Aminoácidos, peptídeos e
proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Características químicas dos
aminoácidos
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Os aminoácidos
• Os aminoácidos
presentes nas
proteínas são
isômeros L
– A biologia é canhota
• Glicina não
tem isomeria
óptica
Carbono
alfa
Grupo R apolar e alifáticos
• Aminoácidos apolares e hidrofóbicos
• Ligações de Van der Waals
• Ala, Val, Leu, Iso
– Interações hidrofóbicas
• Gly; menor aminoácido
• Met
– Possui átomo de enxofre
• Pro
– Iminoácido, menor flexibilidade estrutural
Grupo R aromáticos
• Aminoácidos hidrofóbicos
• Tirosina pode formar pontes de hidrogênio
com a água
• Modificações póstraducionais
– Fosforilação do OH
da tirosina
• Fenilalanina
– Mais apolar
Grupos R polares, não carregados
• Solubilidade intermediária em água
• Serina e treonina
– Grupos hidroxil
• Asparagina e glutamina
– Grupo amida
• Cisteína
– Grupo sulfidril
– Ligações dissulfeto
Grupos R carregados
• Aminoácidos básicos
–
–
–
–
Carga positiva
Lisina, segundo grupo amino
Arginina, grupo guanidina
Histidina, grupo aromático
imidazol
• Aminoácidos ácidos
– Carga negativa
– Possuem segundo grupo
ácido carboxílico
Aminoácidos incomuns
• Modificações pós-traducionais
–
–
–
–
–
4-hidroxiprolina
5-hidroxilisina
6-N-metil-lisina
Gama-carboxiglutamato
Fosforilação de resíduos
• Selenocisteína
– Selênio ao invés de enxofre na Cys
– É adicionado durante a tradução por
mecanismo específico e regulado
pH e pKa
• Constantes de dissociação dependem do pH
do meio e são diferentes para diferentes
moléculas
• Ionização
• < pH; > [H]+
estado não-ionizado
Aminoácidos são ionizáveis
• Substâncias
anfóteras: possuem
natureza dual
• Podem funcionar
assim como ácidos ou
bases
– Doam ou recebem
prótons
Titulação de um aminoácidos
• pKa: tendência de um
grupo fornecer um próton
ao meio
• Aminoácidos podem
perder até 2 prótons para
o meio
• Conclusão: a função das
proteínas depende do pH
ao qual estão submetidas
Curvas de titulação predizem a carga
elétrica dos aminoácidos
• Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis
também em sua cadeia lateral
Peptídeos e proteínas
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Polipeptídeo
>Insulina [Homo sapiens]
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN
QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA
LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY
CN
Peptídeos tbm são ionizáveis
• Ou seja, possuem
curva de titulação
característica
• Funcionam em
faixas de pH ótimas
Número de resíduos por proteína
Uso de aminoácidos
• Varia bastante entre as
proteínas
• Não permite predizer
com precisão o
comportamento
molecular da molécula
Proteínas com outros grupos químicos
• Adicionados pós-traducionalmente
Trabalhando com proteínas
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Proteínas podem ser separadas e
purificadas
• Sabendo que a célula possui milhares
de proteínas, como purificar uma única
delas?
– Basta selecionar por propriedade
• Tamanho, carga e propriedades de ligação
• Obter o extrato bruto
– “correr” em cromatografia de coluna
• Fase estável (matriz)
• Fase móvel (solução com tampão)
– Coluna maior permite maior resolução
na separação
Cromatografia por troca iônica
• Polímero carregado
negativamente
– Proteínas positivas ligam ao
polímero e demoram mais
a ser eluídas da coluna
• Afinidade da proteína é
definido também pelo pH
Cromatografia por exclusão de
tamanho
• Grânulos porosos na
matriz seguram as
moléculas menores
• Moléculas grandes
não entram nos
poros e são eluídas
primeiro
Cromatografia de afinidade
• Adiciona-se à matriz da
coluna algum tipo de
molécula ligante da
molécula de interesse
• Molécula ligadora de
ATP; adiciona-se ATP à
matriz
• Elui-se com solução de
ATP
Eletroforese -- Histórico
•
1952, Markham and Smith
–
•
1955, Smithies
–
•
Géis de acrilamida com maior resolução e permitem
separar ainda moléculas grandes de DNA
1980, Schwartz and Cantor
–
•
Géis de amido funcionam bem para separar
proteínas do soro humano
1967, Loening
–
•
Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que
moléculas de diferentes estruturas têm sua
mobilidade diferenciada quando aplicadas num
papel e submetidas a um campo elétrico
Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos
enormes
É hoje impossível imaginar um laboratório de
biomol sem eletroforese acontecendo a todo
instante...
Vou ali correr
um gelzinho e
já volto
Tenho que ir senão
vou perder meu gel
Eletroforese
• Movimento de partículas dispersas
num fluído sob influência de um
campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa
– Tem tendência a se dirigir ao polo
positivo quando sujeito a um campo
elétrico
• Serve para separar moléculas por
tamanho/carga elétrica
– Proteína deve ser desnaturada com
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em
trabalhos de biologia molecular
Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Aplicação das amostras
Definição do mapa das
amostras por canaleta
Corrida do gel
• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de
íons através da solução
tampão
• Terminais positivo e
negativo
• Tempo adequado, senão o
DNA sai do gel
Coloração das moléculas
• Prata
– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc
• Brometo de etídio
– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV
– Gel de agarose
Eletroforese de um resultado de
cromatografia
O marcador de peso molecular
• Comprado de uma empresa
– Possui proteínas de peso molecular bem conhecido
• Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s)
numa amostra
Geis bidimensionais
• Corre-se o gel normalmente em
uma dimensão... E depois virase-o e corre-se em outra
dimensão
• Cada ponto representa
aproximadamente uma proteína
original presente na amostra
– Maiores géis dão maiores
resolução
Proteínas não separadas podem ser
quantificadas
• Deve-se saber
qual o substrato
que a enzima usa
• Deve-se poder
medir o produto
da ação
enzimática
• Uma unidade de
enzima digere
1μmol de
substrato por
minuto a 25ºC
Estrutura primária das proteínas
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Níveis estruturais das proteínas
As estruturas primárias das
proteínas são conhecidas
• Para todos os genomas
sequenciados, conhece-se a
estrutura primária de todas as
proteínas para este organismo
• As pontes dissulfeto podem se
formar entre diferentes cadeias
protéicas
– E principalmente dentro da
mesma
Sequenciamento de peptídeos
• Degradação de Edman
– Marca e remove apenas o
resíduo N-terminal
• Método ineficiente, permite
sequenciamento de pequenas
porções das moléculas
• Sequenciamento do RNAm é
muito mais simples e preciso;
permite sequenciar proteínas
enormes – como a titina
Produção de peptídeos
• Purificação a partir
de tecidos
• Engenharia genética
• Síntese química
direta
Alinhamento de sequências
• Os organismos possuem,
em grande medida, as
mesmas proteínas
(ortólogas)
– Derivam do ancestral
comum entre os
organismos
• O alinhamento permite
que identifiquemos as
porções mais importantes
(conservadas) da proteína
Evolução molecular
• Quanto mais similares as sequências das
proteínas dos organismos, mais próximos eles
são evolutivamente
Árvore molecular da vida
Conclusões
• Diferentes características químicas das cadeias laterais dos
aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas
• Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas
ou milhares para formar peptídeos e proteínas
• As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente
• As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e
afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e
eletroforese
• As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura
primária (seq. de aminoácidos é conhecida)
• As sequências das proteínas são excelentes marcadores da
evolução da vida na terra