Microscopia de
campo escuro
Campo claro
Campo escuro
Campo escuro
+ filtro vermelho
Microscopia de campo escuro

Campo escuro: bloqueio dos raios centrais,
permitindo apenas iluminação oblíqua na
amostra.
Luz captada pela objetiva = refração + reflexão
fluorescência
refração
absorção
LUZ
reflexão
Microscopia de campo escuro

Tipo de contraste no campo escuro
(iluminação oblíqua)
1) Negativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo,
que fica escuro.
Contraste = (If - Ia) x 100
If
Microscopia de campo escuro

Contraste com campo
escuro
- Os raios não desviados são
obliterados;
- Apenas raios desviados são
captados pela objetiva.
Plano da
imagem
ocular
Lente do tubo
objetiva
Raios não desviados
Distância
focal
amostra
Raios
desviados
condensador
Microscopia de campo escuro

O que a técnica de campo escuro faz?
1) Contraste negativo
- Bloqueia os raios não desviados centrais, permitindo
apenas a passagem de raios desviados num ângulo suficiente
para serem captados pela objetiva;
- os eventos de refração e reflexão são responsáveis pela
produção de raios desviados;
- a amostra fica clara sobre um fundo escuro;
- cria uma aparência tridimensional da amostra;
- a resolução é a mesma do campo claro.
Microscopia de campo escuro

Configuração
Trabalha-se nos planos
da imagem conoscópica
objetiva
Luz não coletada pela objetiva
Luz difratada pela amostra
amostra
condensador
Anel de campo escuro
Só entra luz na objetiva se houver material com índice de
refração maior que o da água.
Microscopia de campo escuro
Sem amostra
Com amostra
Microscopia de campo escuro

1)
Dados técnicos
Acessórios obrigatórios: anel de campo
escuro para o condensador;
Não há objetivas especiais para esta técnica.
OBS: alternativamente, pode-se usar um anel
de fase para objetiva de alta AN (100x)
com uma objetiva de baixa AN.
Campo escuro pode ser usada em luz transmitida e refletida e em estereoscopia.
Microscopia de campo escuro
Dados técnicos: fatores que
influenciam no tamanho do anel

-
-
Posição do anel no condensador;
AN da objetiva e do condensador;
O número de campo da ocular;
Aumento da ocular (menor aumento requer anel mais largo);
Índice de refração do meio de montagem (maior IR requer
anel mais largo).
Microscopia de campo escuro
Dados técnicos do anéis
Acessórios obrigatórios: opções de

anéis de campo escuro.
Microscopia de campo escuro

Dados técnicos- como fazer
- realiza o alinhamento Koehler;
-
seleciona o anel de campo escuro;
movimenta-se o condensador
verticalmente até obter o campo
escuro e com a amostra brilhante.
Microscopia de campo escuro

Técnicas e contraste
Amostra
Transparente
Corada
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Técnica
Contraste
Campo claro
Campo claro
Contraste de fase
Contraste diferencial
de interferência
Campo escuro
Fluorescência
2-5%
25%
15-20%
15-20%
60-75%
60-75%
Microscopia de campo escuro

Indicações
Objetos muito pequenos, cuja visualização é
difícil sobre um fundo claro;
- Pode permitir a detecção de estruturas muito
menores que o poder de resolução do
microscópio (ex.: 0.02 mm), mas isto não
significa que a técnica aumenta a resolução.
- Em combinação com técnica de fluorescência;
Exemplos: - bactéria; - organelas celulares,
- polímeros, cílios, flagelos, microtúbulos,
filamentos de actina;
- partículas de prata e ouro usadas em técnicas
de histoquímica.
-
Microscopia de campo escuro

Limitações
amostras com muitos pontos de causam
espalhamento podem não produzir um
contraste adequado;
- estruturas que causam muito espalhamento
podem mascarar outras estruturas mais
delicadas que espalham pouca luz.
-
Microscopia de contraste de fase

Imagens
Raiz de dente humano
Preparo por desgaste
Sal (cloreto de sódio)