e
de outros tinamídeos, coletadas a partir da veia na asa, e, em algumas aves com
o corte da unha.
O número de indivíduos amostrados de cada espécie, e os locais de coleta
estão discriminados conforme Tabela 1.
31
Tabela 1 - Relação dos tinamídeos e locais de coleta das amostras analisadas nesse estudo
Espécie/amostra
Nome Científico
Nº
Criador
Localidade
Perdiz
Rhynchotus rufescens
02
04
02
18
Criatório Poços de Caldas
Setor de Aves-UESB
Criador Recanto das Aves
Criatório científico da FCAV/Unesp
Poços de Caldas-MG
Itapetinga-BA
Itatiba-SP
Jaboticabal-SP
Inhambu chororó
Crypturellus parvirostris
04
02
Criatório Poços de Caldas
Criador Recanto das Aves
Poços de Caldas-MG
Itatiba-SP
Inhambu-guaçú
Crypturellus obsoletus
02
02
Criador Recanto das Aves
Criatório Poços de Caldas
Itatiba-SP
Poços de Caldas-MG
Macuco
Tinamus solitarius
07
03
Criatório Poços de Caldas
Criador Recanto das Aves
Poços de Caldas-MG
Itatiba-SP
Zabelê
Crypturellus noctivagus
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Jaó
Crypturellus undulatus
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Inhambu-chintã
Crypturellus tataupa
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Inhambu-chororão
Crypturellus variegatus
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Azulona
Tinamus tão
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Extração do DNA
O DNA genômico foi extraído de tecidos e sangue utilizando-se do método
do fenol-cloroformio (AUSEBEL et al., 1995). Para se obter a digestão das
proteínas foi adicionada proteinase K (20mg /ml). Depois transferiu-se o
sobrenadante
para
um
novo
clorofórmio:álcool-isoamilico (24:1)
tubo
adicionando-se
a
este
300
l
de
removendo-se novamente o sobrenadante
para um tubo novo.
Adicionou-se 700l de etanol absoluto gelado, levando-se a mistura para o
freezer a uma temperatura de -20°C por 1 hora, para em seguida descartar o
sobrenadante por decantação. Nova precipitação realizada adicionando-se 150l
de etanol 70%. Prosseguiu-se a uma centrifugação a 4°C por 25 minutos e 12000
rpm e ao finalizar, desprezou-se o sobrenadante, para resuspensão posterior do
pellet seco totalmente, com 150l de TE (10mM Tris HCl pH=7,6 e 1mM EDTA
pH=8,0), sendo finalmente armazenado a 4°C.
32
A visualização da integridade e concentração do DNA foi feita através de
luz ultravioleta (UV) em aparelho Gel-Doc (Bio-Rad). A quantificação e verificação
de qualidade das amostras de DNA foi realizada em aparelho NanoDrop 1000
Spectrophotometer (Thermo Scientific). Na quantificação foram utilizados 2,0l do
DNA extraído, sendo a qualidade das amostras verificada mediante a relação
260/280 nm e 260/230 nm, as quais medem respectivamente a pureza do DNA e a
presença de proteínas, fenol e outros contaminantes que são absorvidos a 280
nm.
Desenho e características dos primers utilizados
Inicialmente para a determinação de polimorfismos em perdizes, foram
selecionados dez locos identificados em avestruzes (TANG et al., 2003; KINWELE
et al., 1998). Outros dez locos foram selecionados a partir do trabalho publicado
por BRENNAN et al. (2008), que desenvolveu primers de STRs específicos para
Inhambu-de-cabeça-vermelha (Tinamus major). A seleção dos primers foi feita
considerando-se o número de alelos e o comprimento dos produtos. Com o
objetivo de diminuição de gastos na etapa de genotipagem foi adicionada aos
primers forward uma cauda M13 (CACGACGTTGTAAAACGAC), de acordo com
protocolo descrito por SCHUELKE (2000) e BOUTIN-GANACHE et al. (2001).
As sequências dos primers foward e reverse, unidades de repetição,
número de alelos (NA) e comprimento dos produtos obtidos pelos primers para
avestruzes e Inhambu-de-cabeça-vermelha selecionados estão apresentados nas
tabelas 2 e 3, respectivamente.
33
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Locos
Acesso GenBank Nº
Seqüência (5` - 3 `)
Repetição
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Tamanho
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Otimização da PCR
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Resultados e discussão
Gel utilizando primers de avestruzes
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Referências
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39
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™Q%¢ ‹L~L Análise do DNA fecal para determinação da presença e do
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duas unidades de Conservação do estado de São Paulo, o Parque Estadual
do Vasununga e a Estação Ecológica de Jataí, São Carlos%¢yttL iš——R5[‘N!M¢
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41
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! E A perdiz (Rhynchotus rufescens), considerada o maior tinamídeo
campestre nacional e com ampla distribuição geográfica no continente americano,
juntamente com outros representantes desta ordem, encontra-se atualmente
ameaçada, principalmente pela destruição de habitats e pela caça predatória. A
conservação destas espécies se justifica não somente por sua história evolutiva,
como principalmente pela importância ecológica que estas aves apresentam,
contribuindo para a dispersão de sementes, controle de insetos e predação, além
da criação em cativeiro para fins comerciais. Para tanto é importante conhecer a
estrutura genética destes animais a fim de subsidiar estratégias conservacionistas.
Neste sentido o presente estudo teve como objetivo desenvolver primers de
microssatélites específicos para perdizes, a partir de biblioteca genômica
enriquecida com microssatélites. De 16 pares de primers desenhados, somente
oito foram otimizados para determinação de polimorfismos genéticos em perdizes,
sendo que quatro destes mostraram-se monofórficos. Foi realizada a genotipagem
em 26 amostras de perdizes de diferentes origens utilizando-se de quatro primers
e obtidas estimativas relacionadas ao percentual de locos polimórficos (50%),
número médio de alelos por loco (5,75), conteúdo de informação polimórfica médio
(0,62)
e
diversidade
genética
esperada
(0,69).
Quanto
ao
teste
de
transferabilidade em outros tinamídeos, tivemos resultados positivos em poucos
pares de primers. A utilização dos locos polimórficos desenvolvidos possibilitará o
estabelecimento de estratégias voltadas para os programas de melhoramento
genético de populações destinadas à produção zootécnica em cativeiro, assim
como, conhecer a estrutura genética de populações naturais.
42
Palavras-chave: Clonagem, conservação, heterozigosidade, transferabilidade e
variabilidade genética
Introdução
Considerada o maior tinamídeo campestre nacional e com ampla
distribuição geográfica no continente americano, a perdiz (Rhynchotus rufescens)
juntamente com outros representantes desta ordem, encontra-se em algumas
regiões, ameaçada de extinção, principalmente pela destruição de habitats e pela
caça predatória (BRESSAN et al., 2009).
São animais que pertencem a avifauna mais antiga deste continente, com
registros fósseis de 10 milhões de anos na Patagônia, e em cavernas no Brasil,
que datam de aproximadamente 20 mil anos (SICK, 1985).
A conservação destas espécies se justifica não somente por sua história
evolutiva, como também pela importância ecológica que estas aves apresentam,
contribuindo para a dispersão de sementes, controle de insetos e predação.
Outro aspecto importante é que alguns destes animais podem ser criados
em cativeiro, assumindo importância econômica na geração de emprego e renda,
desde que sejam atendidas condições básicas de legislação, criação e
comercialização. SANTOS et al. (2009), trabalhando com criatórios de caititus
(Pecari tajacu), demonstraram ser viável economicamente a criação comercial
destes animais, desde que sejam atendidas condições básicas de legislação,
criação e comercialização.
Em trabalhos realizados com perdiz (Rhynchotus rufescens), BRUNELI et
al. (2005) estudaram fatores relacionados ao ciclo reprodutivo destas aves,
determinado época e horário de maior postura de ovos.
Da mesma forma,
CROMBERG et al. (2007), com o objetivo de conhecer aspectos reprodutivos de
perdizes, estudaram a razão sexual, a estrutura sócio-hierarquica e outras
características comportamentais, com vistas à adaptação em cativeiro.
43
Através de pesquisas desenvolvidas no Canadá com outra espécie de
tinamídeo nativo do Chile (Nothoprocta perdicaria), AGGREY et al. (1992)
constataram que apesar do maior tempo para o abate em relação às aves
comerciais, aquelas aves apresentaram bom peso e excelente rendimento de
carcaça. Esforços semelhantes foram conduzidos por GARITANO-ZAVALA (2004)
no sentido de viabilizar a criação em cativeiro de outro tinamídeo encontrado na
Bolivia, denominado localmente de pisacca (Nothoprocta ornata).
Determinar a estrutura genética das populações tanto em vida livre como
em cativeiro, principalmente no que se refere à variabilidade entre indivíduos e
entre populações, constituí um aspecto importante no estabelecimento de
estratégias de conservação e manejo de espécies.Com o desenvolvimento da
técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) na década de 80, marcadores
STRs tem sido muito utilizado em pesquisas direcionadas à produção animal,
assim como, a questões relacionadas à evolução e à biologia da conservação.
Vários trabalhos de pesquisa reportam a utilização de marcadores
microssatélites em espécies de interesse zootécnico, dentre outros citamos os
desenvolvidos para aves domésticas, como frango de corte (GROENEN et al.
1998; 2000), perus (REED et al. 2000), codornas (KAYANG et al. 2000) e
avestruzes (KIMWELE et al. 1998; TANG et al. 2003).
Empregando-se a tecnologia genômica é possível quantificar o risco de
extinção das várias espécies ameaçadas (O`BRIEN, 1994; AVISE et al. 1995). A
utilização de marcadores microssatélites para a estimativa de variabilidade
genética de populações com objetivos conservacionistas é reportada em diversos
estudos. SANDERLIN et al. (2009) trabalhando com STRs-tetranucleotídeos,
constataram baixa diversidade genética em duas populações do urso negro
americano (Ursus americanos).
Estudos realizados por FANTIM et al. (2007) permitiram conhecer o sistema
de reprodução e estabelecer estratégias de manejo em cativeiro e de conservação
em três espécies de tartarugas do gênero Podocnemis. BISHOP et al. (2009)
constataram a diminuição do tamanho efetivo em populações do crocodilo do nilo,
44
ocasionada pela caça excessiva. Da mesma forma, para estudos populacionais
em
ornitorrinco
(Ornithorhynchus
anatinus),
KOLOMYJEC
et
al.
(2008)
desenvolveram dez locos de marcadores microssatélites.
Em pesquisa realizada por CORREA et al. (2009), foram desenvolvidos 16
locos de microssatélites para estudos de genética populacional, determinação de
parentesco e comportamento reprodutivo na espécie cigarra do campo
(Neothraupis fasciata, Passeriforme).
Os microssatélites estão distribuídos no genoma dos diversos organismos,
de forma casual, sendo verificado em animais, a conservação de diversos sítios
em espécies relacionadas, o que permite em alguns casos, a transferência de
marcadores entre espécies ou mesmo gêneros com o uso de primers heterólogos
(MOORE et al., 1991).
MANTELLATTO et al. (2010) testaram a transferabilidade de primers
desenvolvidos para cervídeos dos gêneros Rangifer tarandus, Cervus elaphus, C.
axis e Moschus berezovskii e obtiveram resultados de amplificação em espécies
nativos do gênero Mazama (M. americana, M. bororo, M. gouazoubira, M. nana,
and M. nemorivaga). Trabalhos semelhantes foram realizados por LEITE et al.
(2007) com o cervo do pantanal (Blastocerus dichotomus).
Neste sentido o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento e a
caracterização de locos microssatélite para perdizes (Rhynchotus rufescens),
visando com isso obter marcadores moleculares para futura aplicação em estudos
genéticos populacionais nessa espécie e em outros tinamídeos.
Materiais e métodos
Coleta das amostras
Os estudos foram realizados utilizando amostras de sangue e de tecidos de
26 perdizes amostradas em diferentes regiões do Brasil, e também amostras de
outros tinamídeos.
45
As
espécies
amostradas,
quantidades
e
locais
de
coleta
estão
discriminadas na tabela 1. Entre as 18 perdizes provenientes do criatório cientifico
da FCAV/UNESP foram selecionadas, com base em informações de registros
genealógicos daquele criatório, uma família constituída de pai, mãe e dois filhos,
com o propósito de se avalizar a utilização dos primers desenvolvidos em testes
de parentesco.
Tabela 1 - Relação dos tinamídeos e locais de coleta das amostras
Espécie/amostra
Nome Científico
Nº
Criador
Localidade
Perdiz
Rhynchotus rufescens
02
04
02
18
Criatório Poços de Caldas
Setor de Aves-UESB
Criador Recanto das Aves
Criatório científico da FCAV/Unesp
Poços de Caldas-MG
Itapetinga-BA
Itatiba-SP
Jaboticabal-SP
Inhambu chororó
Crypturellus parvirostris
04
02
Criatório Poços de Caldas
Criador Recanto das Aves
Poços de Caldas-MG
Itatiba-SP
Inhambu-guaçú
Crypturellus obsoletus
02
02
Criador Recanto das Aves
Criatório Poços de Caldas
Itatiba-SP
Poços de Caldas-MG
Macuco
Tinamus solitarius
07
03
Criatório Poços de Caldas
Criador Recanto das Aves
Poços de Caldas-MG
Itatiba-SP
Zabelê
Crypturellus noctivagus
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Jaó
Crypturellus undulatus
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Inhambu-chintã
Crypturellus tataupa
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Inhambu-chororão
Crypturellus variegatus
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Azulona
Tinamus tao
03
Criatório Poços de Caldas
Poços de Caldas-MG
Extração e integridade do DNA
O DNA genômico foi extraído de tecidos e sangue utilizando-se do método
do fenol-cloroformio (AUSEBEL et al. 1995). Para se obter a digestão das
proteínas foi adicionada proteinase K (20mg /ml).
Depois transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo adicionando-se a
este 300 l de clorofórmio:álcool-isoamilico (24:1) removendo-se novamente o
sobrenadante para um tubo novo. Adicionou-se 700l de etanol absoluto gelado,
levando-se a mistura para o freezer a uma temperatura de -20°C por 1 hora, para
46
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Construção da biblioteca enriquecida de microssatélites
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Otimização da PCR
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Genotipagem das amostras e caracterização dos primers
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49
de prata de acordo com CRESTE et al. (2001), com a finalidade de se caracterizar
a variabilidade presente nestes locos.
Análises estatísticas
Os parâmetros estatísticos com frequências alélicas, heterozigosidade
observada (Ho) e esperada (He), conteúdo polimórfico informativo (PIC) e
Probabilidade de não exclusão de paternidade (NE-1P) foram estimados com o
uso do software Cervus 3.0 (MARSHAL et al., 1998). As estimativas dos desvios
de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foram realizadas utilizando-se do
programa GENEPOP 3.3 (RAYMOND e ROUSSET, 1995 )
Resultados e discussão
Desenho dos primers sintetizados
De um total de 96 colônias contendo fragmentos de DNA enriquecidos com
microssatélites foi possível identificar 34 locos de microssatélites (35,4%), sendo
que destes, foram selecionados 16 (47%) para desenho de pares de primers para
amplificação via PCR.
Resultados das amplificações dos géis em agarose
A figura 1 demonstra os resultados obtidos da corrida em gel de agarose
dos de 16 primers de microssatélites desenvolvidos para perdizes após
amplificação em PCR, com temperatura de hibridização de 60º C.
50
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51
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52
Observa-se ainda que os locos RruGT10D e RruGT06G encontram-se em
desequilíbrio de Hardy-Weinberg (p<0,05). Estes valores podem ter ocorrido
provavelmente porque a maioria das amostras de perdizes utilizadas, neste
estudo, é proveniente do plantel da FCAV/UNESP que estão submetidas a um
processo de seleção e de controle de acasalamentos, inerentes á condição de
cativeiro.
Os valores de conteúdo polimórfico informativos, para os quatro
marcadores polimórficos estão de acordo com o esperado, sendo que o marcador
com maior número de alelos (RruGT10D) apresentou maior valor de PIC.
A probabilidade de não exclusão indica o poder de um loco em não excluir
um indivíduo erroneamente determinado para paternidade. Neste estudo, o poder
de não exclusão variou de 0,489 (RruGT10D) a 0,882 (RruGT06G). Apesar de
cada loco isoladamente apresentar alta probabilidade de não exclusão, a análise
combinada resultou em probabilidade de não exclusão de 0,2088 para um
candidato parental, ou seja o conjunto de quatro locos analisados apresentou um
poder de discriminação para análises de paternidade de 79%. Para melhorar este
poder de discriminação, seria interessante o desenvolvimento de mais marcadores
polimórficos.
Estudos realizados por HE et al. (2009), utilizando 14 pares de
microssatélites polimórficos para o faisão dourado, obtiveram valores de exclusão
de paternidade de 99%, o mesmo valor verificado por ZOU et al. (2010),utilizando
18 marcadores microssatélites também polimórficos, para uma população do grou
japonês em semi-cativeiro.
53
a
b
c
d
Figura 2 - Freqüência dos alelos para cada primer de microssatélite: a) RruGT12A; b) RruGT06G;c) RruGT12B e;d)
RruGT10D.
Neste estudo também foi testada a transferabilidade dos primers
desenvolvidos para perdizes (Rhynchotus rufescens) na amplificação de amostras
de DNA de outros tinamídeos, cujo os resultados são apresentados nas tabela 3.
Tabela 3 - Transferabilidade em amostras de DNA de diferentes espécies utilizando primers desenhados para Rhynchotus
rufescens e respectivas temperaturas de hibridização
Primer
Espécie
Macuco
Azulona
Inhambu-guaçu
Inhambu-xororó
Inhambu-chintã
Inhambu-xororão
Jaó do interior
Zabelê
# Bandas inespecíficas
RruGT08A
RruGT12A
58
#
#
- Sem amplificações
RruGT12B
RruGT09D
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RruGT11G
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50
50
50
50
50
50
50
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56
56
56
56
56
56
56
52
#
-
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56
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#
#
-
54
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Sequências do genoma de perdizes depositadas no GenBank
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Referências
~''‹&%¢ KL&L-¢ žL‹L¢ ^QžŽ<K- zL™L¢ žŽ&^'L¢ =R¢ ‘5[5š|R¢ [š‘JM¢ M5¢
MJJR5š‘Š¢ JR‘[¢ 5M[šMn¢ 5RŠšJš‘5I¢ R†‘Š‘[šML¢ Qn¢ –‹<iVK¢ gs<‹¢
ž^'‹&KK %4yL Anais... ~J—[R5‘n –gK~%¢
L:t%¢4yL
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‘¢K‹s^%¢zL¢Current protocols in molecular biologyL¢yt¢&L%¢4]L
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61
CAPITULO 4 - ESTUDO GENETICO-QUANTITATIVO DE CARACTERISTICAS
MORFOLOGICAS, PONDERAIS E COMPORTAMENTAIS EM PERDIZES,
UTILIZANDO DE INFERÊNCIA BAYESIANA
Resumo - Foram utilizados registros de características morfometricas,
ponderais e de comportamento de 690 perdizes pertencentes a quatro gerações,
nascidas nas estações reprodutivas de 2006-2007, 2007-2008, 2008-2009 e 20092010, com o objetivo de se estimar componentes de (co)variância e parâmetros
populacionais. Um modelo multi-caracteristicas foi proposto, em que se
consideram os efeitos fixos de classe de época de nascimento/geração e sexo, e
como aleatórios aditivo direto e residual. Para a obtenção das estimativas foi
utilizado o programa GIBBS2F90, que utiliza para a estimação dos componentes
de variância o método bayesiano. As estimativas de herdabilidade para as
características morfometricas apresentaram magnitudes que variaram de 0.177 a
0.690. As correlação genéticas apresentaram valores diversos, inclusive
indicativos de antagonismo entre algumas características. Os resultados
apresentados indicam que a realização de um processo de seleção utilizando
como critérios de seleção medidas morfometricas, pode incorrer em ganho
genético rápido, dado os valores de herdabilidade.
Palavras-chave: Amostrador de Gibbs, critérios de seleção, parâmetros geneticos
62
Introdução
As novas tendências do mercado consumidor têm possibilitado o
oferecimento de produtos diferenciados como, por exemplo, a produção de carne
de aves silvestres, dentre as quais a perdiz (Rhynchotus rufescens), possui
grande potencial para atender a esta demanda. Representante da fauna brasileira,
esta espécie apresenta características de grande interesse para a produção
animal, tais como excelente valor nutritivo da carne de peito, baixos níveis de
colesterol e altos rendimentos de carcaça e de peito, 74.37 % e 36.65%,
respectivamente (MORO et al. 2006).
Com o objetivo de se expressar o potencial latente desta ave em um
sistema de produção animal, assim como em outras espécies, a utilização da
seleção como metodologia é indispensável. Dentro do estabelecimento de um
programa de melhoramento genético, primeiramente deve-se estabelecer os
objetivos e critérios de seleção a serem adotados, sendo necessário a realização
de estudos a fim de se conhecer os mecanismo genéticos envolvidos. Dentro
deste contexto se insere a importância de se estimar os componentes que
compõem a variância sobre determinada característica. As estimativas de
(co)variância tem sido aplicadas na construção de índices de seleção, em modelos
mistos, estimação de herdabilidade e correlações, planejamento de programas de
melhoramento e interpretação de mecanismo genético de características
quantitativas (HENDERSON, 1986).
Em vista de um sistema de produção de carne, a primeira característica a
ser considerada como critério é o peso corporal, em virtude da facilidade de
obtenção. Entretanto, segundo NORTHCUTT et al. (1992), as mensurações
corporais lineares, como altura e comprimento, são mais precisas na
determinação do tamanho do animal do que o peso, sendo que a utilização de
mensurações corporais, em conjunto com medidas tradicionais, possibilitam maior
precisão para determinar a relativa maturidade do animal, validando-se desta
forma estudos de características morfometricas.
63
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Resultados e Discussão
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66
para as estimativas de correlações genéticas. A similaridade entre média, mediana
e moda em grande parte das distribuições posteriores dos parâmetros são
indicativos de distribuições normais, entretanto em alguns parâmetros (tais como
em algumas correlações genéticas) desvios de normalidades são verificados.
No que concerne a confiabilidade das estimativas, verifica-se que em
virtude do pequeno número de informações, algumas das estimativas apresentam
intervalos de alta densidade amplos. Assim, deve-se ter cuidado em estabelecer
conclusões baseadas em alguns parâmetros (especialmente correlações) em
virtude do intervalo em que se encontra a estimativa.
Herdabilidades
As estimativas de herdabilidade (Tabela 1) para as características
estudadas apresentaram magnitude de baixa a alta, variando entre 0,177
(comprimento de asa) e 0,510 (comprimento de bico) . Constata-se que ganhos
genéticos podem ser obtidos através da seleção, uma vez que se verifica
contribuição do efeito genético sobre a variação das características.
No que se refere
as características morfológicas, não foram possíveis
comparações com resultados da literatura, uma vez que estudos com perdizes ou
outros tinamídeos serem escassos. Entretanto, trabalhos envolvendo outras
espécies, corroboram com os resultados encontrados para características
morfológicas.
Estimativas de herdabilidade de características de conformação como
comprimento de coxa e canela medidas na quarta e sexta semanas e ângulo do
peito na sexta semana de idade em três linhagens de codornas foram relatadas
por MANDAL et al. (1995). Estas estimativas variaram de 0,10 a 0,52, sendo mais
altas na quarta semana. Para ângulo de peito as estimativas variaram de 0,32 a
0,50. Estimativas de herdabilidade de 0,51 a 0,63 para as características peso
corporal, peso muscular e características de esqueleto (peso, comprimento,
67
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Caract.
Param.
A.E.
2
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Mediana
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IAD-LI
IAD-LS
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68
As características de desenvolvimento ponderal (peso adulto e peso aos 90
dias) apresentaram valores altos de herdabilidade, indicando que ganhos
genéticos significativos podem ser obtidos utilizando-as como critérios de seleção.
Valores de magnitude semelhante foram apresentados por THOLON et al. (2008),
trabalhando com pesos em diversas idades em perdizes. Para imobilidade tônica,
estimativa de menor valor foi reportada por HATA (2009) nesta espécie.
Correlações genéticas e residuais
As correlações genéticas entre as características estudadas (Tabela 2)
apresentaram valores entre -0,332 (CT/IT) e 0,806 (CA/LB). Tais valores indicam
que cuidados devam ser dados a programas de seleção para esta espécie, uma
vez que a escolha de determinado critério pode induzir em resultados não
desejáveis em outras características.
Como, verificado em outros estudos, nas mais diversas espécies, os pesos
apresentam-se altamente correlacionados, indicando que a seleção para peso aos
90 dias promoverá aumento no peso adulto dos animais. No que se refere a
associação genética das demais características com PA e P90, a exceção das
estimativas com CB e IT, apresentaram
valores próximos.
Em vista das
correlações estimadas, adotando-se PA ou P90 como critério de seleção ganho
genéticos são esperados nas demais características, com exceção da relação do
CB com o P90.
69
Tabela 3 - Estatísticas descritivas das distribuições posteriores das estimativas de correlação genética entre as
características estudadas
Caract.
A.E.
CT/CB
679
CT/CA
103
CT/PA
1583
CT/LC
110
CT/LB
224
CT/IT
594
CT/P90
297
CB/CA
173
CB/PA
3166
CB/LC
1583
CB/LB
2366
CB/IT
2375
CB/P90
1583
CA/PA
488
CA/LC
1583
CA/LB
45
CA/IT
2375
CA/P90
1584
PA/LC
2375
PA/LB
2375
PA/IT
2375
PA/P90
1583
LC/LB
1187
LC/IT
2375
LC/P90
1583
LB/IT
1584
LB/P90
1584
IT/P90
3167
1
número de amostras efetivas
2
desvio-padrão
Média
Mediana
Moda
IAD-LI
IAD-LS
-0,270
-0,146
0,613
0,219
-0,151
-0,332
0,592
0,626
0,182
0,064
0,158
-0,065
-0,046
0,491
0,407
0,806
0,179
0,404
0,276
0,318
0,246
0,745
0,230
0,038
0,304
0,160
0,395
0,082
-0,346
-0,217
0,609
0,267
-0,255
-0,361
0,643
0,670
0,197
0,066
0,184
-0,090
-0,044
0,551
0,487
0,840
0,189
0,439
0,226
0,325
0,274
0,771
0,321
0,002
0,318
0,188
0,429
0,072
-0,279
-0,158
0,621
0,231
-0,172
-0,348
0,610
0,640
0,190
0,070
0,169
-0,068
-0,042
0,503
0,425
0,816
0,182
0,423
0,278
0,326
0,252
0,757
0,245
0,039
0,317
0,168
0,407
0,082
-0,606
-0,552
0,379
-0,270
-0,569
-0,634
0,292
0,357
-0,138
-0,367
-0,215
-0,419
-0,423
0,185
0,034
0,601
-0,191
0,084
-0,117
-0,036
-0,102
0,549
-0,186
-0,386
-0,119
-0,215
0,043
-0,262
0,076
0,313
0,814
0,662
0,282
0,010
0,856
0,836
0,492
0,469
0,509
0,288
0,316
0,756
0,759
0,950
0,542
0,716
0,647
0,640
0,580
0,914
0,649
0,444
0,688
0,546
0,717
0,408
Com relação às estimativas de correlações residuais, estas apresentaram
valores de menor magnitude quando comparadas as estimativas genéticas,
variando entre -0,114 (CA/LB) e 0,491 (PA/P90). Assim, em vistas dos valores
encontrados, podemos inferir que alterações no ambiente para uma determinada
características, ocasiona poucas mudanças sobre as demais características.
70
Tabela 4 - Estatísticas descritivas das distribuições posteriores das estimativas de correlação residual entre as
características estudadas
Caract.
1
A.E.
CT/CB
594
CT/CA
1267
CT/PA
3167
CT/LC
475
CT/LB
487
CT/IT
3166
CT/P90
3166
CB/CA
1583
CB/PA
3166
CB/LC
2110
CB/LB
2104
CB/IT
3166
CB/P90
2375
CA/PA
3166
CA/LC
3167
CA/LB
3166
CA/IT
3166
CA/P90
3166
PA/LC
3167
PA/LB
3166
PA/IT
3166
PA/P90
3166
LC/LB
2372
LC/IT
2111
LC/P90
2111
LB/IT
3166
LB/P90
1584
IT/P90
3165
1
número de amostras efetivas
2
desvio-padrão
Média
Mediana
Moda
IAD-LI
IAD-LS
0,305
0,392
0,162
0,017
-0,023
0,136
0,047
0,092
0,115
-0,005
-0,058
0,144
0,146
0,306
0,028
-0,114
-0,026
0,205
0,173
0,156
0,013
0,491
0,062
-0,039
0,010
-0,060
0,033
0,008
0,280
0,400
0,193
0,043
-0,023
0,152
0,087
0,085
0,135
0,004
-0,060
0,164
0,129
0,320
0,021
-0,103
-0,045
0,222
0,167
0,163
0,034
0,528
0,081
-0,027
0,042
-0,057
0,049
0,019
0,302
0,394
0,166
0,020
-0,025
0,135
0,052
0,094
0,120
-0,003
-0,055
0,144
0,146
0,308
0,030
-0,112
-0,027
0,207
0,175
0,159
0,015
0,497
0,065
-0,039
0,014
-0,059
0,037
0,008
0,135
0,272
-0,003
-0,131
-0,168
-0,014
-0,111
-0,078
-0,131
-0,200
-0,284
-0,075
-0,086
0,160
-0,107
-0,278
-0,171
0,059
-0,013
-0,049
-0,188
0,326
-0,115
-0,207
-0,174
-0,243
-0,163
-0,173
0,475
0,507
0,321
0,153
0,132
0,282
0,210
0,252
0,344
0,201
0,141
0,351
0,369
0,441
0,163
0,043
0,112
0,350
0,365
0,351
0,216
0,636
0,218
0,122
0,191
0,115
0,218
0,181
Conclusões
Os resultados apresentados indicam que a realização de um processo de
seleção utilizando como critérios de seleção medidas morfometricas, pode incorrer
em ganho genético rápido, dado os valores de herdabilidade, inclusive com
ganhos positivos sobre os pesos dos animais.
71
Referências
Ž~~%¢ ™L&L¢ Efeitos genéticos e ambientais sobre o tempo de permanência
em imobilidade tônica de perdizes (Rhynchotus rufescens)L¢ iš——R5[‘N!M¢
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Mš‘AL¢ Indian Veterinary Journal%¢ †L¢ ‡y%¢ L¢ 4%¢ L¢ ˜:Œ˜%¢
4]L
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of
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Mš[šM¢ —M5R¢ š¢ ~|—¢ MF—L¢ Journal Animal Science%¢ †L‡t%¢ L]%¢ L4:˜yŒ]%¢
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