BIO10-329 Biofísica de Proteínas
Regente: Célia R. Carlini
Estratégias para purificação de uma proteína
Os assuntos abordados nessa aula são:
- Métodos de centrifugação e precipitação diferencial
- Dosagem de proteínas
- Métodos cromatográficos
- Análise de eficiência da purificação
Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações
Principais componentes moleculares da bactéria E. coli
Componentes
H2O
Proteínas
Ac. Nucléico
Carbohidratos
Lipídeos
Outros
Nº de moléculas diferentes
1
3.000
1 - DNA e 1000-RNA
50
40
Íons - 12
Mol. Monoméricas - 500
% peso total
70
15
7
3
2
3
A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de
moléculas presentes em uma célula simples, a bactéria Escherichia coli.
Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas.
Como são as proteínas que executam a maior parte das funções vitais de
um organismo, uma grande parte das questões na Biologia envolve conhecer
em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma proteína.
Para se obter uma proteína em particular, é necessário separá-la de
todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica.
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede
os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D
e a compreensão de suas propriedades biológicas.
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína
individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais
eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
Métodos de
purificação
Proteínas de uma célula
1 proteína
isolada
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas.
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo
de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)
2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas
moléculas:
4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que
interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
SOBRENADANTE
ORGANELAS
Lisossomos
Lisossomos
Mitocôndria
Mitocôndria
Golgi
Golgi
Núcleo
Núcleo
Precipitação com Sal/Solvente
F1
F2
F3 F4
Precipitação com Sal/Solvente
F 2 .2
F 2 .1
F 2 .3
O fluxograma ao lado representa a
“marcha” de purificação de uma proteína,
mostrando as etapas sucessivas, cada
uma consistindo de método, que levam ao
isolamento de uma proteína presente
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas
(100g) presente no material inicial e
quanto da proteína purificada se obtém no
final (0,001g). Esses números são típicos
para a purificação da maioria das
proteínas, em especial enzimas.
Cromatografia Troca Iônica
F 2 .3.1
F 2 .3.2
. . . . . .
F
2. 3.N
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
Gel Filtração
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Em cada etapa, a proteína de interesse é
separada das demais com base em uma
propriedade diferente. Consequentemente, as proteínas ainda misturadas com
aquela que está sendo isolada são cada
vez mais semelhantes em suas
características físico-químicas, exigindo
métodos cada mais sensíveis, capazes
de explorar pequenas diferenças, para se
chegar à proteína pura.
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
SOBRENADANTE
ORGANELAS
Lisossomos
Lisossomos
Mitocôndria
Mitocôndria
Golgi
Golgi
Núcleo
Núcleo
Além dos métodos de purificação, análises
complementares devem ser feitas ao longo da
purificação, para verificar se o processo de
separação está sendo eficiente.
Precipitação com Sal/Solvente
F1
F2
A medida da atividade biológica da proteína
de interesse e do conteúdo de proteínas de
cada fração resultante do processo de
separação devem ser feitas a cada passo.
Assim, apenas a fração que contém a
proteína de interesse, marcada com um
círculo vermelho no fluxograma, é submetida
à próxima etapa de purificação.
F3 F4
Precipitação com Sal/Solvente
F 2 .2
F 2 .1
F 2 .3
Cromatografia Troca Iônica
F 2 .3.1
F 2 .3.2
. . . . . .
F
2. 3.N
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
Gel Filtração
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
• Medida da atividade biológica
- particular para cada proteína
- deve ser quantitativa, para estimar quanto
da proteína de interesse há em cada fração.
• Medidas do conteúdo proteico (diversos)
- absorbância de luz UV de 280 nm
- métodos colorimétricos
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Absortividade molar, e
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
Comprimento de onda
O gráfico mostra o espectro de absorção de luz UV dos aminoácidos aromáticos Trp, Tyr ou Phe.
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo
proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua composição, especialmente triptofano.
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato
Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um
complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm
1. Cu2+ é quelado pela proteína
[Cu2+-proteina]
2. Reação redox
Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína]
Método de Lowry
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de
proteínas e cadeias laterais de aminoácidos
aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o
reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfomobidênio-tungstênio), dando um composto
de cor azul.
Reagente Bradford
= Coomassie
Brilliant Blue G-250
Método baseado em uma mudança espectral do
reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor
azul), quando interage com proteínas.
Interação com proteínas se dá através de
forças de Van der Waals e ligações iônicas,
especialmente com arginina, mas também com
resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e
fenlialanina.
BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou
4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de
proteínas reagem fortemente com o BCA
formando um composto azul,
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).
Material na
fonte
por ultra-som
com
detergente
Vários métodos são
possíveis para transformar
células, órgãos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.
células
Homogeneização
(para romper tecidos e células)
tecidos
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material
de
partida
Sendo a proteína de interesse
uma proteína de membrana, é
necessário solubilizá-la. Para
esse fim são utilizados
detergentes, que dissolvem a
membrana plasmática e
formam complexos solúveis
com as proteínas.
Detergentes podem ser
iônicos e não iônicos
detergente
micelas
Dependendo da concentração
Proteínas
integrais da
membrana
Complexos
não micelares
Detergentes iônicos
Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide
SDS
Dodecil sulfato de
sódio
Detergentes
não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
Deoxicolato de sódio
Octilglicosídeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)
A centrífuga
Câmara blindada
Amostra
sedimentando
rotor
ângulo
fixo
refrigeração
A centrifugação frequentemente é uma das primeiras
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através
do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força
centrífuga é aplicada à amostra, separando seus componentes através de suas massas e/ou densidade, conforme
a técnica.
Através de sucessivas etapas de centrifugação com
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, podese obter diferentes frações de um homogenado de células
ou tecidos.
centrifugação diferencial
vácuo
homogenado
células intactas
pedaços de membrana
núcleos
sangue centrifugado: separação de plasma e células
mitocôndrias
lisossomos
ribossomos
fração
citoplasmática
Força centrífuga
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações,
dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
(necessitam vácuo
para evitar atrito do ar,
além de refrigeração)
1,200g por 15 minutos
separa plasma de
células sanguíneas
R$ 3.000
US$ 70,000
Preço aproximado
200,000 g por 24
horas para separar
organelas menores
ou complexos
proteicos
A centrifugação em um
meio com gradiente de
densidade melhora a
eficiência da separação. As
partículas se deslocarão
através do gradiente até
encontrarem uma região
com densidade equivalente
a sua, quando param de se
mover, formando “bandas”.
Centrifugação em gradiente de densidade
Solucões de sacarose com
densidades diferentes são
colocadas no tubo, uma
sobre a outra
Gradientes podem ser
utilizados para separar
diferentes tipos de células,
organelas, ácidos
nucléicos, complexos
proteicos, etc.
Amostra é colocada no
topo do gradiente
5% sacarose
20% sacarose
Baixa densidade
Média densidade
Alta densidade
centrifugação
Gradiente
separação de:
Ficoll-Hypaque
Sacarose
Cloreto de césio
leucócitos
mitocôndrias
ácidos nucléicos
As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas
são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos
é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
- adição de sais (Precipitação salina)
- adição de solventes
- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
Salting-in X Salting-out
Solubilidade da hemoglobina (S/S’)
NaCl
KCl
MgSO4
(NH4)2SO4
K2SO4
Concentração do Sal,, Molar
O gráfico ao lado ilustra o efeito de
diferentes sais sobre a solubilidade
da hemoglobina.
Em baixa concentração salina, a
solubilidade das proteínas aumenta,
pois os íons do sal ajudam a reforçar
a camada de solvatação.
Em alta concentração salina, a
solubilidade das proteínas diminue
pois os íons do sal competem pelas
moléculas de água disponíveis para
formar a sua própria camada de
solvatação.
Sais com ânions divalentes são mais
eficientes do que os monovalentes
na precipitação de proteínas.
Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.
Hemoglobina
Solubilidade, log
Albumina
Fibrinogênio
Considere uma solução com fibrinogênio,
albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e
mioglobina e observe o gráfico.
Mioglobina
Pseudoglobulina
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar
Proteínas apresentam diferente sensibilidade
para a precipitação salina.
- precipitam primeiro:
proteínas maiores
proteínas mais hidrofóbicas
Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4,
pode-se purificar completamente o
fibrinogênio a partir de uma mistura das 5
proteínas, pois este precipita totalmente em
uma saturação de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a solução e o
fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais
sal à solução até uma saturação de 7 M,
pode-se obter um novo precipitado contendo
albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos também purificada a mioglobina,
ainda em solúvel na presença de 7M do sal,
e que ficou sozinha no sobrenadante.
possuem camadas de solvatação maiores
ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou
quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.
Proteína
P.I.
Pepsina
<1,0
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI
tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam
a camada de solvatação menos organizada.
Ovalbumina galinha
4,6
Albumina sérica humana
4,9
Tropomiosina
5,1
Insulina bovina
5,4
Fibrinogênio humano
5,8
Gama-globulina
6,6
Colágeno
6,6
Água
Mioglobina equina
7,0
Hemoglobina humana
7,1
Ribonuclease A bovina
7,8
Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
Clorofórmio
Benzeno
Citocromo C equino
10,6
Histona bovina
10,8
Lisozima, galinha
11,0
Salmina, salmão
12,1
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Solvente
Constante Momento
Dielétrica Dipolar
78.5
48.9
32.6
24.3
20.7
4.8
2.3
1.85
3.96
1.66
1.68
2.72
1.15
0.00
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante
dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação
das proteínas.
Os mais utilizados são etanol e acetona.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é
necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
Aos precipitados obtidos com sal ou
solvente, adiciona-se água.
Membrana
de celofane
Ao precipitado obtido com variação
de pH, retornar ao pH original.
solvente
solução a
ser dialisada
início
Dt
final
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
SOBRENADANTE
ORGANELAS
Lisossomos
Mitocôndria
Golgi
Núcleo
Precipitação com Sal/Solvente
F1
F2
F3 F4
Precipitação com Sal/Solvente
F 2 .2
F 2 .1
F 2 .3
Cromatografia Troca Iônica
F 2 .3.1
F 2 .3.2
. . . . . .
F
2. 3.N
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
Gel Filtração
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Até o momento, exploramos as
etapas iniciais de purificação de
proteínas, como a centrifugação
diferencial e precipitação
fracionada.
Esses métodos, apesar de terem
baixo poder de resolução (exploram
diferenças grosseiras entre as
proteínas), permitem processar
grandes volumes ou massas, típicos
das etapas iniciais de isolamento.
Quando já houve redução significativa dos montantes de proteínas a
serem processados, iniciam-se as
cromatografias, que irão explorar as
diferenças mais sutis entre as
moléculas.
Não esquecer que todas as frações
obtidas devem ter o conteúdo de
proteínas e de atividade biológica
medidos, para se decidir qual/quais
deverão passar para o passo
seguinte da purificação.
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Amostra com
diferentes
componentes
Resina
embebida
em
tampão
Mais tampão é
colocado na
coluna,
forçando os
componentes
da amostra a
interagirem
com a resina
Os componentes da mistura são
separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como:
• massa molecular
• carga elétrica
• solubilidade
• afinidade
Tempo 2
Tempo 1
Líquido
que sae
da coluna
é
recolhido
em tubos
de um
coletor de
frações
Componentes da
amostra se
separam e saem
da coluna com
diferentes
volumes de
tampão
Coletor de
frações
Um cromatograma, como o
gráfico ao lado, é a maneira
usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia.
Tempo n
Concentração
Tempo zero
Tempo ou volume
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:
separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca iônica:
separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem carácter hidrofóbico
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
Moléculas com massas diferentes
proteína grande
proteína pequena
Fluxo do tampão
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina
grão da resina poroso
tubos
grãos (beads) da
resina com poros
Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo).
Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
uma proteína em seu estado nativo
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gelfiltração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Ler a massa
correspondente
Moléculas
maiores
20
25
50
75
100
volumeKav
de eluição
125 mL
traçado da medida de atividade
biológica nas frações
40
60
80
Medir o volume de eluição
da fração mais ativa.
Transportar para a curva de
calibraçao.
100
Moléculas
menores
120 mL
volume
Medida da ativ. biológica
Massa molecular (kD)
Observa
ra
escala
log
Absorbância a 280 nm
Curva de calibração
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo
de moléculas ou partículas a serem separadas
indica quais os tamanhos das
partículas que podem entrar
nos poros da resina e serem
fracionados. Acima ou abaixo
da faixa, não há separação.
Resinas para Gel-Filtração
NOME
TIPO
FAIXA DE RESOLUÇÃO
(kD)
Sephadex G-10
Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-100
Sephadex G-200
Dextrana
Dextrana
Dextrana
Dextrana
Dextrana
0.05 - 0.70
1-5
1 - 30
4 - 150
5 - 600
Bio-Gel P- 2
Bio-Gel P- 6
Bio-Gel P- 10
Bio-Gel P- 30
Bio-Gel P-100
Bio-Gel P-300
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
Policrilamida
0.1 - 1.8
1-6
1.5 - 20
2.4 - 40
5 - 100
60 - 400
Sepharose 6B
Sepharose 4B
Sepharose 2B
Agarose
Agarose
Agarose
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio
10 - 4.000
60 - 20.000
70 - 40.000
-Gel: Bio -Rad Laboratories
Moléculas pequenas
Proteínas
Moléculas pequenas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de
gel-filtração.
O gel nessa coluna é o
Sephadex G-200, cuja
faixa de resolução de
proteínas é de 5.000 a
600.000 d.
Observe como proteínas
nos extremos da faixa
de resolução tendem a
“sair” da parte linear da
curva.
Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de
dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr.
Kav = Ve-Vo
Vt-Vo
onde:
Ve – volume de eluição de uma certa proteína
Vt – volume total da coluna
Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com
massa acima da resolução da resina
Cromatografia de troca iônica
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.
DEAE
Trocadora de ânions
CM
Trocadora de cátions
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
Cromatografia de troca iônica
---
-
-
O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla
faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de
10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições
em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas:
1)
2)
adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a
mesma carga;
eluição das proteínas adsorvidas.
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
Moléculas com a mesma carga,
ou sem carga, não interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna
Eluição
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a
interação entre as proteínas e a resina.
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
Na+Cl- +
+
+
+
+
+
+
++
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico
das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteína
P.I.
Pepsina
<1,0
Ovalbumina galinha
4,6
Albumina sérica humana
4,9
Tropomiosina
5,1
Insulina bovina
5,4
Fibrinogênio humano
5,8
Gama-globulina
6,6
Colágeno
6,6
Mioglobina equina
7,0
Hemoglobina humana
7,1
Ribonuclease A bovina
7,8
Citocromo C equino
10,6
Histona bovina
10,8
Lisozima, galinha
11,0
Salmina, salmão
12,1
Proteínas apresentam carga positiva quando em meio
ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em
meio alcalino em relação ao seu pI.
Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido
ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.
H+
ácido
PI
+
neutro
básico
-
-COOH
+
-NH3
-COO
-
-NH2
H+
A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o
pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos
aminoácidos ácidos e básicos.
Responda: em pH 7,0, qual será a carga
elétrica da albumina, da mioglobina e do
citocromo C ?
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica
Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo
com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do
tampão de eluição.
As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas,
sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).
Eluição NaCl
Eluição NaCl
+
_
0. 10 M
0. 10 M
(+)
(-)
CM
(-)
(-)
+
+ +
0. 20 M
_
=
(-)
_
=
0. 15 M
=
0. 15 M
++
(+)
DEAE
_
(+) =
0. 20 M
(+)
Não retidas
Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)
+
+
+
Não retidas
Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
Tipos de Resina de troca Iônica
NOME
Dowex 1
TIPO
GRUPO IONIZÁVEL
OBSERVAÇÕES
Tipos
de
Resina
de
troca
Iônica
Fortemente básica
Ø - CH N (CH )
Troca aniônica
2
DEAE -celulose
resina de polistireno
Fortemente básica
resina de polistireno
Básica
CM-celulose
Ácida
DEAE -Sephadex
Gel de dextrano
básico
CM - Sephadex
Gel de dextrano
ácido
Dowex 50
+
3 3
Ø - SO 3-H
Dietilaminoetil
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2
Carboximetil
- CH2COOH
Dietilaminoetil
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2
Carboximetil
- CH 2COOH
Troca Catiônica
Fracionamento de proteínas
ácidas e neutras
Fracionamento de proteínas
básicas e neutras
Combinação de gel filtração
e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
Combinação de gel filtração
e troca iônica de proteínas
básicas e neutras
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio
- Gel: Bio Rad Laboratories
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
Cromatografia de afinidade:
Um dos métodos mais
eficientes para a
purificação de proteínas,
possibilitando um alto
rendimento com número
reduzido de etapas.
A separação de
moléculas tem como
base a interação
específica do analito
(molécula-alvo) com um
ligante imobilizado na
matriz. Forças
envolvidas nessa
interação podem ser não
covalentes
(eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de H)
ou covalentes (p.e.,
ponte dissulfeto).
Ex: cromatografia de imunoafinidade
Adsorção
Mistura de proteínas
Eluição
Partículas de
gel recobertas
de anticorpos
anti-A
Lavagem
pH 2,0 ou sal
Anti-A
interage
apenas
com a
proteína A
Coluna
empacotada
com esse gel
Desprezar
proteínas não
retidas
Complexo
Ag-AC é
desfeito
Antígeno A
puro -
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
por competição com o ligante livre
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Ligante
grupo-específico
Especificidade
Proteína A
Região Fc de IgG
Proteína G
Região Fc de IgG
Concanavalina A
Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue
Várias enzimas, albumina
lisina
Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina
proteinases tipo tripsina
benzamidina
proteinases tipo tripsina
calmodulina
Proteínas reguladas por calmodulina
heparina
Fatores de coagulação, lipases,
hormônios, receptores estoróides, etc
Metais de transição
Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP
ou cGMP)
Sítios de ligação das proteínas
A, G e L à imunoglobulina, que
permitem a purificação de
anticorpos por cromatografia
de afinidade
Preparo da resina de afinidade:
Estratégias para acoplamento de ligantes à resina
Reagente
Alvo no ligante
Passo 1. Ativação da resina
Passo 2. Acoplar
o ligante
Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento
estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligação à resina.
A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.
Braço espaçador covalente entre
a resina e o ligante
Molécula-alvo (analito)
ligante
Ligação reversível não covalente
Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade
diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos,
açúcares, lipídeos, etc.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença
de solvente orgânico.
Consiste de 2 sistemas:
Fase estacionária
(suporte sólido)
X
Fase móvel
(líquido ou gás)
Duas Possibilidades
- Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel
AMOSTRAS
- Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária
Dois tipos de montagem:
CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Suporte: PAPEL
Suporte: GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC)
Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose)
Fase Estacionária: sílica (mineral apolar)
Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico)
Fase Móvel: Solvente aquoso ou água
Cromatografia de Partição
tempo 0
Papel
ou placa
de sílica
t1
t2
tn
direção do
fluxo do
solvente
Rf =
Amostra
na origem
Compostos
separados
distância de migração da substância
distância de migração do solvente
Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)
Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um
valor de Rf característico.
Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem
identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação)
diferentes compostos.
Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o
composto isolado.
HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia
abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias.
Característica diferencial da cromatografia convencional:
• partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns)
• aumento da eficiência da separação em função do número maior de grãos
de resina em um mesmo volume da coluna
• fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna
Desenho básico de um HPLC
Detector
Controle e
análise dos
dados
Duas bombas permitem eluição em gradiente
Detector: índice de refração, absorbância UV
ou Vis, fluorescência, etc.
Coletor de
frações
bombas
Injetor de
amostra
Coluna e
forno
Coluna pode ser aquecida para melhorar a
eluição diferencial na fase reversa
Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C
Moléculas
retidas
100
% de acetonitrila
Absorbância a 214 nm
Moléculas
não retidas
Tempo ou volume de retenção
Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila
Fase estacionária
C18
C8
tC2
Aminopropyl
Cyanopropyl
Diol
CN Fenil
Função
–Si (CH3)2 C18 H37
–Si (CH3)2 C8 H17
–Si C2 H5
–Si (CH2)3 NH2
–Si (CH3)2 (CH2)3CN
–Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH
NH2 C4 C8
C18
Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia
Condição de equilíbrio: em meio ácido
(0.1% de ácido trifluoroacético) para
aumentar hidrofobicidade (protonar as
carboxilas)
Eluição com gradiente crescente de solvente
orgânico miscível com água
- acetonitrila, metanol, propanol
Cromatografia de interação hidrofóbica
É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos
apolares de uma proteína e uma matriz de carácter hidrofóbico.
Proteínas em solução salina concentrada
“perdem” parte da camada de solvatação para
os sais, expondo na superfície regiões ricas em
aminoácidos apolares, que interagem com uma
matriz hidrofóbica
matriz
hidrofóbica
H
Proteína
altamente
hidrofílica
P
Proteína
menos
hidrofílica
P
1. diminuir a concentração de sal
2. diminuir a polaridade da fase móvel
3. adicionar detergente
Força da interação hidrofóbica aumenta com o
tamanho da cadeia de C na resina:
camada de
H2O
solvatação
[Proteína]
Três estratégias para eluição:
Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8)
Eficiência dos sais em provocar “salting-out” varia com a série de Hofmeister:
Ânions: PO4-2> SO4-3>CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCNCátions:NH4+>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg+>Ca+>Ba+
[sal]
volume
Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida
através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes
em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína
de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades
específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de
partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser processadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às
diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes
etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de
interesse.
Purificação da Glicoquinase hepática de Rato
Etapa
Atividade Específicab Rendimentoc Índiceb
( U.mg
(%)
U . -1-) a
Purificação
Marcha A: somente cromatografias convencionais
1. Sobrenadante de pâncreas
2. (NH4)2 SO4, precipitado 25 -55%
3. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex , pH 7.0, eluição KCl
4. troca iônica, coluna CM-cellulose, pH 5.5, eluição NaCl
6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose
7. gel-filtração, coluna Sephacryl S-300
0.17
2.0
23
44
80
130
100
85
45
33
15
15
1
12
140
260
480
780
Marcha B: com cromatografia de afinidade
1. Sobrenadante de pâncreas
2. troca iônica, coluna DEAE- Sephadex, pH 7.0, eluição KCl
3. Afinidade cromatográfica (benzamidina~agarose)
0.09
18
420
100
84
83
1
195
4.500
U nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza
a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas
b Atividade específica: medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína
c Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação
d Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.
a
Uma tabela como a vista acima é a maneira usual de se descrever o resultado de uma
purificação. No exemplo acima, a mesma proteína foi isolada por duas “marchas” diferentes de
purificação (A e B). Observe os parâmetros de purificação.
Se você fosse repetir essa purificação, qual esquema de purificação escolheria ?
EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.
Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de
proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas.
Fornece informações sobre a massa molecular e composição
de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor.
A poliacrilamida é um polímero que um
gel de malha porosa.
A poliacrilamida funciona como uma
peneira, deixando passar através de seus
poros as moléculas pequenas e retendo
as grandes
+
acrilamida
N,N´-metilenobisacrilamida
Catalisador
(persulfato de amônio)
• É formado a partir da reação de acrilamida
e bisacrilamida.
• concentração de acrilamida variando de
5 a 20% determina o diâmetro dos poros
• uso de gradiente de acrilamida aumenta
o poder de resolução
• o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na
presença do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)
poliacrilamida
Desnaturação de proteínas por SDS
H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-
A porção hidrocarboneto do
detergente interage com as
regiões hidrofóbicas da proteína,
dispondo o grupo sulfato
carregado na superfície, em
contacto com o meio aquoso. A
repulsão entre os grupos fosfato
desestabiliza os laços não
covalentes que mantém a
estrutura 3D da proteína,
desnaturando-a.
Sódio dodecil sulfato
Efeito do SDS
• desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através
dos poros da poliacrilamida;
• mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas
migrem para o anôdo;
• facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
catodo
Poços para
as amostras
O desenho ao lado mostra o tipo mais comum
de cuba para PAGE.
Na cuba, o gel é polimerizado entre duas
placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm
uma da outra.
amostra
1 mm
tampão
Placas
de vidro
gel
anodo
tampão
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
Antes da polimerização, um pente é colocado
na parte superior do gel para formar os poços
onde serão colocados de 5 a 20 microlitros
de cada amostra, misturadas com azul de
bromofenol, um indicador da corrida.
As partes superior e inferior do gel fazem
contacto com recipientes de tampão, onde
estão os eletrodos que estabelecerão o
campo elétrico (~100V) durante a corrida
(1 a 2h).
Terminada a corrida, as placas são retiradas
da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente
retirado e corado para revelar as bandas de
proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie
Blue ou nitrato de prata.
SDS-PAGE das proteínas da bactéria
Salmonella tiphymurium
Eletroforese em Meio Redutor
Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe
pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a
determinação do número de cadeias e tipo de
ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas
Direção
da
migração
Padrões
A
B
AB
ss
A
2 - Mercaptoetanol
B
A
B
SH
SH
Sem
Cada linha (banda) corada no gel
representa uma proteína
Com
2 - Mercaptoetanol
Massa molecular (kD)
SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas
A migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é
proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se proteínas
padrões com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibração
do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de
uma proteína desconhecida na curva, pode-se estimar a sua
massa molecular.
Mr
(-)
97.4
Mobilidade relativa =
87.0
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida
45.0
29.0
Mobilidade relativa
(+)
21.0
12.5
6.5
Curva de calibração de SDS-PAGE
Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Terminamos aqui a 4ª.aula online do curso de Biofísica de Proteínas.
Os assuntos abordados nessa aula são:
-
Métodos de centrifugação e precipitação diferencial
-
Dosagem de proteínas
-
Métodos cromatográficos
-
Análise de eficiência da purificação
Na aula prática, vocês terão oportunidade de ver alguns tipos de
cromatografia funcionando.