COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE
UMA PLANTA
COMO SE MODIFICA GENETICAMENTE
UMA PLANTA
As estratégias mais utilizadas de
transferência de DNA para plantas:
Estratégia
1.
global:







- Célula vegetal N
Alvos possíveis de transformação genética:
Identificar o objectivo de
melhoramento
 Vector biológico:
Agrobacterium
(uma bactéria do solo com duas espécies
importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes)
Identificar e isolar o(s) gene(s) de
interesse
Núcleo (N)
Plastos (P) (resistência a herbicidas do tipo triazina)
Mitocôndrias (M) (cms - "cytoplasmic male sterility")
P
M
 Vector não biológico: Bombardeamento
Clonar o(s) gene(s) num vector
apropriado
com micropartículas, de ouro ou tungsténio
(com cerca de 1 mm de diâmetro)
Transferir o(s) gene(s) de
interesse à planta
Transferência directa: O DNA entra através
da membrana celular permeabilizada por
choques eléctricos ou agentes permeabilizantes (como o polietilenoglicol)
Avaliar a integração e o
comportamento do(s) gene(s) na
planta
Utilização laboratorial do Agrobacterium:
Avaliar o comportamento da
planta transgénica no terreno
Cultura in vitro do material
vegetal (plântulas micropropagadas e germinantes)
Representação esquemática
do processo de infecção:
Situação que ocorre na natureza:
H 3CO
Colonização genética das plantas por infecção por Agrobacterium tumefaciens
Bactéria com o Ti -plasmídio
OH
OCH 3
H 3CO
A
Receptor membranar vir
Infecção de plantas feridas e transferência do
DNA para as células
OH
OCH 3
A
vir
Infecção dos explantes com
a suspensão bacteriana
(Acetosseringona - ou outros compostos produzidos pelas
células vegetais feridas)
COCH 3
COCH 3
COCH 3
Ferimento do material
vegetal (seccionamento)
H 3CO
OH
Leitura da absorvência
a 600 nm
OCH 3
Aplicação sobre a
zona de ferida
(24-48h)
A
vir
vir G* (Molécula que vai activar
vir G
Incubação numa solução diluída de
bactérias (durante alguns segundos
a alguns minutos) e transferência
dos explantes para meio fresco para
cocultura com as bactérias
Agrobacterium
a região de virulência)
F
A
Plasmídio Ti
B
G
C
D
E
Cultura em meio
líquido com agitação
(adição ou não de
acetosseringona)
Região de virulência
Ti -plasmídio
(responsável pela virulência)
D
Região excisada e
transferida à planta, por informação vinda da região de virulência D
T-DNA
Indução pelo T-DNA de:
Plasmídio Ti
1 - crescimento independente de hormonas,
2 - síntese de opinas (compostos de carbono e azoto
dos quais a bactéria se alimenta
Indução de rebentos transformados
em meio de cultura selectivo (por ex.
com antibióticos de selecção) e na
presença dos fitorreguladores
adequados
Após a cocultura:
- transferência dos explantes para
meio de cultura fresco (com ou sem
prévia lavagem em água ou meio
cultura, ou secagem sobre papel de
filtro estéril)
- o meio fresco deve conter antibióticos para eliminar o Agrobacterium
Agrobacterium
desarmado
A. rhizogenes
Formação de raízes no material
infectado. As raízes excisadas
crescem e ramificam em meio
de cultura sem hormonas
Cromossoma
bacteriano
Planta com agrobactérias
vivendo em "crown gall"
ESTRATÉGIAS E PROBLEMAS DA
ENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS
EXEMPLOS DE ALGUNS PROBLEMAS ACTUAIS
SOLUCIONÁVEIS POR ENGENHARIA GENÉTICA
– 900 milhões de pessoas passam fome (este número cresce
 Identificação, isolamento e manipulação
in vitro dos genes
 Transferência dos genes manipulados
para as células vegetais
anualmente em 95 milhões)
– Os oceanos e os terrenos de cultura são explorados aos seus
limites
– A quantidade de terra arável por pessoa diminui
continuamente
– As perdas de culturas por pestes, doenças e ervas daninhas
atinge os 40-60%
– As perdas anuais de arroz são superiores a 200 milhões de
metros cúbicos, o equivalente a alimento para
1000 milhões de pessoas
– 1/3 da produção de trigo perde-se devido a:
Ervas daninhas
Pragas
Doenças
(resistência a herbicidas, pragas, doenças?...)
– As quantidades de arroz que se perdem anualmente devido a infecções
com o vírus Tungro davam para alimentar 15.000.000 de pessoas
(introdução de resistência à virose?)
 Cultura das células para obter plantas trans-
génicas ou linhas de células transgénicas, mantidas in vitro como callus, suspensões ou raízes
Diferenciação de rebentos adventícios
a partir de folhas em meio de cultura
OBJECTIVOS DA
ENGENHARIA GENÉTICA DE PLANTAS
 Resistência a insectos
 Resistência a herbicidas

Resistência a doenças (vírus, fungos, bactérias)
 Expressão de proteínas importantes do ponto de
vista farmacológico (i.e.: antigéneos)
Plantas regeneradas de folhas transformadas, à esquerda uma plântula resistente ao antibiótico de selecção (canamicina) e à direita uma planta sensível (não
transformada)
 Inibição do amadurecimento de frutos
 Criação de esterilidade masculina
 Manipulação do metabolismo do carbono
ou fósforo
–Anualmente 2.000.000 de crianças ficam cegas por falta de pró-vit. A
(melhoramento do potencial nutritivo do arroz com
enriquecimento em pró-vitamina A por introdução de
genes da via biossintética dos carotenos, ß-caroteno?)
Plantas micropropagadas (amendoeira)
utilizadas como fonte de material para
regeneração adventícia e transformação
genética
 Melhoramento da absorção de ferro
……
Monitorização da presença de um gene
de referência introduzido por transformação. Por incubação num substracto
adequado, a enzima codificada pelo gene dá origem a um produto de cor azul
que permite identificar as células/plantas
transformadas (à esquerda duas plantas
transformadas e à direita 3 plantas controlo)