UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS VALOR DA P16INK4A COMO MARCADORA DE LESÕES PRECURSORAS DO CÂNCER ANAL EM PACIENTES HIV POSITIVOS IVAN TRAMUJAS DA COSTA E SILVA MANAUS 2010 i IVAN TRAMUJAS DA COSTA E SILVA VALOR DA P16INK4A COMO MARCADORA DE LESÕES PRECURSORAS DO CÂNCER ANAL EM PACIENTES HIV POSITIVOS Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do grau de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira MANAUS 2010 Ficha Catalográfica. C837v Costa e Silva , Ivan Tramujas da. INK4A Valor da p16 como marcadora de lesões precursoras do câncer anal em pacientes HIV positivos / Ivan Tramujas da Costa e Silva. Manaus: Universidade do Estado do Amazonas, 2010. xvi , 222 f. Tese (Doutorado) Universidade do Estado Amazonas –Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2010. Orientador: Prof.Dr.Luiz Carlos de Lima Ferreira. INK4 Titulo em Inglês: Value of p16 as a surrogate marker of anal cancer precursor lesions in HIV positive patients. 1. Neoplasias do ânus. 2.Genes p16. 3.Imunocitoquímica. 4.Imunohistoquímica. 5.Lesões pré-cancerosas. 6.Doenças infecciosas. I. Título. CDU: 616.9 Ficha catalográfica elaborada por Maria Inês de Melo Albuquerque CRB-11/694 Am. ii FOLHA DE JULGAMENTO VALOR DA P16INK4A COMO MARCADORA DE LESÕES PRECURSORAS DO CÂNCER ANAL EM PACIENTES HIV POSITIVOS IVAN TRAMUJAS DA COSTA E SILVA “Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”. Banca Julgadora: ________________________________ Prof. Luiz Carlos de Lima Ferreira, Dr. Presidente _________________________________________ Prof. Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda, Dr. Membro ________________________________________ Profª. Angélica Espinosa Barbosa Miranda, Drª. Membro _________________________________________ Profª. Cristina Maria Borborema dos Santos, Drª. Membro _____________________________ Prof. Fernando Luiz Westphal, Dr. Membro iii DEDICATÓRIA À Lucia, Barbara, Letícia e Débora. À Celda Maria. iv AGRADECIMENTOS As pesquisas aqui descritas fazem parte de dois projetos abrangentes sobre o câncer anal e suas lesões precursoras em HIV-positivos pioneiramente desenvolvidos, na Região Norte, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM). Foram iniciados, após aprovação de convênio firmado com o Programa Nacional de DST e Aids, do Ministério da Saúde, e com a UNESCO, em 2006 e foram operacionalizados com o apoio da Universidade do Estado do Amazonas, da Superintendência da Zona Franca de Manaus, da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e da Fundação de Apoio Institucional Muraki. Compreenderam um imenso trabalho de equipe que mobilizou, por 3 anos, de alguma forma, toda a FMT-AM, todos os seus funcionários, todos os seus pesquisadores, assim como voluntários de outras instituições e organizações. Não seria possível nomeá-los individualmente sem incorrer em lapsos injustos. Cada um dos que emprestou seu tempo e sua contribuição para o desenvolvimento e a consecução dos projetos deixou neles sua marca indelével que não pode ser quantificada, mas é absolutamente necessário reconhecer que o que tem sido obtido a partir dos estudos realizados não poderia sê-lo sem a menor e aparentemente mais singela das cooperações. A todos os meus mais penhorados agradecimentos. Nada do que foi realizado tê-lo-ia sido sem a participação ativa daqueles a quem todos os esforços de bem atender foram dirigidos: os pacientes. Agradeço sinceramente a participação, nos estudos, de todos os que procuraram a FMT-AM para atendimento, seja no Ambulatório de Coloproctologia, seja na Semana de Prevenção do Câncer Anal, e espero que o trabalho desenvolvido tenha contribuído para aplacar ansiedades e mitigar sofrimentos dos que nos honraram com sua escolha. v RESUMO INTRODUÇÃO: Técnicas imunoquímicas de detecção da proteína p16INK4a (IMQ) são empregadas na prevenção do câncer cervical, uma vez que a proteína encontra-se superexpressada em lesões provocadas por genótipos de alto risco do papilomavírus humano (HPV). Sendo a história natural do câncer anal considerada semelhante à do cervical, as mesmas técnicas são propostas para diminuir a variabilidade intra e interobservadores existente em seu diagnóstico precoce. OBJETIVO: Esta pesquisa estudou a validade diagnóstica da IMQ em espécimes anais citológicos e histológicos de pacientes sob risco de câncer anal atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, de janeiro/2007 a dezembro/2008. MÉTODOS: Com métodos estatísticos frequentistas e Bayesianos, buscou-se inicialmente estudar a variabilidade interobservadores no diagnóstico de lesões intraepiteliais escamosas anais (ASIL) pelo exame histopatológico de biópsias anais e a prevalência destas lesões. Os exames de 372 pacientes puderam ser comparados entre três patologistas da instituição. Estudouse, a seguir, a validade diagnóstica da imunoquímica-p16INK4a em espécimes anais citológicos e histológicos de pacientes HIV-positivos. RESULTADOS: A concordância absoluta entre diagnósticos individuais e os de consenso correspondentes foi ruim (kappa = - 0,002). Considerando os resultados apenas positivos ou negativos para ASIL, obteve-se concordância regular entre os observadores (kappa = 0,35), tendo sido moderada quando os resultados foram considerados positivos ou negativos para lesão de alto grau ou câncer (kappa = 0,52). Foi significante a diferença da prevalência-ponto de ASIL entre HIV-positivos e negativos (38,3% versus 13,5%; p < 0,0001). Houve prevalência maior de ASIL entre homens-que-fazem-sexo-com-homens/HIV+ (49,5%) e de lesões de alto grau em Mulheres/HIV+ = 28,6%. Entretanto, homens-que-fazemsexo-com-homens/HIV-negativos e homens heterossexuais/HIV+ também apresentaram prevalências de ASIL elevadas (30,8% e 21,1%, respectivamente). Não houve associação estatística entre os resultados imunocitoquímicos feitos em esfregaços convencionais ou pela técnica Glucyte® e os histopatológicos e da genotipagem de HPV pela reação em cadeia da polimerase (p> 0,05). No melhor cenário de comparação, a imunocitoquímica-p16INK4a apresentou 31% de sensibilidade e 81% de especificidade para o diagnóstico de ASIL e 30% e 66%, respectivamente, para o diagnóstico de infecção por HPV de alto risco, sendo baixo o valor preditivo positivo para ASIL. Em contrapartida, a imunoistoquímica-p16INK4a apresentou significante associação com os resultados histopatológicos (p < 0,0001), sendo a sensibilidade de 79% e especificidade de 80% para apontar ASIL e de 60% e 84%, respectivamente, para lesão de alto grau. CONCLUSÕES: Os pacientes HIV-positivos e os HIV-negativos anorreceptivos analisados apresentaram prevalências-ponto de ASIL elevadas. A concordância diagnóstica histopatológica média entre patologistas foi moderada para o diagnóstico de lesões iguais ou mais graves do que HSIL. Não houve associação estatística entre a imunocitoquímica-p16INK4a e a histopatologia anal em pacientes HIV-positivos, sendo a imunocitoquímica método insensível para o diagnóstico de ASIL ou de infecção por HPV de alto risco, havendo, entretanto, melhor especificidade para ASIL quando a imunocitoquímica foi realizada em esfregaços de camada delgada. Houve associação estatística significante entre a imunoistoquímica-p16INK4a e os resultados histopatológicos de pacientes HIV-positivos, sendo a imunoistoquímica-p16INK4a mais específica do que sensível no diagnóstico de ASIL e razoável discriminadora de lesões de alto-grau. Palavras-Chave: Genes p16; Imunocitoquímica; Imunoistoquímica; Lesões Précancerosas / Diagnóstico; Neoplasias do Ânus. vi ABSTRACT INTRODUCTION: Immunochemical techniques for detection of p16INK4a protein (IMC) are employed in the prevention of cervical cancer, since the protein is over expressed in lesions caused by high-risk genotypes of human papillomavirus (HPV). As the natural history of anal cancer is considered similar to cervical cancer, the same diagnostic techniques are proposed to reduce the intra- and interobserver variability existing in its early diagnosis. OBJECTIVE: This research investigated the diagnostic validity of IMC in anal cytological and histological specimens from patients at risk for anal cancer seen at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas, from January/2007 to December/2008. METHODS: With frequentist and Bayesian statistics, it was initially studied the interobserver variability in the diagnosis of anal squamous intraepithelial lesions (ASIL) by histopathological analysis of anal biopsies and the prevalence of these lesions. The histopathological findings of 372 patients could be compared among three pathologists of the institution. Next, it was studied the diagnostic validity of IMC in anal cytological and histological specimens of HIV-positive patients. RESULTS: The absolute agreement between individual diagnoses and the corresponding consensus was poor (kappa = - 0.002). Considering the results only ASIL-positive or negative, fair agreement was obtained among observers (kappa = 0.35), whereas moderate agreement was found when the results were considered positive or negative for high-grade lesion or cancer (kappa = 0.52 ). The difference of the point-prevalences of ASIL between HIV-positive and negative patients was significant (38.3% versus 13.5%, p <0.0001). There was a higher prevalence of ASIL in HIV-positive men-who-have-sex-with-men (49.5%) and of high-grade lesions in HIV-positive women (28.6%). However, HIV-negative men-who-havesex-with-men and HIV-positive heterosexual men also showed elevated prevalences of ASIL (30.8% and 21.1%, respectively). There was no statistical association among p16INK4aimmunocytochemical (ICC) results of conventional or GlucyteTM technique smears and the histopathological findings or HPV genotyping by polymerase chain reaction (p> 0.05). In the best comparative scenario, ICC showed 31% sensitivity and 81% specificity for the diagnosis of ASIL, and 30% and 66%, respectively, for the diagnosis of high-risk HPV infection. Also, the positive predictive value of ICC for ASIL was low. In contrast, p16INK4aimmunohistochemistry (IHC) showed a significant association with histopathological findings (p <0.0001), with a sensitivity of 79% and specificity of 80% to indicate ASIL and 60% and 84%, respectively, to indicate high-grade lesions. CONCLUSIONS: The HIV-positive and anoreceptive HIV-negative patients analyzed showed elevated point-prevalences of ASIL. The average histopathological diagnostic agreement among pathologists was moderate for the diagnosis of lesions either HSIL/cancer or lower than HSIL. There was no statistical association between anal ICC and histopathology in HIV-positive subjects, being ICC an insensitive method for the diagnosis of ASIL and of high-risk HPV infection, despite good specificity for ASIL was observed when ICC was performed in thin layer smears. There was a significant statistical association between anal IHC and histopathological findings in HIVpositive patients, being IHC more specific than sensitive in the diagnosis of ASIL and a fair discriminator of high-grade lesions. Key-words: Anus Neoplasms; Genes, p16; Immunohistochemistry; Precancerous Conditions / Diagnosis. Immunocytochemistry; vii LISTA DE FIGURAS Legenda Tese Figura 1 Canal Anal: corte sagital................................................................ 2 Figura 2 Zona de transição anal.................................................................. 2 Figura 3 Diagrama da estrutura circular do genoma do HPV...................... 5 Figura 4 Diagrama do vírion do HIV............................................................. 8 Figura 5 Anoscopia com magnificação de imagem..................................... 19 Figura 6 O ciclo celular de mamíferos......................................................... 24 Figura 7 Tipos de ciclina e suas expressões temporais.............................. 26 Figura 8 Ação das ciclinas complexadas com CDK sobre a proteína do retinoblastoma (pRb) nas diferentes fases do ciclo celular........... 27 Figura 9 A adição de radicais fosfato à proteína do retinoblastoma (pRb).. 28 Figura 10 O ciclo de vida do papilomavírus humano..................................... 30 Figura 11 Reação imunoquímica pelo método da Streptavidina-biotinaperoxidase..................................................................................... 38 Figura 12 Esfregaço de células anais em lâmina realizado com escova citológica........................................................................................ 49 Artigo 4.2 Figure 1 Distribution of Proportional Frequencies of Histopathological Results of Anal Biopsies……………………………………………... 100 Artigo 4.3 Figure 1 HeLa cells positively stained in a p16INK4a immunochemical reaction. Scale = 10…………………………………………………. 136 Figure 2 Positive anal p16INK4a immunochemical stain of atypical 136 squamous cells. Scale = 10……………………………………… viii LISTA DE TABELAS Legenda Artigo Tabela 4.1 Table 1 Individual diagnoses of pathologists versus consensus diagnoses……………………………………………………. 83 4.1 Table 2 Instances of gross agreement betwen the individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses……………………………………………………. 84 Instances of agreement between the individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses considering histopathological results positive or negative for ASIL or cancer…………………………….. 85 Comparison between individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses considering a two tiered classification of anal dysplasia/cancer……….. 86 Association between individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses considering the results either with or without the presence of severe dysplasia/cancer……………………………………………. 87 Frequencies of Histopathological Results of Anal Biopsies by Ethnic Breakdown, Level of Education and HIV status……………………………………………………. 98 4.1 4.1 4.1 4.2 Table 3 Table 4 Table 5 Table 1 Pág. 4.2 Table 2 Frequencies of Anal Canal Histopathological Diagnoses According to Population Sample Strata Studied..……….. 99 4.2 Table 3 Analysis of Standard Residuals of the Frequencies of Histopathological Results Relative to the Population Sample Strata Studied……………………………………... 101 Table 4 Comparative Odds Ratios of Group 1 of Presenting Anal Squamous Intraepithelial Lesions…………………........... 102 Table 1 Association among p16INK4a immunocytochemistry and histopathological results in HIV-positive patients at Tropical Medicine Foundation of Amazonas…………….. 137 4.2 4.3 ix Artigo 4.3 4.3 4.4 4.4 Tabela Legenda Pág. Table 2 Association between p16INK4a immunocytochemistry and human papillomavirus genotyping results in HIVnegative patients at Tropical Medicine Foundation of Amazonas…………………………………………………… 137 Measures of diagnostic validity of p16INK4a immunocytochemistry in HIV-positive patients at Tropical Medicine Foundation of Amazonas…………………………………... 138 Association between p16INK4a immunohistochemistry and histopathological results in HIV-positive patients attended at Tropical Medicine Foundation of Amazonas. 157 Measures of diagnostic validity of p16 immunohistochemistry in HIV-positive patients attended at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas...…… 158 Table 3 Table 1 Table 2 x LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA % Percentual + Positivo - Negativo ºC Graus Centígrados ® Marca Registrada AAL Ambulatório Araújo Lima Ac. 1ário Anticorpo primário Ac. 2ário Anticorpo secundário ACU Condiloma acuminado ADCin Adenocarcinoma invasivo ADCis Adenocarcinoma in situ AIDS, aids Síndrome da imunodeficiência adquirida AIN, NIA Anal intraepithelial neoplasia, neoplasia intraepitelial anal AMI, HRA Anoscopia com magnificação de imagem ASC-H Células escamosas atípicas não podendo excluir lesão intraepitelial de alto grau ASC-US Células escamosas atípicas de significado indeterminado ASG-US Células glandulares atípicas de significado indeterminado ASIL Lesão intraepitelial escamosa anal BAK Bcl2-antagonist killer, proteína que induz apoptose BCAI Benign cellular alterations/inflammatory, alterações celulares benignas/inflamação CD4 Receptor transmembrana de 54 kDa CDK Cinase (ou quinase) dependente de ciclina CEC, SCC Carcinoma espinocelular (epidermóide ou de células escamosas) CECin Carcinoma epidermóide invasivo xi CECis Carcinoma epidermóide in situ CEP Comitê de Ética em Pesquisa CIN, NIC Cervical intraepithelial neoplasia, neoplasia intraepitelial cervical cm Centímetro CML, LBC Citologia em meio líquido CSIL Lesão intraepitelial escamosa cervical Da Dalton DAB Diaminobenzidina DNA Ácido desoxirribonucléico E2F Fator de transcrição nuclear que promove a transição da fase G1 para a S do ciclo celular FMT-AM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas g Grama GLUCYTETM Método proprietário de citologia em meio líquido GP5+, GP6+ Iniciadores de reação em cadeia da polimerase HAART Terapia anti-retroviral de alta potência H&E Hematoxilina e eosina HeLa Células imortalizadas de Henrietta Lacks de câncer cervical causado pelo HPV tipo 18 HIV Vírus da imunodeficiência humana HPV Vírus do papiloma humano HR-HPV HPV de alto risco HSH, MSM Homens que fazem sexo com homens HSH-HIV+ Homens que fazem sexo com homens com infecção pelo HIV HSIL Lesão intraepitelial escamosa de alto grau HSV Vírus do herpes simples HUGV Hospital Universitário Getúlio Vargas xii IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística ICC Immunocytochemistry, imunocitoquímica IHC Immunohistochemistry, imunoistoquímica INK Proteínas inibidoras das quinases dependentes de ciclinas IR-HPV HPV de risco intermediário kDa Quilodalton kg Quilograma kV Quilovolt LR-HPV HPV de baixo risco LSIL Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau μ Micro μl Microlitro M Mol mg Miligrama min Minutos ml Mililitro mM Milimol MY09, MY11 Iniciadores de reação em cadeia da polimerase N Normal p16INK4a, p16 Proteína inibidora das quinases dependentes da ciclina 4 e 6, com 16 kDa de massa molecular p53 Proteína supressora tumoral de 53 kDa de massa molecular P.A. Pureza analítica Pap-a Papanicolaou anal Pap-c Papanicolaou cervical pb Pares de Bases PBS Phosphate buffer solution, solução tampão fosfatada PCR Reação em cadeia da polimerase pRb Proteína do retinoblastoma xiii RNA Ácido ribonucléico rpm Rotações por minuto s Segundos SABP Método imunoquímico da streptavidina-biotina-peroxidase TM Trade mark UFAM Universidade Federal do Amazonas UNS Unsatisfactory, insatisfatório ZTA, ATZ Zona de transição anal xiv SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1.1 O Câncer Anal – Particularidades....................................................... 1.1.1 Aspectos Anatômicos.......................................................................... 1.1.2 O Carcinoma Epidermóide Anal.......................................................... 1.1.2.1 O Vírus do Papiloma Humano............................................................. 1.1.2.1.1 Câncer Anal e Interação entre HPV e HIV.......................................... 1.1.3 Lesões Precursoras do Câncer Anal.................................................. 1.1.4 Exames para o Diagnóstico das Lesões Precursoras do Câncer Anal..................................................................................................... 1.1.4.1 Citologia Anal Oncótica....................................................................... 1.1.4.2 Anoscopia com Magnificação de Imagem (AMI)................................. 1.1.4.3 Métodos de Detecção Biomolecular do HPV...................................... 1.1.4.4 Exame Histopatológico....................................................................... 1.1.5 Detecção Imunoquímica da p16INK4a................................................... 1.1.5.1 Bases das Técnicas de Detecção Imunoquímica da Proteína p16INK4a................................................................................................ 1.1.5.1.1 O Ciclo Celular.................................................................................... 1.1.5.1.2 Controle do Ciclo Celular.................................................................... 1.1.5.1.3 Interferência no Ciclo Celular Levando ao Câncer............................. 1.1.5.1.4 Ação do HPV em Tecidos Anogenitais............................................... 1.1.5.1.5 A Proteína p16INK4a em Tecidos Infectados por HPV de Alto Risco................................................................................................... 1.1.5.2 Princípios do Método de Processamento Imunoquímico de Espécimes Citológicos e Histológicos................................................. 1.1.5.2.1 Soluções Utilizadas numa Reação Imunoquímica.............................. 1.1.5.2.2 Preparo do Espécime para a Recuperação Antigênica...................... 1.1.5.2.3 Recuperação Antigênica..................................................................... 1.1.5.2.4 Bloqueio de Antígenos Inespecíficos.................................................. 1.1.5.2.5 Aplicação do Anticorpo Primário......................................................... 1.1.5.2.6 Marcação do Anticorpo Primário......................................................... 1.1.5.2.7 Revelação Imunoquímica dos Locais em que Ocorreu a Reação Antígeno-Anticorpo.............................................................................. 1.1.5.2.8 Contracoloração e Montagem............................................................. 1.1.5.2.9 Controles Positivo e Negativo............................................................. 1 1 1 3 5 8 11 2 OBJETIVOS........................................................................................................ 2.1 Geral.................................................................................................... 2.2 Específicos.......................................................................................... 43 43 43 3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 3.1 Modelo de Estudo............................................................................... 3.2 Universo de Estudo............................................................................. 3.2.1 População de Referência.................................................................... 3.2.2 População de Estudo.......................................................................... 3.2.3 Participantes........................................................................................ 3.2.3.1 Tamanho da Amostra.......................................................................... 3.2.3.2 Critérios de Exclusão e Exclusão........................................................ 3.2.3.2.1 Inclusão............................................................................................... 44 44 44 44 45 45 45 46 46 15 15 18 20 21 23 23 23 25 29 29 31 33 33 36 36 37 39 40 40 41 41 xv 3.2.3.1.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 Exclusão.............................................................................................. Instrumentos de Coleta........................................................................ Escova Citológica................................................................................ Colposcópio......................................................................................... Pinça de Biópsia Prof. Medina............................................................. Protocolos de Coleta de Dados da Anoscopia com Magnificação de 3.3.4 Imagem e de Histopatologia................................................................ 3.3.5 Protocolos de Estudo........................................................................... 3.4 Procedimentos..................................................................................... 3.4.1 Entrevista............................................................................................. 3.4.2 Exame Proctológico............................................................................. 3.4.3 Coleta Citológica.................................................................................. 3.4.4 Anoscopia com Magnificação de Imagem........................................... 3.4.5 Reação em Cadeia da Polimerase...................................................... 3.4.5.1 Recuperação de DNA.......................................................................... 3.4.5.2 Amplificação do DNA por PCR............................................................ 3.4.5.2.1 PCR para diagnóstico do HPV............................................................ 3.4.5.2.1.1 Oligonucleotídeos MY09/MY11........................................................... 3.4.5.2.1.2 Eletroforese em Gel de Agarose......................................................... 3.4.5.2.1.3 PCR Aninhada (Oligonucleotídeos GP5+/GP6+)................................ 3.4.5.3 Reação de Sequenciamento............................................................... 3.4.5.4 Precipitação do Produto da Reacão de Sequenciamento................... 3.4.5.5 Eletroforese para Sequenciamento..................................................... 3.4.5.6 Alinhamento das Amostras Sequenciadas.......................................... 3.4.5.7 Análise das Sequências Nucleotídicas................................................ 3.4.6 Análise Citológica........................... .................................................... 3.4.6.1 Produção de Esfregaços em Camada Delgada.................................. 3.4.6.2 Imunocitoquímica para a p16INK4a ....................................................... 3.4.7 Análise Histológica.............................................................................. 3.4.7.1 Histologia Convencional...................................................................... 3.4.7.2 Imunoistoquímica para a p16INK4a........................................................ 3.5 Plano de Coleta de Dados................................................................... 3.5.1 Resultados da Imunocitoquímica para a p16INK4a ............................... 3.5.2 Resultado do Exame Histopatológico.................................................. 3.5.3 Resultado da Imunoistoquímica para a p16INK4a.................................. 3.5.4 Resultado da PCR-HPV...................................................................... 3.6 Análise dos Resultados....................................................................... 3.6.1 Estudo da Variabilidade Interobservadores......................................... 3.6.2 Estudo de Prevalência......................................................................... 3.6.3 Estudo Imunocitoquímico da Proteína p16INK4a .................................. 3.6.4 Estudo Imunoistoquímico da Proteína p16INK4a .................................. 46 47 47 47 47 47 47 48 48 48 48 50 51 51 52 52 52 53 53 54 54 55 55 55 56 56 56 57 57 58 59 59 59 59 59 59 60 60 61 62 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 63 Interobserver variability in the diagnosis of anal cancer precursor 4.1 lesions: a study of the commoner scenario…………………………….. 64 Anal cancer precursor lesions in HIV-positive and HIV-negative 4.2 patients seen at a tertiary health institution in Brazil………………….. 88 Performance of p16INK4a immunocytochemistry as a marker of anal 4.3 squamous intraepithelial lesions………………………………………… 112 xvi p16INK4a immunohistochemistry as a marker of anal cancer precursor lesions in HIV positive patients………………………………………….. 139 5 CONCLUSÕES................................................................................................... 159 4.4 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 161 7 ANEXOS............................................................................................................. 7.1 A – Equipe Científica de Apoio ao Desenvolvimento do Projeto de Tese.................................................................................................... 7.2 B – Cronograma de Execução Física.................................................. 7.3 C – Orçamento.................................................................................... 7.4 D – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.............................. 7.5 E – Protocolo de Estudo...................................................................... 7.6 F – Requisição de Exame Histológico/anoscopia com magnificação de imagem........................................................................................... 7.7 G – Técnica de Produção de Esfregaço de Camada Delgada (Synermed®)........................................................................................ 7.8 H – Resultado de Exame Histopatológico........................................... 7.9 I – Medidas de Validação Diagnóstica................................................. 7.10 J – Protocolo de Coloração Imunocitoquímica da p16INK4a................. 7.11 K – Protocolo de Coloração Imunoistoquímica da p16INK4a................. 7.12 L – Certificado de Aprovação de Projeto de Pesquisa (CEP/FMT-AM - 1768/2006)........................................................................................ 7.13 M – Certificado de Aprovação de Projeto de Pesquisa (CEP/FMTAM - 1769/2006) ................................................................................. 7.14 N – Instructions to Authors – Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões............................................................................................. 7.15 O – Instructions to Authors – Acta Cirúrgica Brasileira……………….. 7.16 P – Guidelines for Authors – Journal of Histochemistry & Cytochemistry……………………………………………………………... 7.17 Q – Instructions to Authors – Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical................................................................................ 175 175 177 178 181 182 183 184 186 187 188 189 190 191 192 196 205 217 1 1 INTRODUÇÃO No decorrer dos últimos 30 – 40 anos o câncer anal vem apresentando uma mudança em seu perfil epidemiológico. Tida outrora como rara, a afecção passou a ser observada com maior frequência em determinados estratos populacionais descritos como de risco para o seu desenvolvimento.1 Esta mudança epidemiológica refletiu-se num interesse aumentado em se querer descobrir as origens e as implicações desta alteração, que vem redundando num maior conhecimento a respeito das causas da doença, de sua história natural, de suas abordagens diagnóstica e terapêutica e de sua prevenção. Reflexo disso é a grande produção científica existente na literatura médica, a respeito do assunto, nos últimos anos. 2-15 Doença de evolução arrastada que pode levar muitos anos para produzir sintomas que impliquem em sua detecção, possui um grande potencial de cura, se descoberta a tempo, e mais ainda, pode ser evitada através de medidas diagnósticas que a surpreendam precocemente e possibilitem sua erradicação no estágio pré-maligno. 8,16,17 1.1. O Câncer anal - Particularidades 1.1.1 Aspectos Anatômicos O ânus é o orifício de saída do tubo digestivo para o meio externo. O reto (a porção terminal do tubo digestivo), em seu trajeto em direção ao ânus, é estreitado por um tubo muscular que o envolve e aperta como se fora um anel de guardanapo. Este tubo muscular é composto, grosso modo, pelos esfíncteres interno e externo do ânus e pelo músculo puborretal, que, abraçando circunferencialmente o reto em sua passagem para o exterior, provocam a formação de um canal. Em indivíduos adultos, o canal anal possui cerca de 4 cm de extensão. Está delimitado, cranialmente, pelo anel anorretal (formado pelo músculo puborretal) e, caudalmente, pelo rebordo anal (orifício anal, ou ânus). Estes limites são também os do início e fim do músculo esfíncter interno anal em peças anatômicas2,18 (Figura 1) 2 Figura 1 – Canal anal: gráfico de corte sagital. O canal anal estende-se do início ao fim do músculo esfínter interno do ânus.19 Internamente, o canal anal é revestido, em seu segmento cranial, por mucosa retal (epitélio colunar simples) e, em sua porção caudal, por pele modificada (epitélio pavimentoso estratificado desprovido de apêndices epidérmicos). Tais dois tipos diferentes de tecidos epiteliais encontram-se, na porção média do canal, numa região em que o marco anatômico macroscópico mais evidente é a linha das válvulas anais (linha pectínea ou denteada). A transição microscópica entre epitélio colunar, cranial, e epitélio pavimentoso, caudal, entretanto, não é feita de forma abrupta, na linha denteada. Ela se processa numa faixa que compreende a região que se situa cerca de 6 mm abaixo da linha denteada até, em alguns casos, 2 cm acima dela. Tal faixa de transição foi denominada por Fenger zona de transição anal (ZTA).18-20 (Figura 2) Figura 2 – A zona de transição anal estende-se desde 2 cm acima da linha pectínea até 0,6 cm abaixo dela, segundo as descrições de Fenger.19 3 Na ZTA os componentes celulares distribuem-se em quatro a nove camadas sobrepostas, sendo constituídos por células basais, colunares, cuboidais e pavimentosas. A ZTA deriva da cloaca embrionária e separa a mucosa retal do epitélio escamoso do canal anal. Na área da ZTA pode-se observar, por exemplo, células escamosas (pavimentosas) em locais cranialmente dispostos em relação à linha pectínea, onde não deveriam existir outros tipos de células senão as colunares, próprias do epitélio glandular retal.1,19 Do rebordo anal para fora, observa-se pele idêntica à de outras regiões hirsutas do corpo, sendo a faixa de pele perianal que se estende circunferencialmente, num raio de 5 cm, tendo o ânus como seu ponto central, denominada margem anal.21 Segundo a Organização Mundial de Saúde, a classificação histológica dos tumores da margem anal é idêntica à dos tumores de pele e, dentre os tumores malignos originados ou predominantemente situados no canal anal, o mais comumente observado (mais de 80% dos casos) é o carcinoma epidermóide (ou de células escamosas, ou espinocelular - CEC).10 Sendo, então, a ZTA composta como descrito, um CEC pode iniciar-se num território anatômico onde deveria se esperar apenas o crescimento de tumores malignos de outras linhagens histológicas, como os adenocarcinomas, que são os tumores mais frequentemente observados no reto.1 1.1.2 O Carcinoma Epidermóide Anal O CEC do canal anal é três a cinco vezes mais freqüente do que o CEC da margem anal. Oitenta e cinco por cento dos cânceres anais desenvolvemse entre o anel anorretal e o rebordo anal (limites do canal anal). Em mulheres, são mais freqüentes os cânceres do canal anal (3:2), ao passo que em homens são os da margem anal os mais comumente observados (4:1). 1,17 4 Apesar de raro na população geral (incidência de 0,7 a 2,0/100.000 habitantes) e em comparação com os outros tumores do intestino grosso (cerca de 4% apenas),22-24 o câncer anal tem apresentado incidências significativas em indivíduos pertencentes a grupos (ou com comportamentos) de risco para a doença.14 São considerados fatores de risco para o câncer anal: história de radioterapia perineal; presença de fístula anal crônica; presença de doença de Crohn anorretal; tabagismo; teste de papanicolaou cervical (pap-c) positivo para suspeita de lesão intraepitelial escamosa cervical (CSIL); história de carcinoma do colo do útero; doença de Hodgkin; história de transplante renal; promiscuidade; infecção pelo vírus do herpes simples 2 (HSV); infecção pelo vírus da imunodeficiência humana adquirida (HIV); homossexualidade masculina; sexo anal receptivo; imunossupressão; testes sorológicos positivos para sífilis, gonorréia e clamidíase; condiloma anal; e adição a drogas alucinógenas.1,7,8,14,22,25-30 Num dos grupos com maior risco de desenvolvimento de câncer anal, os homens que fazem sexo com homens (HSH), a incidência da afecção aumentou de 35 casos/100.000 indivíduos para 70 casos/100.000 com o advento da epidemia de aids (década de 80 do século passado),31 mas, mais recentemente, foi observada em 137/100.000 indivíduos por ano, após o emprego mais alargado da terapia anti-retroviral de alta potência (HAART).32 Noutro grupo com elevada incidência da moléstia, os receptores de transplantes renais, há relatos de risco de desenvolvimento de câncer anal 10 a 100 vezes maior do que a população geral.24,33 O CEC anal vem sendo associado à infecção anogenital persistente causada pelo vírus do papiloma humano (HPV).10,14,34-36 5 1.1.2.1 O Vírus do Papiloma Humano O HPV é um vírus com tropismo epitelial (pele e mucosas) da família Papillomaviridae. Possui um capsídio não envelopado icosaédrico de 55 nm de diâmetro limitando um genoma circular de ácido desoxirribonucleico (DNA) de dupla hélice composto por cerca de 7.900 pares de bases. O genoma do HPV contém três regiões em que se situam genes que exercem funções precoces (E de early), tardias (L de late) e de regulação do DNA na preservação existencial do vírus. Os genes E mais estudados (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) codificam proteínas de mesmo nome que são voltadas para a preservação do DNA viral e transformação de células infectadas; os genes L (L1 e L2), por sua vez, codificam as proteínas estruturais do capsídio viral. (Figura 3)37 Figura 3 – Diagrama da estrutura circular do genoma do HPV. E1 a E7 – genes precoces; L1 e L2 – genes tardios; kbp – mil pares de base. FONTE: Lambert; Sugden, 2004.37 Mais de 200 genotipos diferentes do HPV já foram descritos, mas apenas cerca de 90 foram completamente sequenciados. Destes, somente 30 a 40 genótipos demonstram preferência pelo epitélio anogenital. 38-43 6 O HPV é espécie-específico e não cresce in vitro, mas tem sido estudado por meio de métodos moleculares, que dividiram suas cepas em três classes segundo a tendência de associação com casos de neoplasia anogenital: a classe que reúne tipos de HPV de alto risco (HR-HPV), a dos de risco intermediário (IR-HPV) e a dos de baixo risco (LR-HPV). Na região anal, assim como na cervical, os subtipos de baixo risco (principalmente 6 e 11) relacionam-se com o aparecimento de lesões condilomatosas anogenitais e a lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), enquanto as de risco intermediário (33, 35 e outros) e alto risco (principalmente 16 e 18) associamse a lesões intraepiteliais escamosas de alto grau (HSIL) e neoplasias malignas anogenitais.38,40,41,44 Na região anogenital, o HPV demonstra preferência por zonas de transição epitelial, com alto nível de transformação celular, que, no canal anal, é representada pela ZTA.45 Neste local, atinge a camada basal por meio de microlesões epiteliais.40,45,46 O vírus liga-se às células basais por meio das integrinas receptoras α6β1 e α6β4 nelas existentes, que intermedeiam sua penetração para o interior do citoplasma.47 Neste sentido e em outros o CEC anal guarda muita semelhança com o câncer cervical, pois ambos os cânceres desenvolvem-se predominantemente em zonas de transição celular escamocolunar, cuja origem embriológica é a mesma (cloaca embrionária); os cânceres que predominantemente se desenvolvem em ambas as regiões são de mesma linhagem histológica (CEC); e ambos são precedidos de lesões precursoras (lesões intraepiteliais escamosas).3,48-50 Como a maioria dos pacientes portadores de infecção anogenital pelo HPV não desenvolve câncer, o aparecimento da doença parece se dever a um somatório de fatores. A infecção promovida por um sorotipo viral de alto risco, muito embora pareça ser necessária para o desenvolvimento de câncer, não é suficiente. Há indícios que variantes genotípicas de determinados HR-HPV exerçam influência neste sentido, da mesma forma que a carga viral do HPV 7 infectante. Outra condição descrita como necessária ao desenvolvimento de neoplasia anogenital é a persistência da infecção pelo HPV, que costuma ocorrer principalmente em indivíduos com alguma forma de imunossupressão, uma vez que em pacientes imunocompetentes a infecção costuma ser depurada ao cabo de 2 anos.38 A eficácia da resposta imune do hospedeiro à agressão viral, principalmente dependente da imunidade celular, responde pela erradicação da infecção em pacientes imunocompetentes. Ocorre, nestes pacientes, uma acentuada resposta imune celular mediada principalmente por linfócitos TCD4, mas também, em certa medida, por células assassinas naturais e por linfócitos citotóxicos antígeno-específicos.38 A produção de anticorpos contra a proteína L1 do capsidio viral segue o desenvolvimento da resposta imune celular efetiva contra a presença do HPV, mas os níveis destes anticorpos parecem decrescer rapidamente após a erradicação da infecção. Em última instância, a infecção pelo HPV, diante da inoperância dos sistemas defensivos do hospedeiro acaba se tornando nãopermissiva à ação de suas defesas imunológicas quando ocorre integração viral ao genoma celular do hospedeiro.38 Em transplantados renais, pacientes que vivem sob regime constante de imunossupressão para evitar a rejeição do órgão transplantado, já se estimou ser necessário decorrer 84 a 112 meses após o transplante a fim de que haja maior possibilidade de surgimento de câncer anal em pacientes com infecção anal continuada pelo HPV. Neles, as drogas imunossupressoras interferem de formas diferentes na resposta celular imune que normalmente se desenvolve após o transplante alogênico.30,51 Em pacientes HIV-positivos, por razões semelhantes, mas por vias diversas, também ocorre especial risco para o desenvolvimento do câncer anal.52,53 8 1.1.2.1.1 Câncer Anal e Interação entre HIV e HPV O HIV é um vírus da família Retroviridae, subfamília Lentivirinae, gênero Lentivirus com genoma de ácido ribonucléico (RNA) que necessita, para multiplicar-se, da enzima transcriptase reversa, responsável pela transcrição do RNA viral para uma cópia DNA, que pode então integrar-se ao genoma do hospedeiro (Figura 4).54 Figura 4 – Diagrama do vírion do HIV. A glicoproteína gp120 está associada à glicoproteína gp41 e ambas formam projeções no envelope lipídico do vírion. A proteína matricial p17 reveste internamente o envelope viral. As proteínas do capsídio p6 e p24 constituem a capa do centro (core) viral de formato cônico. A estrutura nucleóide do vírus é formada pelas proteínas p7, protease, integrase e transcriptase reversa e por duas fitas de RNA.54 O HIV costuma infectar células que possuem o receptor transmembrana CD4 (proteína de 54 kDa existente em abundância em linfócitos T imaturos e linfócitos T auxiliares e, em menor quantidade, em monócitos, macrófagos e células dendríticas apresentadoras de antígenos).54 9 As partículas virais acoplam-se à proteína CD4 e co-receptores existentes na membrana da célula hospedeira por meio do complexo protéico ligante gp120/gp41 constituinte do envelope viral. Outras proteínas de membrana celular também podem ligar-se ao ligante viral. É o caso da lectina tipo-C existente na superfície de células dendríticas. Ocorre então, de uma forma ou de outra, fusão do envelope viral com a membrana da célula a ser infectada e o conteúdo viral (core) é introduzido na célula hospedeira por ação da enzima viral protease.54 Por ação de outra enzima viral, a transcriptase reversa, o RNA viral é copiado e transformado em DNA viral de dupla fita. A enzima viral integrase insere a cópia do DNA viral no núcleo da célula infectada e integra o DNA viral ao genoma da célula hospedeira. Uma vez integrado, o DNA viral permanece associado ao material genético do hospedeiro durante todo o período de vida da célula hospedeira.54 O HIV explora o maquinário de transcrição e tradução da célula hospedeira para gerar seus próprios produtos virais (entre eles a proteína reguladora tat) e RNA viral é novamente produzido e enviado do núcleo para o citoplasma da célula hospedeira onde os ribossomas produzem dele as cadeias protéicas virais. Duas cópias de RNA viral e as cadeias de proteínas virais são reunidas e enviadas para a membrana celular, onde, por brotamento, são envelopadas e liberadas da célula hospedeira como um novo vírion imaturo. A protease viral termina por maturar os vírions liberados e os mesmos são capazes de infectar novas células.54 As células infectadas pelo HIV sofrem um processo de deterioração funcional que acaba em sua destruição acelerada, motivo do estado de imunossupressão que se desenvolve nos pacientes infectados pelo vírus. Tal imunoincompetência é tida como fator de risco reconhecido para o desenvolvimento do câncer anal e de suas lesões precursoras, considerando as similaridades existentes entre o câncer anal e o cervical.38 10 O câncer do colo de útero constitui-se numa condição clínica definidora de aids segundo a classificação do Centers of Disease Control, enquanto que a displasia cervical é classificada como condição em estágio B na evolução da doença causada pelo HIV. O estado de imunossupressão e interações virais têm sido responsabilizados por este tipo de evolução em pacientes HIVpositivas.38,55,56 Por outro lado, apesar de não ser doença definidora de aids, reconhecese, atualmente, que a maioria dos casos de câncer anal é encontrada em pacientes HIV-positivos57 e que, neles, a associação com a presença detectada de DNA de HPV nos espécimes histopatológicos de câncer chega a 100% dos casos de lesões de canal anal.58 Não parece ser apenas a diminuição quantitativa e qualitativa de linfócitos TCD4 circulantes o motivo desta maior propensão para o desenvolvimento de câncer anogenital em pacientes HIV-positivos, uma vez que o HIV e o HPV infectam células diversas (enquanto o HPV infecta células epiteliais, o HIV infecta linfócitos infiltrantes e células apresentadoras de antígeno). Há indícios de haver interações virais promovidas por fatores solúveis como citocinas e fatores de crescimento assim como proteínas transativadoras virais como a tat, que possivelmente alteram a transcrição viral do HPV, a replicação viral do HIV e a imunidade local.38 A proteína tat do HIV é essencial para a transcrição e replicação do vírus, mas, como também é secretada de células infectadas pelo HIV, pode exercer ações sobre células vizinhas. Em células infectadas pelo HPV, amplia a expressão das proteínas papilomavirais E6 e E7, inativando, por consequência, as proteínas supressoras tumorais p53 e pRb. O resultado destas ações é o aumento da proliferação de células infectadas pelo HPV.56 Em pacientes HIV-positivos, a HAART tem promovido sobrevidas cada vez mais prolongadas e o câncer anal, outrora raro nestes pacientes simplesmente porque não viviam o suficiente, passou a ser observado em proporções significativas. Sendo assim, apesar do aumento dos índices 11 laboratoriais de imunocompetência proporcionados pela HAART, a terapia não tem demonstrado conferir proteção contra a infecção anogenital prolongada pelo HPV, de tal forma que a incidência de câncer anal em HSH-HIV-positivos, grupo populacional que apresenta maior perigo de desenvolver a doença, vem aumentando nos últimos 13 anos.15,59 A ação direta da proteína tat sobre células HPV-infectadas pode explicar esta inoperância da HAART em reduzir os riscos de desenvolvimento do câncer anal em pacientes HIV-positivos que recuperaram índices laboratoriais de imunocompetência.56 Embora poucos, devido à dificuldade operacional para sua realização, há relatos convincentes publicados na literatura de que o câncer anal evolui de lesões precursoras não adequadamente tratadas em pacientes persistentemente imunodeprimidos.13,58,60-63 1.1.3 Lesões Precursoras do Câncer Anal Indícios de que o câncer anal evolui de lesões precursoras iniciaram-se com o relato de Fenger e Nielsen, em 1981, que encontraram displasia escamosa em 2,3% de 306 espécimes retirados do canal anal em procedimentos cirúrgicos proctológicos para o tratamento de doenças benignas. Na época, aconselharam que todo e qualquer espécime anal retirado devesse ser submetido a estudo histopatológico.64 Em 1985, McCance et al. relataram a presença de neoplasia intraepitelial multifocal em 5 mulheres e sua associação com a presença de HPV tipos 6 e 16. Das 5 mulheres, duas apresentaram, além de lesões cervicais e vulvares, lesões descritas como sendo intraepiteliais retais. Uma das duas mulheres com lesões “retais” apresentava neoplasia intraepitelial acentuada com presença de DNA de HPV-16 conforme detecção pelo método da hibridização in situ. Apesar de terem sido os primeiros autores a fazer referência à presença de neoplasia intraepitelial de características semelhantes às cervicais, vaginais e vulvares na região perianal e no “reto” não fizeram maiores considerações em relação ao achado.65 12 Fenger e Nielsen, em 1986, investigaram 139 espécimes de amputações abdominoperineais do reto e encontraram displasia escamosa acentuada e carcinoma in situ em 13 de 16 espécimes de canal anal contendo variantes de carcinoma epidermóide. Em todos os 10 casos com carcinoma escamoso usual (dos 16 com câncer anal que encontraram) foram observadas lesões préneoplásicas. Tais lesões foram encontradas ou nas bordas das malignas ou em locais próximos das mesmas, mas separados por epitélio normal, como se fossem lesões satélites. O estudo concluiu existir uma forte associação entre lesões pré-malignas e carcinoma anal invasivo e que esta associação não incidental ocorreu mais frequentemente na região da ZTA, onde as lesões tenderam a apresentar distribuição pontilhada.66 Mantendo sua linha de pesquisa, os autores relataram, também em 1986, ter encontrado 19 casos de lesões precursoras do câncer anal em dois anos de investigação em que todos os casos novos destas lesões observados na população da Dinamarca foram referenciados para seu serviço. Por terem enfrentado problemas na diferenciação entre displasia escamosa grave e carcinoma in situ, os investigadores classificaram morfologicamente os espécimes segundo o sistema empregado, na época, para lesões similares no colo do útero (neoplasias intraepiteliais cervicais ou NIC), denominando as lesões neoplasia intraepitelial do canal anal (NICA), e dividindo-as em 3 graus, assim como as NIC. Foram, então, os primeiros pesquisadores a utilizar a sigla NICA, mais tarde consagrada como NIA (neoplasia intraepitelial anal) para a descrição de lesões escamosas precursoras do câncer anal.2,67 A presença do vírus do papiloma humano em espécimes anais contendo lesão intraepitelial escamosa anal (ASIL) tem sido considerada comprovação de que as ASIL possuem a mesma origem etiológica que os CEC anais em que genótipos do virus são encontrados em prevalências que variam de 70 a 100% dos casos.36,50 Além da associação com HPV, da localização preferencial em zona de transição epitelial escamocolunar e das características morfológicas, outra semelhança observada entre as ASIL e as CSIL é que, enquanto lesões LSIL 13 anais possuem maior tendência a desaparecer com o passar dos anos, certo percentual de lesões HSIL pode evoluir para câncer, principalmente em indivíduos imunodeprimidos.15,51,61,62,68 Scholefield, Castle e Watson (2005) descreveram o aparecimento de CEC anal em 3 de 35 pacientes com NIA-III acompanhados em seu serviço ao longo de um período que variou de 14 a 120 meses. Os cânceres ocorreram, todos eles, em pacientes que apresentavam alguma forma de imunossupressão sistêmica, muito embora nenhum dos 35 pacientes acompanhados fosse HIV-positivo. Nenhum paciente considerado imunocompetente apresentou câncer no período de observação, mesmo aqueles portadores de NIA-III multifocal.61 Em pacientes HIV-positivos, o grupo de pesquisadores da Universidade da Califórnia, em São Francisco, afirma ter observado claramente a evolução para câncer de lesões NIA-II ou NIA-III.60 Em pôster apresentado na 16ª Conferência sobre Retrovirus e Infecções Oportunísticas, ocorrida em Montreal, no Canadá, em 2009, o grupo do Dr. Joel Palefsky relata ter observado 65 cânceres anais em cerca de 1700 HSH HIV-positivos numa revisão que fizeram dos pacientes acompanhados em seu serviço, de 1997 a 2007. Em 27 destes 65 pacientes pacientes com câncer houve possibilidade de resgatar dados históricos que relacionaram o desenvolvimento de câncer no exato local onde outrora havia sido diagnosticada uma HSIL. Os cânceres eram de canal anal em 17 pacientes, perianais em 7 e metacrônicos em 3 pacientes. O tempo médio de progressão para câncer foi de 47,1 meses após o primeiro diagnóstico de HSIL, mas não se conseguiu determinar por quanto tempo o paciente apresentava HSIL antes do primeiro diagnóstico da lesão.63 Entretanto, em trabalho anterior do mesmo grupo, foi estimado que cerca de 49% de HSH-HIV-positivos teriam desenvolvido HSIL se fossem acompanhados rigorosamente por 4 anos.31 Sobhani e colaboradores descreveram o desenvolvimento de câncer anal em 3,5% (7/199) dos pacientes que haviam tratado de condiloma do canal anal entre 1993 e 2002 e que apresentavam displasia anal de alto grau. Os 14 cânceres surgiram principalmente em pacientes HIV-positivos (6/7) após um intervalo de 13 a 108 meses. Relataram que os cânceres desenvolveram-se naqueles pacientes que apresentaram baixa densidade de células de Langerhans no epitélio anal.13 Watson e colaboradores observaram progressão para câncer anal em 8 pacientes de 55 (14,5%) encaminhados para seu serviço em virtude do diagnóstico de NIA-II ou NIA-III. O tempo de evolução do estágio de prémalignidade para o de câncer foi de em média 42 meses. Não ficou claro se a evolução maligna ocorreu em pacientes imunossuprimidos.62 Mais recentemente, Kreuter e colaboradores relataram que, dentre 446 HSH HIV-positivos estudados, cinco pacientes desenvolveram câncer anal após terem recusado tratamento de HSIL. O tempo médio de evolução para câncer nos pacientes com HSIL foi de 8,6 meses, mas não se sabia há quanto tempo os pacientes eram portadores de HSIL antes de entrarem no estudo. Os autores também relataram que, nos pacientes que submeteram a quimiorradioterapia para tratamento de câncer do canal anal, a ocorrência de efeitos colaterais do tratamento, recidivas precoces e mortalidade foi significativa. Concluíram que, diante das evidências de que o câncer anal pode ser prevenido com o tratamento de suas lesões precursoras, uma conduta voltada para o diagnóstico precoce destas lesões deveria ser implementada em pacientes sob maior risco de desenvolver o câncer anal.58 Para a prevenção do câncer do colo uterino, a detecção precoce de degenerações celulares causadas pela presença do HPV está bem firmada, sendo o pap-c exame amplamente utilizado como método de detecção precoce de lesões cervicais pré-cancerosas. Sua utilização, aliada à realização de biópsias cervicais monitoradas pela colposcopia, foi responsável pela diminuição da incidência do cancer do colo uterino, nos Estados Unidos da América do Norte, de 40 casos/100.000 mulheres, em 1940, antes do advento do pap-c, para 7,3 casos/100.000 mulheres, atualmente.69-73 15 Devido, então, às semelhanças que apresenta com o câncer cervical, a prevenção do câncer anal também tem sido realizada por meio dos mesmos exames utilizados para a detecção de lesões precursoras do colo do útero. A hipótese por trás dessa conduta é que por apresentarem história natural considerada semelhante, espera-se que os mesmos exames responsáveis por condutas que levaram à diminuição da incidência de CSIL provocarão redução semelhante na incidência de ASIL em grupos populacionais de risco. 16,33,68,74-76. Decorreu disso o surgimento de vários estudos destinados a avaliar métodos de detecção destas lesões anais e compará-los com os classicamente utilizados para as lesões cervicais.75,77-86 1.1.4 Exames para o Diagnóstico das Lesões Precursoras do Câncer Anal 1.1.4.1 Citologia Anal Oncótica A citologia anal oncótica, ou Papanicolaou anal (pap-a), exame essencialmente idêntico ao pap-c,87,88 tem sido preconizada como método de massa para a detecção precoce do câncer anal, pela sua simplicidade de execução e pelo seu baixo custo.22,75,89 Quando inicialmente realizada, a coleta citológica anal o foi através da luz de anoscópios por meio do emprego de espátulas de madeira,90,91 material que foi logo substituído por suabes de algodão umedecidos, considerados superiores às espátulas por proporcionarem esfregaços com menor distorção por dessecamento.92 A coleta através da luz do anoscópio logo foi abandonada em favor da coleta às cegas, pois se percebeu que a geléia lubrificante necessária para a introdução do anoscópio no canal anal aderia ao material de coleta e diminuía o número de células que o material conseguia recuperar, sendo os esfregaços resultantes paucicelulares.93 16 A propósito da realização de esfregaços celulares anais satisfatórios, desde o advento do emprego do pap-a como recurso diagnóstico na prevenção do câncer anal, observou-se que a técnica detinha certas diferenças com o pap-c que precisavam ser reconhecidas, entendidas ou corrigidas. 93 Além da contra-indicação do emprego de geléias lubrificantes ou medicamentosas no canal anal antes da coleta celular, observou-se que esfregaços anais podiam ser obscurecidos pela presença de debris fecais, pelos, sangue, muco e pus que podiam dificultar o exame microscópico. Observou-se, também, que a técnica de coleta celular precisava ser bem treinada até que se conseguisse uma produção consistente de esfregaços satisfatórios que diminuisse as dificuldades interpretativas dos citopatologistas. 93 O material de coleta, fosse ele a escova citológica ou suabes de algodão ou poliéster umedecidos, deveria ser introduzido cerca de 3 cm para o interior do canal anal até alcançar a ZTA. Nesta posição, deviam ser rodados 10 a 12 vezes e retirados num movimento em espiral exercendo-se leve pressão lateral sobre as paredes do canal.94 Realizada a coleta celular, ou o esfregaço deveria ser imediatamente realizado em lâmina microscópica e fixado em solução alcoólica (esfregaço convencional), ou a ponta do material de coleta quebrada ou agitada em frasco contendo meio líquido de preservação celular para a realização de esfregaços segundo algumas técnicas proprietárias (p. ex.: ThinPrep®, SurePath®, GluCyte®).94 Os defensores das técnicas de citologia em meio líquido (CML) na análise de espécimes anais argumentam que os processos de preparo de esfregaços das mesmas depuram-nos de debris fecais, de células inflamatórias e de um número excessivo de bactérias. Da mesma forma, apregoam que, na CML, as células do esfregaço são mais bem preservadas e não ocorrem artefatos por dessecamento. Tais vantagens são reputadas como valiosas no reconhecimento de células anormais em espécimes anais que, limpos dessas impurezas, seriam mais bem avaliados.95 Ocorre, entretanto, que, pelo menos em relação à citologia cervical, uma revisão sistemática bem conduzida não 17 conseguiu encontrar vantagens na produção diagnóstica de citopatologistas comparando leituras feitas em esfregaços convencionais e as feitas com CML.96 Não há trabalho de revisão semelhante em relação à citologia anal, mas há indícios de que em mãos experientes e se adequadamente realizados, os esfregaços convencionais podem produzir resultados semelhantes aos da CML quanto à capacidade diagnóstica.79 A classificação dos achados citológicos no pap-a segue a terminologia proposta pelo sistema de Bethesda de relatório de laudos de citologia cervical:87 negativo para ASIL ou neoplasia maligna, ASC-US (células escamosas atípicas de significado indeterminado), LSIL, ASC-H (células escamosas atípicas não podendo afastar lesão de alto grau), HSIL e carcinoma. Tal classificação foi concebida em reunião de consenso entre especialistas em citopatologia para contornar dificuldades diagnósticas que existiam na classificação antiga (mas ainda adotada em centros europeus) em que a displasia cervical recebia três graus de denominação: NIC I (neoplasia intraepitelial cervical grau 1), NIC II e NIC III. Por ser muitas vezes difícil estabelecer a diferença entre NIC I e NIC II, os casos NIC II, no sistema de Bethesda 2001, passaram a ser considerados, juntamente com casos NIC III, lesões intraepiteliais de alto grau.97 A avaliação das NIA, segundo os critérios de Bethesda, foi um desdobramento natural da conduta diagnóstica que se tem tomado em relação às lesões precursoras do câncer anal, que tem repetido o que é feito há mais tempo com sucesso em relação às CSIL.98 Entretanto, os índices publicados de especificidade e sensibilidade do pap-a, mesmo em espécimes avaliados pela CML e classificados pelos critérios do Sistema de Bethesda, variam muito na literatura,99 demonstrando haver necessidade de treinamento e conhecimento específicos a respeito das alterações citológicas que se busca encontrar e uniformidade de experiência tanto entre quem procede à coleta do material citológico, como entre citopatologistas.100 É um exame operador-dependente responsável por índices de precisão diagnóstica (variabilidade intra e interobservadores) que, por 18 vezes, têm ficado aquém do que se deveria esperar de um teste que se quer reputar como de rastreamento de massa realmente eficaz no diagnóstico precoce do câncer anal, principalmente na avaliação da população geral.83 Há indícios, em contrapartida, que, em grupos populacionais de risco, os índices de validade diagnóstica do método igualem os obtidos pelo pap-c no diagnóstico precoce do câncer cervical.16,22,77,78 Outro problema reconhecido em relação ao pap-a é sua incapacidade de prever o grau histológico de ASIL. Destarte, há recomendações atuais de que qualquer resultado não negativo do pap-a deva ser motivo de encaminhamento do paciente para a realização de biópsia dirigida pela anoscopia com magnificação de imagem.101 1.1.4.2 Anoscopia com Magnificação de Imagem (AMI) A AMI é realizada, a exemplo da colposcopia cervical, com o emprego de colposcópios que, dependendo do modelo, aumentam a resolução da imagem que se observa da região perianal e intra-anal de 6 a 70 vezes.86,102,103 Consegue-se, com a AMI, a visibilização diferenciada de lesões subclínicas HPV-produzidas com a aplicação tópica de solução fraca de ácido acético, que, ao causar coagulação reversível de proteínas nucleares, edemacia as células e torna as lesões subclínicas esbranquiçadas (acetobrancas) justamente porque apresentam uma concentração maior de células com núcleos de tamanho aumentado e, portanto, com maior conteúdo protéico (Figura 5).104 19 Figura 5 – Anoscopia magnificada (16X) demonstrando lesão acetobranca, às 7 h (seta), com diagnóstico histopatológico confirmado de lesão intraepitelial de baixo grau. Às 4 h, a lesão observada é condilomatosa. Os achados da colposcopia anal, como também é chamada a AMI, 105 na identificação de lesões precursoras do câncer anal tentam repetir os mesmos achados descritos para lesões semelhantes observadas no colo do útero.102,106,107 Considerado exame mais preciso do que o pap-a na capacidade de detecção de lesões precursoras do canal anal, a AMI falha por possuir baixos índices de especificidade,86,108 a exemplo da colposcopia cervical.109,110 Sua sensibilidade, no entanto, é mais elevada do que a da citologia e permite a realização monitorada de biópsias, estas sim consideradas até o presente como padrão-ouro para a definição de presença de lesão tecidual causada pelo HPV.109 A AMI é considerada exame cuja curva de aprendizado é longa e que apresenta desafios não observados na colposcopia cervical, sendo ainda realizada em poucos centros.93,111 A utilização associada do pap-a e da AMI tem apresentado bons índices de eficácia diagnóstica na detecção de lesões precursoras do câncer anal. Há 20 indícios de que ambos os métodos, quando empregados conjuntamente por profissionais experientes, bastam para definir a conduta a ser adotada num dado paciente, não havendo, por exemplo, necessidade de se determinar o tipo de HPV causador da lesão.16,84 Entretanto, por consistir em conduta invasiva que, não raro, implica na realização de biópsias, muitas vezes em pacientes que apresentam algum grau de imunodepressão, a utilização desta associação de testes diagnósticos tem sido confrontada com o emprego de métodos menos invasivos que sejam tentativamente acompanhados de índices de acurácia diagnóstica pelo menos semelhantes.67,112 1.1.4.3 Métodos de Detecção Biomolecular do HPV Como há evidências sólidas de que o câncer anal costuma estar associado à infecção anogenital crônica por HPV de alto risco, a determinação da presença de infecção anal pelo HPV e, mais ainda, a definição dos casos infectados por genótipos de HPV de alto risco tem sido feita como forma de detecção dos pacientes com maior risco de degeneração maligna. 35 Os exames biomoleculares mais utilizados têm sido a captura híbrida, a hibridização in situ e a reação em cadeia da polimerase.34,36 Entretanto, tem-se observado que apesar de haver uma tendência em se detectar a presença principalmente de HPV de alto risco em espécimes histopatológicos de casos de câncer anal, a detecção biomolecular de HPV em espécimes citológicos anais tem indicado existir infecção por múltiplos genótipos de HPV, provavelmente reflexo da natureza multifocal da infecção anal pelo vírus. Sendo assim, a detecção de infecção por HPV de baixo risco em raspado citológico anal não afastará a possibilidade de presença de neoplasia intraepitelial de alto grau ou de câncer anal num determinado paciente.36 21 Por outro lado, a detecção de HPV de alto risco num raspado anal, a exemplo do que se sabe em relação a exames biomoleculares cervicais, não discrimina se o paciente em questão é portador de infecção viral latente (sem presença de NIA), de infecção subclínica (com NIA assintomática) ou de infecção clinicamente evidente (com NIA ou câncer). Pacientes com infecções anais latentes pelo HPV não extrairiam benefício algum de abordagens invasivas para a realização de biópsias monitoradas pela AMI. 112 Da mesma forma, devido à reconhecida elevada prevalência de infecções anais pelo HPV na população sexualmente ativa, a detecção biomolecular do vírus em raspados anais não representa necessariamente a possibilidade da presença de ASIL, podendo simplesmente indicar a presença de infecções transitórias.84,113,114 1.1.4.4 Exame Histopatológico O exame padrão-ouro para a confirmação da presença de lesão precursora do câncer anal é a análise histopatológica de espécimes anais retirados de lesões suspeitas. Conforme seus congêneres cervicais, as NIA são classificadas em 3 graus de acordo com a altura do comprometimento displásico na espessura do epitélio anal. As NIA I apresentam alterações displásicas no 1/3 inferior do epitélio anal, as NIA II nos 2/3 inferiores e as NIA III em toda a espessura do epitélio.77,115 Para evitar os problemas de precisão diagnóstica intra e interobservadores que surgiram na interpretação das NIA, 98 as lesões histopatológicas, assim como as NIC, têm sido cada vez mais frequentemente classificadas em apenas dois graus, seguindo o proposto pelo sistema de Bethesda de interpretação de laudos citológicos relacionados à prevenção do câncer do colo uterino.87 Sendo assim, as NIA I passaram a ser denominadas LSIL e as NIA II e III HSIL.16,67,100,116 O diagnóstico histopatológico de ASIL baseia-se no achado de substituição de parte ou de todo o epitélio anal normal por células imaturas que 22 apresentam muitas das características de células basais. Tais alterações ocorrem na ausência de infiltrados inflamatórios e sem invasão da membrana basal. Observa-se perda da estratificação celular normal, polimorfismo nuclear e hipercromasia, aumento da celularidade com hiperpapilomatose associada com hiperacantose, presença de coilócitos (células com núcleos aumentados e irregulares, envoltos num halo claro, observadas nas camadas de maior diferenciação celular), de espessamento do epitélio escamoso e graus variados de desarranjo e atipias celulares, com ou sem figuras mitóticas atípicas.117-119 Enquanto as LSIL se caracterizam pela presença de coilócitos e de desarranjo celular sem figuras atípicas de mitose confinadas ao 1/3 inferior da espessura do epitélio anal, as HSIL são reconhecidas pela perda acentuada da maturação celular ordenada e da arquitetura do epitélio, aumento na razão núcleocitoplasmática e grande número de células atípicas em mitose, tudo localizado no 1/3 inferior do epitélio, mas estendendo-se também ao 1/3 médio e/ou ao superior da espessura epitelial anal.100,118 Mesmo sendo o padrão-ouro contra o qual todos os outros métodos de detecção da presença de lesões celulares ou tissulares indicativas de infecção pelo HPV devam ser comparados, o exame histopatológico de espécimes anais, até mesmo em casos de câncer, não é infalível, sendo sujeito a consideráveis índices de variabilidade interpretativa inter e intraobservadores, 9 não sendo diferente a imprecisão diagnóstica relacionada a casos de ASIL, principalmente nos graus mais inferiores da lesão (NIA I e NIA II),61, mas notável também em NIA III e sua diferenciação com câncer invasivo.67 Diante destas imperfeições diagnósticas e da necessidade de se estabelecer definitivamente se existe ou uma associação entre ASIL e câncer ou um padrão evolutivo entre uma afecção e outra, há ainda necessidade de se otimizar a metodologia de detecção das lesões teciduais provocadas pelo HPV e de surpreender, com segurança e precocemente, aqueles casos com maior potencial de malignidade.116 Decorrem destas incorreções diagnósticas dos testes mais comumente utilizados para a detecção do câncer anal e suas lesões precursoras iniciativas 23 em busca de marcadores que auxiliem na detecção dos casos sob maior risco de degeneração maligna. Neste sentido, com base em técnicas imunoquímicas realizadas para aumentar a capacidade diagnóstica de lesões sob suspeita de evolução para o câncer cervical,120,121 investigações têm sido empreendidas no sentido de avaliar o valor destes métodos no diagnóstico precoce do câncer anal, sendo a detecção imunoquímica de hiperexpressão da proteína p16 INK4a (ou simplesmenste p16) em espécimes anais com grande chance de infecção pelo HPV um exame que vem sendo investigado mais recentemente. 122-129 1.1.5 Detecção Imunoquímica da p16INK4a A detecção da hiperexpressão da proteína p16 INK4a tem sido observada em tecidos cervicais infectados por HPV de riscos intermediário e alto que expressam as oncoproteínas E6 e E7. A ligação e a inativação das proteínas supressoras tumorais p53 e pRb pelas oncoproteínas virais induzem a transformação e imortalização dos queratinócitos, base para a degeneração maligna de tecidos escamosos infectados pelo HPV.120 Nestes tecidos imortalizados, a proteína p16INK4a está hiperexpressada apesar de funcionalmente inativa. A detecção imunoquímica desta hiperexpressão é, então, sinal de lesão epitelial induzida por infecção causada por genótipos de HPV que mais se associam ao risco de câncer.123 1.1.5.1 Bases das Técnicas de Detecção Imunoquímica da Proteína p16INK4a 1.1.5.1.1 O Ciclo Celular Normalmente, as células de organismos eucarióticos, aqueles cujas células contêm núcleos bem definidos, são formadas, desenvolvem-se, dividem-se e perecem num constante ciclo de renovação com o fim de manter a integridade funcional e estrutural dos diversos tecidos que compõem. Antes de sofrer apoptose, a célula sofre um número determinado de divisões celulares para preservação tecidual. O período de atividade celular em que as 24 células replicam seu DNA, dividem-se e, depois de divididas, preparam-se para nova replicação de DNA é chamado de ciclo celular.130 O ciclo celular é composto de duas fases: a interfase e a mitose. 131 A interfase, o período mais longo do ciclo celular, compõe-se de três etapas: G1, S e G2. (Figura 6)131 Figura 6 – O ciclo celular de mamíferos. A interfase compreeende as fases G1, S (Síntese) e G2. Gap = intervalo. Adaptado de Bernards, 2009.132 Na G1, a célula cresce preparando-se para a replicação do DNA e seus centrossomos replicam-se. Nela, a célula revisa seu ambiente verificando se está pronta para a replicação do DNA. Se não estiver pronta, por algum motivo, a célula entra numa subfase chamada G0, em que o ciclo celular é interrompido. Quando a célula estiver preparada para a replicação do DNA, ela deixa o estágio G1, ou, antes dele, a subfase G0, e prossegue para o estágio S. 131 Na etapa de síntese (S) o DNA condensado nos cromossomos é replicado, a célula continua a crescer e ocorre a formação de várias proteínas necessárias para a síntese do DNA. Ao final da replicação do DNA, a célula 25 conterá o dobro do número normal de cromossomos, tornando-se pronta para entrar no estágio seguinte, o G2. 130,131 Em G2, a exemplo de G1, desenvolve-se um estágio intermediário no qual a célula procede a uma revisão para verificar se está pronta para prosseguir adiante no ciclo celular. Funciona como uma parada de segurança para verificação se todo seu DNA e outros componentes intracelulares foram adequadamente duplicados. É também a última chance que a célula tem para crescer antes de se dividir em duas células independentes, na mitose, a fase seguinte. 131 1.1.5.1.2 Controle do Ciclo Celular O ciclo celular é controlado por proteínas codificadas por genes que atuam em seus diversos estágios, de forma a preservar a normalidade do ambiente e da vida celular. Tais proteínas atuam para evitar a proliferação descontrolada das células e para regular a passagem de uma fase a outra do ciclo celular por meio de mecanismos de retroalimentação. 130,131 Uma classe dessas proteínas reguladoras do ciclo celular é a das quinases (ou cinases) dependentes de ciclinas (CDK). As CDK são componentes primordiais do sistema de controle do ciclo celular, exercendo sua ação ao adicionar grupos fosfatos a outras moléculas num processo denominado fosforilação. Para efetuarem tal ação, as CDK precisam ser ativadas por outra classe de proteínas, a das ciclinas. As ciclinas recebem este nome exatamente por atuarem ciclicamente durante a divisão celular, ora sendo sintetizadas, ora sendo degradadas. Ciclinas sintetizadas ligam-se às CDK, ativando-as, e, por meio da fosforilação de outras proteínas, induzem a célula a passar de uma fase a outra no ciclo celular. Após executarem esta ação, as ciclinas são degradadas, desativando as CDK, e um novo sinal é 26 transmitido à célula, agora para a finalização de uma determinada fase do ciclo celular.132,133 Há diferentes classes de ciclinas para os diversos estágios do ciclo celular, resultando em múltiplos complexos ciclina-CDK. As ciclinas da fase G1 ao ligarem-se com CDK específicas estimulam o ciclo celular para fazer a transição entre G1 e S. Quando a célula atinge um tamanho suficiente e o ambiente celular é considerado propício para a replicação do DNA as ciclinas começam a se degradar. A degradação das ciclinas da fase G1 provoca a inativação de suas CDK-alvos e a célula entra na fase S de seu ciclo. 130,133 (Figura 7) Figura 7 – Tipos de ciclina e suas expressões temporais. Ciclina D – expressada no início da fase G1; ciclina E – expressada no meio da fase G1; ciclina A – expressada na transição da fase G1 para a S; ciclina B – expressada nas fases G2 e M. Adaptado de Bernards, 2009.132 A ação das ciclinas e das CDK no ciclo celular ocorre por intermédio de alterações que estas proteínas promovem em outras proteínas. Dentre as ciclinas da fase G1, a ciclina D liga-se às CDK 4 e 6 e o complexo por elas 27 formado liga-se à proteína do retinoblastoma (pRb), provocando o início de sua fosforilação e consequente inativação. (Figura 8)132 Figura 8 – Ação das ciclinas complexadas com CDK sobre a proteína do retinoblastoma (pRb) nas diferentes fases do ciclo celular. A fosforilação da pRb, induzida pelo complexo Ciclina-D/CDK4, está associada à ativação do ciclo celular, promovendo a transição da fase G1 para a S. Adaptado de Bernards, 2009.132 A pRB, uma fosfoproteína supressora tumoral de 110 kDa, existente na maioria das células dos tecidos humanos, exerce sua ação captando o fator de transcrição celular E2F, inativando-o. O E2F livre estimula a célula a sair da fase G1 e entrar na fase S do ciclo celular. Quando ligado à pRb, o E2F perde sua capacidade de estimulação nuclear. A pRb hipofosforilada (com número reduzido de radicais fosfato acoplados) liga-se avidamente ao E2F não o deixando livre para estimular a síntese de DNA nuclear. Quando a pRb sofre ação, por acoplamento, do complexo ciclina-D/CDK4-6, começa a receber radicais fosfato e esta fosforilação inicial provoca a liberação do fator E2F, que poderá então desempenhar seu papel no ciclo celular. 130,132 (Figura 9) 28 Figura 9 – A adição de radicais fosfato à proteína do retinoblastoma (pRb), promovida pelo complexo Ciclina-CDK inativa a proteína, fazendo-a liberar o fator de transcrição nuclear E2F que, livre, induzirá a passagem do ciclo celular para a fase S, por meio da estimulação de mitógenos. Adaptado de Bernards, 2009.132 O ciclo de fosforilação da pRb é regulado por mecanismos de retroalimentação. Um desses mecanismos ocorre por meio de proteínas inibidoras das CDK (ou INK). Dentre as INK, a proteína p16INK4a é codificada por um gene supressor tumoral e recebe esta denominação por possuir 16 kDa de massa atômica e inibir a quinase dependente da ciclina 4 (e também a 6). Com as CDK4 e 6 inibidas, não haverá fosforilação da pRb e consequentemente o ciclo celular será mantido em repouso. Em células normais, entretanto, que precisam continuar seu curso de vida, ocorrem variações na expressão da p16, de forma a possibilitar a transição do ciclo celular do estágio G1 para o S.134 Findo o estágio da síntese, o fator E2F e a pRb fosforilada encontram-se com expressões aumentadas, o que redunda na estimulação dos genes que produzem a proteína p16INK4a. A p16INK4a então produzida inibe a ação das CDK4 e 6 e bloqueia a fosforilação da pRb. A pRb torna-se hipofosforilada e volta a captar avidamente o fator E2F livre que deixa de estar superexpressado no ambiente celular e deixa de estimular a passagem do ciclo celular da fase G1 para a S. Com o acúmulo de unidades do complexo pRb-E2F, ou, em 29 outras, palavras, da pRb hipofosforilada, ocorre diminuição da estimulação dos genes produtores da p16, e a proteína diminui a sua expressão, liberando a ação do complexo ciclina-D/CDK4-6 sobre a união pRb-E2F e a pRb é novamente fosforilada, com liberação do E2F e o ciclo celular volta a ser estimulado.134 O estímulo para a produção da p16INK4a provém da pRb funcionalmente inativa. Se a pRb deixar de ser funcional, e for constantemente fosforilada, estimulará o lócus gênico para a produção da p16.134 1.1.5.1.3 Interferência no Ciclo Celular Levando ao Câncer O câncer resulta de múltiplas alterações genéticas que controlam a proliferação celular (ciclo celular), a diferenciação celular ou a morte celular programada. Os genes que controlam essas ações podem ser, grosso modo, de duas classes: os oncogenes e os genes supressores tumorais. Os oncogenes são versões mutagênicas de genes que estimulam a proliferação celular continuada enquanto os genes supressores tumorais normalmente impedem a proliferação celular, mas costumam ser inativados em crescimentos neoplásicos.132 Considera-se que cânceres associados à infecção pelo papilomavírus humano (o câncer anal entre eles) se desenvolvem devido às ações dos oncogenes virais E6 e E7, que atuam, respectivamente, sobre as proteínas supressoras tumorais p53 e pRb, inativando-as.135 1.1.5.1.4 Ação do HPV em Tecidos Anogenitais Nas células da camada basal da ZTA, com alto poder de proliferação e diferenciação, após o contato com o HPV, a expressão dos genes virais inicialmente está reprimida. Com o passar do tempo, entretanto, os genes virais E5, E6 e E7 passam a atuar, resultando na proliferação das células infectadas, que se expandem lateralmente. À proporção que as células proliferadas da 30 camada basal vão se diferenciando migram para as camadas tegumentares mais superiores. Nesse ínterim, ocorre expressão dos genes virais L1 e L2, que codificam as proteínas estruturais do vírus e facilitam a replicação do genoma viral. Nas camadas superiores da epiderme ou da mucosa, partículas virais completas são por fim formadas e liberadas (Figura 10).45 Figura 10 – O ciclo de vida do papilomavírus humano. FONTE: Adaptado de zur Haunsen, 2002.45 Após a infecção anogenital inicial, o DNA do HPV normalmente é encontrado na forma epissomal (não integrada ao DNA da célula infectada), característica das lesões benignas HPV-produzidas. Por outro lado, nas malignas, o genoma viral rompe-se na região E1-E2, sofre deleção na sequência codificadora do gene 5 e integra-se ao DNA da célula infectada.41 Estes eventos levam à expressão aumentada dos oncogenes virais E6 e E7. As proteínas por eles codificadas são as mais frequentemente encontradas nos tumores malignos anogenitais causados pelo vírus.45 As oncoproteínas virais E6 e E7 agem sobre as proteínas supressoras tumorais p53 e do retinoblastoma (pRb), respectivamente. A proteína E6 degrada a p53 e a proteína proapoptótica BAK (Bcl2-antagonist killer), ativa a telomerase e inibe a degradação das cinases da família SRC (steroid receptor coactivators). A proteína E7 acopla-se à pRb (libertando o fator de transcrição E2F), inativando-a; desativa a proteína inibidora de cinases dependentes da ciclina p16INK4a, mas permite sua superexpressão; estimula os genes da fase S 31 do ciclo celular; bloqueia a função das proteínas p21 e p27 (também inibidoras de cinases dependentes da ciclina); e induz aneuploidia nas células em que ela está expressada ao causar amplificação centriolar.45 Os produtos virais E6 e E7 atuam sinergicamente, um protegendo o outro das incompletudes oncogênicas que possuem individualmente. A atuação da E6 pode ser comprometida pela presença da proteína p16 INK4a, mas a E7, apesar de ser responsável pela superexpressão de p16INK4a, desvia a inibição da E6 provocada pela p16INK4a ativando diretamente as ciclinas E e A, que também fosforilam a pRb em instantes diversos da fase G1 do ciclo celular. Este, então, é um artifício utilizado pelo HPV de alto risco, que invalida a ação inibidora da p16INK4a, tornando-a inócua, apesar de superexpressada em tecidos infectados por HPV de alto risco. A E6, por sua vez, impede a morte celular programada induzida pela E7 ao degradar as proteínas indutoras de apoptose p53 e BAK.45,122,123,125,136-138 1.1.5.1.5 A Proteína p16INK4a em Tecidos Infectados por HPV de Alto Risco A p16INK4a, um produto do gene CDKN2A, é uma inibidora das CDK4 e 6, que, em condições normais, impede a fosforilação da pRb e a liberação do fator de transcrição celular E2F. As células, sob estímulo da p16 INK4a, permanecem na fase G1 do ciclo celular e não seguem para a fase de síntese de DNA.134 Em tecidos infectados por HPV de alto risco, o oncogene viral E7 promove a inativação tanto da proteína p16INK4a como da função da pRb, estimulando as células infectadas a entrarem na fase S de seu ciclo de divisão celular após uma breve pausa no ponto de checagem G1. A ação do oncogene E7, ao mesmo tempo em que provoca aumento da expressão de uma pRb fosforilada não-funcional, que por mecanismo de feedback negativo causa a liberação de grandes quantidades de p16INK4a, promove diretamente a inativação da p16INK4a não deixando que a proteína, apesar de 32 superexpressada, bloqueie a ação do oncogene viral E6. Estão assim criadas as condições para a divisão celular irrefreável e para o crescimento neoplásico que dela redunda.45,140 Espécimes de carcinoma escamoso cervical e de lesões intraepiteliais cervicais de alto grau (HSIL) demonstram coloração imunoistoquímica intensa quando expostos a anticorpos anti-p16INK4a.136 Da mesma forma, há relatos de que o desenvolvimento de grande parte das lesões displásicas anais, por estar ligado ao aumento da expressão da proteína oncogênica viral E7, apresenta expressão aumentada de p16INK4a funcionalmente inativa, mas detectável por técnicas imunoquímicas. Sendo assim, o achado imunoquímico de hiperexpressão da p16INK4a em células e tecidos displásicos do epitélio anogenital refletiria a presença da proteína oncogênica E7 de HPV de alto risco.140,141 A p16INK4a, então, aparenta ser um biomarcador promissor, uma vez que sua expressão reflete a presença de cepas oncogênicas do HPV num ambiente em que o ciclo celular do hospedeiro sofreu desarranjo, ou seja, mais do que a simples presença de HR-HPV, a positividade imunoquímica da p16INK4a acusa a presença do desarranjo celular provocado pelo vírus de alto risco. No caso de tecidos cervicais, os dados atualmente existentes sugerem que a imunocoloração difusa para a p16INK4a, por meio do emprego de um anticorpo monoclonal anti-p16INK4a, tem demonstrado ser marcadora diagnóstica útil da presença de alterações celulares provocadas pela infecção por tipos oncogênicos do HPV, tanto em pacientes com neoplasia intraepitelial cervical (NIC) graus 2 e 3, como num subgrupo definido de pacientes com NIC1, cujo risco de evolução para graus mais acentuados de displasia passa a poder ser reconhecido.137 33 Compartilhando o câncer anal de muitas das características do câncer cervical, supôs-se que os achados celulares e teciduais observados em relação à p16INK4a pudessem ser também observados em esfregaços e espécimes de tecidos anais infectados por HPV de alto risco, sendo esta hipótese testada em trabalhos recentemente publicados na literatura.100,122-129,143,144 1.1.5.2 Princípios do Método de Processamento Imunoquímico de Espécimes Citológicos e Histológicos145-147 Em virtude de nos métodos imunoquímicos de detecção de proteínas celulares existirem múltiplas variáveis que devem ser conhecidas, entendidas e adequadamente tratadas, caso se queira proceder a reações confiáveis e bemsucedidas, proceder-se-á, a seguir, a um detalhamento dos princípios gerais que regem a realização de reações imunoquímicas em espécimes citológicos e histológicos. Para que uma determinada proteína possa ser detectada em amostras celulares e teciduais é necessário que o Ac. 1ário contra aquela determinada proteína tenha condições de ligar-se à mesma e que esta ligação seja revelada por meio de uma coloração específica. Para atingir este desiderato, as seguintes etapas de processamento imunoquímico devem ser cumpridas. 1.1.5.2.1 Soluções Utilizadas numa Reação Imunoquímica Para o processamento de reações imunoquímicas são necessárias as seguintes soluções para os respectivos fins a que se destinam: 1.1.5.2.1.1 Xilol P.A. (pureza analítica) – para desparafinização e desidratação de espécimes histológicos; 1.1.5.2.1.2 Álcool absoluto P.A. – para a formação de soluções em concentrações decrescentes utilizadas na hidratação de 34 espécimes, num sentido, e na desidratação, noutro. Também utilizado, em concentrações superiores a 95%, para a fixação de espécimes citológicos. 1.1.5.2.1.3 Água destilada – para hidratação de espécimes contidos em lâminas e lavagem dos mesmos para retirada de excesso de reagentes; 1.1.5.2.1.4 PBS 1X equilibrado em pH = 7,4 – solução tampão estabilizadora bioquímica do anticorpo que não agride o meio celular. O pH da solução deve ser equilibrado acima de 7,0 a fim de que os anticorpos não se descolem dos tecidos, podendo também auxiliar em evitar ligações inespecíficas do anticorpo. A solução de PBS 1X é preparada a partir de solução de PBS 20X (0,01 M). A solução 0,01 M de PBS é preparada com 160 g de cloreto de sódio P.A., 27,31 g de fosfato de sódio dibásico anidro P.A. (Na2HPO4) e 4,86 g de fosfato de sódio monobásico di-hidratado P.A. (NaH2PO4.2H2O) diluídos em água destilada completada para um volume de 1.000 ml. Os sais são inicialmente adicionados a 800 ml de água destilada e o pH é ajustado para 7,4 com o emprego de solução de HCl 1N e de NaOH 2N. Para formar 1 litro da solução de PBS 1X são adicionados 50 ml da solução de PBS 20 X (0,01 M) a 950 ml de água destilada. Antes de utilizar a solução de PBS 1X o pH deve ser novamente equilibrado para 7,4 com o auxílio de pH-âmetro e das soluções de HCL 1N e de NaOH 2N. 1.1.5.2.1.5 Citrato 0,01 M equilibrado em pH = 6,0 – para recuperação antigênica. Solução preparada com 2,1 g de ácido cítrico monoidratado P.A. (C6H8O7.H2O, P.M. = 210,1384) diluídos em 1.000 ml de água destilada (solução 0,01 M). O pH deve ser 35 equilibrado em 6,0 com a utilização de pH-âmetro e solução 2N de NaOH; 1.1.5.2.1.6 Triton X-100 (éter octil-fenil-polioxietileno) – solução surfactante utilizada como permeabilizante da membrana celular em reações imunocitoquímicas; 1.1.5.2.1.7 Leite desnatado 5% – para bloqueio da atividade da biotina endógena. Solução preparada com 5 g de leite em pó desnatado para cada 100 ml de PBS 1X; 1.1.5.2.1.8 Água oxigenada 3% (10 volumes) – para bloqueio da atividade da peroxidase endógena; 1.1.5.2.1.9 Anticorpo primário (Ac. 1ário) – para marcação da proteína que se deseja revelar. Utilizado em diluições diferentes para a imunoistoquímica e para a imunocitoquímica. Sintetisado em animais de laboratório (camundongo, por exemplo). 1.1.5.2.1.10 Anticorpo secundário biotinilado – para marcação do Ac. 1ário; 1.1.5.2.1.11 Streptavidina-peroxidase – para marcação do Ac. 2ário (Ac. 2ário); 1.1.5.2.1.12 Diaminobenzidina (DAB) – para revelação da reação antígenoanticorpo ao marcar a Streptavidina-peroxidase. A revelação ocorre pela coloração amarronzada própria do reagente DAB imprimida aos tecidos em que houve a reação antígeno-anticorpo. Preparada com 1 gota de DAB+ cromógeno diluída em 1 ml de tampão da solução de DAB+ cromógeno (peróxido de hidrogênio). 1.1.5.2.1.13 Hematoxilina de Harris – para proceder à contracoloração de células e tecidos que não foram corados pela técnica imunoquímica por não conterem expressão da proteína que se 36 deseja revelar. Preparada com 5 g de Hematoxilina P.A., 100 g de sulfato de alumínio e amônio (NH4Al(SO4)2·12H2O) P.A., 50 ml de álcool etílico a 95% e 2,5 g de óxido de mercúrio vermelho (HgO P.A.) para 1 litro de água destilada. 1.1.5.2.1.14 Meio de montagem (Enthelan) – para proceder à montagem da lâmina com lamínula. 1.1.5.2.2 Preparo do Espécime para a Recuperação Antigênica Logo após serem coletados, os espécimes são fixados a fim de que suas proteínas não se degradem. A substância utilizada para a fixação deve promover a preservação da morfologia e da imunorreatividade do espécime, prevenir a extração, a difusão e o deslocamento do antígeno e não deve interferir com as reações de recuperação antigênica. A técnica de recuperação antigênica do material biológico a ser submetido à coloração imunoquímica para a detecção de uma determinada proteína apresenta certas variações de acordo com a natureza do espécime e sua fixação. Espécimes citológicos previamente fixados em álcool 96% são reidratados em soluções alcoólicas progressivamente menos concentradas e, por fim, em água destilada. Espécimes histológicos, por sua vez, antes de serem igualmente reidratados, devem ser desparafinados em solução de xilol. Tais medidas são voltadas para a exposição da membrana celular de maneira que os próximos passos da reação imunoquímica permeiem o acesso do Ac. 1ário ao interior da célula. 1.1.5.2.3 Recuperação Antigênica A fixação de tecidos pela formalina produz ligações cruzadas inter e intramoleculares de pontes de metileno e de bases Schiff entre sítios antigênicos das proteínas tissulares, sendo responsável por coloração imunoquímica fraca ou falso-negativa de determinadas proteínas. Estes sítios antigênicos fixados são compostos de aminas, grupos amida, tióis, grupos 37 hidroxilas e anéis aromáticos cíclicos. Uma forma de executar a recuperação antigênica para possibilitar reações imunoquímicas é realizada pelo aquecimento do espécime a 95 – 100º C em solução tampão de citrato. O aquecimento do espécime quebra as ligações cruzadas das bases Schiff, que são mais fracas, enquanto o tampão citrato quela ou precipita cálcio em graus variados e remove o cálcio precipitado dos espécimes, quebrando as ligações de fixação permanentemente e revelando antígenos e epítopos, permitindo sua exposição à ação do Ac. 1ário. A fixação de esfregaços celulares com soluções alcoólicas, por outro lado, precipita proteínas pela destruição de ligações hidrofóbicas que mantêm coesa a conformação terciária das moléculas de proteína. As estruturas primária e secundária das proteínas são preservadas de maneira que as sequências aminoácidas, que funcionam como sítios antigênicos, são mantidas para reagirem com seus anticorpos. A recuperação antigênica de esfregaços celulares fixados em álcool 96% é feita mediante o aquecimento do espécime celular a 95 – 100 ºC em solução de tampão citrato 0,01 M com o surfactante Triton X-100, com pH equilibrado para 6,0, que remove a camada lipídica residual da membrana celular, que é permeada, e expõe antígenos intracelulares. Estes poderão entrar, então, em contato com o Ac. 1ário. 1.1.5.2.4 Bloqueio de Antígenos Inespecíficos Para o processamento imunoquímico de um espécime citológico ou histológico pelo método da streptavidina-biotina-peroxidase (SABP)* utiliza-se um Ac. 1ário não marcado, que reagirá unicamente com o antígeno tecidual ao qual é específico. Entretanto, para que esta ligação antígeno-anticorpo seja revelada, o método SABP utiliza um Ac. 2ário biotinilado (marcado com biotina), que se ligará ao Ac. 1ário, e uma solução de streptavidina conjugada com peroxidase, que se ligará avidamente à biotina do Ac. 2ário e exporá a * Outros métodos de processamento imunoquímico de espécimes histológicos e citológicos são o direto que utiliza anticorpo conjugado com marcador, o indireto que utiliza Ac. 1ário não marcado e um Ac. 2ário conjugado com marcador, e os métodos de anticorpos não marcados: o da ponte enzimática, o da peroxidase-antiperoxidase, o da biotina-avidina, o do conjugado avidina-biotina e os sistemas polivalentes. 38 peroxidase para reagir com o reagente de coloração DAB+ cromógeno (Figura 11). Figura 11 – Reação imunoquímica pelo método da Streptavidina-biotina-peroxidase. A reação compõe-se da cobertura sequencial do espécime citológico ou histológico com quatro reagentes. O anticorpo primário (Ac. 1ário) primeiramente adicionado liga-se ao antígeno específico no espécime. O anticorpo secundário (Ac. 2ário) biotinilado, a seguir, liga-se ao Ac. 1ário. Na sequência, a Streptavidina-peroxidase liga-se à biotina do Ac. 2ário. Por fim, a substância cromógena (diaminobenzidina) reage com a peroxidase e precipita-se no espécime, conferindo uma cor amarronzada ao local em que ocorreu a reação antígeno-anticorpo, que é, então, revelada. O processamento específico desta reação no sítio de ligação antígenoanticorpo primário depende do bloqueio da biotina e da peroxidase endógenas normalmente existentes na maioria dos tecidos orgânicos. Caso contrário, a streptavidina-peroxidase se ligará inespecificamente a sítios teciduais que contenham biotina, e não apenas à biotina do Ac. 2ário. Da mesma forma, a solução cromógena DAB+, se a peroxidase endógena não tiver sido bloqueada antes da adição do Ac. 2ário, não se ligará apenas à streptavidina-peroxidase, ocorrendo, então, coloração imunoquímica inespecífica, sendo responsável por resultados falso-positivos. A biotina endógena pode ser bloqueada imergindo-se o espécime em solução de leite desnatado e a peroxidase endógena costuma ser bloqueada imergindo-se o mesmo espécime em solução de água oxigenada a 3%. Com a biotina e a peroxidase endógenas bloqueadas, a eventual coloração imunoquímica positiva que redundar da aplicação do método SABP a 39 espécimes citológicos e histológicos revelará os locais onde tão-somente ocorreu a reação antígeno – Ac. 1ário que se desejava investigar. 1.1.5.2.5 Aplicação do Anticorpo Primário Tendo sido bloqueadas a biotina e a peroxidase endógenas, a reação imunoquímica prossegue com a aplicação do Ac. 1ário em diluições conhecidas. Tais diluições normalmente são obtidas depois de repetidas reações imunoquímicas-teste em diluições crescentes até se obter a maior diluição do Ac. 1ário que evite coloração de background (inespecífica), mas ainda assim promova colorações fortemente positivas na presença do antígeno que se quer revelar em tecidos sabidamente doentes (controles-positivos). A duração de aplicação do Ac. 1ário sobre o espécime varia de acordo com a sensibilidade e a concentração do Ac. 1ário, assim como com a qualidade do espécime a ser corado. O tempo de exposição do espécime ao Ac. 1ário também varia de acordo com a temperatura em que a reação se processa. Tempos menores são obtidos com temperaturas mais elevadas. É sempre imprescindível que se certifique que o Ac. 1ário aplicado sobre o espécime não desseque, logo as lâminas contendo os espécimes recobertos pela solução que contém o Ac. 1ário devem ser acondicionadas em câmaras umedecidas. A exposição do espécime ao Ac. 1ário por um período de 12 a 18 horas (overnight), à temperatura de 4 ºC (no refrigerador), permite que anticorpos primários possam ser utilizados em diluições maiores, reduzindo a incidência de coloração imunoquímica inespecífica. Possui vantagens econômicas, pois menos Ac. 1ário será utilizado em cada reação e haverá condições de se programar melhor o horário de trabalho dos profissionais envolvidos na execução do método. 40 1.1.5.2.6 Marcação do Anticorpo Primário Após a aplicação do Ac. 1ário, no método de coloração imunoquímica SABP, procede-se à sua marcação com o Ac. 2ário biotinilado. O Ac. 2ário conjugado com biotina liga-se especificamente ao Ac. 1ário e expõe a biotina com o qual é conjugado. A seguir, expõe-se o espécime à solução de streptavidina conjugada com peroxidase. A streptavidina desta solução ligar-se-á ávida e especificamente à biotina do Ac. 2ário, desde que a biotina endógena tenha sido bloqueada anteriormente. A peroxidase que ficará exposta, após esta reação Ac. 1ário – Ac. 2ário – streptavidina, deverá ser tão-somente a acoplada à streptavidina, desde que a peroxidase endógena tenha sido anteriormente bloqueada. 1.1.5.2.7 Revelação Imunoquímica dos Locais em que Ocorreu a Reação Antígeno-Anticorpo A revelação dos locais de reação antígeno-Ac. 1ário é feita cobrindo-se o espécime, que fora previamente coberto com a solução de streptavidinaperoxidase, com uma solução de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) diluída em peróxido de hidrogênio. Esta solução DAB é convertida pela peroxidase conjugada à streptavidina num produto insolúvel que se precipita e confere uma coloração amarronzada aos locais em que a enzima está presente, ou seja, revela os locais em que houve a reação antígeno-anticorpo. 1.1.5.2.8 Contracoloração e Montagem A etapa final do processo imunoquímico é a contracoloração para diferenciação citológica ou histológica das porções do espécime coradas pela reação imunoquímica daquelas que não revelam a ligação antígeno-anticorpo. Costuma-se utilizar uma solução fraca de hematoxilina (hematoxilina de Harris) 41 para promover a coloração nuclear sem interferir na visibilização da coloração imunoquímica. As lâminas microscópicas, depois de contracoradas, são recobertas com um meio de montagem (Enthelan) e cobertas com lamínulas. As lâminas assim montadas estarão prontas para leitura após secagem. 1.1.5.2.9 Controles Positivo e Negativo Todo berço de lâminas microscópicas contendo espécimes a serem submetidos a uma determinada reação imunoquímica deve conter uma lâmina contendo um espécime que sabidamente resultará em coloração imunoquímica positiva para a presença do antígeno que se quer detectar (controle positivo) assim como uma lâmina que não deverá se corar pelo método (controle negativo). A lâmina controle-negativo não deverá se corar na reação imunoquímica ou porque o espécime nela contido sabidamente não possui o antígeno que se procura revelar, ou porque, contendo sabidamente o antígeno, este não deverá ser revelado porque à lâmina não será aplicado o Ac. 1ário†. Os controles positivo e negativo são necessários para a comprovação da adequação de uma determinada reação imunoquímica. Caso o controle positivo não se core positivamente numa determinada reação imunoquímica ou o controle negativo se core, todas as lâminas desta reação deverão ser desprezadas, e a reação considerada inconfiável. Diante das imperfeições dos métodos mais atualmente empregados no diagnóstico precoce do câncer anal, a utilização de uma técnica com potencial † O anticorpo secundário é sintetizado de proteínas de um animal diferente do utilizado para a síntese do Ac. 1ário e contra epítopos protéicos deste animal. Logo, dirige-se especificamente a proteínas só existentes no Ac. 1ário. Na inexistência do Ac. 1ário, o Ac. 2ário não se ligará a proteína alguma do espécime humano ao qual foi aposto e será completamente lavado nas etapas preparatórias de revelação da reação antígeno – Ac. 1ário, devendo, neste caso, a reação resultar negativa. 42 para identificar, com segurança, aquelas lesões sob maior perigo de evolução para o câncer e que dirimisse dúvidas eventualmente enfrentadas com o emprego dos outros métodos, seria vantajosa no sentido de aumentar a acurácia deste exercício diagnóstico. Como a detecção de lesões precursoras do câncer anal em populações de risco está sendo realizada apenas recentemente em Manaus, acredita-se existir grande variabilidade diagnóstica entre os profissionais que se dedicam ao controle da doença. Este estudo foi, então, destinado a avaliar o desempenho da técnica de detecção imunoquímica da proteína p16 INK4a no diagnóstico acurado de ASIL em população sob grande risco para o desenvolvimento do câncer anal acompanhada em instituição de referência no atendimento de pacientes HIV-positivos, na cidade de Manaus. Foi desenhado para verificar as medidas de acurácia diagnóstica do método imunoquímico em comparação com exames tradicionalmente utilizados para a comprovação diagnóstica de ASIL e da presença de infecção por HR-HPV. 43 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Testar medidas de validação diagnóstica da imunoquímica para a proteína p16INK4a em espécimes citológicos e histológicos de pacientes HIV positivos, verificando a precisão diagnóstica do exame histopatológico de biópsias anais obtidas de pacientes sob risco de desenvolvimento de câncer anal atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. 2.2 Específicos 2.2.1 Observar a variabilidade interobservadores no diagnóstico histopatológico de neoplasias intraepiteliais anais e câncer anal na Gerência de Patologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas; 2.2.2 Estimar a prevalência de lesões intraepiteliais escamosas anais nos pacientes atendidos no Ambulatório de Coloproctologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas; 2.2.3 Calcular a sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo e negativo da técnica imunocitoquímica de detecção da p16INK4a no diagnóstico de lesões precursoras do câncer anal em indivíduos HIV-positivos; 2.2.4 Calcular a sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo e negativo da técnica imunoistoquímica de detecção da p16INK4a no diagnóstico de lesões precursoras do câncer anal em indivíduos HIV-positivos; 2.2.5 Examinar o poder de predição de infecção anal por HPV de alto risco em indivíduos HIV-positivos com imunocitoquímica positiva para a p16INK4a. 44 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Modelo de Estudo Trata-se (sensibilidade, de um estudo especificidade, transversal valores de preditivos análise positivo da validação e negativo) diagnóstica da imunoquímica para a proteína p16INK4a em espécimes citológicos e histológicos de pacientes HIV positivos como exame capaz de predizer a presença de lesões causadas pela infecção anal pelo HPV. Para tanto, amostras de células e tecidos anais foram obtidas e submetidas a processamento imunocitoquímico, imunoistoquímico e histológico. As lâminas microscópicas produzidas foram analisadas, sendo utilizados como padrões diagnósticos (padrões-ouro) a análise histológica e a genotipagem do HPV. Para corroborar os resultados imunoquímicos, procedeu-se a estudos de variabilidade diagnóstica dos exames histopatológicos anais e de prevalência de ASIL nos pacientes atendidos no Ambulatório de Coloproctologia da FMTAM O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-AM (Anexos L e M). 3.2 Universo de Estudo 3.2.1. População de Referência O estudo teve como alvo pacientes que procuraram a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM) para acompanhamento e tratamento assim como pacientes com queixas proctológicas que procuraram a especialidade de Coloproctologia no Ambulatório Araújo Lima (AAL) do Hospital Universitário Getúlio Vargas (HUGV) da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) para acompanhamento e tratamento. Para a FMT-AM converge a maioria dos casos de doenças infecciosas do Estado do Amazonas. A FMT-AM situa-se no bairro de D. Pedro, da cidade de Manaus. 45 Para o AAL aflui a maioria dos casos de doenças proctológicas do Estado do Amazonas, inclusive os encaminhados por Postos de Assistência Médica do Sistema Único de Saúde da cidade de Manaus para tratamento cirúrgico no HUGV. O AAL situa-se no bairro do Centro da cidade de Manaus. A cidade de Manaus, capital do Estado do Amazonas, está situada à margem esquerda do Rio Negro. Seu município abrange uma área terrestre de 11.401 km. Sua população é constituída de 1.644.690 habitantes que não ocupam uniformemente a sua superfície geográfica, concentrando-se em núcleos periféricos com saneamento básico pouco satisfatório.148 3.2.2 População de Estudo A população de estudo compôs-se de pacientes cadastrados no Programa DST/AIDS da FMT-AM, que procuraram os ambulatórios e o hospital da Fundação para acompanhamento e tratamento (no registro ativo do Programa DST/AIDS da FMT-AM constavam 2.476 pacientes à época da realização do atendimento dos pacientes). Constou também de um grupo de pacientes com doenças proctológicas, mas não pertencentes a grupos de risco para o desenvolvimento do câncer anal, referenciados à FMT-AM pelo AAL. 3.2.3 Participantes No período de janeiro de 2007 a dezembro de 2008 foram estudados todos os pacientes consecutivamente atendidos no ambulatório de Coloproctologia da FMT-AM. Dentre estes, nos HIV-positivos foram estudados os métodos imunoquímicos. 3.2.3.1 Tamanho da amostra Para um intervalo de confiança de 95%, com nível de significância de 5%, com maior erro aceitável de 5%, numa população estimada de 1.000 pacientes que procurariam ativamente a FMT-AM para tratamento e investigação de DST/aids, com prevalência estimada de ASIL de 60%, e adição de 10% a mais no número de pacientes calculados para reposição de perdas, 46 projetou-se inicialmente estudar 300 pacientes distribuídos em três grupos: 100 HSH/HIV+, 100 MHIV+ e 100 pacientes não pertencentes a grupos de risco para o câncer anal. Em virtude de dificuldades encontradas no recrutamento de pacientes para o estudo, que invibializariam sua consecução em tempo hábil, optou-se por adotar amostragem de conveniência, incluindo todos os pacientes consecutivamente atendidos no ambulatório de Coloproctolgia da FMT-AM, que resultou no atendimento de 399 pacientes aos quais foram aplicados critérios de exclusão. 3.2.3.2 Critérios de Inclusão e Exclusão 3.2.3.1.1 Inclusão Todos os pacientes consecutivamente atendidos no ambulatório de Coloproctologia da FMT-AM 3.2.3.1.2 Exclusão Pacientes menores de 18 anos de idade, exclusive; Pacientes especiais; Pacientes indígenas; Pacientes que não cumpriram qualquer das etapas do exame proctológico e das coletas de material; Pacientes com as seguintes análises à histologia anal: o Lâmina danificada; o Lâmina com amostra tecidual exígua; o Ausência ou erro de identificação na lâmina; o Espécimes ou lâminas extraviados. Pacientes com as seguintes análises à imunocitoquímica anal: o Lâmina danificada, extraviada, ou com ausência/erro de identificação. 47 3.3 Instrumentos de Coleta 3.3.1 Escova Citológica Para a coleta de material celular anal para a realização de exame imunocitoquímico em esfregaços convencionais e feitos pela técnica de CML e para a realização de genotipagem de HPV por PCR. 3.3.2 Colposcópio Colposcópio com aumento de imagem de 16X na distância focal de 30 cm, como anoscópio de magnificação de imagem. 3.3.3 Pinça de Biópsia Prof. Medina Para a realização de biópsias anais. 3.3.4 Protocolos de Coleta de Dados da Anoscopia com Magnificação de Imagem e de Histopatologia Para coleta de informações a respeito da AMI foi utilizado o protocolo constante do Anexo F, que ilustra o formulário Requisição de Exame Histopatológico - Anoscopia com Magnificação. Os laudos histopatológicos das biópsias realizadas por ocasião das AMI foram emitidos no formulário constante do Anexo H. 3.3.5 Protocolos de Estudo Os dados de identificação social e demográfica dos pacientes bem como os relativos aos resultados lançados nos prontuários dos pacientes e nos formulários citados no item 3.3.4 foram compilados no Protocolo de Estudo demonstrado no Anexo E. 48 3.4 Procedimentos Os pacientes estudados foram recrutados conforme se segue: os HIVpositivos acompanhados na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas foram encaminhados para atendimento no Ambulatório de Coloproctologia da instituição; os HIV-negativos acompanhados no Ambulatório de Coloproctologia do Hospital Universitário Getúlio Vargas foram referenciados à FMT-AM para atendimento. 3.4.1 Entrevista Após ter concordado com o estudo, assinando Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo D), cada paciente foi entrevistado, respondendo a perguntas constantes do formulário apresentado no Anexo F (Requisição de Exame Histopatológico - Anoscopia com Magnificação). Tal formulário serviu de base para a coleta de dados e preenchimento do protocolo de estudo (Anexo E); os dados foram transportados para base de dados eletrônica derivada da plataforma Epi Info®.149 O formulário foi identificado por número aleatório sequencial obtido de tabela construída no Microsoft Excel®. 3.4.2 Exame Proctológico Cada paciente foi colocado na mesa de exames em posição supina para que suas regiões inguinais fossem examinadas à procura de adenomegalias linfáticas. Na sequência, já na posição de Sims modificada para exame proctológico, foi submetido à inspeção desarmada da região anal e perianal. Os achados do exame físico foram anotados no protocolo de estudo. 3.4.3 Coleta Citológica A coleta de células anais foi realizada por meio de escova citológica saturadamente umedecida em água corrente. A escova foi introduzida 3 cm para o interior do canal anal. Nesta situação, foi rodada 360º em torno de seu eixo por dez vezes e, a seguir, retirada num movimento em espiral, exercendo- 49 se leve pressão sobre as paredes do canal anal. Imediatamente após a retirada do instrumento de coleta, produziu-se esfregaço numa lâmina silanizada com extremidade fosca, cobrindo-se toda a área direita transparente da lâmina (Figura 12). Figura 12 – Esfregaço de células anais em lâmina com extremidade fosca realizado com escova citológica. A escova foi rolada em torno do eixo de sua haste sobre a superfície da lâmina, de forma que todas as suas faces deixassem impressão na lâmina. Rapidamente, após a realização do esfregaço, a lâmina foi mergulhada em frasco de transporte contendo solução fixadora de álcool etílico a 96%. A escova citológica foi adicionalmente introduzida mais duas vezes no canal anal do paciente a ser examinado: uma para a realização de nova coleta celular para a realização da detecção imunocitoquímica da proteína p16INK4a em esfregaços produzidos pela técnica de CML e outra para a coleta de material celular anal para a realização da detecção da presença de infecção pelo HPV pela PCR. Para a CML, a escova foi agitada em frasco contendo a solução conservadora do kit GluCyte® (Synermed International Inc., Westfield, IN, E.U.A.). Para a PCR, a ponta da escova cervical foi agitada no interior de frasco de Eppendorf de 2 ml contendo em seu interior 1 ml de solução conservante (TRIS-HCL 50 mM pH8,0 e EDTA 1 mM). Os frascos contendo as lâminas silanizadas, os do kit GluCyte® e os de Eppendorf foram hermeticamente fechados e enviados, os dois primeiros para 50 o Laboratório de Patologia da FMT-AM e os de Eppendorf para o Laboratório de Virologia da instituição para a realização oportuna do processamento dos materiais. Os frascos GluCyte® foram armazenados à temperatura ambiente, enquanto os das lâminas silanizadas (após 24 h de fixação) e os Eppendorf à temperatura de – 20ºC até o momento dos processamentos imunocitoquímicos e biomoleculares. Cada lâmina citológica foi numerada, em sua extremidade fosca, com um número aleatório diferente. Os conjuntos frasco de transporte e lâmina foram identificados com uma etiqueta na qual foi impresso o número aleatório relativo à lâmina que o frasco continha. Números aleatórios diferentes foram imputados aos espécimes celulares destinados à CML e à PCR. 3.4.4 Anoscopia com Magnificação de Imagem Todos os pacientes foram submetidos, logo após a coleta citológica para a realização da PCR para HPV, à AMI. O exame foi realizado com colposcópio de aumento de 16 X, a 30 cm de distância focal (MEDPEJ® PE2000, Ribeirão Preto, SP, Brasil). O procedimento foi iniciado com um toque retal com dedo enluvado besuntado em geléia de lidocaína a 2% para lubrificar o canal anal para a introdução de um anoscópio descartável de plástico. Durante o toque, atenção foi voltada para a presença de irregularidades no revestimento do canal anal, bem como de tumorações. Uma gaze embebida em acido acético a 3% foi colocada no interior do canal anal, por dentro do anoscópio, que foi a seguir retirado, ficando a gaze em contato com as paredes do canal anal por 2 min. A gaze foi então retirada e o anoscópio reintroduzido para a realização do exame do canal anal sob magnificação de imagem. 51 Os resultados da AMI foram considerados positivos ou negativos para lesões acetobrancas. Na presença de lesão(ões) acetobranca(s) (ACB+), a topografia da(s) mesma(s) foi(ram) anotada(s) em relação à altura a partir do orifício anal (orificial, anoderma, pectínea, suprapectínea) e à situação horária na circunferência do canal anal (1 - 12 h), sendo considerada a comissura anal anterior a posição de 12 h. Lesões acetobrancas eventualmente encontradas foram biopsiadas e o material, acondicionado em frascos com solução fixadora de formalina tamponada a 10%, encaminhado para estudo histopatológico e imunoistoquímico no Laboratório de Patologia da FMT-AM. Os achados da AMI foram anotados no laudo constante do Anexo F. As AMI negativas para lesões acetobrancas (ACB–) foram seguidas de biópsias anais 0,5 cm acima da linha pectínea, às 7 h. 3.4.5 Reação em Cadeia da Polimerase As amostras da coleta de material esfoliado do canal anal foram submetidas à PCR de acordo com a técnica descrita por Bauer e Manos (1993), utilizando os iniciadores de consenso MY11 e MY09, que amplificam um fragmento de 450 pb (pares de bases) da região de transcrição tardia L1 e os iniciadores gerais GP5+/GP6+, que amplificam fragmento de 150 pb da região L1, superpondo-se aos MY.150 3.4.5.1 Recuperação de DNA As amostras mantidas a -20ºC foram degeladas à temperatura ambiente para a execução da extração do DNA. As amostras anais foram inicialmente centrifugadas, sendo o sobrenadante retirado. Ao precipitado foram adicionados 130 μl de tampão de lise celular e 20 μl de proteinase K 10 mg/ml. Essa mistura foi mantida em banho-maria a 55º C overnight (modificado de Bauer e Manos, 1993)151. Em seguida, a amostra foi submetida à extração 52 pelos Kits Promega (Madison, WI, E.U.A.) ou Qiagen (São Paulo, SP). Após o procedimento de extração, as amostras ou foram processadas para o diagnóstico molecular ou foram rearmazenadas a -70º C. 3.4.5.2 Amplificação do DNA por PCR Para confirmar a presença de DNA cromossomal humano amplificável conservado nas amostras para as reações de PCR, foi utilizado um par de oligonucleotídeos que amplificam uma região microsatélite (GATA) 13 do cromossoma 15 humano – ISO5P. Existindo DNA humano, após a amplificação com ISO5P, uma banda correspondente a 170 pb pode ser visualizada em gel de agarose 2,5%, corado com brometo de etídio (1 μg/ml) e fotografado na máquina Image Master R VDS FTI – 500 da Pharmacia Biotech (Piscataway, N.J., E.U.A.). 3.4.5.2.1 PCR para diagnóstico do HPV 3.4.5.2.1.1 Oligonucleotídeos MY09/MY11 A reação de PCR foi processada no equipamento termociclador PxE 0.2 Thermal Cycler Thermo Electron Corporation (Waltham, Ms, E.U.A.). O sistema utilizado para a PCR foi composto por 5 μl de DNA da amostra; 5 μl do tampão 10x; 1,5 μl de MgCl2 50 mM, 5 μl do primer anterógrado MY09; 5 μl do primer retrógrado MY11; 1,0 μl de dNTP 10 mM; 0,5 μl de Taq polimerase 5U/μl e 27 μl de água de injeção para completar o volume de 50 μl. Para controle da reação, utilizamos um controle negativo (água de injeção) e uma amostra positiva para HPV (sequenciada). O equipamento foi programado para executar o seguinte termociclo: 53 ETAPAS TEMPERATURA TEMPO Desnaturação 95ºC 60 segundos Desnaturação 95ºC 60 segundos Anelamento 55ºC 60 segundos Extensão 72ºC 60 segundos Extensão final 72ºC 5 minutos Manutenção/Hold 4ºC Tempo indefinido 40 CICLOS As amostras foram submetidas ao próximo passo do procedimento ou armazenadas a -20ºC em freezer específico de amostras amplificadas. 3.4.5.2.1.2 Eletroforese em Gel de Agarose Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão TEB (Tris borato e EDTA) 1x, nas seguintes condições: 70 V até a entrada da amostra no gel, aumentando para 100 V até a amostra chegar ao final da corrida com duração de cerca de duas horas. Utilizou-se como marcador o ladder múltiplo de 100 pb da Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, E.U.A.). O gel foi corado com brometo de etídio (1,0 μg/ml), em que as bandas coradas correspondentes a 450 pb foram visualizadas sob luz ultravioleta e fotografadas no equipamento Image Master® VDS FTI-500, da Pharmacia Biotech. 3.4.5.2.1.3 PCR Aninhada (Oligonucleotídeos GP5+/GP6+) Os produtos da PCR (amplicons) obtidos com os oligonucleotídeos MY09 e MY11 foram utilizados como amostra, sendo manipulados numa outra sala, específica para produtos amplificados. A nova reação de PCR foi processada no equipamento termociclador PxE 0.2 Thermal Cycler Thermo Electron Corporation. O sistema utilizado para a PCR foi composto por 1 μl do amplicon; 5 μl do tampão 10x; 1,5 μl de MgCl2 50 mM, 5 μl do primer GP5+; 5 μl do primer GP6+; 1,0 μl de dNTP 10 mM; 0,5 μl de Taq polimerase 5U/μl e 31 54 μl de água de injeção para completar o volume de 50 μl. Para controle da reação, utilizou-se um controle negativo (água de injeção) e uma amostra sabidamente positiva para HPV (sequenciada). Após o preparo do sistema para cada amostra, as amostras foram levadas ao termociclador utilizando-se a mesma programação descrita para os oligonucleotídeos MY09/11. Terminada a reação de amplificação, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2,5% onde o fragmento amplificado foi correspondente a 150 pb. 3.4.5.3 Reação de Sequenciamento As amostras foram sequenciadas usando-se os iniciadores MY09 ou MY11 ou GP5+ ou GP6+ em sequenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biociences, Uppsala, Suécia). Para o sequenciamento utilizou-se o seguinte sistema de reação: 5,0 μl do amplicon da PCR-aninhada; 4,0 μl do pré-mix DYEnamic ET - terminator Kit; 1,0 μl do primer MY09/MY11, ou 1,0 μl de GP5+/GP6+, utilizando-se o seguinte programa: 95°C por 25 segundos, 95°C por 15 segundos, 50°C por 20 segundos, 60°C por 1 minuto, repetidos por 30 ciclos de amplificação. 3.4.5.4 Precipitação do Produto da Reacão de Sequenciamento Após a reação de sequenciamento foi realizada a precipitação. Ao produto da PCR de sequenciamento foi adicionado 1 μl de acetato de amônia e 27,5 μl de etanol absoluto. Este sistema foi misturado utilizando-se o agitador por um minuto e incubado por vinte minutos à temperatura ambiente. A placa foi envolvida em papel alumínio para evitar a incidência de luz. 55 Após a incubação, a placa foi centrifugada a 4.000 rpm por quarenta minutos, em centrífuga refrigerada 5804R da Eppendorf (Hamburg, Alemanha). O sobrenadante foi descartado. A placa foi centrifugada invertida num pulso de 1.000 rpm por alguns segundos. Em seguida providenciou-se a evaporação do etanol, deixando a placa secar por 15 minutos. O DNA foi novamente suspendido com a adição de 10 μl de tampão (do kit). A placa foi vedada e agitada em vortex por dois minutos. Nova centrifugação num pulso de 1.000 rpm por alguns segundos foi realizada. 3.4.5.5 Eletroforese para Sequenciamento A decodificação de sequência nucleotídica do fragmento amplificado foi realizada em sequenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biociences-Pharmacia). A eletroforese capilar em gel de poliacrilamida foi feita com base na metodologia padrão do fabricante. Para injeção utilizou-se 3 kV por 80 segundos; a corrida foi processada a 6 kV por 200 minutos, sob temperatura de 44°C. 3.4.5.6 Alinhamento das Amostras Sequenciadas Para o alinhamento das sequências de nucleotídeos obtidas foi utilizado o programa de computador CLUSTAL W (BioEdit, Carlsbad, CA, E.U.A.). 3.4.5.7 Análise das Sequências Nucleotídicas Para confirmação e identificação do tipo do HPV foi realizada uma comparação de todas as sequências nucleotídicas das amostras sequenciadas com as existentes no Banco de Dados Mundial de Nucleotídeos - GeneBank, utilizando-se o programa BLAST152 por meio do site http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 56 Os resultados da PCR-HPV foram os seguintes: HPV− (negativo para a presença de HPV); HPVa (presença de HPV de baixo risco); HPVb (presença de HPV de alto risco); HPVn (sendo “n” o sorotipo específico do HPV detectado). 3.4.6 Análise Citológica No Laboratório da Gerência de Patologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas os frascos contendo a solução conservante GluCyte® com material celular anal em suspensão foram processados para a produção de esfregaços em lâminas silanizadas. 3.4.6.1 Produção de Esfregaços em Camada Delgada Os materiais oriundos dos esfoliados anais contidos nos frascos GluCyte® foram processados para a produção de esfregaços em camada delgada pelo método Synermed® de CML segundo as instruções do fabricante (Anexo G). Uma vez feitos os esfregaços, em lâminas silanizadas, as lâminas foram acondicionadas em frascos contendo álcool etílico a 96% para fixação por 24 h. Após os esfregaços em camada delgada terem sido fixados, as lâminas foram armazenadas a -20ºC até o momento do processamento imunocitoquímico para a detecção da proteína p16INK4a. 3.4.6.2 Imunocitoquímica para a p16INK4a As lâminas contendo esfregaços convencionais e em camada delgada para a detecção de expressão da proteína p16INK4a foram submetidas ao protocolo de coloração imunocitoquímica seguido pelo Laboratório da Gerência de Patologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (Anexo J). Esfregaços de células HeLa, linhagem imortalizada de células de câncer cervical,153 que sabidamente coram-se fortemente no processo imunoquímico da proteína p16INK4a, foram utilizados como controles positivos e negativos para análise da adequação da coloração. Para serem utilizadas como controle 57 negativo, os esfregaços de células HeLa foram submetidos a todo o processo imunoquímico sem a adição do Ac. 1ário. A imunocitoquímicva para a proteína p16INK4a foi considerada positiva quando se observou células displásicas com coloração nuclear amarronzada, com ou sem coloração citoplasmática também positiva. As lâminas foram classificadas ou como p16-negativas (ausência de coloração imunoquímica ou coloração apenas citoplasmática) ou p16-positivas (coloração nuclear positiva, com ou sem coloração citoplasmática). Não foi feita gradação da intensidade da coloração imunocitoquímica. 3.4.7 Análise Histológica No Laboratório de Patologia da FMT-AM, os espécimes fixados em solução tamponada de formalina a 10% foram incluídos em blocos de parafina e seccionados em fatias de 4 µ. 3.4.7.1 Histologia Convencional O corte histológico foi montado em lâmina de microscópio e corado pelo método tradicional da hematoxilina-eosina. Após cobertura com lamínula, as lâminas preparadas foram observadas à microscopia ótica à procura da presença de lesões teciduais próprias de infecção anal pelo HPV. Os achados histopatológicos foram definidos como: NEG - negativo para lesão intraepitelial escamosa anal (incluindo alterações celulares benignas, incluindo inflamação, alterações reacionais e metaplasia escamosa); LSIL lesão intraepitelial escamosa anal de baixo grau; HSIL – lesão intraepitelial escamosa anal de alto grau; CEPis – carcinoma epidermóide in situ; CEPin carcinoma epidermóide invasivo; ADCis – adenocarcinoma in situ; e ADCin adenocarcinoma invasivo. Se mais de uma biópsia tivesse sido realizada num mesmo individuo, o resultado com maior lesão tecidual foi o utilizado para análise. 58 Os resultados histopatológicos foram considerados padrão-ouro para a confirmação da presença de lesões anais citopáticas HPV-dependentes. 3.4.7.2 Imunoistoquímica para a p16INK4a A coloração imunoistoquímica para a detecção de hiperexpressão da p16INK4a foi realizada em cortes histológicos retirados dos espécimes de biópsias anais realizadas seguindo o protocolo de coloração imunoistoquímica utilizado no Laboratório da Gerência de Patologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (Anexo K). Para cada reação imunoistoquímica foram utilizados controles positivos e negativos conhecidos para comparação dos cortes histológicos. Como controle positivo foi utilizado uma lâmina preparada de um espécime de um caso bem estabelecido de câncer cervical, tecido que sabidamente assume coloração imunoquímica intensa sob a ação do anticorpo anti-p16INK4a. Como controle negativo foi utilizado uma lâmina com o mesmo espécime de câncer cervical à qual não foi aplicado o Ac. 1ário. Uma coloração amarronzada intensa predominantemente observada no núcleo, com ou sem coloração citoplasmática foi considerada positiva para a expressão da p16INK4a. As lâminas foram assim classificadas de acordo com a distribuição da coloração amarronzada: negativas (NEG) – lâminas com menos de 1% de células coradas; esporádicas (ESP) – lâminas com menos de 5 % de células coradas, mesmo isoladamente; focais (FOC) – lâminas em que pequenos agrupamentos de células positivamente coradas estiveram presentes, mas não ultrapassaram 25% das células observadas; e difusas (DIF) – lâminas com mais de 25% das células observadas positivamente coradas.120 Os resultados imunoquímicos e histopatológicos considerados para análise foram os de consenso entre três patologistas, sendo, entretanto, anotados os resultados individuais da leitura histopatológica para a realização de estudo da variabilidade diagnóstica interobservadores. Na leitura de 59 consenso, a observação das lâminas foi feita conjuntamente pelos três patologistas da Gerência de Patologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas em microscópio com ótica compartilhada. Apenas um diagnóstico foi emitido por paciente, aquele que acusava a maior lesão no espectro evolutivo de ASIL a câncer. 3.5 Plano de Coleta de Dados Dos procedimentos descritos no item 3.4 foram coletados os seguintes dados, que foram considerados variáveis para análise estatística: 3.5.1 Resultados da Imunocitoquímica para a p16INK4a Modalidades estudadas: negativa (−) ou positiva (+). 3.5.2 Resultado do Exame Histopatológico Modalidades estudadas: NEG, LSIL, HSIL, CEPis, CEPin, ADCis, ADCin. 3.5.3 Resultado da Imunoistoquímica para a p16INK4a Modalidades estudadas: negativa (NEG); esporádica (ESP); focal (FOC); difusa (DIF). 3.5.4 Resultado da PCR-HPV Modalidades estudadas: Negativa para a presença de HPV (HPV−); HPV de baixo risco (HPVa); HPV de alto risco (HPVb); tipo específico de HPV detectado (HPV-n: sendo “n” o número do sorotipo detectado). 3.6 Análise dos Resultados A análise estatística dos dados compilados foi feita pelos pacotes estatísticos R,154 BioEstat 5.0,155 e EpiInfo.149 60 3.6.1 Estudo da Variabilidade Interobservadores A análise estatística das variáveis categóricas representadas pelos diagnósticos histopatológicos das leituras individuais e da leitura de consenso foi realizada pelo estudo da frequência com a qual os diagnósticos emitidos por cada patologista concordaram com a leitura de consenso, levando-se em consideração os resultados dos intervalos de confiança de 95% e dos testes do chi-quadrado ou G para tabelas de contingência. A concordância entre os diagnósticos individuais dos patologistas e os de consenso também foi estudada pelo cálculo do coeficiente kappa.156 O grau de concordância interobservadores foi avaliado segundo os critérios propostos por Landis & Koch (1977):156 <0,00 = ruim; 0,00 a 0,20 = fraca; 0,21 a 0,40 = regular; 0,41 a 0,60 = moderada; 0,61 a 0,80 = forte; 0,81 a 1,00 = quase perfeita. P-valores abaixo de 0,05 foram considerados significantes. 3.6.2 Estudo de Prevalência Para o estudo da prevalência de ASIL entre os pacientes atendidos, os mesmos foram analisados como um todo, separados segundo a presença ou não de infecção por HIV, e distribuídos em estratos populacionais conforme a presença ou ausência de fatores de risco para o câncer anal [HSH/HIV = homens que fazem sexo com homens HIV; M/HIV = mulheres HIV; GR = indivíduos de ambos os gêneros sem condições de risco para o câncer anal; H/HIV = homens heterossexuais HIV; OFR = indivíduos de ambos os gêneros HIV, sem hábitos sexuais anorreceptivos (AR), mas com relato de pelo menos uma dentre as seguintes condições de risco para o câncer anal: tabagismo, uso de drogas alucinógenas injetáveis, DST, transplantes de órgãos sólidos, história de câncer anogenital ou de suas lesões precursoras; HSH/HIV; e M/HIVAR = mulheres HIV com hábitos sexuais anorreceptivos]. 61 Resumos descritivos das características epidemiológicas dos pacientes atendidos foram feitos. As características epidemiológicas dos pacientes foram confrontadas com os resultados histopatológicos das biópsias anais por meio do emprego de estatística frequentista (teste do Chi-quadrado, teste exato de Fisher e teste G) e Bayesiana – pacote R LearnBayes157 – de análise de tabelas de contingência, por meio do teste de Monte Carlo 158, pela análise de Resíduos Padrões e pelo método de Análise por Correspondência. A razão de chances para associação com ASIL foi calculada para cada combinação de dois dos sete grupos de pacientes estudados. Significância estatística foi considerada quando o p-valor dos testes estatísticos convencionais ficou abaixo de 5%, quando as probabilidades Bayesianas posteriores favoreceram alguma das hipóteses testadas e quando o valor absoluto dos resíduos padrões foi superior a 1,96. 3.6.3 Estudo Imunocitoquímico da Proteína p16INK4a As frequências dos resultados imunocitoquímicos da proteína p16 em esfregaços convencionais e nos produzidos pela técnica de CML foram comparados com a dos resultados histopatológicos, após a distribuição dos dados em tabelas de contingência, que foram analisadas pelo teste G com a correção de Williams e pelos intervalos de confiança de 95%. Associação semelhante foi feita entre os resultados imunocitoquímicos e os da genotipagem de HPV pela PCR. Com a redistribuição dos dados em tabelas 2 X 2, foram calculadas as medidas de validade diagnóstica (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo) (Anexo I) da imunocitoquímica para a p16 62 em relação a dois padrões-ouro: os resultados histopatológicos e os da genotipagem de HPV pela PCR. Para se obter as medidas de validade diagnóstica da imunocitoquímica da p16 em relação aos resultados da PCR, a presença de HPV de alto risco foi utilizada como ponto de corte de comparação entre os resultados da genotipagem e os do exame imunocitoquímico. Estimou-se, assim, o poder de predição de infecção anal causada por HPV de alto risco em pacientes com imunocitoquímica positiva para a p16. Significância estatística foi considerada para valores de p inferiores a 5%. 3.6.4 Estudo imunoistoquímico da proteína p16INK4a As frequências obtidas dos resultados imunoistoquímicos da p16 foram comparadas com as dos resultados do exame histopatológico, após a disposição dos dados em tabelas de contingência que foram analisadas pelos testes do chi-quadrado (com a correção de Yates) ou G (com a correção de Williams) e pelos intervalos de confiança de 95%. Com a redistribuição dos dados em tabelas 2 X 2, obtiveram-se os índices de validação diagnóstica (sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo) (Anexo I) da imunoistoquímica para a proteína p16 em relação ao exame histopatológico (padrão-ouro). Significância estatística foi considerada quando p ≤ 0,05. 63 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados e a discussão são apresentados, a seguir, na forma de artigos originais relacionados ao tema da tese e que exploram cada um dos objetivos específicos que foram delineados. Os artigos referem-se a projetos desenvolvidos durante o Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para a obtenção do título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas. O primeiro estudo, intitulado “Interobserver variability in the diagnosis of anal cancer precursor lesions: a study of the commoner scenario” será publicado na Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões, e está relacionado ao primeiro objetivo específico desta tese. O segundo estudo, “Anal cancer precursor lesions in HIV-positive and HIV-negative patients seen at a tertiary health institution in Brazil”, será publicado na Acta Cirúrgica Brasileira, e refere-se ao que foi projetado ser estudado no segundo objetivo específico desta tese. O terceiro estudo, “Performance of p16INK4a immunocytochemistry as a marker of anal squamous intraepithelial lesions“, foi submetido para publicação no The Journal of Histochemistry & Cytochemistry e encontra-se sob avaliação. Aborda os assuntos descritos nos 3º e 5º objetivos específicos desta tese. O quarto estudo, “p16INK4a immunohistochemistry as a marker of anal cancer precursor lesions in HIV positive patients“, foi submetido para publicação na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical e encontra-se sob avaliação. Cumpre com o que foi traçado para ser avaliado em relação ao 4º objetivo específico desta tese. 64 4.1 Interobserver variability in the diagnosis of anal cancer precursor lesions: a study of the commoner scenario● Variabilidade interobservadores no diagnóstico de lesões precursoras do câncer anal: estudo do cenário habitual● Ivan T. COSTA E SILVA*, José R. ARAÚJO¶, Rosilene V. ANDRADE¶, Celso Rômulo B. CABRAL, Felicidad S. GIMENEZ, Adriana G. D. P. GUIMARÃES*, Priscila R. SANTOS ¥¥, Laila Cristina A. ROJAS¥, Luiz Carlos L. FERREIRA§ ● This study was undertaken at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas * MD, Fellow of the Brazilian College of Surgeons, MSc, Post-Graduation Program of Tropical Medicine Foundation of Amazonas / University of the State of Amazonas, Manaus –Brazil; Department of Surgery, School of Medicine, Federal University of Amazonas ¶ MD, MSc, Department of Pathology, Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Manaus - Brazil PhD, Department of Statistics, Exact Sciences Institute, Federal University of Amazonas, Manaus - Brazil MD, MSc, Department of Surgery, School of Medicine, Federal University of Amazonas, Manaus – Brazil ¥ JD, Department of Surgery, School of Medicine, Federal University of Amazonas, Manaus – Brazil § MD, PhD, Departments of Research and Pathology, Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Manaus - Brazil 65 Correspondence to: Ivan Tramujas da Costa e Silva, MD, MSc. Federal University of Amazonas, Department of Surgery, R. Afonso Pena, 1053, Manaus – AM, Brazil, Zip Code: 69020-160. email: [email protected]. Disclaimers: all authors have no conflicts of interest. Funding: Sponsored by the National Program of DST and AIDS, Ministry of Health of Brazil – UNESCO (grant 914BRA1101) 66 Resumo Objetivo: Analisar a variabilidade interobservadores no diagnóstico de lesões precursoras do câncer anal no cenário mais comum de um serviço constituído por patologistas sem experiência prévia no diagnóstico destas lesões. MÉTODOS: Quinhentas e duas lâminas histopatológicas com espécimes anais retirados de 372 pacientes HIV-positivos e HIV-negativos foram analisadas no Departamento de Patologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas por três patologistas com ampla experiência no diagnóstico de doenças tropicais e infecciosas, mas sem experiência prévia importante no diagnóstico de lesões precursoras do câncer anal. As leituras individuais de cada patologista foram comparadas com a que se seguiu a diagnóstico de consenso em microscópio de ótica compartilhada. Os diagnósticos individuais foram confrontados com os de consenso mediante análise da estatística kappa. RESULTADOS: A concordância absoluta entre cada diagnóstico individual e o de consenso correspondente foi ruim (kappa = - 0,002). Considerando os resultados apenas positivos ou negativos para lesões intraepiteliais escamosas anais, obteve-se concordância regular entre os observadores (kappa = 0,35), enquanto que a concordância foi moderada quando os resultados histopatológicos foram considerados positivos ou negativos para lesão intraepitelial de alto grau ou câncer (kappa = 0,52). CONCLUSÃO: A variabilidade interobservadores no diagnóstico histopatológico do câncer anal e de suas lesões precursoras entre patologistas sem grande experiência na área, apesar de experts em outras, é tal que os diagnósticos neste campo e neste cenário comum deve sempre ser de consenso. Descritores: Canal Anal; Neoplasias do Ânus; Variações Dependentes do Observador; Patologia. 67 Abstract OBJECTIVE: To analyze interobserver diagnostic variability among pathologists non-specialized in the diagnosis of anal cancer precursor lesions, a common scenario found in the majority of pathology services. METHODS: Five hundred and two histopathological slides prepared from anal specimens retrieved from 372 HIV positive and HIV negative patients were evaluated at the Department of Pathology of the Tropical Medicine Foundation of Amazonas by three pathologists, experts in the diagnosis of tropical and infectious diseases, but with no special previous experience in anal cancer precursor lesions diagnosis. Individual readings of the slides by each pathologist were compared to a consensus diagnosis which followed conjoined evaluations of the slides in a multi-headed microscope. Individual versus consensual diagnoses were analyzed by kappa statistics. RESULTS: Absolute agreement between each individual diagnosis and corresponding consensual diagnosis was poor (kappa = - 0.002). When considering results either positive or negative for anal squamous intraepithelial lesions there was fair interobserver agreement (kappa = 0.35), whereas moderate interobserver agreement was noted when considering histopathological results either positive or negative for high grade squamous intraepithelial lesions or cancer (kappa = 0.52). CONCLUSION: Interobserver variability in the histopathological diagnosis of anal cancer and its precursor lesions among pathologists with no distinctive experience in the field, albeit experts in other areas, is such that diagnoses in this area, in this common scenario, should always be consensual. Keywords: Anal Canal; Anus Neoplasms; Observer Variation; Pathology. 68 Introduction Anal cancer is still considered a rare disease in the general population, although it is experiencing an increase in incidence in recent years in certain population groups known to be at risk for its development.1-4 In the general population, the incidence of the malignancy varies from 0.8 to 2 cases per 100,000 inhabitants, but in at risk population groups the rate has been reported in alarming 70 to 120 times greater proportions.5-7 With its recognized association to continuous human papillomavirus infection in subjects with some degree of immunosuppression,8 anal malignancy is thought to behave similarly to the much more extensively studied cervical cancer.9,10 As for cervical cancer, anal carcinoma is preceded by precursor lesions, namely anal intraepithelial neoplasias (AIN), which are classified into three categories, representative of their recognized increasing potential for cancer transformation, i.e. AIN-I, AIN-II and AIN-III.11 Due to a considerable degree of inter and intraobserver disagreement in the analysis of cervical intraepithelial neoplasias (CIN),12 the current trend is to condense the original three tiered classification (CIN-I, CIN-II, CIN-III) into the two tiered proposed by the 2001 Bethesda consensus.13 Thus, accordingly, AIN-I has been called low grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) and AIN-II and III are joined into a single category called high grade squamous intraepithelial lesion (HSIL).3,14-17 Despite this regulatory effort some diagnostic difficulties still persist in differentiating between LSIL and HSIL and, especially in the anal canal, some additional misinterpretations are prone to occur when differentiating reactive 69 inflammatory changes of the anal transitional zone18 from those that should be regarded as anal squamous intraepithelial lesion (ASIL), either low grade or high grade.3 Studies that depict this matter normally include pathologists with some recognized expertise in the diagnosis of anal cancer and its precursor lesions and do not reflect what is probably much more seen in common practice of services of general pathology. Due to the low incidence and prevalence of anal cancer and its precursor lesions in the general population, the disease is very rarely observed in the daily practice of these services.15,17,19 Tropical Medicine Foundation of Amazonas (FMT-AM) is an institution of the state of Amazonas which is specialized in diagnosing and treating tropical and infectious diseases. It concentrates the treatment of most of the state’s AIDS cases and follows up a significant number of HIV positive subjects. Until 2006, FMT-AM did not routinely screen at risk individuals that were attended at the institution for anal cancer and its precursor lesions. With the beginning of the activities of the institution’s Coloproctology Outpatient Clinic, in January 2007, a sudden new demand was created at its pathology service: the need for processing and interpreting anal biopsies performed in patients at risk to develop anal cancer. Pathologists with extensive experience in the diagnosis of tropical diseases were then faced with a new challenge: to accurately identify lesions that were, until then, only rarely seen at the institution. As the management of a lesion associated to anal cancer depends directly on its precise histopathological diagnosis, it is of utmost importance that decision taking relies on solid evidences of the presence or absence of ASIL or cancer.17 70 This study was undertaken to analyze interobserver variability in early diagnosis of anal cancer in a pathology unit specialized in the diagnosis of infectious diseases, but with no previous special experience in the diagnosis of anal cancer and its precursor lesions. It was meant to reproduce what is probably more usual in the majority of pathology services around the world. Materials and Methods This is an observational analysis of the histopathological findings of anal biopsies performed in HIV positive and HIV negative patients with or without other anal cancer risk conditions or behaviors. The study was approved by the Ethics in Research Committee of FMT-AM (CEP/FMT-AM 1768/2006) and is part of a project intended to evaluate the various diagnostic tests commonly employed for the detection of anal cancer and its precursor lesions in patients treated at the Coloproctology Outpatient Clinic of the institution between January 2007 and December 2008. After written consent was given to participate in the study, all anal biopsies analyzed herein were performed by coloproctologists at the anal transitional zone (ATZ) under high resolution anoscopy guidance, according to an already described protocol.20 The specimens were fixed in 10% formalin buffered solution and sent to the laboratories of the Department of Pathology of FMT-AM for processing and analysis. Four micra sections of the paraffin embedded specimens were prepared and submitted to usual H&E staining. Each final slide was identified only by a random number which did not referred to the origin of the specimen. 71 The possible projected diagnoses were: UNS (unsatisfactory for analysis), ASE (absence of squamous epithelium), NEG (negative for ASIL or cancer), BCAI (benign cellular alterations/inflammatory), ACU (condyloma acuminatum), LSIL, HSIL, SCCis (squamous cell carcinoma in situ), SCCin (invasive squamous cell carcinoma), ADCis (adenocarcinoma in situ), ADCin (invasive adenocarcinoma). The diagnostic criteria utilized for the definition of ACU, LSIL, HSIL and SCC were already described.21 The slides were initially diagnosed individually by three senior pathologists (one with a PhD in anatomic pathology and two with Masters Degree) with 35, 28 and 13 years of experience in general pathology. The pathologists were blinded to the origin of the slides. During a nine month period after the end of anal biopsies collection there were several meetings of consensual readings of all the previously diagnosed slides. The slides were then reexamined by the three pathologists in a multi-headed microscope. All histopathological results were compiled by one of the researchers (ITCS) who did not participate of the reading sessions. Statistical analysis of categorical variables representing the histopathological findings of the first individual readings and the consensus reading was made by studying the frequency with which the diagnoses given by each pathologist agreed with the consensus reading, taking into account the 95% confidence intervals and the calculation of chi-square or G tests for contingency tables. It was then also carried out by means of the calculation of the kappa coefficient between the individual pathologists’ diagnoses and the consensus reading results. BioEstat 5.0 software was used for the calculation of frequencies, the confidence intervals, and of the kappa coefficient.22 The degree 72 of interobserver agreement was assessed using the criteria proposed by Landis and Koch: <0.00 = poor, 0.00 to 0.20 = slight, 0.21 to 0.40 = fair, 0.41 to 0.60 = moderate, 0.61 to 0.80 = substantial, 0.81 to 1.00 = almost perfect.23 P values below 0.05 were considered significant. Results From a total of 372 patients actually studied, 1643 histopathological interpretations of anal biopsies were made. Of these, 502 histopathological slides submitted to the consensus reading were randomly allocated for analysis. Table 1 shows all the individual histopathological diagnoses in relation to the consensus reading. Cells in gray denote complete agreement between the initial individual diagnoses and those of the consensus reading. Nine out of the 11 projected possible histopathological diagnoses were actually observed. The distribution of frequencies of concordant individual diagnoses (sum of shaded cells of Table 1) or discordant individual interpretations (sum of nonshaded cells of Table 1) in relation to the consensus reading is depicted in Table 2. It can be noticed that absolute agreement between each individual and corresponding consensual diagnoses was observed in only 34.5% of the histopathological readings. It is also evident that although the sample sizes corresponding to each pathologist were quite different, there was no statistical difference among them when analyzing the proportions of concordant positive and negative results, although the conclusions regarding pathologist 1 may be interpreted with caution due to his small number of slide readings, which was associated to ample 95% confidence intervals. According to the Kappa analysis, 73 agreement between initial individual different diagnoses and corresponding consensus readings was poor. For Tables 3, 4 and 5 NEG results encompassed UNS, ASE and BCAI. Diagnostic categories UNS and ASE were considered NEG, for in doing so they comprehended 80% of the observed diagnostic combinations. For Table 4 LSIL results included ACU. Table 3 depicts the agreement between the initial histopathological readings and the consensus readings, considering the results either positive or negative for ASIL or cancer. In this approach, the initial readings of the three pathologists demonstrated a greater agreement with consensus results. Except for pathologist 1, who despite substantial agreement with the consensus, read very few individual slides, the best performance was observed for pathologist 3, who tended to agree more with the consensus reading, although the kappa obtained indicated only fair agreement. The higher rate of diagnostic concordance with positive results for ASIL or cancer of pathologist 2 (compared to pathologist 3) was hindered by a perceived trend to assign inferior diagnoses than those obtained by the consensus reading. Table 4 shows the histopathological findings into three categories: LSIL (including ACU), HSIL or higher (including cancer) and NEG (negative for intraepithelial lesion or cancer). The analysis of interobserver agreement in this situation should be made using the linear weighted kappa index, which assigns different weights to each evaluation in order to measure the degree of disagreement between two readings.24 The index considers that the evaluative difference between two observers that interpret a particular slide NEG (observer 1) and HSIL (observer 2) is substantially greater than the difference if observer 74 1 considered the slide LSIL and observer 2 HSIL. The linear weighted kappa of the two pathologists who had the greater productions of individual readings was only fair due to the greater trend presented by pathologist 2 to consider NEG results that were found to be LSIL in the consensus readings. The results were also affected by pathologist 3’s misinterpretations of LSIL in relation to consensus readings. Table 5 analyzes the results of individual readings of each pathologist compared to the results of consensus readings, considering the presence or absence of signs of severe dysplasia or cancer ( HSIL). In this type of analysis, the replication of the condensed diagnoses of the three pathologists was moderate, despite the great difference between pathologist 1 and the other two. Pathologists 2 and 3 presented greater agreement with consensus readings in this approach. No statistical difference was observed between individual readings and consensus readings for results equal or higher than severe dysplasia, according to the analysis of the 95% confidence intervals. Discussion This study was developed in a setting where pathologists did not have previous particular experience with the diagnosis of anal cancer and anal squamous intraepithelial lesions, despite being experts in other pathological fields. It certainly reproduces what is commonly found in the majority of centers that do not deal routinely with anal cancer screening in at risk populations. Apart from the absence of an expert in anal cancer precursor lesions, this study also mimics what is probably found in so many services where 75 pathologists have different work loads, according to their areas of expertise or administrative demands. This investigation was then meant to analyze without undue intervention the diagnostic production of pathologists during their routine work. No especial diagnostic challenge was exercised on the observers before the consensual reading sessions. Anal cancer is now considered a disease amenable to cure and, more importantly, a preventable malignancy. But, in order to obtain control of the malady, it must be accurately diagnosed at an early stage, if possible prior to malignant transformation.2,25,26 The diagnostic gold standard for anal cancer and its precursor lesions is the conventional histopathological examination,27 as it is for the much more widely studied cervical cancer. For cervical cancer, the interobserver variability among experienced pathologists ranges from moderate to almost perfect. 12,13,24 For anal cancer, on the other hand, there are several reports in the literature pointing out the diagnostic imperfections of histopathological analysis of anal specimens, even among pathologists with recognized expertise in the field.15,17,19,28 Carter et al. conducted a study of diagnostic agreement in 100 archived slides of histological sections derived from biopsies of the anal canal. The slides were examined by five pathologists, three with experience in the interpretation of anal dysplasia and two with extensive experience in the diagnosis of cervical cancer precursor lesions according to Richart’s initial criteria (CIN-I, CIN-II and CIN-III). Diagnostic categorization was based on Fenger & Nielsen’s similar classification of AIN11. The authors observed that the participant pathologists tended to agree on the diagnosis of normal anal epithelium and in cases of 76 invasive cancer but that, for intermediate lesions, only moderate agreement was achieved. They felt the need to re-study the subject utilizing a two tiered classification of AIN.28 Colquhoun et al. reported a study of 190 histopathological slides that presented all the spectrum of anal dysplasia, from normal to invasive anal carcinoma, according to Fenger & Nielsen’s classification. Slides were revised by three pathologists with experience in anal pathology. Only moderate agreement was reached among the pathologists according to the kappa criteria employed in the study. Nevertheless, when the interpretations of the 3 pathologists were compared to a previous consensus diagnosis of nine other pathologists, kappa’s agreement index ranged from 0.38 to 0.60. The authors concluded that in order to obtain greater interobserver agreement indexes it would be probably better to abide to a two tiered categorization of AIN (high grade and low grade dysplasia). They also suggested that the employment of biomolelular markers might facilitate the identification of dysplastic lesions.15 Lytwyn et al. published an analysis of diagnostic agreement among 4 pathologists experienced in the interpretation of cervical and anal cytopathology and histopathology. The pathologists evaluated 155 histological slides of anal specimens withdrawn from 93 HIV positive patients with anoreceptive sexual habits. Anal dysplasia and cancer was analyzed according to two grades (either LSIL or HSIL). Kappa’s index of agreement among the diagnoses of the 4 pathologists was 0.59 (moderate agreement according to the authors’ criteria of kappa interpretation). When analyzing the average agreement between each of the two pairs of pathologists, kappa’s index was 0.66 (substantial), while kappa’s agreement index with the consensus reading was 0.75 (substantial). 77 The authors end up recognizing that even among experienced pathologists interobserver agreement was at least moderate and that it would be desirable that new gold standards for the diagnosis of anal cancer and its precursor lesions be investigated.17 Kreuter et al. have recently studied the sensitivity and specificity of several promising surrogate biomarkers for the diagnosis of AIN and found that either Ki67, p16, or minichromosome maintenance proteins 3, 4, 6 and 7 presented 100% sensitivity and 100% specificity in the diagnosis of HSIL by two highly experienced histopathologists. The authors concluded that the markers are effective additional tools in routine anal pathology to improve the diagnosis of AIN, especially in borderline cases.26 In the study herein reported, the agreement between the initial diagnosis of each pathologist and the consensus diagnosis, considering all the observed different diagnoses, resulted in a negative kappa index, as a reflex of greater disagreement in the interpretation of all the exact observed diagnoses. This should be expected considering the type of analysis that was performed over 9 different diagnostic categories. If the exact interpretation of a specific grade of AIN is prone to considerable disagreement among expert pathologists, 28 it should not be surprising that the disagreement over so many more diagnostic categories be greater, mainly because it was observed among pathologists with no previous especial experience in the diagnosis of anal cancer precursor lesions. As for the analysis of the presence or absence of ASIL or cancer, the agreement between the initial diagnoses of the two most productive pathologists and the consensus results was only fair, due to a greater tendency 78 to underestimate lesions in the initial reading, meaning that, if it was not for the consensus reading, a considerable number of more significant lesions would not be detected. In order to avoid the potentiality for disagreement attributed to the three tiered classification of AIN,15,28 this study interpreted anal precancerous lesions into two categories (LSIL and HSIL). Nevertheless, considerable disagreement with the consensus diagnosis was observed relative to LSIL (71.22% and 72.00% of the interpretations of pathologists 2 and 3 were, respectively, inferior to consensual LSIL) and HSIL (44.68% and 71.43% of the readings of pathologists 2 and 3 were, respectively, inferior to consensual HSIL) results. Plausible explanations for this diagnostic disagreement could be the confounding biases that might have occurred due to the greater frequency of condyloma acuminatum in the anal canal of patients at risk for anal cancer and to the presence of crushing artifacts in ATZ biopsies, emphasizing that the quality of the diagnosis of anal cancer precursor lesions depends on proper collection of the specimen. The management of a diagnosed high grade anal lesion is still controversial. Some defend the immediate treatment of any detected HSIL 29 while others prefer to rigorously follow up patients with HSIL until early signs of malignant transformation are detected and only then adequately treat the patients.30 However, for both lines of management, it is important to precisely recognize histopathological lesions equal to or more severe than HSIL. In this approach, the two pathologists who had a higher production of initial diagnostic interpretations tended to agree more with the consensus reading, although the kappa coefficient obtained was only moderate. Better agreement was not 79 reached because, again, 44.68% (21/47) of the readings of pathologist 2 and 71.43 % (5/7) of the interpretations of pathologist 3 underclassified the lesions, a finding that could have a decisive influence on the clinical management of the lesions if the consensus reading was not undertaken. The authors conclude that for the pathologists who participated in this study, the average interobserver agreement was only fair, notwithstanding the replication for lesions equal to or more severe than HSIL was moderate. A distinct impression was formed that any similar investigation on the diagnosis of anal cancer and its precursor lesions (in centers where pathologists with extensive experience in the field are missing: a common scenario in the majority of services of pathology due to the low incidence of anal cancer in the general population) should be based on consensus diagnoses, preferably with three or more observers in order to facilitate the resolution of eventual interpretative disagreements between two pathologists. The employment of surrogate markers of anal high grade dysplasia could be helpful to increase the diagnostic replication of lesions with greater potential for malignant transformation and lessen the learning curve of pathologists not especially versed in the diagnosis of anal intraepithelial lesions. Acknowledgements: The authors are thankful for the expert technical support of Pathology Technicians Sandra Caranhas, Sandra Oliveira, Carlos Marques, Andreza Fernandes and Maria Silva, and of Administrative Technician Agustinho Monteiro. 80 REFERENCES 1. Sobhani I, Walker F, Roudot-Thoraval F, Abramowitz L, Johanet H, Henin D, et al. Anal carcinoma: incidence and effect of cumulative infections. AIDS 2004 Jul 23;18(11):1561-9. 2. Palefsky JM. Anal cancer prevention in HIV-positive men and women. Curr Opin Oncol 2009 Sep;21(5):433-8. 3. Longacre TA, Kong CS, Welton ML. Diagnostic problems in anal pathology. Adv Anat Pathol 2008 Sep;15(5):263-78. 4. D'Souza G, Wiley DJ, Li X, Chmiel JS, Margolick JB, CRANSTON RD, et al. Incidence and epidemiology of anal cancer in the multicenter AIDS cohort study. J Acquir Immune Defic Syndr 2008 Aug 1;48(4):491-9. 5. Johnson LG, Madeleine MM, Newcomer LM, Schwartz SM, Daling JR. 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Individual diagnoses of pathologists versus consensus diagnoses Individual Consensus P1 UNS ASE NEG BCAI ACU LSIL HSIL SCCis ADCin Total P1 UNS ASE NEG BCAI ACU LSIL HSIL SCCis ADCin TOTAL 0 1 1 2 2 0 0 1 1 2 1 3 0 0 0 0 2 0 2 1 2 0 0 7 P2 UNS ASE Neg BCAI Cond LSIL HSIL CEPis ADCin TOTAL UNS ASE NEG BCAI ACU LSIL HSIL SCCis ADCin Total P2 P3 UNS ASE NEG BCAI ACU LSIL HSIL SCCis ADCin Total P3 Global Total 3 1 3 2 2 11 37 6 3 30 21 25 3 1 7 2 56 83 1 5 2 8 3 5 89 34 15 45 14 3 7 6 1 4 25 205 1 47 0 1 1 12 52 157 71 21 54 40 0 2 409 UNS ASE Neg BCAI Cond LSIL HSIL CEPis ADCin TOTAL 2 1 3 1 2 45 1 25 7 2 0 2 13 29 21 3 10 7 0 1 86 10 3 60 128 11 231 56 2 1 502 1 2 9 17 15 1 3 1 3 9 5 1 4 3 1 1 1 2 2 2 Individual = Individual diagnoses of each pathologist (P1, P2, P3); UNS = unsatisfactory for analysis; ASE = absence of squamous epithelium; NEG = negative for intraepithelial squamous lesion or cancer; BCAI = benign cellular alterations/inflammatory; ACU = condyloma acuminatum; LSIL = low grade squamous intraepithelial lesion; HSIL = high grade squamous intraepithelial lesion; SCCis = squamous cell carcinoma in situ; ADCin = invasive adenocarcinoma. 84 Table 2. Instances of gross agreement between the individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses Consensus Pathologist Yes P1 P2 P3 Total % CI95% 4 57.14 18.41-90.10 No % CI95% 3 42.86 9.90-81.59 143 34.96 30.34-39.80 266 65.04 60.20-69.66 26 30.23 20.79-41.08 Total 7 409 60 69.77 58.92-79.21 86 173 34.46 30.31-38.80 329 65.54 61.20-69.69 502 CI95% = 95% confidence interval; Test G (Williams) = 2.14; p = 0.34; kappa = -0.002 (CI95% = -0.10 to 0.10) 85 Table 3. Instances of agreement between the individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses considering histopathological results positive or negative for ASIL or cancer Pathologist P1 Consensus POS % CI95% NEG % CI95% TOTAL Kappa POS 4 100.00 47.29 - 100.00 0 0.00 0.00 - 52.71 4 NEG 1 33.33 0.84 - 90.57 2 66.67 9.43 - 99.16 3 Total P1 = 7 P2 POS 113 96.58 91.48 - 99.06 4 3.42 0.94 - 8.52 117 NEG 148 50.68 44.80 - 56.56 144 49.32 43.44 - 55.20 292 Total P2 = 409 P3 76.19 52.83 - 91.78 5 23.81 8.22 - 47.17 21 NEG 19 29.23 18.60 - 41.83 46 70.77 58.17 - 81.40 65 Total P3 = 86 POS 133 93.66 88.31 - 97.06 9 6.34 168 46.67 41.42 - 51.97 192 NEG 0.34 <0.01 16 0.70 0.03 POS Pathologists p-valor 0.38 <0.01 2.94 - 11.69 142 53.33 48.03 - 58.58 360 Global Total = 502 0.35 <0.01 ASIL = anal squamous intraepithelial lesion; Consensus = consensus diagnoses; P1, P2 e P3 = Pathologists 1, 2 and 3; POS = positive diagnosis for ASIL or cancer; NEG = negative diagnosis for ASIL or cancer; CI95% = 95% confidence interval. Kappa = unweighted kappa index. 86 Table 4. Comparison between individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses considering a two tiered classification of anal dysplasia/cancer Ind. Consensus HSIL P1 HSIL 1 LSIL 0 NEG 1 P2 HSIL P3 CI95% LSIL 33.33 0.84 - 90.57 % CI95% 2 66.67 0.00 - 95.00 1 100 33.33 0.84 - 90.57 0 0 NEG % Total K p 9.43 - 99.16 0.00 - 63.16 3 50.00 - 100.00 0.00 - 95.00 1 2 66.67 9.43 - 99.16 3 7 0.53 0.3 0.00 - 63.16 27 64.29 48.03 - 78.45 14 33.33 19.57 - 49.55 1 2.38 0.06 - 12.57 42 5 6.67 2.20 - 14.88 67 89.33 80.06 - 95.28 3 4 0.83 - 11.25 75 16 144 49.32 43.44 - 55.20 292 Total P2 = 409 0.39 <0.01 5.48 3.16 - 8.75 132 45.21 39.40 - 51.11 HSIL 4 LSIL 3 NEG 2 50 3 37.5 8.52 - 75.51 6 46.15 17 26.15 15.70 - 84.30 23.08 5.04 - 53.81 3.08 0.37 - 10.68 Total P1 = 0.32 - 52.65 8 30.77 9.09 - 61.43 13 70.77 58.17 - 81.40 65 Total P3 = 86 0.39 <0.01 1 12.5 19.22 - 74.87 4 16.03 - 38.54 46 Pathol. HSIL CI95% LSIL NEG % 32 60.38 46.00 - 73.55 19 35.85 23.14 - 50.20 2 3.77 0.46 - 12.98 53 LSIL 8 8.99 3.96 - 16.95 74 83.15 73.73 - 90.25 7 7.87 3.22 - 15.54 89 NEG 19 5.28 3.21 - 8.12 149 41.39 36.25 - 46.67 192 53.33 48.03 - 58.58 360 Total = 502 0.4 <0.01 Ind. = individual results of pathologists 1 (P1), 2 (P2) and 3 (P3); Consensus = consensus readings results; Pathol. = consolidated results of P1, P2 and P3; LSIL = low grade squamous intraepithelial lesion or condyloma acuminatum; HSIL = high grade squamous intraepithelial lesion or cancer; NEG = negative for anal squamous intraepithelial lesions or cancer, including absence of squamous epithelium and unsatisfactory results; CI95% = 95% confidence interval; K = linear weighted kappa index; p = p-value of the linear weighted kappa index. 87 Table 5. Association between individual diagnoses of each pathologist and the consensus diagnoses considering the results either with or without the presence of severe dysplasia/cancer Individual P1 Consensus <HSIL <HSIL HSIL % CI95% 3 75.00 19.41 - 99.37 2 66.67 9.43 - 99.16 % CI95% TOTAL 1 25.00 0.63 - 80.59 4 1 33.33 0.84 - 90.57 3 Total P1 = 7 <HSIL 346 94.28 91.39 - 96.42 21 5.72 3.58 - 8.61 367 HSIL 15 35.71 27 64.29 48.03 - 78.45 42 Total P2 = 409 P2 P3 HSIL 21.55 - 51.97 93.59 85.67 - 97.89 5 6.41 2.11 - 14.13 78 HSIL 4 50.00 15.70 - 84.30 4 50.00 15.70 - 84.30 8 Pathologists <HSIL 422 93.99 91.37 - 96.00 27 6.01 4.00 - 8.63 449 HSIL 21 39.62 26.45 - 54.00 32 60.38 46.00 - 73.55 53 Total = 502 Total P3 = 0.09 0.40 0.55 <0.01 0.41 <0.01 0.52 <0.01 73 p <HSIL Kappa 86 Individual = individual diagnoses of each pathologist (P1, P2, P3); <HSIL = lesion with a lesser grade than high grade squamous intraepithelial lesion; HSIL = lesion equal to or more severe than HSIL; Pathologists = consolidated results for all pathologists; CI95% = 95% confidence interval; Kappa = unweighted kappa index; p = p-value of the unweighted kappa index. 88 4.2 Investigative Surgery Anal cancer precursor lesions in HIV-positive and HIV-negative patients seen at a tertiary health institution in Brazil¹ Lesões precursoras do câncer anal em pacientes HIV-positivos e HIV-negativos atendidos numa instituição de saúde terciária no Brasil Ivan Tramujas da Costa e SilvaI, José de Ribamar AraújoII, Rosilene Viana de AndradeII, Celso Rômulo Barbosa CabralIII, Felicidad Santos GimenezIV, Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro GuimarãesI, Ticiane Costa MartinsV, Lucília Rocha LopesV, Luiz Carlos de Lima FerreiraVI I MD, Fellow PhD degree of the Post-Graduation Program of Tropical Medicine Foundation of Amazonas / University of the State of Amazonas. Assistant Professor of Surgery, Federal University of Amazonas, Manaus, Brazil II MD, Master. Service of Pathology, Tropical Medicine Foundation of Amazonas. Assistant Professor of Pathology, State University of Amazonas, Manaus, Brazil III PhD. Associate Professor. Department of Statistics, Exact Sciences Institute, Federal University of Amazonas, Manaus, Brazil IV MD, Master. Volunteer Faculty, Department of Surgery, Federal University of Amazonas, Manaus, Brazil V MD, Resident. Getúlio Vargas University Hospital, Federal University of Amazonas, Manaus, Brazil 89 VI MD, PhD. Department of Research and Service of Pathology, Tropical Medicine Foundation of Amazonas. Associate Professor of Pathology, Federal University of Amazonas, Manaus, Brazil ABSTRACT PURPOSE: To investigate the prevalence of anal squamous intraepithelial lesions (ASIL) or anal cancer in patients attended at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas. METHODS: 344 patients consecutively attended at the institution, in 2007/2008, were distributed in the following strata according to presence/abscense of at risk conditions for anal cancer: Group 1 – HIV-positive men-who-have-sex-withmen (101); Group 2 – HIV-positive females (49); Group 3 – patients without any at risk condition for anal cancer (53); Group 4 – HIV-positive heterosexual men (38); Group 5 – HIV-negative patients, without anoreceptive sexual habits, but with other at risk conditions for anal cancer (45); Group 6 – HIV-negative menwho-have-sex-with-men (26); and Group 7 – HIV-negative anoreceptive females (32). The histopathological results of biopsies guided by high-resolution anoscopy were analyzed by frequentist and bayesian statistics in order to calculate the point-prevalence of ASIL/cancer and observe any eventual preponderance of one group over the other. RESULTS: The point-prevalence of ASIL for all the patients studied was 93/344 (27%), the difference between HIV-positive and negative patients being statistically significant (38.3% versus 13.5%; p < 0.0001). The prevalence of ASIL for each one of the groups studied was: Group 1 = 49.5%, Group 2 = 28.6%, Group 3 = 3.8%, Group 4 = 21.1%, Group 5 = 11.1%, Group 6 = 30.8% and Group 7 = 18.8%. Standard residual analysis demonstrated that ASIL was significantly prevalent in patients of Group 1 and high-grade ASIL in patients of Group 2. The odds for ASIL of Group 1 was significantly higher in comparison to 90 Groups 2, 3, 4, 5 and 7 (p < 0.03). The odds for ASIL of Groups 2, 4 and 6 were significantly higher in comparison to Group 3 (p < 0.03). CONCLUSIONS: In the patients studied, ASIL (low and/or high-grade) tended to be significantly more prevalent in HIV-positive patients. Nonetheless, HIVnegative anoreceptive patients also presented great probability to have anal cancer precursor lesions, mainly those of the male gender. Key words: Anal Canal. Anus Neoplasms. Epidemiology. HIV. RESUMO OBJETIVO: Investigar a prevalência de lesões intraepiteliais escamosas anais (ASIL) ou câncer anal em pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. MÉTODOS: 344 pacientes consecutivamente atendidos na instituição, em 2007/2008, foram distribuídos nos seguintes estratos conforme a presença/ausência de fatores de risco para o câncer anal: Grupo 1 – homensque-fazem-sexo-com-homens HIV-positivos (101); Grupo 2 – mulheres HIVpositivas (49); Grupo 3 – pacientes sem condição de risco para o câncer anal (53); Grupo 4 – homens heterossexuais HIV-positivos (38); Grupo 5 – pacientes HIV-negativos, sem hábitos sexuais anorreceptivos, mas com outras condições de risco para o câncer anal (45); Grupo 6 – homens-que-fazem-sexo-comhomens HIV-negativos (26); e Grupo 7 – mulheres HIV-negativas, com hábitos sexuais anorreceptivos (32). Os resultados histopatológicos das biópsias anais dirigidas pela colposcopia anal foram analisados por meio de estatística frequentista e bayesiana para a determinação da prevalência-ponto de ASIL/câncer e verificar eventual preponderância estatística de um grupo sobre o outro. RESULTADOS: A prevalência-ponto de ASIL para todos os pacientes estudados foi de 93/344 (27%), sendo significativa a diferença entre HIVpositivos e negativos (38,3% versus 13,5%; p < 0,0001). A prevalência de ASIL 91 para cada um dos grupos estudados foi: Grupo 1 = 49,5%, Grupo 2 = 28,6%, Grupo 3 = 3,8%, Grupo 4 = 21,1%, Grupo 5 = 11,1%, Grupo 6 = 30,8% e Grupo 7 = 18,8%. A análise de resíduos demonstrou prevalência significante de ASIL para o Grupo 1 e de ASIL de alto-grau para o Grupo 2. A razão-de-chances do Grupo 1 para ASIL foi significantemente maior em comparação com os Grupos 2, 3, 4, 5 e 7 (p < 0,03). A razão-de-chances para ASIL dos Grupos 2, 4 e 6 foi significantemente maior em comparação com o Grupo 3 (p < 0.03). CONCLUSÕES: Nos pacientes estudados, ASIL (baixo e/ou alto-grau) foi significantemente mais prevalente em pacientes HIV-positivos. Entretanto, pacientes HIV-negativos anorreceptivos também apresentaram grande probabilidade de possuir as lesões, especialmente os do gênero masculino. Descritores: Canal Anal. Neoplasias do Ânus. Epidemiologia. HIV. ¹Research performed at Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil 92 Introduction Anal cancer, although rare in the general population, has shown an increase in incidence in recent decades in some sections of the population considered at greater risk of developing the disease.¹ The disease is associated with continued anal human papillomavirus (HPV) infection. About 75% of the sexually active population will develop HPV anogenital infection throughout life, although most of the affected individuals will not present clinical signs of the illness.² When present, these signs (mainly anal intraepithelial neoplasia, or AIN) are similar to those found in association with cervical cancer, a malignancy with which anal cancer shares many characteristics.³ Following the classification of cervical intraepithelial neoplasia, anal cancer precursor lesions, alike, have been conventionally defined as AIN 1, AIN 2 and AIN 3. In accordance with what is experienced with cervical intraepithelial neoplasia, to minimize considerable inter and intra-observer interpretative variability, the 2001 Bethesda Classification System of cellular atypia is used so that AIN 1 is defined as LSIL (low-grade squamous intraepithelial lesion) and AIN 2 and 3 are unified in a sole category, HSIL (high-grade squamous intraepithelial lesion).4 Patients with HSIL lesions are at an increased risk to develop anal cancer. 5 Nevertheless, depending on the genotype of the infecting HPV, in the presence 93 of infection with multiple HPV types and under immunodepressive conditions, lesions considered to be LSIL at admittance can evolve to HSIL. This is the case for individuals infected with acquired immunodeficiency virus (HIVpositive) and especially for HIV-positive men-who-have-sex-with-men (MSM).6 However, even among women, the incidence of anal cancer is 7 times greater in HIV-positive individuals in contrast to HIV-negative with other at risk conditions for the malignancy.² Strict follow-up policies directed at patients considered to be at risk to develop anal cancer have been implemented in some institutions based on data that indicate a historical increase in the incidence of the malignancy in these population groups.7 Therapeutic management of lesions at a higher risk to evolve to malignant degeneration is the objective of these policies in an attempt to reduce the incidence of anal neoplasia.8 The Tropical Medicine Foundation of Amazonas (FMT-AM) is a public health service of the state of Amazonas, Brazil, specialized in the treatment of infectious diseases. The majority of HIV infected individuals of the state are referred to FMT-AM for diagnosis, follow up and treatment. From January 2007, HIV-positive patients followed up in the institution, as well as other HIV-negative patients presenting colorectal complaints, were referred to its Coloproctology Outpatient Clinic. Until then, there was no consolidated data on the magnitude of the frequency of anal cancer precursor lesions among patients managed only at FMT-AM. 94 This work was, therefore, designed to evaluate the frequency of anal squamous intraepithelial lesions (ASIL) and anal cancer in patients who were examined at the institution in order to gather evidence to corroborate the need to implement a follow-up and treatment routine program directed at patients at risk of developing anal malignancy. Methods Ethics and patients This cross-sectional observational study was approved by the Ethics in Research Committee of FMT-AM (CEP/FMT-AM nº 1768/2006). The data relative to the patients herein included were collected from those seeking medical evaluation at FMT-AM and referred to the institution’s Coloproctology Outpatient Clinic for consultation from January 2007 to December 2008. The population studied included consecutively attended HIV-positive and HIVnegative individuals, from both genders, with and without risk factors for the development of anal cancer who had never before been submitted to coloproctological examination or sampling at FMT-AM. All the individuals presenting one the following criteria were excluded: age below 18 years, developmental disabilities, native Brazilian Indians, those who did not complete any stage of specimen collection, those with missing or unsatisfactory specimens, and those missing crucial data for statistical analysis. 95 All the patients who signed the Informed Consent forms were interviewed and responded to a questionnaire directed at their epidemiological characteristics and anal cancer risk conditions. Out of the 399 patients examined in the study period, after applying inclusion and exclusion criteria, 344 were screened for analysis. These patients were further stratified in the following groups according to the presence or absence of anal cancer risk conditions: Group 1 = HIV-positive MSM (101 patients); Group 2 = HIV-positive females (49 patients); Group 3 = individuals of both genders without anal cancer risk factors or behaviors (53 patients); Group 4 = HIVpositive heterosexual males (38 patients); Group 5 = HIV-negative individuals of both genders without anoreceptive sexual habits, but that reported at least one among the other inquired anal cancer risk factors or behaviors (current tobacco smoking, injection drug addiction, sexually transmitted diseases, solid organ transplantation, and history of anogenital cancer or its precursor lesions) (45 patients); Group 6 = HIV-negative MSM (26 patients); and Group 7 = HIVnegative females with anoreceptive sexual habits (32 patients). Biopsy proceedings All the patients were submitted to high-resolution anoscopy with biopsies after topical application of a 3% acetic acid solution for 2 minutes as described elsewhere,9 but with the following modifications: at least two biopsies were made in the anal canal of each subject. Patients without acetowhitening at highresolution anoscopy were submitted to biopsies within the anal transitional zone at standard positions (4 and 7 o’clock, considering the anterior anal commissure 96 as 12 o’clock). Patients with anal canal acetowhitened lesions had all of them biopsied and an additional biopsy was performed in a non-acetowhitened anal transitional zone area. The formalin-fixed biopsy specimens were delivered to the Department of Pathology of FMT-AM for processing and evaluation. Hematoxilin-eosin-stained slides prepared from 4 µm-thick sections of the paraffin blocks containing the anal specimens were diagnosed by three pathologists. Only consensual results were considered. The projected possible histopathological results were: negative-for-ASIL (LSIL or HSIL) or cancer, including benign inflammatory alterations, condyloma acuminatum, LSIL, HSIL, epidermoid carcinoma in situ, adenocarcinoma in situ, invasive epidermoid carcinoma, and invasive adenocarcinoma. Anal condyloma, LSIL and HSIL were diagnosed according to well established morphological parameters.10 Statistical analysis Statistical analyses of the observed data were performed with R statistical software11 for the entire population sample, considering ethnic and educational differences, for HIV-positive and HIV-negative patients, and for the population sample strata that considered the presence or absence of anal cancer risk factors or behaviors. 97 Descriptive summaries of epidemiological characteristics were evaluated. The population sample characteristics were tested against the observed histopathological results using frequentist and Bayesian – via R package LearnBayes12 – statistical methods for analysis of contingency tables, the Monte Carlo test13, analysis of Standard Residuals and Correspondence Analysis. The odds for association with ASIL were calculated for each combination of two strata of patients. Statistical significance was inferred whenever the p-value of conventional statistical tests was found below 5%, when Bayesian posterior probabilities favored some given hypothesis and when absolute values of standard residuals were above 1.96. For the statistical analysis, LSIL results encompassed anal condyloma, and only one result was attributed per patient: that with the highest grade of severity in the Negative-for-ASIL → ASIL → Cancer sequence. Results Due to missing data in respect to some non-crucial study variables, the sample size of some epidemiological analyses varied. Regarding the ethnic breakdown, the larger number of brown skinned patients reflects the regional ethnic composition of the Amazonian population. In terms of educational level, patients with less than a higher educational level were significantly more numerous (p < 0.0001). The distribution of ASIL-positive and 98 ASIL-negative histopathological results in relation to the ethnic groups and to the educational level showed no differences either by frequentist or by Bayesian statistical analyses (Bayes factor = 0.001963119 for ethnic characteristics and 0.01647418 for educational level). The prevalence of ASIL in all the patients analyzed showed a significant difference between HIV-positive and HIVnegative individuals. (Table 1) TABLE 1. Frequencies of Histopathological Results of Anal Biopsies by Ethnic Breakdown, Level of Education and HIV status HP ASIL Ethnic Category White Brazilian Pardo Brazilian Afro-Brazilian Asian Brazilian TOTAL Level of Education Primary Secondary Higher Illiterate TOTAL HIV Positive Negative TOTAL % 95%CI 27.63 27.16 17.65 0.00 26.63 17.99-39.09 21.67-33.22 3.80-43.43 0.00-77.64 21.99-31.68 – ASIL % 95%CI 72.37 72.84 82.35 1.00 73.37 60.91-92.01 66.78-78.33 56.57-96.20 22.36-1.00 68.32-78.01 – 21 66 3 0 90 – TOTAL – 55 177 14 2 248 – 76 243 17 2 338 0.6818 – 26 21.14 14.30-29.42 97 78.86 70.58-85.70 123 48 15 1 90 29.45 31.91 33.33 26.79 22.58-37.08 19.09-47.12 0.84-90.57 22.12-31.86 115 32 2 246 70.55 68.09 66.67 73.21 62.92-77.42 52.88-80.91 9.43-99.16 68.14-77.88 163 47 3 336 – p-value* – 0.3497 – 72 21 38.30 13.46 31.32-45.65 8.53-19.84 116 135 61.70 86.54 54.35-68.68 80.16-91.47 188 156 93 27.03 22.41-32.06 251 72.97 67.94-77.59 344 0.0001 HP = histopathological result; ASIL = positive for anal squamous intraepithelial lesion; ASIL = negative for ASIL; 95%CI = 95% Confidence Interval; *² Pearson’s Test The mean age of all the screened patients was 39 years. MSM tended to be younger than females (33 years versus 40 years) and patients without risks for anal cancer older than all others groups (46 years). 99 Table 2 shows the distribution of frequencies of histopathological results of the anal canal biopsies performed in all the patients studied relative to their sample strata. TABLE 2. Frequencies of Anal Canal Histopathological Diagnoses According to Population Sample Strata Studied Histopathological Result Group LSIL Total % 95%CI 29 28.71 20.15-38.57 HSIL % 95%CI NEG % 95%CI Total 21 20.79 13.36-30.01 51 50.50 40.36-60.60 101 11 22.45 11.77-36.62 35 71.43 56.74-83.42 49 3 6.12 1.28-16.87 1 1.89 0.05-10.07 1 1.89 0.05-10.07 51 96.23 87.02-99.54 53 5 13.16 4.41-28.09 3 7.89 1.66-21.38 30 78.95 62.68-90.45 38 3 2 4.44 0.54-15.15 40 88.89 75.95-96.29 45 5 19.23 6.55-39.35 3 11.54 2.45-30.15 18 69.23 48.21-85.67 26 6 18.75 7.21-36.44 0 26 81.25 63.56-92.79 32 251 72.97 67.94-77.59 344 6.67 1.40-18.27 52 15.12 11.50-19.35 0.00 0.00-8.94 41 11.92 8.69-15.82 HIV-positive men who have sex with men (MSM); HIV-positive females; individuals of both genres without anal cancer risk factors; HIV-positive heterosexual males; HIV-negative individuals of both genres without anoreceptive sexual habits, but with other anal cancer risk factors; HIV-negative MSM; HIVnegative females with anoreceptive sexual habits; LSIL = low grade squamous intraepithelial lesion; HSIL = high grade squamous intraepithelial lesion; NEG = biopsy negative for anal squamous intraepithelial lesion. 95%CI = 95% Confidence Interval; G-Test (Williams) = 64.4682 (P<0.0001) As some of the cells of Table 2 contain less than 5 subjects, a feature that could compromise the validity of the conventional statistical analysis of the data disposed in the table, which pointed to a p-value below 0.0001, a Monte Carlo test was initially applied to the same data. The approximated p-value obtained was 0.0004998, indicating that the null hypothesis of independence should indeed be rejected, a reflex of statistical significance. A Bayesian analysis of the data was also undertaken for the same purpose and the value of the Bayes factor was 480,615.50, indicating a very strong evidence against the existence of independence, again indicating statistical significance. 100 As all the statistical methods employed led to the same results, it could be stated that the strata of the population sample studied showed very different histopathological findings when compared to each other. The mosaic plot of Figure 1 is a pictorial representation of the proportions of frequencies showed in Table 2 relative to each Group of patients. The width of each bar is representative of the size of the respective Group, while the height of each one of the three segments that form a bar represents the proportional distribution of frequencies of histopathological results (LSIL, HSIL and NEG) regarding every individual Group of patients. Figure 1. Distribution of Proportional Frequencies of Histopathological Results of Anal Biopsies HIV men-who-have-sex-with-men (MSM); HIV females; individuals of both HIV heterosexual males; HIV individuals of both genders without anoreceptive sexual habits, but with other anal cancer risk factors; HIV MSM; HIV females with HP = histopathological; genders without anal cancer risk factors; anoreceptive sexual habits; LSIL = low-grade squamous intraepithelial lesion; HSIL = high-grade squamous intraepithelial lesion; NEG = biopsy negative for anal squamous intraepithelial lesion. 101 It can be visually perceived in Figure 1 that patients of Groups 1 and 6 showed evident association with positive results for ASIL (LSIL and HSIL), that patients of Group 2 showed evident association with HSIL, and that patients of Group 7 showed evident association with LSIL. As to results NEG, the most evident association is that presented by patients of Group 3. Despite being friendly, though, this is an entirely intuitive assessment. An evaluation of the behavior of the dependence between histopathological results versus nature of sample strata was then undertaken by the analysis of standard residuals (Table 3). TABLE 3. Analysis of Standard Residuals of the Frequencies Histopathological Results Relative to the Population Sample Strata Studied Group HIV-positive Histopathological results LSIL HSIL of NEG 2.58 3.51 -2.64 2.14 -1.62 -0.13 -2.16 -2.48 1.98 -0.72 -0.31 0.43 -1.45 -1.46 1.25 -0.06 0.54 -0.22 -1.95 0.53 0.55 men-who-have-sex-with-men (MSM); HIV-positive females; individuals of both HIV-positive heterosexual males; HIV-negative individuals of both genres without anoreceptive sexual habits, but with other anal cancer risk factors; HIV-negative MSM; HIV-negative females with anoreceptive sexual habits; HSIL = high-grade squamous intraepithelial lesion; LSIL = low-grade squamous intraepithelial lesion; NEG = biopsy negative for anal squamous intraepithelial lesion. genres without anal cancer risk factors; The highest positive residuals were given by the combinations: Group 1 + ASIL (either LSIL or HSIL), Group 2 + HSIL and Group 3 + Negative-for-ASIL. The 102 most pronounced negative residuals were observed with: Group 3 + ASIL, Group 1 + Negative-for-ASIL and Group 7 + HSIL. Finally, concentrating the values of rows LSIL and HSIL, from Table 2, in a single row called ASIL, the odds ratios for ASIL of Group 1 were estimated against the histopathological results of each one of the other groups (Table 4). TABLE 4. Comparative Odds Ratios of Group of Presenting Anal Squamous Intraepithelial Lesions Group OR 2.5 25 3.7 7.8 2.2 4.3 95%CI p-value 1.20 5.22 0.0241 7.22 - 158.07 <.0001 1.60 - 9.31 0.0045 3.10 - 24.18 <.0001 0.90 - 5.80 0.1363 1.70 - 12.21 0.0042 HIV-positive men-who-have-sex-withmen (MSM); HIV-positive females; individuals of both genres without anal cancer risk conditions; HIV-positive heterosexual males; HIV-negative individuals of both genres without anoreceptive sexual habits, but with other anal cancer risk conditions;HIV- negative MSM; HIV-negative females with anoreceptive sexual habits; OR = odds ratio; 95%CI = 95% Confidence Interval The greatest odds ratio was observed between Groups 1 and 3. The hypothesis of equality between the odds for ASIL of Groups 1 and 6 could not be rejected, considering the observed 95% Confidence Interval (p = 0.14). Inequality was observed in all other comparisons. The odds ratios formed between the 103 remaining combinations of two groups were also tested. All of them were nonsignificant, except for those obtained between Groups 2 and 3 (10.20; 95% Confidence Interval = 2.18 47.71; p = 0.0015), 6 and 3 (11.33; 95% Confidence Interval = 2.20 58.43; p = 0.0024), and 4 and 3 (6.80; 95% Confidence Interval = 1.35 34.15; p = 0.0239). Discussion This work is based on an analysis of frequencies of histopathological diagnoses observed in anal canal biopsies performed in HIV-positive and HIV-negative patients by attending Coloproctologists at FMT-AM. All patients underwent biopsy proceedings, including those who had no obvious acetowhite lesions during high-resolution anoscopy. This is a differential aspect of this study, considering that if only individuals with positive anal cytology and anoscopy were included, patients in whom these diagnostic tests were false-negative would have been excluded. Two biopsies were performed in each acetowhite negative patient in order to minimize the chance of false negative anoscopy interpretations. On the other hand, there were cases of diffuse anal transitional zone acetowhitening either due to wart rings or to nonspecific staining. Multiple biopsies were performed for all these cases. Statistical analysis of data gathered for this study is distinctive in the aspect that it was conducted contrasting conventional tests (frequentist, such as Chi-square and G tests) with non-conventional (mainly Bayesian analysis and analysis of standard residuals), in order to validate the final conclusions. 104 The Bayesian method is based on the computation of the Bayes factor, which is the ratio of probabilities observed after data collection of two considered hypotheses (presence of independence versus lack of independence). It measures the evidence against the existence of independence. A result greater than 1.00 favors lack of independence (statistical significance). Otherwise, the hypothesis of independence is to be accepted. The analysis of standard residuals is a mensuration of the degree of deviation of the measurements away from the hypothesis of independence. Each residual is calculated as (observed expected)/expected², in which observed represents the cell value and expected is the expected value of the cell considering the null hypothesis was true. Roughly, it is assumed that residuals with absolute values above 1.96 represent cells with more individuals than expected for independence (statistical significance). The non-conventional statistics employed in this study corroborated and reinforced the results obtained by frequentist statistics. Abramowitz et al. reported 108 HPV-related lesions in 473 HIV-positive patients of both genders with or without anoreceptive sexual habits (22.8%). The prevalence of ASIL (condyloma included) was 36.5% in HIV-positive MSM, 14.6% in HIV-positive heterosexual males and 11.3% in HIV-positive females, but only 47.2% of these lesions were located solely in the anal canal.14 Comparatively, in FMT-AM’s survey of exclusively intra-anal HPV-induced 105 lesions, the prevalence of ASIL among HIV-positive patients was 38.30% (49.50% in MSM, 28.57% in females and 21.05% in heterosexual males). The initially managed group of HIV-positive individuals at FMT-AM showed a prevalence of ASIL above 60%, but most of them had AIDS or HIV infection for many years. Durable HIV infection seems to be accompanied by a higher risk for ASIL because the frequency of precursor lesions of anal cancer in HIVpositive patients has shown a tendency to increase since the advent of highly active antiretroviral therapy.2,5,6 As the coloproctological examination consolidated as a routine for the initial evaluation of HIV-positive individuals at FMT-AM, the frequency of those with a less-than-a-year-diagnosed retrovirus increased, so that it ultimately comprised 54.6% of all HIV-positive patients herein included. Although patients with prolonged HIV infection may be at greater risk to present ASIL,8 it remains to be shown, in studies analyzing the prevalence of ASIL in HIV-positive patients, that it is important to consider the length of time of HIV infection. 14 HIV-positive MSM are known to be the population group most likely to develop anal cancer, and are followed by HIV-negative MSM and by HIV-positive females.2,15 In HIV-positive MSM, the prevalence of ASIL is also high, and was reported to be 81% in 357 patients studied at the University of California at San Francisco.16 In fact, anoreceptive habits increase the likelihood that male patients present ASIL compared with anoreceptive females since MSM tend to have anoreceptive sexual activity more frequently than women and also are 106 prone to have more anal-introducer sexual partners, which makes them more likely to have anal HPV infection.17 Furthermore, HIV infection confers MSM a relative risk 5.7 times greater to have ASIL than HIV-negative MSM.15 Prevalence of ASIL in men investigated at FMT-AM was significantly higher among HIV-positive than in HIV-negative (p = 0.0003) irrespective of the presence of other risk factors for anal cancer. Among HIV-positive men, it was higher in MSM than in heterosexual (p = 0.0045). Nevertheless, ASIL was not statistically more prevalent in HIV-positive men (MSM or heterosexual) compared to HIV-negative MSM (p = 0.1363 and p = 0.3094, respectively), meaning that, in men, “HIV-infection” and “receptive anal intercourse” factors appeared both to be influential in association with ASIL. Prevalence of cytological or histological ASIL in HIV-positive females was estimated to be 14.5% in a multicentric study recently conducted at five academic centers in the U.S.18 Although comparatively smaller than the one reported for HIV-negative MSM in the EXPLORE study (20%), which was based on cytological results,19 both prevalences are considerably higher than that described by Holly et al. (8%) in HIV-negative females with other risk factors for anal cancer in a study also based on cytological results.17 In this study, HIV-positive females showed a frequency of HSIL significantly higher than anoreceptive HIV-negative females (p = 0.0064), while the latter had a frequency of LSIL higher than the former, but without statistical significance (p = 0.1139). Even considering that 75% of the HIV-positive 107 females studied practiced anoreceptive sex and that the other risk factors for anal cancer were unevenly distributed between the two groups, it could be reasoned that, in the females studied, the condition of being HIV-positive was linked to the elevated association with HSIL and that the practice of anoreceptive sex predisposed HIV-negative females to LSIL association. Indeed, in Hessol et al.’s study of a cohort of HIV-positive and HIV-negative US women, all at risk for anal cancer development, those who reported anal intercourse were 3.8 times more likely to have anal LSIL than women with no history of anoreceptive sex, while HIV-positive women were 3.1 times more likely to have anal HSIL than HIV-negative women.17 Despite that it was not possible to rigorously and independently indicate the exact factors mostly associated with the presence of ASIL in each population strata, since some confounding factors could not be dissociated in the strata (e.g.: HIV-positive MSM, HIV-positive females, HIV-positive heterosexual males, HIV-negative MSM and HIV-negative anoreceptive females could or could not have other risk factors for anal cancer, such as current tobacco smoking) it may be inferred from the comparative analysis of the proportions of the frequencies of the histopathological diagnoses observed among the groups, that conditions “anal intercourse” and “HIV infection” were those associated with more positive results for LSIL and/or HSIL. The absence of risk factors for anal cancer (presented by Group 3 of patients) was, conversely, the feature most significantly associated with negative results (and also with lower rates of positive results) for ASIL. 108 Although the population sample strata observed in this study were unevenly sized, including some with few individuals, the combined evaluation of the data done by frequentist and alternative statistical methods suggests, with a high degree of confidence, that HIV-positive MSM were significantly more associated with ASIL results than all other groups, except for HIV-negative MSM; that HIVpositive females were significantly more associated with HSIL results than all other groups, except for HIV-positive MSM; and that patients from Group 3 were significantly more associated with Negative-for-ASIL results than all other groups, except for Group 5. One can argue that groups 3 and 5 should not be compared to the remaining groups since they were composed of patients from both genders, while the others were not. Nevertheless, there was no statistical difference between genders in the distribution of ASIL within groups 3 and 5. Conclusions The authors conclude that both HIV-positive patients and HIV-negative patients with anoreceptive sexual habits followed up at the Coloproctology Outpatient Clinic of FMT-AM presented elevated point-prevalences of ASIL (low-grade and/or high-grade). References 1. Daling JR, Weiss NS, Hislop TG, Maden C, Coates RJ, Sherman KJ, Ashley RL, Beagrie M, Ryan JA, Corey L. Sexual practices, sexually transmitted diseases, and the incidence of anal cancer. N Engl J Med 1987;317:973-7. 109 2. Bratcher J, Palefsky J. Anogenital human papillomavirus coinfection and associated neoplasia in HIV-positive men and women. The PRN Notebook. 2008;13:1-8. 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Financial source: National Program of DST-AIDS, Ministry of Health of Brazil – UNESCO (grant 914BRA1101). 112 4.3 Running headline: P16 AS A SURROGATE CYTOLOGICAL MARKER OF ASIL 113 Performance of p16INK4a immunocytochemistry as a marker of anal squamous intraepithelial lesions Ivan T Costa e Silva, Michelle C Ribeiro, Felicidad S Gimenez, Júnia Raquel D Ferreira, Renata S Aragão, Paula Emanuelle V Hargreaves, Adriana G D P Guimarães, Luiz Carlos L Ferreira This research was performed at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas / University of the State of Amazonas, Manaus – Brazil (ITCS, MCR, JRDF, RSA, PEVH, AGDPG, LCLF), and Department of Surgery (FSG) of the Federal University of Amazonas. Correspondence and Requests for Reprints to: Ivan Tramujas da Costa e Silva, MD, MSc. Federal University of Amazonas, Department of Surgery, R. Afonso Pena, 1053, Manaus – AM, Brazil, Zip Code: 69020-160. email: [email protected]. Disclaimers: all authors have no conflicts of interest. Funding: Sponsored by the National Program of DST-AIDS, Ministry of Health of Brazil – UNESCO (grant 914BRA1101) 114 Abstract Protein p16INK4a (p16) is overexpressed in anogenital lesions harboring integrated high-risk human papillomavirus (HPV) genotypes. Therefore, p16 immunocytochemistry (ICCp16) has the potential to reveal lesions at risk of progression to anal cancer and be a surrogate marker of these lesions. This study examined the measures of diagnostic validity of ICCp16 (immunoperoxidase method with anti-p16-clone 6H12) in conventional and GlucyteTM smears in 190 HIV-positive patients consecutively treated at the outpatient clinic of Coloproctology of Tropical Medicine Foundation of Amazonas in 2007/2008. Histopathological results of concomitant anal biopsies monitored by high-resolution anoscopy and HPV typing out of anal scrapings by polymerase chain reaction were used as gold-standards. No statistically significant association was found between the immunochemical results (conventional or GlucyteTM smears) and histopathological or HPV genotyping findings (p > 0.05). In the best scenario, ICCp16 presented 31% sensitivity and 81% specificity for the diagnosis of anal squamous intraepithelial lesions (ASIL) and 30% and 66%, respectively, for the diagnosis of infection with high-risk HPV. These results suggest the need for improvements in the technique of p16immunocytochemistry before the marker can experience wide acceptance in clinical practice. Keywords: Anus Neoplasms; Genes, p16; Immunocytochemistry; Precancerous Conditions/diagnosis; Sensitivity and Specificity. 115 Introduction Due to the increasing incidence of anal cancer that has been observed in recent years,(Johnson et al. 2004) and because it is considered a plausible hypothesis that the natural history of anal cancer resembles that of the cervix, including having the same association with continued infection by the human papilloma virus (HPV),(Melbye & Sprogel 1991) much of what was achieved in reducing the historical incidence of cases of cervical cancer has been replicated for the prevention of anal cancer in the hope that the same good results are obtained.(Palefsky & Cranston 2009) Within this context is the growing effort that is undertaken to detect anal cancer precursor lesions (anal squamous intraepithelial lesions, or ASIL) through diagnostic tests similar to those that have been employed for a long time in the early diagnosis of cervical cancer.(Medical Advisory Secretariat 2007) The anal pap smear, a method similar to cervical pap smear, is reputed as a test that provides diagnostic accuracy rates similar to the cervical counterpart,(de Ruiter et al 1994; Friedlander, Stier & Lin 2004; Palefsky et al 1997) although it is prone to considerable intra- and interobserver interpretive variability.(Lytwyn et al 2005) Much of this variability is observed in differentiating between cellular aberrations caused by benign inflammatory changes in the anal transitional zone (ATZ)(Fenger 1979) and ASIL of low grade (LSIL) or high grade (HSIL). There is also some difficulty in characterizing atypical squamous cells of undetermined significance (ASC-US) as HSIL or less than HSIL lesions.(Longacre, Kong & Welton 2008; Lytwyn et al 2005) 116 In an attempt to increase the reliability of cytology in the diagnosis of precursor lesions of cervical cancer, several markers of aberrant cells derived from lesions with higher malignant potential have been investigated.(Gravitt et al 2008) Protein p16INK4a (p16) immunocytochemistry is one of the most studied markers.(Tsoumpou et al 2009) Protein p16, a product of gene CDKN2A, is an inhibitor of kinases 4 and 6 dependent of cyclin D, which, under normal conditions, through a negative feedback stimulation, prevents the phosphorylation of retinoblastoma protein (pRb) and subsequent release of cellular transcription factor E2F. Cells, under E2F stimulus, leave the cell cycle checking stage named G1 and proceed to the phase of DNA synthesis (S) and replication. Under p16 control, cells remain in G1 and do not follow to S.(Khleif et al 1996) In tissues infected with high-risk HPV (HR-HPV), the viral oncogene E7 causes inactivation of both p16 and pRb functions and stimulates cells to enter the S phase after a brief pause at G1. E7 causes increased expression of a hypophosphorilated non-functional pRb and promotes the inactivation of the overexpressed p16, that will not be able to block the action of complex CDK46/ciclin D, nor to inactivate the other active viral oncogene, E6, the product of which inactivates tumor suppressor protein p53, thereby preventing HPVinfected cells to engage into apoptosis. Unrestrained division of cells with p16 overexpression is a feature of anogenital tissues infected by HR-HPV.(Mulvany, Allen & Wilson 2008) 117 Thus, due to similarities between cervical and anal cancers, the employment of p16-immunocytochemistry to enhance the detection capability of cases with precursor lesions with greater potential to progress to anal cancer would be a natural consequence of what has been used in relation to cervical cancer. The prevalence of anal cancer precursor lesions in a group of HIV-positive patients initially treated at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas (FMT-AM) was found to be elevated,(Guimarães 2007) which motivated the institution of a routine coloproctological evaluation of these patients, resulting in the implementation of a comprehensive research project of the methods of early diagnosis of anal cancer in patients seen at the unit. Protein p16 immunocytochemical detection in anal scrapings was part of the project, based on existing literature evidence pointing to the usefulness of this method in the elucidation of doubtful cases of cervical cytology.(Tsoumpou et al 2009) 118 Materials and Methods A primary cross-sectional study of diagnostic evaluation comparing the results of p16-immunocytochemistry (ICCp16) with histopathological and HPV genotyping findings was conducted on patients treated at the Outpatient Coloproctology Clinic of FMT-AM between January 2007 and December 2008. The study was approved by the Ethics in Research Committee of the institution (CEP / FMT-AM 1768 / 2006) and refers to the findings that have resulted merely from the first patient care. Patients Of a total of 399 patients consecutively treated during that period, only those that were HIV-positive were selected for the study. The exclusion criteria were: individuals younger than 18 years, individuals with disabilities, indigenous peoples, those who failed to meet any of the stages of sample collection, those with missing laboratory tests and those with test results considered to be unsatisfactory for analysis. One hundred and forty men and 50 women, aged 18-73 years (mean 35.6 years) were studied. Sampling and biopsy proceedings All patients underwent anal cellular sampling with cytological brush. After introducing it 3 cm cranialwards into the anal canal, in order to reach the ATZ, the brush was rolled 10 times around its axis and withdrawn in a spiraling movement exerting light pressure on the lateral walls of the anal canal. The 119 brush, once removed, was used to produce a conventional smear on a silanized slide, which was immediately immersed in a mailer containing a 96% ethyl alcohol solution. Similar cytological samples were retrieved for ICCp16 in thin layer smears (LBC), and to perform genotyping of HPV by polymerase chain reaction (HPV-PCR). For ICCp16 performed by the method of LBC, the tip of the brush was shaken inside a vial containing the preservation solution of the kit GluCyte TM (Synermed International Inc., Westfield, IN, USA). For the biomolecular test, the cytology brush was stirred inside an Eppendorf tube containing a preservative solution with TRIS-HCL 50 mM, pH = 8,0, and EDTA 1 mM. After anal cytological sampling, the patients were submitted to high-resolution anoscopy monitored anal canal biopsies after topical application of 3% acetic acid, as previously described.(Costa e Silva et al 2008) The biopsy specimens were fixed in 10% neutral, phosphate buffered formalin solution. Cellular and tissue specimens processing The mailers containing the silanized slides with conventional smears, the vials of the GluCyteTM kit containing anal cell suspensions and the jars containing the biopsy specimens were sent to the Laboratory of Pathology of FMT-AM and stored at 25C. After fixation, conventional smears were stored at -20C. 120 Eppendorf tubes were sent to the Laboratory of Molecular Biology of FMT-AM and stored at -20C, pending the timely implementation of the HPV-PCR. Thin-Layer smears: The anal cell samples suspended in GluCyte TM solution were processed according to manufacturer’s instructions in order to produce thin-layer smears.(SynermedTM 2007) LBC smears were performed on silanized slides, fixed in 96% ethanol and, after fixation, stored at -20C. Conventional histopathological stain: microscopic slides were mounted with 4 sections of paraffin embedded anal biopsy specimens. The sections were stained with traditional hematoxylin-eosin (H&E) technique. p16 immunocytochemical stain: cytological smears were unfrozen and rehydrated in a diluted solution of ethyl alcohol followed by immersion in distilled water. Antigen retrieval was done by plunging the silanized slides in a preheated solution of citrate buffer 0.01 Mol with Triton X-100, which was then heated for 10 min at 99C in a microwave oven. After cooling for 20-30 minutes and washing in phosphate buffer solution (PBS) for 5 min, blocking of nonspecific antigens was performed by soaking the slides in solutions of 3% hydrogen peroxide for 5 min and 5% skim milk for 15 minutes. The slides were then sequentially washed in distilled water, stabilized in PBS, dried and the smears delimited with a hydrophobic marking. The marked smears were covered with primary anti-p16INK4a antibody (clone 6H12, Novocastra, NewCastle, UK) at a dilution of 1:400, which was allowed to act overnight. The primary antibody was then consecutively marked with biotinylated secondary 121 antibody and streptavidin-peroxidase (30 min each), and the smears were covered, for 5 min, with diaminobenzidine solution for disclosure of antigenantibody reaction. The final steps consisted of counterstaining with a weak solution of hematoxylin and dehydration with solutions with decreasing dilutions of absolute alcohol, after which the slides were mounted with coverslips. HeLa cells(Lucey, Nelson-Rees & Hutchins 2009) were utilized as positive (Figure 1) and negative controls (no primary antibody was applied) in every immunocytochemical reaction. ICCp16 staining was considered either negative (no staining or only cytoplasmic staining) or positive (positive nuclear staining, with our without cytoplasmic staining) (Figure 2). No assessment was made of the intensity of immunocytochemical staining. Histopathologic analysis considered the following evolutionary diagnostic spectrum of ASIL to cancer: negative for malignancy or ASIL, condyloma acuminatum, anal intraepithelial neoplasia grade I (AIN-I), AIN-II, AIN-III and invasive cancer. Subsequently, condyloma acuminatum and AIN-I were merged in the diagnosis of LSIL and AIN-II and III were considered HSIL. Whenever multiple anal biopsies were performed, the lesion of greater severity in the diagnostic spectrum of ASIL was chosen for analysis. Only consensual immunochemical and histopathological results among the three senior pathologists of the Department of Pathology of FMT-AM were considered for analysis. 122 HPV typing: genotyping of infecting HPV in the thawed exfoliated cell samples of the anal canal was performed by a nested polymerase chain reaction technique using primers MY09 and MY11, and, sequentially, primers GP5+ and GP6+, as described in the literature. (de Roda Husman et al 1995) Only one genotype was isolated from each specimen: that with predominant expression. The results of genotyping of the infecting HPV were issued in three categories: Negative = HPV absent; LR = low-risk HPV types (6, 11, 61, 62, 81, 84, 102); and HR = high-risk HPV types (16, 18, 31, 33, 52, 53, 54, 58, 59, 66, 68, 70, 82, 85). For purposes of data analysis, the intermediate risk serotype 83 was considered HR. Statistical analysis The frequencies of ICCp16 results in conventional and thin layer smears were compared with those of histopathological findings, after the distribution of data in contingency tables that were analyzed by Williams' G test and by the 95% confidence intervals. A similar association was made between ICCp16 and HPV genotyping results. Redistributing the data in 2 X 2 tables, the measures of diagnostic validity (sensitivity, specificity, positive and negative predictive values)(Jekel, Katz & Elmore 2005) of ICCp16 were obtained relative to two gold-standards: histopathological results and HPV-PCR results. In order to obtain the measures of diagnostic validity of ICCp16 in relation to HPV genotyping a cutoff at HRHPV was used to compare PCR results with immunocytochemical findings. 123 The statistical package BioEstat 5.0(Ayres et al 2007) was employed to calculate the p-value for the associations between variables and for the determination of the 95% confidence intervals. Statistical significance was accepted when p ≤ 0.05. 124 Results No case of anal cancer was observed in the HIV-positive patients treated during the study period. The sample sizes for each of the variables studied varied depending on the number of patients who presented satisfactory test results. Only ICCp16 satisfactory results observed in both types of smears studied were analyzed. However, fourteen percent of the results of LBC immunocytochemical smears were unsatisfactory for analysis, while only 3% of conventional smears were. A significant statistical difference according to the 95% confidence intervals was observed in favor of conventional smears. Table I exposes ICCp16 results for the two methods of smear preparation employed in this study in comparison with histopathological results. No statistically significant association was observed regarding ICCp16 results in conventional or LBC smears in comparison to histopathological findings. Likewise positive ICCp16 results in conventional or LBC smears were not useful to point out patients with ASIL and did not help to differentiate LSIL from HSIL. Both kinds of smears showed statistically similar results. Therefore, conventional smears were used for comparison with the results of HPV-PCR, since they represented the larger sample. 125 Table 2 shows the results of ICCp16 in conventional smears in relation to HPVPCR in anal scrapings. There was no statistical association between the variables. Table 3 shows the measures of diagnostic validity of ICCp16 in relation to two gold-standards: the histological results and HPV-PCR. ICCp16 was not sensitive in any of the scenarios of comparison, nor was it able to predict, with confidence, cases associated with ASIL or HPV infection. ICCp16 showed, however, a better specificity in the diagnosis of ASIL when used in thin layer smears. 126 Discussion The hypothesis that supports the use of ICCp16 as a useful tool in early diagnosis of anal cancer is that the detection of the overexpressed protein in atypical cells present in cytological smears would indicate the presence of HRHPV induced lesions in the anal canal, those considered at highest risk of progression to cancer. In this sense, the test would be more accurate than HPV typing in anal scrapings, in which the presence of HPV would indicate merely the existence of a virus infection in the anal canal and not the presence of the virus in a given lesion.(Gohy et al 2008) Likewise, the immunochemical test would be able to mark cells with variable morphological aberrations so that they could be further assessed by a more careful examination to define them as pre-neoplastic or not. Nonetheless, the quality of any p16 immunochemical reaction is influenced by multiple variables. Some of these variables are: the type and fixation time of specimens; the type of protocol used for antigen retrieval; the sensitivity of the detection system; the type, the lot and the concentration of the primary antibody used; and the appropriate blockage of nonspecific antigens. Adding to these variables, the lack of standardization in differentiating p16-positive reactions from false-positivity contributes to the discordant data reported in the literature, even when ICCp16 was employed in the more thoroughly investigated cervical specimens.(Mulvany, Allen & Wilson 2008) 127 Tsompou et al, in a systematic review of literature with meta-analysis on p16immunochemistry of cervical cytological and histological specimens, observed that, although the technique is easily employed in both types of specimens, evaluation of comparative results in the literature is compromised by the lack of a standardized methodology, particularly regarding cytological specimens. The authors state that they failed to find a general consensus about the threshold at which a sample should be considered p16-positive.(Tsoumpou et al 2009) Many of the slides examined in this study showed strong background staining which hampered the assessment of squamous cells on the lookout for atypical features. This difficulty was more evident in cases where there was the presence of fecal debris, bacteria, erythrocytes or inflammatory cells (not uncommon findings in anal scrapings). Despite the dilution of primary antibody used in this study (1:400) was obtained after successive test reactions, yet the presence of background staining was observed in 16% of slides with conventional smears and 43% of smears made by the thin layer technique (a significant difference against LBC). This difference may be due to the characteristics of the LBC method employed, in which the smears were performed with the centrifuged sediments of anal scrapings, which would concentrate not only cells but also the residues responsible for the immunocytochemical background. Paucicellularity, predominance of anucleated squamous cells or smears containing only glandular cells were also observed in 8% and 10%, respectively, of conventional and LBC smears. Such findings may also have affected the 128 immunocytochemical results as there were not many nucleated squamous cells to be investigated in search of atypias in these slides. To our knowledge, the only published report about the use of p16 immunochemistry in anal cytological specimens is that of Darvishian et al. The authors destained 43 archived anorectal ThinPrep pap smears and submitted them to immunochemical staining using the avidin/biotin method with CINtec's p16INK4a monoclonal antibody, clone E6H4 (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA). Only the smears of patients that had archived anal biopsies performed within the period of a year were selected. The dilution of the primary antibody used was not reported and positive results were considered those with immunochemical staining present in the nucleus and/or the cytoplasm. The authors obtained positive ICCp16 results in 28 of the 43 (65%) slides studied. No correlation between severity of dysplasia and staining intensity was observed. Five cases with benign tissular findings (12%) and 10 cases with LSIL or HSIL (23%) were ICCp16-negative. The measures of diagnostic validity of ICCp16 in detecting ASIL or cancer obtained were: sensitivity of 72%, specificity of 71%, positive predictive value (PPV) of 93%, and negative predictive value (NPV) of 33%.(Darvishian et al 2006) Comparatively, the study herein reported examined cytological specimens taken from 190 HIV-positive patients at the same visit in which anal biopsies were performed, so that the immunocytochemical results were more representative of the histological findings. Sixty-six of 169 (39%) conventional cytological slides were p16-positive. Of these, only 30 (45%) corresponded to LSIL or HSIL 129 cases. Among the 103 p16-negative cases, seventy (68%) corresponded to anal biopsies negative for ASIL or anal cancer and 33 (32%) to LSIL or HSIL cases. As in Brazil conventional smears are more commonly used in comparison to LBC smears, ICCp16 was here executed in both types of smears in order to compare their individual performance. Both smears were equally inaccurate as indicators of the presence of ASIL, so that the results of diagnostic validity of ICCp16 of our study were generally inferior to those reported by Darvishian et al., although the LBC smears have shown greater specificity for ASIL (81% versus 71%). Morphological differentiation of cells with overexpression of p16 protein can not always distinguish between atypical cells and those that are found in benign immature metaplasia, so that there is need for training and experience in the assessment of p16-immunostained slides counterstained with hematoxylin.(Meyer et al 2007) A nuclear scoring system of p16-positive cells was proposed in cervical immunocytochemistry for differentiating between atypical cells and atrophic or metaplastic cells.(Wentzensen et al 2005) It was demonstrated that this system was able to significantly increase the specificity of ICCp16 without diminishing sensitivity in detecting cases with reflex histopathology revealing HSIL. It was also shown that the qualitative methodology proposed to identify cells with nuclear aberrations was able to predict, with the detection of only one p16positive cell, the presence of HSIL in the corresponding histopathological finding.(Wentzensen et al 2007) 130 Hence, it is possible that further investigation regarding nuclear scoring in automated ICCp16 techniques performed in LBC anal smears free of contaminants may enhance the accuracy of the method in the early diagnosis of anal cancer. 131 Conclusions In this research p16-immunocytochemistry was not a sensitive test for the diagnosis of squamous intraepithelial lesions or of infection with high-risk types of human papillomavirus in anal specimens from HIV-positive patients. However, good specificity for the diagnosis of anal squamous intraepithelial lesions was observed when p16-immunocytochemistry was performed on thin layer cell smears. 132 Acknowledgements: The authors are thankful for the expert technical support of Biologist Roberto Silva Junior, Pathology Technicians Sandra Caranhas, Sandra Oliveira, Carlos Marques, Andreza Fernandes and Maria Silva, of Administrative Technician Agustinho Monteiro and of Graduate Students of Medicine at Federal University of Amazonas Bruno Souza, Willian Stremel, Camila Cunha, Gisele Milano, Natália Oliveira, Stephany Silva, Christine Pedrosa, Drielle Sales, Elmo Costa, Paulo Sérgio Merchak Junior and Renata Jessica Romano. 133 Literature Cited Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Ayres M, Ayres Jr, M, Ayres DL, Santos AAS (2007) BioEstat 5.0. 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Scale = 10. 137 Table 1 – Association among p16INK4a immunocytochemistry and histopathological results in HIV-positive patients at Tropical Medicine Foundation of Amazonas Histopathological results ICCp16con LSIL % (95% CI) HSIL % (95% CI) NEG % (95% CI) TOTAL Positive 15 22.7 (13.3-34.7) 15 22.7 (13.3-34.7) 36 54.6 (41.8-66.9) 66 Negative 16 17 16.5 (9.9-25.1) 70 68.0 (58.0-76.8) 103 TOTAL 31 18.3 (12.8-25.0) 32 18.9 (13.3-25.7) 106 62.7 (55.0-70.0) 169 15.5 (9.2-24.0) p value* 0.219 ICCp16lbc Positive 5 29.4 (10.3-56.1) Negative 8 13 TOTAL ICCp16 con 3 17.7 (3.8-43.4) 9 52.9 (27.8-77.0) 17 14.3 (6.4-26.2) 10 17.9 (8.9-30.4) 38 67.9 (54.0-79.7) 56 17.8 (9.8-28.5) 13 17.8 (9.8-28.5) 47 64.4 (52.3-75.3) 73 = p16 immunocytochemistry in conventional citology smears; ICCp16 lbc 0.3969 = p16 immunocytochemistry in thin layer citology smears; LSIL = low-grade squamous intraepithelial lesions; HSIL = high-grade squamous intraepithelial lesions; NEG = negative for cancer or precancerous lesion; 95% CI = 95% confidence interval; *Williams' G test Table 2 – Association between p16INK4a immunocytochemistry and human papillomavirus genotyping results in HIV-positive patients at Tropical Medicine Foundation of Amazonas HPV genotyping result ICCp16con LR % (95% CI) Positive 8 27.6 (12.7-47.2) Negative TOTAL HR Negative % (95% CI) TOTAL 20.7 (8.0-39.7) 15 51.7 (32.5-70.6) 29 18 31.0 (19.5-44.5) 14 24.1 (13.9-37.2) 26 44.8 (31.7-58.5) 58 26 29.9 (20.5-40.7) 20 23.0 (14.6-33.3) 41 47.1 (36.3-58.1) 87 HPV = human papillomavirus; ICCp16 6 % (95% CI) con = p16 immunocytochemistry in conventional cytology smears; LR = low-risk HPV; HR = high-risk HPV; 95% CI = 95% confidence interval; p = 0.8347 (Williams' G test) 138 Table 3 – Measures of diagnostic validity of p16INK4a immunocytochemistry in HIV-positive patients at Tropical Medicine Foundation of Amazonas Comparison Sensitivity (%) Specificity (%) PPV (%) NPV (%) ICCp16con/HP 47.6 66.0 45.5 68.0 ICCp16lbc/HP 30.8 80.9 47.1 67.9 ICCp16con/PCR¹ 30.0 65.7 20.7 75.9 con ICCp16 /HP = p16 immunocytochemistry in conventional smears versus lbc histopathological results; ICCp16 /HP = p16 immunocytochemistry in thin layer citology smears versus histopathological results; ICCp16 con /PCR = p16 immunocytochemistry in conventional smears versus human papillomavirus genotyping; PPV = positive predictive value; NPV = negative predictive value. ¹Validity measures calculated considering high-risk HPV as the cutoff for immunocytochemistry evaluation. 139 4.4 p16INK4a immunohistochemistry as a marker of anal cancer precursor lesions in HIV positive patients ♠ Imunoistoquímica da p16INK4a como marcadora de lesões precursoras do câncer anal em pacientes HIV positivos ♠ Running title: p16INK4a: a marker of anal intraepithelial lesions in HIV patients Ivan Tramujas da COSTA E SILVAI, Michelle Coelho RIBEIROII; Celso Rômulo Barbosa CABRALIII, Felicidad Santos GIMENEZIV, Paula Emanuelle Vasco HARGREAVESV, Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro GUIMARÃESI, Luiz Carlos de Lima FERREIRAVI ♠ This research was performed at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Manaus – Brazil I MD, fellow PhD degree, Post-Graduation Program of Tropical Medicine Foundation of Amazonas / University of the State of Amazonas. Rua Pedro Teixeira, 25, 69040-000, Manaus – AM, Brazil II JD, Department of Surgery, School of Medicine, Federal University of Amazonas. R. Afonso Pena, 1053, 69020-160, Manaus – AM, Brazil III PhD, Department of Statistics, Exact Sciences Institute, Federal University of Amazonas. R. Afonso Pena, 1053, 69020-160, Manaus – AM, Brazil IV MD, MSc, Department of Surgery, School of Medicine, Federal University of Amazonas. R. Afonso Pena, 1053, 69020-160, Manaus – AM, Brazil V Biologist, Department of Pathology, Tropical Medicine Foundation of Amazonas. Rua Pedro Teixeira, 25, 69040-000, Manaus – AM, Brazil 140 VI MD, PhD, Departments of Research and Pathology, Tropical Medicine Foundation of Amazonas. Rua Pedro Teixeira, 25, 69040-000, Manaus – AM, Brazil Correspondence to: Ivan Tramujas da Costa e Silva. Federal University of Amazonas, Department of Surgery, R. Afonso Pena, 1053, 69020-160, Manaus – AM, Brazil. email: [email protected]. FINANCIAL SUPORT: National Program of DST-AIDS, Ministry of Health of Brazil – UNESCO (grant 914BRA1101) 141 Resumo INTRODUÇÃO: A imunoistoquímica para a proteína p16INK4a parece representar um marcador promissor para a detecção de casos com maior potencial para o desenvolvimento de câncer anal. Este estudo analisou as medidas de validade diagnóstica da imunoistoquímica-p16 em pacientes HIVpositivos atendidos no ambulatório de Coloproctologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM). MÉTODOS: Todos os pacientes HIV-positivos atendidos no período jan-2007/dez-2008 foram inicialmente incluídos. Todos foram submetidos a biópsias do canal anal monitoradas pela colposcopia anal após a aplicação de ácido acético 3%. Lâminas H&E e imunoquímicas processadas pelo método a partir dos da imunoperoxidase espécimes para a p16 foram histológicos. Os resultados histopatológicos e imunoquímicos consensuais expedidos foram dispostos em tabelas de contingência e analisados pelos testes do Chi-quadrado e G, sendo calculadas medidas de validade diagnóstica da imunoistoquímica-p16. Significância estatística foi considerada para p ≤ 0,5. RESULTADOS: Cento e sessenta pacientes HIV-positivos foram estudados após a aplicação de critérios de inclusão e exclusão. Houve significante associação estatística entre os resultados histopatológicos e imunoquímicos (p < 0,0001). Utilizando como ponto de corte os resultados imunoquímicos difusos a imunoistoquímica-p16 apresentou sensibilidade de 53% e especificidade de 93% para o diagnóstico de ASIL e 60% de sensibilidade e 84% de especificidade para o diagnóstico de HSIL. CONCLUSÃO: Apesar da significante associação entre os resultados da imunoistoquímica-p16 e os resultados histopatológicos, a imunoistoquímicap16 tendeu a ser mais específica do que sensível no diagnóstico de ASIL e não foi boa discriminadora de casos HSIL nos pacientes HIV-positivos atendidos na FMT-AM. Palavras-chaves: Neoplasias do Ânus; Genes, p16; Imunoistoquímica; Lesões Pré-cancerosas/diagnóstico; Sensibilidade e Especificidade. 142 Abstract INTRODUCTION: Immunochemistry for p16INK4a protein seems to represent a promising marker for the detection of cases with greater potential for the development of anal cancer. This study evaluated measures of diagnostic validity of p16-immunohistochemistry in HIV-positive patients treated at the Outpatient Clinic of Coloproctology of Tropical Medicine Foundation of Amazonas. METHODS: All consecutive HIV-positive patients observed in the period between Jan-2007/Dec-2008 were initially included. All patients underwent high-resolution anoscopy monitored biopsies of the anal canal anal after topical application of 3% acetic acid. Microscopic slides were processed from the histological specimens and stained by H&E and p16-immunochemistry (immunoperoxidase) methods. Consensual histopathological and p16- immunochemistry results were arranged in contingency tables and analyzed statistically using Chi-square and G tests. Diagnostic validity measures of p16immunochemistry were calculated. Statistical significance was considered for p ≤ 0.5. RESULTS: One hundred and sixty HIV-positive patients were studied after application of inclusion and exclusion criteria. There was a significant statistical association between histopathological and immunochemical results (p < 0.0001). With diffuse results as the cutoff, p16-immunochemistry presented sensitivity of 53% and specificity of 93% for the diagnosis of ASIL and sensitivity of 60% and specificity of 84% for the diagnosis of HSIL. CONCLUSION: Despite the significant association between p16-immunohistochemistry and histopathological results, p16-immunohistochemistry tended to be more specific than sensitive in the diagnosis of ASIL and was not a good discriminator of HSIL in HIV-positive patients attended at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas. Key-words: Anus Neoplasms; Genes, p16; Immunohistochemistry; Precancerous Conditions/diagnosis; Sensitivity and Specificity. 143 Introduction Anal cancer, although a disease rarely found in the general population, has been observed in increasing proportions in certain at risk population segments.1,2 Anal canal malignancy has several characteristics considered similar to cancer of the cervix;3-5 therefore, much of the successful diagnostic and therapeutic conducts directed to the control and reduction of cervical cancer cases has been replicated to the management of anal cancer.6 However, while cervical cancer cases are gradually decreasing in centers with well instituted programs for the prevention of the disease, the same has not been observed in relation to anal cancer, once its incidence has been increasing in recent years in population groups recognized to be at risk for the development of the malignancy.7,8 Explanations for this worrying evolutionary difference are the lack of programs directed to anal cancer prevention in at-risk segments of the population in most health care services, the lack of complete knowledge that still exists about the true natural history of anal malignancy, the lack of consistent data showing that treatment of high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) actually reduces the incidence of anal cancer, the insufficient number of researchers with experience in the area and the fact that, although similar to cervical cancer, anal cancer has some significant differences still not well investigated.7 One of them is the frequency of association with human papillomavirus (HPV) infection. While for cervical cancer this association approaches 100% of cases, not all cases of anal cancer seem to be associated with the virus.9,10 Another striking difference is the eventual interpretative difficulties involved in distinguishing between histopathological precursor lesions of anal cancer and benign inflammatory lesions. Anal biopsies with scanty specimens, tangential sections of the paraffin blocks, the presence of thermal artifacts or of epithelial reactive/inflammatory atypia coexisting in the anoderma or the anal transitional zone, the use of subjective morphological criteria and 144 lack of experience in the histopathological diagnosis of anal cancer and its precursor lesions are some of the given explanations for these difficulties. 11-13 Reflecting these interpretative challenges is the considerable intra- and interobserver variability (even among experts) that is commonly found in the histopathological diagnosis of anal cancer and its precursor lesions.14-15 Histopathological examination of anal specimens, despite being considered the gold standard for diagnosis of the disease, has been responsible for diagnostic agreement rates lower than those obtained in relation to cervical cancer.14,16 In order to resolve this issue, some initiatives have been undertaken to identify effective markers of lesions with greater potential to progress to anal cancer, which can overcome the problems of diagnostic definition of conventional histopathological examination.1,9,11-13,17-19 One of the promising markers, that has been already used for some time in the diagnosis of precursor lesions of cervical cancer (cervical intraepithelial neoplasia), is the protein p16INK4a (p16).20,21 P16, a protein encoded by the gene CDKN2A, is an inhibitor of kinases 4 and 6 dependent of cyclin D, which, under normal conditions, prevents the phosphorylation of retinoblastoma protein (pRb) and subsequent release of cellular transcription factor E2F. Factor E2F, when released, stimulates the cell to leave the checking stage G1 and proceed to the next cell cycle phase, that of DNA synthesis (S) and replication. Cells under stimulation of p16 remain in G1 stage and do not follow to S phase. This represents a regulatory mechanism of the cell cycle.22 In tissues infected with high-risk HPV (HR-HPV), the viral oncogene E7 promotes the inactivation of both p16 and pRb function, thereby stimulating the infected cells to enter the S phase of their cycle of cell division after a brief pause at the G1 checkpoint. The action of the oncogene E7 on keratinocytes is 145 at least twofold: on one side, it causes increased expression of a hypophosphorilated non-functional pRb (since the protein becomes unable to link to factor E2F), in another it promotes directly the inactivation of the over expressed p16. The release of large amounts of non-functional p16 in cells under the action of the oncogene E7 is derived from a negative feedback mechanism with pRb. The defunctionalized p16, despite being over expressed, has no ability to block the action of complex CDK4-6/ciclin D, nor to inactivate the other active oncogene of HR-HPV, E6, the product of which inactivates tumor suppressor protein p53 an so prevents HPV-infected cells to engage into apoptosis. Unrestrained cell division, a feature of neoplastic growths, is the final product of this derangement of the host cellular environment promoted by viral oncogenes.23,24 The immunochemical detection of p16 protein overexpression has then the ability to mark tissues infected with HR-HPV and enhance them so as to facilitate the identification of histopathological lesions with higher malignant potential. This property of the diagnostic test has been useful to reduce the intra- and interobserver variability that is commonly found in the diagnosis of anal intraepithelial neoplasia.18 This study was designed to evaluate the measures of diagnostic validity of p16 immunohistochemistry as an indicator of the presence of anal cancer precursor lesions in HIV-positive patients treated at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas (FMT-AM), a reference institution in the state of Amazonas, Brazil, for monitoring and treatment of HIV-positive patients. Methods A primary cross-sectional study of the diagnostic results of p16 immunohistochemistry (IHCp16) in comparison to conventional histopathological examination (HP) was performed on patients treated at the Outpatient Coloproctology Clinic of FMT-AM between January 2007 and December 2008. This research was approved by the Ethics in Research 146 Committee of the institution (CEP/FMT-AM 1768/2006) and refers to microscopic slide readings that have resulted merely from the first patient care. Patients Of a total of 399 patients seen during the study period only those who were HIV-positive were selected. Exclusion criteria included individuals younger than 18 years, those with special needs, indigenous peoples, patients who for some reason failed to meet all stages of biopsy proceedings and performance of laboratory tests and those patients with missing or unsatisfactory test results. Biopsy proceedings All patients, without distinction, were submitted to high-resolution anoscopy (HRA) monitored biopsies of the anal canal after topical application of 3% acetic acid, as previously described, which included biopsies of all observed acetowhite lesions and of non-acetowhite epithelium, at standardized positions within the anal transitional zone, when no lesion was detected at HRA. 25 Processing of specimens The anal biopsy specimens were fixed in 10% buffered formalin and referred to the Pathology laboratories of FMT-AM for processing. Conventional histopathological stain: microscope slides were mounted with 4 μ sections of the specimens included in paraffin blocks and stained by traditional hematoxylin-eosin technique (H&E). P16 immunohistochemical technique: Silanized microscopic slides were mounted with 4 μ sections retrieved from the same paraffin blocks used for the H&E stain. Briefly, the sections were deparaffinized by dipping the slides in xylene solution. Afterwards, they were rehydrated in solutions with increasing dilutions of absolute alcohol. The next step consisted in the antigen retrieval from the specimen sections by immersing slides in 0.01 mol citrate 147 buffer solution and heating in a microwave oven in two cycles of 7 min at 95 °C. After cooling, blocking of nonspecific antigens was carried out plunging the slides in solutions of 5% skim milk and 3% hydrogen peroxide, each for 15 min. Sequentially, the delimited specimens were covered with primary antibody antip16INK4a (clone 6H12, Novocastra, UK) at a dilution of 1:50. The primary antibody was allowed to react overnight. After sequentially marking the primary antibody with biotinylated secondary antibody and streptavidin-peroxidase (30 min each), sections on slides were covered, for 10 min, with diaminobenzidine solution for antigen-antibody reaction revealing. After counterstaining, with a weak solution of hematoxylin, and dehydration the slides were mounted with coverslips. Positive controls (well-evidenced cases of cervical cancer) as well as negative (slides of the same specimens used in positive controls to which the primary antibody was not applied) were processed in each immunochemical reaction. Immunohistochemical and histopathological interpretative readings were consensual among three pathologists. Histopathological analysis considered the following evolutionary diagnostic spectrum of ASIL to cancer: NEGhp (negative for ASIL or malignancy), condyloma acuminatum, anal intraepithelial neoplasia grade I (AIN-I), AIN-II, AIN-III and invasive cancer. Subsequently, condyloma acuminatum and AIN-I were merged into one category: low-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL). AIN-II and AIN-III were accordingly considered high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL). Only one histopathological diagnosis was considered per patient. The lesion with the higher grade in the diagnostic spectrum of ASIL was chosen for each patient, whenever multiple biopsies were performed. The criteria for the evaluation of p16 immunohistochemical staining followed those proposed by Klaes et al., namely: negative staining (NEGihc) – slides which stained less than 1% of the cells; sporadic staining – slides with less than 5% of the cells stained, even in isolation; focal staining – slides in which small clusters of positively stained cells were present but did not 148 exceeded 25% of the cells observed; and diffuse staining – slides in which more than 25% of the cells stained positively.21 An intense brown staining observed predominantly in the nucleus, with or without cytoplasmic staining was considered positive for p16 expression in immunohistochemical specimens. Statistical analysis The frequencies of IHCp16 results were compared with those of the histopathological analysis, after distribution in N x N contingency tables. The data were analyzed by chi-square (with Yates correction) or G (with Williams correction) tests and by the 95% confidence intervals. With the redistribution of data in 2 x 2 contingency tables, the measures of diagnostic validity (sensitivity, specificity, positive and negative predictive values) of p16 immunohistochemistry in relation to histopathology (gold standard) were obtained.26 Statistical significance was considered when p ≤ 0.05. Results Of the 399 patients enrolled in the study period, 160 HIV-positive could be evaluated after fulfilling the inclusion and exclusion criteria. There were no cases of anal cancer among the HIV-positive patients attended. Two (1.25%) of the biopsies performed in acetowhite-negative anal canals at high-resolution anoscopy were positive for ASIL (1 condyloma acuminatum, 1 LSIL). The corresponding IHCp16 results were focal and diffuse. Table 1 contrasts IHCp16 results with histopathological findings. There was a statistically significant association between the results of both exams. While the frequencies of sporadic and focal immunohistochemical results did 149 not differ statistically in relation to the three categories of histopathological findings, diffuse IHCp16 results tended to be more associated with histopathological results LSIL and HSIL and NEGihc results tended to be significantly associated to NEGhp results. Analyzing only IHCp16 findings associated with HSIL cases in Table 1, the following results were obtained: sporadic = 5 (16.7%, 95%CI 5.6%, 34.7%), focal = 2 (6.7%, 95%CI 0.8%, 22.1% ), diffuse = 18 (60.0%, 95%CI 40.6%, 77.3%), NEGihc = 5 (16.7%, 95%CI 5.6%, 34.7%). Statistical difference was observed when the 95% confidence intervals of diffuse results were compared to IHCp16 results sporadic, focal and NEGihc. In a similar analysis undertaken for LSIL histopathological results, there was no statistical difference among the various immunochemical findings. When this analysis was done in relation to NEGhp results, a marked statistical difference was observed for NEGihc results in comparison to the other three IHCp16 results. Table 2 outlines the measures of diagnostic validity of IHCp16 considering two cutoffs related to the immunohistochemical results shown in Table 1. One cutoff considered positive all immunochemical results sporadic, focal and diffuse; the other cutoff considered positive only diffuse IHCp16 results. Measures of diagnostic validity of IHCp16 were calculated for both cutoffs according to two scenarios of histopathological findings: one considered all results positive or negative for ASIL and the other considered the results only positive or negative for HSIL. For the data analyzed, the more balanced measures of diagnostic validity were those which were obtained from the association of any positive IHCp16 result with ASIL of any grade. Discussion Due to certain diagnostic difficulties peculiar to the anal area, such as those observed particularly in the examination of the anal transitional zone,27 a region that it is not uncommon to find atypias of inflammatory/reactive origin that can be confused with HSIL,1 much has been investigated in search of diagnostic methods that accurately mark lesions with greater potential for anal 150 cancer progression, in order to reduce the interpretative intra and interobserver variability that exists in the histopathological diagnosis of the disease, in all its evolutionary phases.9,11-13,17-19,28,29 The p16INK4a protein is one of the mostly studied markers mainly due to its characteristics of being over expressed in lesions associated with infection by HR-HPV types, precisely the ones mostly linked with HSIL, the precursor lesion with greater probability to progress to anal cancer.11,12,17,18,28,29 However, many a variable must be taken into consideration so that the interpretation of a specific p16 immunochemical reaction can be considered appropriate. The type and time of fixation of the specimen, the type and batch of the primary antibody used, the use of immunochemical solutions adequately prepared, the exposure time of specimens to these solutions, the proper handling of specimens and solutions when manual processing techniques are undertaken and lack of standardization in the interpretation of what should be considered positive staining are some of them.23 These variables may be one of the reasons for the disparate measures of diagnostic validation and precision of IHCp16 in the literature, even in cases related to the diagnosis of cervical cancer.23,30 In the early diagnosis of cervical cancer, IHCp16 diffuse staining, although it tends to identify high-grade lesions in patients with HR-HPV infection, has not always shown consistent results.30 Ozgul et al., in a study of 83 slides with cervical specimens with diagnoses of LSIL, HSIL, squamous cell carcinoma and normal compared with 83 IHCp16 slides processed out of sections from the same specimens, found that despite the positivity of IHCp16 was strongly associated with HSIL, they were not able to observe a correlation between intensity of tissue expression of p16 and the presence of HR-HPV.31 Equally, Yildiz et al. investigated the correlation between the presence of HPV infection and degree of expression of p16 in 35 cervical specimens with LSIL or HSIL. Despite observing correlation between the intensity and distribution of staining for p16 and diagnosis of LSIL and HSIL, they found no correlation between HPV presence and intensity and distribution of p16.32 151 Likewise, results reported in the literature about the association between IHCp16 positive results and HR-HPV in the diagnosis of anal cancer and premalignant lesions are not uniform. It has been noted that IHCp16 tends to produce strong positive band staining, occupying more than one third of the thickness of the anal epithelium in specimens in which HR-HPV DNA is integrated into the genome of the host cell and where it is often observed the presence of HSIL.11,13 However, diffuse IHCp16 results are also described in cases where it is not detected the presence of HR-HPV or where HPV DNA is not integrated into the host cell genome, and also where there is no histopathological features suggestive of ASIL.11 Nevertheless, some studies do demonstrate a good correlation among diffuse IHCp16 results, HSIL, and presence of HR-HPV.12,29,33 In the material studied herein the results of IHCp16 tended to be significantly positive in association to LSIL or HSIL histopathological findings and significantly negative when there was no presence of ASIL in biopsies processed by H&E (p < 0.0001). When considering positive only diffuse IHCp16 results in relation to the presence of any ASIL finding a significant statistical difference was observed (p <0.0001), although the measures of diagnostic validity obtained were lower than expected due to the strong tendency of association of diffuse IHCp16 results with LSIL cases and also to the verified association of some diffuse results with histopathological NEG readings. HSIL results were significantly associated with diffuse IHCp16 readings, according to the analysis of the 95% confidence intervals, although only 60% of HSIL were diffusely stained in p16 immunochemistry. These results contrast with those presented by other authors who, although obtaining higher percentages of diffuse IHCp16 results related to HSIL, also observed results sporadic/focal in patients with high grade lesions.11,13 Such findings may be due to the multiple variables related to the immunochemical method employed, from processing to interpretation,23,30 and to the non-uniform biological behavior of anal squamous intraepithelial lesions, 152 which may or may not be linked to HPV infection, and, when linked, the virus can be found in episomal or integrated form.9,17 As a discriminator of ASIL, IHCp16 was generally more specific than sensitive in this study. Walts et al. reported that diffuse p16 immunohistochemical staining had a sensitivity of 67% and specificity of 98% for the diagnosis of ASIL in 104 anal biopsy specimens taken from the archives of the Department of Pathology at Cedars Sinai Medical Center, in Los Angeles.11 For the same type of analysis, in 160 anal specimens, we obtained sensitivity of 53% and specificity of 93%. Bean et al. reported sensitivity of 76%, specificity of 86%, positive predictive value (PPV) of 62% and negative predictive value (NPV) of 93% for IHC-p16 as a marker for anal HSIL in 75 specimens retrieved from the archives of the Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham. 13 IHCp16 in our 160 HIV-patients presented, comparatively, sensitivity of 60%, specificity of 84%, PPV of 45% and NPV of 90%. Therefore, in the patients studied at FMT-AM, p16 immunohistochemistry was not a good discriminator of HSIL cases because the observed frequency of diffuse IHCp16 results in patients with LSIL was comparatively similar (Table 1). However, considering that LSIL lesions may show strong tendency to progress to HSIL over time in HIV-positive patients,34 diffuse IHCp16 findings related to LSIL, in these patients, maintain the quality of the marker as capable of pointing out lesions with greater potential for anal cancer development. Conclusions It was observed, in this study, a significant association between p16 INK4a immunohistochemical results and histopathological readings. However, IHCp16 tended to be more specific than sensitive in the diagnosis of ASIL and was not a good discriminator of HSIL cases in HIV-positive patients, meaning that the search for the ideal marker (high sensitivity and specificity) of lesions with 153 greater potential for anal cancer progression should still deserve extensive research. ACKNOWLEDGEMENTS: The authors are thankful for the expert technical support of Pathologists José de Ribamar Araújo and Rosilene Viana de Andrade, of Biologist Roberto Moreira da Silva Junior, of Pathology Technicians Sandra Caranhas, Sandra Oliveira, Carlos Marques, Andreza Fernandes and Maria Silva, and of Administrative Technician Agustinho Monteiro. CONFLICT OF INTEREST: All authors declare to have no conflicts of interest. REFERENCES 1. Longacre TA, Kong CS, Welton ML. Diagnostic problems in anal pathology. Adv Anat Pathol 2008;15:263-278. 2. Sobhani I, Walker F, Roudot-Thoraval F, Abramowitz L, Johanet H, Henin D, et al. 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Neles, a imunocitoquímica para a p16 não revelou ser método sensível para o diagnóstico de ASIL ou de infecção por HPV de alto risco em espécimes anais. Entretanto, boa especificidade para o diagnóstico de ASIL foi observada quando o método foi realizado em esfregaços de camada delgada. 5.4 Houve associação estatística significante entre a imunoistoquímica da p16 e os resultados histopatológicos observados em pacientes HIV-positivos. Entretanto, a imunoistoquímica da p16 tendeu a ser mais específica do que sensível no diagnóstico de ASIL e não foi boa discriminadora de HSIL. 5.5 Em pacientes HIV-positivos, o valor preditivo positivo da imunocitoquímica da p16 para apontar a presença de infecção anal por HPV de alto risco foi baixo. 160 Em função destas conclusões, propõe-se que, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, os diagnósticos histopatológicos e citológicos envolvendo a detecção de lesões precursoras do câncer anal sejam emitidos após concordância consensual entre, no mínimo, três patologistas; que todos os pacientes HIV-positivos e os com hábitos sexuais anorreceptivos que procurarem a instituição para atendimento sejam orientados a procurar o Ambulatório de Coloproctologia para avaliação, visando a detecção precoce de lesões precursoras do câncer anal; que a imunoistoquímica da proteína p16INK4a seja incorporada como técnica diagnóstica auxiliar na detecção de casos cujo exame histopatológico convencional suscite dúvidas quanto à presença ou não de lesão intraepitelial escamosa de alto grau; e que a imunocitoquímica da p16INK4a sofra nova investigação em esfregaços anais realizados pela técnica de camada delgada, de preferência automatizada, com a incorporação do método de pontuação nuclear qualitativa. 161 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 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Hargreaves Ticiane da Costa Martins Jane Anne Nunes Lira Bióloga, Bc Acad. Medicina Acad. Medicina UFAM FMTAM UFAM UFAM Estagiária Histoquímica Estagiária Estagiária Jacqueline Pereira Pinheiro Bruno Meireles Brito de Souza Willian Stremel Camila Oliveira Cunha Gisele Teixeira Milano Natália Amorim de Oliveira Stephany Oliveira da Silva Priscilla Ribeiro dos Santos Laila Cristina Alves Rojas Ac. Biomedicina Acad. Medicina Acad. Medicina Acad. Medicina Acad. Medicina Acad. Medicina Acad. Medicina Acad. Medicina Acad. Medicina UEA UFAM UFAM UFAM UFAM UFAM UFAM UFAM UFAM Nome Estagiária Estagiário Estagiário Estagiária Estagiária Estagiária Estagiária Estagiária Estagiária Leitura de lâminas. Leitura de lâminas. Atendimento a pacientes, coleta de material citológico e histológico. Realização da PCR. Auxílio no processamento imunoquímico. Auxilio no processamento de lâminas citoistopatológicas. Auxílio no processamento imunoquímico. Auxílio no processamento imunoquímico. Auxílio no atendimento de pacientes e no processamento de espécimes citológicos, histológicos e imunoquímicos; orientanda de PIBIC. Auxílio no atendimento de pacientes e no processamento de espécimes citológicos, histológicos e imunoquímicos. 176 Nome Formação (Titulação) Lucília Rocha Lopes Acad. Medicina Christine Rondon Pedrosa Acad. Medicina Drielle Nogueira Sales Acad. Medicina Elmo Pontes da Costa Acad. Medicina Paulo Sérgio L Merchak Junior Acad. Medicina Renata Jessica Brasil Romano Acad. Medicina Renata da Silva Galvão Ac. Biomedicina Nathalia Wanderley Coronel Acad. Medicina Instituição de trabalho UFAM UFAM UFAM UFAM UFAM UFAM UEA UFAM Experiência em Estagiária Estagiária Estagiária Estagiário Estagiário Estagiária Estagiária Estagiária Atividades no Desenvolvimento da Tese Auxílio no atendimento de pacientes e no processamento de espécimes citológicos, histológicos e imunoquímicos. Auxílio na realização da PCR. Auxílo na realização da PCR e no atendimento de pacientes. 177 7.2 Cronograma de Execução Física: Item 1 2 3 4 5 6 7 ANEXO B INÍCIO: 01/ 2007 TÉRMINO: 08/ 2010 ATIVIDADES Treinamento nas atividades de coleta e recebimento de amostras clínicas, cadastramento, histologia, imunocitoistoquímica e na técnica da PCR visando o aprendizado e a autonomia nas atividades do projeto Coleta de material anal, envio, recebimento, cadastramento e processamento das amostras celulares e teciduais. Leitura das lâminas histológicas, imunocitoistoquímicas, interpretação da PCR-HPV e emissão dos laudos respectivos Compilação dos dados coletados e análise estatística Revisão bibliográfica - erudição Redação final do estudo Defesa da tese 2006 Out - Dez DURAÇÃO EM MESES = 12 meses 2007 Jan - Dez 2008 Jan - Dez 2009 Jan - Jun Jul - Dez X X X X X X 2010 Jan - Jun Jul - Ago Set X X X X X X X X X X X 178 7.3 Item ANEXO C Orçamento Quant. 1 200 2 3 MATERIAL PERMANENTE Preço unitário Custo do item R$ R$ 5 Escova cervical citológica Estéril Pinça de McGill 16 cm 0,60 70,00 350,00 5 Pinça de biópsia Prof. Medina 24 cm 200,00 1000,00 4 3 Seringa Carpule 30,00 90,00 5 3 Caixa de agulhas gengivais longas – caixa com 100 unidades 40,00 120,00 6 6 Caixa c/ 50 tubetes de lidostesin 3% com vasoconstritor 25,00 150,00 7 200 Anuscópios descartáveis abertos 2,50 500,00 8 1 Solução de lugol – frasco com 500 ml 25,0 25,00 9 2 Gaze – compressas – pacotes com 500 unidades 26,00 52,00 10 10 Luvas de látex descartáveis – procedimento – caixa com 50 pares 23,00 230,00 11 100 21,00 2100,00 12 3 Xilocaína geléia 2% Lápis preto nº 2 1,50 4,50 13 2 Apontador de lápis 5,00 10,00 14 1 Perfurador de papel de mesa 75,00 75,00 15 1 Caneta marcadora permanente preta – embalagens com 4 8,00 8,00 16 1 Caneta esferográfica Bic Cristal preta – caixa com 20 25,00 25,00 17 3 Papel carbono – caixas com 100 10,00 30,00 18 3 Papel A4 75 g – caixa com 5 resmas com 500 folhas 55,00 165,00 19 5 Tinta de impressora Lexmark 82 (p&b) – 18L0032 110,00 550,00 20 5 Tinta de impressora Lexmark 83 (color) – 18L0042 150,00 750,00 21 1 Tinta de impressora HP 51645GL (p&b) 90,00 90,00 22 2 Etiquetas autocolantes – rolo com 500 10,00 20,00 23 1 Pasta Registradora AZ 345 X 80 – pacote com 2 15,00 15,00 24 1 Grampeador de mesa Z66 30,00 30,00 25 1 Grampos 26/6 ARO 5000 un. – pacote com 5 caixas 20,00 20,00 26 1 Hematoxilina - 500 ml 105,00 105,00 27 1 Orange - 500 ml 45,00 SUBTOTAL 120,00 45,00 R$ 6.679,50 179 Item Quant. MATERIAL PERMANENTE Preço unitário Custo do item R$ R$ 28 2 Xileno - 1 l 30,00 60,00 29 3 Lamínulas de vidro 24 x 50 mm – cx c/ 100 15,00 45,00 30 6 Lâminas de vidro c/ extr. Fosca fina – cx com 50 10,00 60,00 31 5 Álcool 95% - 1 litro 5,00 25,00 32 2 Álcool absoluto – 1 l 20,00 40,00 33 1 Ácido acético glacial – 1 l 35,00 35,00 34 2 Corante Giemsa – 500 ml 60,00 120,00 35 250 0,35 87,50 36 37 2 Sol. Tris-HCl 50mM pH 8,0 e EDTA 1mM - 200 ml 100,00 200,00 2 150,00 300,00 38 1 Sol. tampão PBS pH 7,2 (NaCl 0,800g, KCl 0,020g, NaPO4 dibásico 0,115g, KPO4 monobásico 0,020g, AD 100 ml) Ácido bórico 1000 g 30,00 30,00 39 1 Acetato de amonium 500 g 60,00 60,00 40 1 Agarose 100 g 660,00 660,00 41 1 EDTA 500 g 62,00 62,00 42 1 Tris base molecular grade 2500 g 720,00 720,00 43 1 100 PB DNA Ladder 250 μg 1600,00 1600,00 44 3 Primer MY09 500,00 1500,00 45 3 Primer MY11 500,00 1500,00 46 3 Primer ISO4M 500,00 1500,00 47 3 Primer ISSO5 500,00 1500,00 48 3 Tween 700,00 2100,00 49 4 d NTP 1400,00 5600,00 50 6 Taq Polimerase 450,00 2700,00 51 3 DYENAMIC ET DYE terminator kit 1600,00 4800,00 52 3 Megabace LR Matrix 800,00 2400,00 53 3 Proteinase K 800,00 2400,00 54 2 Solução de formalina 10% tamponada – frascos de 1 litro 50,00 SUBTOTAL 100,00 Tubos de Eppendorf - 1,5 ml R$ 30.204,50 180 Item Quant. MATERIAL PERMANENTE Preço unitário Custo do item R$ R$ 55 1 Material complementar para carga viral HIV 1000,00 1000,00 56 1 Vidraria 700,00 700,00 57 1 Outros Insumos de impressão 500,00 500,00 58 2 DAB – corante p/ imunoistoquímica 600,00 1200,00 59 2 4200,00 6 Sol. ABC – revelador de imunoistoquímica CINtectm p16INK4a Cytology Kit for the Autostainer (50 testes) 2100,00 60 3179,01 19074,06 61 6 p16 INKa Kit para 50 testes histologia 3179,01 19074,06 62 3 Lâminas Silanizadas – caixas com 100 461,31 1383,93 63 1 Solução salina Tris-tamponada com Tween 20, conc. 10x – frasco de 500 ml 567,46 567,46 64 1 Meio de montagem Glycergel – frasco de 15 ml 100,72 100,72 65 1 Meio de montagem aquoso Faramount RTU – frasco de 15 ml 122,58 122,58 66 1 Meio de montagem Permanente - frasco de 100 ml 461,31 461,31 67 3 Primer GP5+ 500,00 1500,00 68 3 Primer GP6+ 500,00 1500,00 69 1 Processador ThinPrep 2000 (Cytyc Corporation) 10000,00 10000,00 70 5 Solução conservante PreservCyt® - 1 litro 500,00 2500,00 69 10 Biólogo – bolsa mensal para 10 meses 1000,00 10000,00 70 1 Estatístico – bolsa mensal – 1 mês 1000,00 1000,00 71 12 Técnico de Laboratório – bolsa mensal, para 12 meses 350,00 4200,00 SUBTOTAL TOTAL R$ 79.084,12 R$ 115.968,10 181 7.4 ANEXO D TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 182 7.5 ANEXO E PROTOCOLO DE ESTUDO 183 7.6 ANEXO F REQUISIÇÃO DE EXAME HISTOLÓGICO / ANOSCOPIA COM MAGNIFICAÇÃO DE IMAGEM 184 7.7 ANEXO G TÉCNICA DE PRODUÇÃO DE ESFREGAÇO DE CAMADA DELGADA MÉTODO SYNERMEDTM 185 7.7 ANEXO G TÉCNICA DE PRODUÇÃO DE ESFREGAÇO DE CAMADA DELGADA MÉTODO SYNERMEDTM 186 7.8 ANEXO H RESULTADO DE EXAME HISTOPATOLÓGICO BIÓPSIA ANAL GUIADA POR ANOSCOPIA COM MAGNIFICAÇÃO DE IMAGEM Sem alterações Retite (proctite) crônica inespecífica + ++ +++ LSIL escamoso transição glandular HSIL escamoso transição glandular Doença de Paget Carcinoma escamocelular Adenocarcinoma Adenocarcinoma mucinoso Carcinoma indiferenciado Tumor carcinóide Melanoma maligno Tumor não epitelial Tumor metastático Outro tumor: Hemorróida externa interna mista Descritivo: / / Data 2 0 0 Ass. e carimbo do patologista 187 7.9 ANEXO I MEDIDAS DE VALIDAÇÃO DIAGNÓSTICA 188 7.10 ANEXO J PROTOCOLO DE COLORAÇÃO IMUNOCITOQUÍMICA DA P16INK4A 1º Fase Preparo de soluções e calibração do pH-âmetro Calibrar pH-âmetro, conforme instruções do fabricante. Preparar soluções de PBS 1X (pH 7,4), citrato 0,01 mol (pH 6,0) com Triton 100X, leite desnatado 5% em PBS, DAB – 1 gota do cromogênio em 1 ml do tampão DAB. Reidratação Mergulhar o berço com lâminas em Álcool absoluto 50% - 1X por 10 minutos. Retirar o excesso de álcool Mergulhar o berço com lâminas em água destilada: Lavar lâminas 1X por no mínimo 30 seg. 2º Fase RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA Colocar 300 ml de solução de recuperação antigênica para ICQ (RA-ICQ) em cuba de coloração e préaquecer a solução a 95º - 99ºC (2 minutos). Mergulhar o berço contendo as lâminas na cuba com a solução pré-aquecida e manter em forno de microondas a temperatura constante entre 95 e 99ºC por 10 minutos. Esfriamento: Tirar a cuba contendo as lâminas com solução de RA-ICQ do microondas e deixá-la parcialmente imersa em cuba contendo água de torneira em temperatura ambiente e aguardar aproximadamente 20 a 30 minutos, até o resfriamento da solução de RA-ICQ. PBS 1X: Lavar 1X por 5 min. BLOQUEIO DE ANTÍGENOS INESPECÍFICOS Bloqueio da atividade da peroxidase endógena Após retirar o excesso de líquidos, mergulhar lâminas por 15 min (1 X) na solução de peróxido de hidrogênio para ICQ. PBS 1X: Lavar 1X por 5 min. Bloqueio da atividade da biotina endógena Leite desnatado 5% em PBS 1X: mergulhar lâminas1X, por 5 minutos. Água destilada: Lavar 1X. PBS 1X: Lavar 1X por 5 min. Secar a lâmina e delimitar o local a ser coberto com o anticorpo primário com a caneta de marcação de área de leitura microscópica. Aplicação do Anticorpo Primário – proteína p16, clone 6H12, Novocastra, United Kingdom Cobrir o esfregaço delimitado com 100 l de anticorpo primário diluído em PBS 1X na concentração de 1:400. Deixar agir overnight, em ambiente úmido, em refrigerador, a 4ºC. 3º Fase PBS 1X: Lavar 1X por 5 min. o Marcação do anticorpo primário Anticorpo secundário biotinilado (com biotina): Cobrir o esfregaço citológico, previamente delimitado com caneta pap, com 100 l do anticorpo secundário biotinilado (Reagente de ligação multiespécies Easy Path – frasco 1) e deixar descansar em recipiente úmido por 30 minutos. Sacudir cada lâmina sobre papel filtro/gaze para retirar o excesso de Ac. PBS 1X: Lavar 3X por 5 min. Streptavidina-peroxidase: Cobrir o esfregaço citológico, previamente delimitado com caneta pap, com 100 l do reagente streptavidina-peroxidase (USA-HRP Reagente de Marcação Easy Path – frasco 2) e deixar descansar em recipiente úmido por 30 minutos. PBS 1X: Lavar 3X por 5 min. o Revelação dos locais onde ocorreram as reações antígeno-anticorpos DAB (diaminobenzidina): Cobrir com a solução diluída de DAB o corte histológico previamente delimitado e aguardar de 5 a 10 minutos. PBS 1X: Lavar 1X. o Contra-coloração Hematoxilina: Mergulhar lâminas 1X por 10 minutos. Água de torneira: Retira-se o excesso de hematoxilina. o Desidratação Álcool a 70%, álcool a 80% e álcool absoluto: Mergulhar 1X em cada, rapidamente. Secar: Deixar secar à temperatura ambiente. 4º Fase Montar Lâmina: Aplicar pequena quantidade de Enthelan sobre a lâmina e sobrepor lamínula. Obs.: incluir lâminas com material controle positivo e controle negativo (céls. HeLa) em cada reação ICQ. 189 7.11 ANEXO K PROTOCOLO DE COLORAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DA P16INK4A 1º Fase Preparo de soluções e calibração do pH-âmetro Calibrar pH-âmetro, conforme instruções do fabricante. Preparar soluções de PBS 1X (pH 7,4), citrato 0,01 mol (pH 6,0), leite desnatado 5% em PBS 1X, DAB – 1 gota do cromogênio em 1 ml do tampão DAB. Desparafinizaçâo Mergulhar, sequencialmente, o berço com lâminas em cubas contendo: Xilol 1: 1 X por 10 minutos. Xilol 2: 1 X por 5 minutos. Álcool absoluto 1, álcool absoluto 2, álcool 80%, álcool 70%, água destilada: Mergulhar 1X em cada, rapidamente. 2º Fase RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA Mergulhar o berço contendo as lâminas em cuba de coloração, preenchendo-a com solução de tampão de citrato 0,01 mol de forma a garantir que o nível da solução fique 1 cm acima do nível das lâminas. Colocar a cuba no forno de microondas e deixar por 7 minutos, em potência média. Aguardar 1’ 30” com a porta semiaberta e repetir por mais 7 minutos no microondas, em potência média. Novamente, aguardar 1’ 30” no microondas com a porta semi-aberta. Esfriamento: Tirar a cuba contendo as lâminas com solução tampão de citrato do microondas e deixá-la parcialmente imersa em cuba contendo água de torneira em temperatura ambiente e aguardar aproximadamente 20 a 30 minutos, até o resfriamento da solução de citrato. Água destilada: Lavar 2X por 5 min. PBS 1X - do frasco de PBS 20X – retirar 100 ml e PBS 1X: Lavar 2X por 5 min. adicionar 1.900 ml de AD (para um total de 2 l) BLOQUEIO DE ANTÍGENOS INESPECÍFICOS Bloqueio da atividade da peroxidase endógena Mergulhar lâminas por 15 min (1 X) em 200 ml de solução de peróxido de hidrogênio 3%. Água destilada: Lavar 1X. PBS 1X: Lavar 2X por 5 min. Bloqueio da atividade da biotina endógena Leite desnatado 5% em PBS 1X: mergulhar lâminas1X por 5 minutos. Água destilada: Lavar 3X até tirar bem o leite. PBS 1X: Lavar 2X por 5 min. Secar a lâmina e delimitar o local a ser coberto com o anticorpo primário com a caneta de marcação de área de leitura microscópica. Aplicação do Anticorpo Primário – proteína p16, clone 6H12, Novocastra, United Kingdom Cobrir o corte histológico previamente delimitado com solução preparada na proporção de 1l de p16 para cada 49 l de PBS 1X (fazer o suficiente para destinar 25 l para cada lâmina) e deixar agir overnight, em ambiente úmido (tupperware com esponja úmida), a 4ºC. 3º Fase PBS 1X: Lavar 2X por 5 min. o Marcação do anticorpo primário Anticorpo secundário biotinilado (com biotina): Cobrir o corte histológico previamente delimitado com 25 l de anticorpo secundário biotinilado (Reagente de ligação multiespécies Easy Path – frasco 1) e deixar descansar em recipiente úmido por 30 minutos, à temperatura ambiente. Sacudir cada lâmina sobre papel filtro/gaze para retirar o excesso de Ac. PBS 1X – Lavar 2X por 5 min. Streptavidina-peroxidase: Cobrir o corte histológico previamente delimitado com 25 l de streptavidinaperoxidase (USA-HRP Reagente de Marcação Easy Path – frasco 2) e deixar descansar em recipiente úmido por 30 minutos à temperatura ambiente. PBS 1X: Lavar 2X por 5 min. o Revelação dos locais onde ocorreram as reações antígeno-anticorpos – APAGAR A LUZ DO RECINTO DAB (diaminobenzidina): Cobrir com a solução diluída de DAB o corte histológico previamente delimitado e aguardar 10 minutos. PBS 1X: Lavar 1X. o Contra-coloração Hematoxilina: Mergulhar lâminas 1X por 10 minutos. Água de torneira: Retira-se o excesso de hematoxilina. o Desidratação Álcool 70%, álcool 80%, álcool absoluto 2, álcool absoluto 1, xilol 2, xilol 1: Mergulhar 1X em cada, rapidamente. 4º Fase Montar Lâmina: Aplicar pequena quantidade de Enthelan sobre a lâmina e sobrepor lamínula. Obs.: incluir lâminas com material controle positivo e controle negativo em cada seção de coloração IHQ 190 7.12 ANEXO L CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DE PROJETO DE PESQUISA 191 7.13 ANEXO M CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DE PROJETO DE PESQUISA 192 7.14 – Anexo N 193 194 195 196 7.15 – Anexo O 197 198 199 200 201 202 203 204 205 7.16 – Anexo P 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 7.17 – Anexo Q 218 219 220 221
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