Microscopia de
contraste de fase
Microscopia de contraste de fase

Contraste: diferença de iluminação entre
amostras e os arredores ou o plano de fundo.
Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração
+ reflexão)
fluorescência
refração
absorção
LUZ
reflexão
Microscopia de contraste de fase

Tipos de contraste de fase
1) Positivo: amostra é mais escura do que o plano de fundo;
2) Negativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo.

Equação
Contraste = (If - Ia) x 100
If
I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).
Microscopia de contraste de fase

Tipos de amostra
1) Amplitude: alteram a intensidade da luz transmitida.
Amostras transparentes coradas causam o mesmo
efeito.
2) Fase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase
nos comprimentos de onda que a atravessam.
Amostra transparente
Amostra tipo amplitude
Amostra tipo fase
Amostra tipo misto (maioria)
Microscopia de contraste de fase

Contraste em amostra com
baixo retardo de fase
Plano da
ocular
imagem
- Os raios não desviados são
retardados cerca de ¼ de l em
relação aos raios não desviados;
Lente do tubo
- a diferença de intensidade de luz
não é percebida pelo olho humano
objetiva
(não dá contraste).
Raios desviados
Distância
focal
amostra
Raios
não desviados
condensador
Microscopia de contraste de fase

O que o contraste de fase faz?
1) Contraste de fase positivo
- Acelera os raios não desviados em ¼ de l, elevando a
diferença de fase total para ½ de l;
- a amostra fica escura, circundada por halo claro, sobre
um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá
contraste.
2) Contraste de fase negativo
- Retarda os raios não desviados em ¼ de l, elevando a
diferença de fase total para ½ de l;
- a amostra fica clara, circundada por halo escuro, sobre
um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá
contraste.
Microscopia de contraste de fase

Configuração
não desviados + 90º
Não desviados
objetiva
Raios desviados
180º fora de fase
Anel de fase
Raios desviados
90º fora de fase
amostra
Trabalha-se nos planos
da imagem conoscópica
condensador
Anel de fase
Microscopia de contraste de fase

Configuração
Parte central
do anel mais
fina que a
periferia
Parte central
do anel mais
fina que a
periferia
Contraste positivo
Contraste negativo
Microscopia de contraste de fase

1)
Dados técnicos
Acessórios obrigatórios: anel de fase para
condensador e objetivas com anéis de
fase;
2) Acessório extra: filtro verde. Isto porque os
o sistema é projetado para funcionar
melhor no centro do espectro visível (cor
verde).
Microscopia de contraste de fase

Técnicas e contraste
Amostra
Transparente
Corada
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Técnica
Contraste
Campo claro
Campo claro
Contraste de fase
Contraste diferencial
de interferência
Campo escuro
Fluorescência
2-5%
25%
15-20%
15-20%
60-75%
60-75%
Microscopia de contraste de fase

-
-
Alinhamento dos anéis de fase
Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a
imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular;
Alinhar os anel do condensador movimentando os
parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica;
Sem alinhamento a técnica não funciona.
Anéis não alinhados
Anéis alinhados
Microscopia de contraste de fase

Indicações
- Amostras vivas ou fixadas não coradas;
- Melhorar contraste para visualização de
detalhes em amostras coradas (ex.: estriações
transversais de músculos)
Microscopia de contraste de fase

Limitações
os halos podem obscurecer os detalhes que
circundam a amostra;
-
os anéis de fase reduzem a resolução da
objetiva;
-
-
não é adequada para amostras espessas.
Microscopia de contraste de fase

Imagens
- Células de ovário de hamster
Contraste de fase positivo
Contraste de fase negativo
Osso de dinossauro fossilizado
com quartzo no canal de Havers
Preparo por desgaste
Contraste de fase
Osso compacto humano
Preparo por desgaste
Contraste de fase + coloração
Aterosclerose (placa de colesterol
na parede da artéria)
Contraste de fase + coloração
Pneumonia brônquica
Contraste de fase + HE
Língua humana
Contraste de fase + HE
Cartilagem hialina
Contraste de fase
Pólen de plantasc
Contraste de fase + HE
Neurônio multipolar