Sumário
Apresentação.......................................................................................................... 13
Lista de abreviaturas............................................................................................... 16
Capítulo 1 – Introdução Geral.. .............................................................................. 19
1.1. O problema da alimentação à escala planetária.. ............................. 19
1.2. O conceito de Biotecnologia............................................................. 27
1.3. A utilização das plantas e o aparecimento da agricultura............... 28
1.4. Perspectiva histórica e métodos de estudo
em Biotecnologia Vegetal........................................................................ 34
Capítulo 2 – Cultura in vitro de plantas................................................................. 43
2.1. Introdução......................................................................................... 43
2.2. Totipotência da célula vegetal.......................................................... 44
2.3. Multiplicação vegetativa.................................................................... 49
2.4. Métodos convencionais de multiplicação vegetativa........................ 50
2.5. A cultura in vitro de plantas............................................................. 53
2.5.1. Condições de cultura.. ....................................................... 55
2.5.1.1. Os recipientes........................................................ 55
2.5.1.2. Assepsia................................................................. 55
2.5.1.3. Factores físicos...................................................... 57
2.5.2. O meio de cultura............................................................. 57
2.5.2.1. Elementos minerais............................................... 58
2.5.2.2. Vitaminas e aminoácidos..................................... 59
2.5.2.3. Outros compostos................................................. 60
2.5.2.4. Hidratos de carbono............................................. 62
2.5.2.5. Hormonas vegetais................................................ 62
Auxinas................................................................. 64
Citocininas............................................................ 66
Giberelinas............................................................ 68
Ácido abscísico..................................................... 70
Etileno................................................................... 71
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Capítulo 3 – Clonagem de plantas – proliferação de meristemas
e organogénese....................................................................................................... 75
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3.1. Introdução......................................................................................... 75
3.2. Tipos de meristemas......................................................................... 76
3.2.1. Meristema apical da raiz................................................... 79
3.2.2. Meristema apical do caule................................................ 80
3.3. Objectivos da cultura de meristemas caulinares.............................. 82
3.3.1. Funcionamento do meristema........................................... 83
3.3.2. Propagação em larga escala.............................................. 84
3.3.2.1. Preparação da planta mãe.................................... 85
3.3.2.2. Iniciação e estabelecimento das culturas............ 86
3.3.2.3. Multiplicação......................................................... 88
3.3.2.4. Alongamento e enraizamento dos rebentos........ 90
3.3.2.5. Aclimatização das plantas regeneradas................ 94
3.3.3. Multiplicação de plantas isentas de vírus......................... 96
3.3.4. Conservação de germoplasma.. ......................................... 99
3.4. Vantagens da cultura de meristemas.............................................. 100
3.5. Limitações da técnica...................................................................... 100
3.6. Indução de organogénese............................................................... 103
Capítulo 4 – Embriogénese somática.................................................................... 109
4.1. Introdução....................................................................................... 109
4.2. Embriogénese zigótica.................................................................... 110
4.3. Embriogénese não zigótica............................................................. 116
4.4. Embriogénese somática.. ................................................................. 117
4.4.1. Tipos de embriogénese somática.................................... 120
4.4.2. Fases da regeneração de plantas por
embriogénese somática............................................................. 124
4.4.2.1. Indução......................................................................... 124
4.4.2.2. Desenvolvimento e maturação
dos embriões somáticos.. .......................................................... 128
4.4.2.3. Germinação dos embriões somáticos
e conversão em plantas............................................................ 134
4.5. “Sementes artificiais”.. ..................................................................... 138
4.6. Estudos genéticos, bioquímicos e moleculares.............................. 140
4.7. Considerações finais.. ...................................................................... 148
Capítulo 5 – Embriogénese polínica e obtenção de haplóides............................ 151
5.1. Introdução....................................................................................... 151
5.2. Ocorrência natural de haplóides.................................................... 153
5.3. Métodos de obtenção de haplóides................................................ 155
5.4. Embriogénese polínica.. .................................................................. 157
5.4.1. Desenvolvimento do pólen.............................................. 159
5.4.2. Vias androgénicas........................................................... 163
5.4.3. Dimorfismo polínico e culturas ab initio........................167
5.4.4. Factores que afectam a indução de androgénese........... 169
5.5. Níveis de ploidia das plantas regeneradas.. .................................... 175
5.6. Duplicação do número de cromossomas dos haplóides................. 178
5.6.1. Utilização de colchicina.................................................. 179
5.6.2. Duplicação via formação de um calo............................. 179
5.7. Os haplóides e o melhoramento vegetal.. ....................................... 181
5.8. Problemas e limitações................................................................... 183
5.8.1. Albinismo........................................................................ 183
5.8.2. Variabilidade das plantas regeneradas.. .......................... 188
Capítulo 6 – Suspensões celulares e metabolitos secundários............................. 191
6.1. Introdução....................................................................................... 191
6.2. Obtenção de suspensões celulares................................................. 192
6.3. Medidas de viabilidade e crescimento celular.. .............................. 196
6.4. Suspensões celulares e produção de metabolitos secundários...... 198
6.5. Optimização de rendimentos.......................................................... 209
6.5.1. Adição de precursores..................................................... 209
6.5.2. Biotransformação.. ........................................................... 209
6.5.3. Elicitação.......................................................................... 211
6.5.4. Selecção de linhas celulares............................................ 212
6.6. Transformação genética de plantas e produção
de metabolitos secundários................................................................... 213
6.6.1. Produção de metabolitos em hairy roots........................ 215
6.7. Produção de metabolitos noutros órgãos.. ...................................... 217
6.8. Sistemas de cultura imobilizados................................................... 217
6.9. Considerações finais........................................................................ 219
9
Capítulo 7 – Protoplastos e hibridação somática................................................. 221
7.1. Introdução....................................................................................... 221
10
7.2. Breve resenha histórica.. ................................................................. 224
7.3. Isolamento de protoplastos............................................................. 225
7.4. Purificação de protoplastos............................................................. 228
7.5. Contagem e determinação da viabilidade....................................... 230
7.6. Cultura de protoplastos................................................................... 232
7.7. Evolução das culturas...................................................................... 234
7.8. Fusão de protoplastos..................................................................... 236
7.9. Produtos de fusão.. .......................................................................... 239
7.10. Selecção dos produtos de fusão
e caracterização das plantas obtidas..................................................... 243
7.11. Aplicações e limitações da utilização de protoplastos.................. 249
Capítulo 8 – Transformação genética de plantas................................................. 253
8.1. Introdução....................................................................................... 253
8.2. Transferência de genes por cruzamento e selecção....................... 255
8.3. Plantas geneticamente modificadas por engenharia genética........ 261
8.4. Agrobacterium tumefaciens........................................................... 264
8.5. Mecanismo de infecção das células vegetais
com Agrobacterium tumefaciens.......................................................... 271
8.5.1. Ligação das bactérias às células vegetais........................ 271
8.5.2. Indução dos genes vir................................................... 272
8.5.3. Processamento do T-DNA.. .............................................. 274
8.5.4. Transporte e integração do T-DNA nas células vegetais.... 275
8.6. A utilização de A. tumefaciens na transformação
experimental de plantas........................................................................ 279
8.7. Genes quiméricos............................................................................ 282
8.8. A transformação genética de plantas com A. tumefaciens............. 290
8.9. Outros métodos de transformação.................................................. 293
8.10. Transformação de organitos citoplasmáticos................................. 299
8.11. Expressão dos genes nas plantas.................................................. 303
Capítulo 9 – Plantas com novas características obtidas
por transformação genética.................................................................................. 307
9.1. Introdução....................................................................................... 307
9.2. Plantas tolerantes a herbicidas........................................................ 309
9.3. Plantas resistentes a insectos.......................................................... 313
9.4. Plantas resistentes a agentes patogénicos....................................... 318
9.5. Plantas resistentes a factores abióticos............................................ 322
9.6. Produção de compostos de interesse.............................................. 326
9.7. Alteração das propriedades dos alimentos...................................... 332
9.8. Alterações no amadurecimento dos frutos..................................... 339
9.9. Alterações na coloração das flores.................................................. 344
9.10. Alterações nos teores de lenhina.................................................. 348
9.11. Rendimento das culturas............................................................... 350
9.12. Tecnologia terminator................................................................. 352
9.13. Outras características.................................................................... 355
Capítulo 10 – Impacto das plantas geneticamente modificadas........................... 359
10.1. Introdução..................................................................................... 359
10.2. Eventuais impactos em termos de saúde...................................... 361
10.3. Eventuais impactos ambientais..................................................... 370
10.4. Eventuais impactos sócio-económicos.......................................... 377
Bibliografia............................................................................................................ 383
Endereços internet................................................................................................ 405
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Apresentação
Este livro tem uma história. A história começa em 1995 quando após
a conclusão do doutoramento propus à comissão científica do então
Departamento de Botânica a criação de uma disciplina de opção na área da
Biotecnologia Vegetal. A proposta foi aceite e a disciplina foi incluída nos
planos de curso das Licenciaturas em Biologia e Bioquímica Faculdade de
Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra (FCTUC), com o nome
de Introdução à Biotecnologia Vegetal tendo funcionado, pela primeira
vez, no ano lectivo de 1996/97 e, com a excepção de uma interrupção no
ano lectivo de 2002/03, de forma ininterrupta até ao presente. Na altura
iniciavam‑se as primeiras culturas de plantas geneticamente modificadas
com alguma expressão em termos globais e a bibliografia disponível para
os alunos era muito limitada. Para além disso, ela encontrava‑se dispersa
por diferentes livros e essencialmente disponível em língua inglesa. Este
contexto levou‑me a elaborar uma sebenta onde reuni um conjunto de
informação sobre os diferentes temas abordados nas aulas.
Numa época em que a ciência evolui de forma tão acelerada a sebenta
foi‑se adaptando a novas realidades. A componente mais relacionada com
a clonagem de plantas reduziu‑se enquanto outros temas, como a obtenção de plantas haplóides e a engenharia genética de plantas ganharam
protago­n ismo, muito em função do seu maior impacto em termos práticos
no melhoramento das plantas. A minha inclusão no Centro de Estudos Farmacêuticos da Universidade de Coimbra permitiu‑me contactar com outras
realidades e realizar alguma investigação na área dos metabolitos secundá­
rios das plantas, actualmente mais designados como produtos naturais.
O grande potencial da biotecnologia nesta área começa agora a ser explorado
de forma mais consistente. Como consequência esta área do conhecimento
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passou a ter um peso mais alargado no funcionamento da disciplina e foi
também incorporada na sebenta.
O resultado desta evolução é o livro actual. No primeiro capítulo é feita
uma introdução geral à biotecnologia e à sua importância no melhoramento
de plantas Os fundamentos da cultura in vitro de células, tecidos ou
órgãos vegetais são analisados no capítulo 2. O capítulo 3 trata das técnicas
de clonagem in vitro relacionadas com a proliferação e formação de novo
de meristemas. A embriogénese somática, também um método de clonagem
mas igualmente com uma importância determinante em estudos de desenvolvimento embrionário é tratada no capítulo 4. As técnicas de obtenção
de plantas haplóides e a sua importância no desenvolvimento de novas
variedades são analisadas no capítulo 5 com um destaque particular para o
potencial embriogénico do pólen. O capítulo 6 é sobre a cultura de células
e o seu potencial de produção de metabolitos secundários. O interesse
industrial destes compostos é também analisado tal como o potencial das
raízes na formação de metabolitos secundários. O capítulo 7 é sobre os métodos de obtenção de protoplastos e o potencial das células desprovidas de
parede na obtenção de novas combinações genéticas, os chamados híbridos
somáticos. As técnicas de transformação genética de células vegetais, com
particular destaque para o mecanismo de transferência de genes utilizando
Agrobacterium tumefaciens são tratadas no capítulo 8. Segue‑se um capítulo
onde são indicados vários exemplos de plantas com novas características
obtidas por transformação genética. Essas novas características vão desde
resistência a insectos ou herbicidas à produção de biofármacos. Finalmente,
o último capítulo (10) tem como objectivo clarificar alguns conceitos que
erroneamente têm sido divulgados na opinião pública lançando a confusão
sobre as plantas geneticamente modificadas. No final é fornecida uma lista
onde se descriminam os livros, artigos e teses que serviram de base para
a elaboração deste livro bem como uma lista de endereços internet onde
se pode obter informação complementar sobre os assuntos aqui abordados.
Os capítulos 2 a 9 são essencialmente técnicos. Nos capítulos 1 e 10 são
referidos alguns assuntos mais ou menos controversos relacionados com
as plantas geneticamente modificadas e onde a minha opinião está expressa.
Como é de esperar essa opinião apenas me compromete a mim.
O livro serve de suporte à actual disciplina de Biotecnologia Vegetal
do curso de Biologia da FCTUC podendo ser usado em disciplinas similares
de outras instituições do ensino superior. A sua preparação teve também
o propósito de chegar a outros públicos alvo nomeadamente pessoal técnico
ligado a empresas agrícolas, hortícolas ou florestais, professores do ensino
secundário da área da biologia, pessoas cuja actividade profissional esteja
de algum modo ligada ao melhoramento de plantas e mesmo o cidadão
comum que apenas pretende manter‑se informado sobre este assunto em
particular. Nesta perspectiva optou‑se, em algumas situações, por utilizar
uma linguagem menos técnica que fosse de mais fácil acesso a pessoas sem
grande formação específica na área.
Um livro científico é como um gadget. Quando se leva para casa já
está desactualizado. O autor ([email protected]) agradece antecipadamente
todas as correcções e sugestões que possam melhorar futuras edições desta
publicação.
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