ESTUDO TEÓRICO DE NOVOS INIBIDORES DA ENZIMA
DIIDROOROTATO DESIDROGENASE HUMANA.
Saulo Cardoso CARVALHO – Estudante da Faculdade de Farmácia – UFPA; [email protected]
Roseane Maria Ribeiro COSTA - Pesquisadora do Laboratório Controle de Qualidade – UFPA;
[email protected]
José Otávio Costa SILVA Júnior – Pesquisador do Laboratório P & D Farmacêutico e Cosméticos –
UFPA; [email protected]
Natália Farias SILVA – Pesquisadora do Laboratório Controle de Qualidade – UFPA. [email protected]
RESUMO: a artrite reumatoide é uma inflamação crônica caracterizando-se por dores nas
articulações e progressão para irreversíveis lesões articulares. a enzima diidroorotato
desidrogenase de homo sapiens vem sendo estudada como alvo promissor por apresentar ação
antiproliferativa e atividade imunomoduladora. recentemente, foram sintetizados inibidores a
base de hidroxifurazanas, que apresentaram atividade inibitória bastante satisfatória frente a esta
enzima, o que demonstrou ser uma alternativa potencial para tratamento da artrite reumatoide.
desta forma, este trabalho buscou avaliar os parâmetros físico-químicos de doze inibidores
sintetizados e o agente inibidor (metabólito ativo) antiproliferativo a771726 (a26). inicialmente
as estruturas dos inibidores foram desenhadas bidimensionalmente no programa chemdraw ultra
e posteriormente desenhadas tridimensionalmente e minimizadas através da mecânica clássica
mm++ no programa chem 3d ultra. a partir desses resultados, foram realizados cálculos para a
estabilização e otimização da energia usando programa gaussian 03. a otimização das estruturas
foram baseadas no método da teoria do funcional de densidade (tfd). a visualização das
estruturas otimizadas foi realizada com o programa visual molecular dimanycs (vmd). os
resultados teóricos mostraram que a molécula 12 apesar de ser a estrutura mais estável
apresentou atividade inibitória (ic50) considerada moderada. no entanto, as moléculas 10 e 11
quando comparadas em nível de energia e ic50 ao inibidor natural a26 da enzima apresentou
resultados satisfatórios. portanto, dentre os 12 inibidores sintetizados a molécula 10 apresenta
um alto potencial para a pesquisa e desenvolvimento de fármacos antirreumáticos com
amenização dos efeitos adversos dos tratamentos convencionais.
Palavras-chave: DHODH, Artrite Reumatoide, B3LYP.
INTRODUÇÃO:
A enzima Diidroorotato Desidrogenase (DHODH) participa do mecanismo da
biossíntese de nucleotídeos de pirimidinas, a qual se trata de uma importante via
metabólica em organismos eucarióticos e procarióticos (ROWLAND et al., 1998). Sua
atuação se dá no quarto passo desta via, onde esta enzima é responsável pela conversão
da molécula Diidroorotato (DHO) em Orotato (ORO), que ocorre em apenas uma única
etapa de oxidação-redução utilizando a Flavina Mononucleotídeo (FMN) como
coenzima (BJORNBERG., 1998).A primeira parte da reação o substrato DHO é
oxidado, enquanto que a flavina é reduzida. Já na segunda parte reacional, a FMN é
reoxidada com o auxílio de um segundo substrato, que desempenha a função de agente
oxidante, que pode variar de acordo com a origem biológica da enzima. Este tipo de
mecanismo apresentado nesta classe é conhecido como ping-pong bi-bi no qual ocorre
quebra e formação de ligação de forma simultânea (TAKASHIMA et al, 2002).
736
As enzimas DHODH por apresentarem origem de organismo diferentes, tal
como localização celular, características estruturais e propriedades estruturais são
divididas em duas famílias, 1 e 2. A família 1 ainda apresenta uma subdivisão em dois
grupos: A e B. A classe 1 A bastante estudada no tratamento de Doença de Chagas
(PINHEIRO et al., 2008). Neste trabalho a classe da enzima estudada será da classe 2.
A estrutura cristalográfica da enzima DHODH classe 2 de Homo sapiens
(HsDHOD) foi definida por Liu e colaboradores, sendo depositada no Protein Data
Bank (PBD) com o código 1D3H (LIU et al., 2000).O modelo é monomérico, no qual é
constituído por 364 resíduos de aminoácidos e 298 moléculas de águas de cristalização.
O cristal do complexo enzimático da 1D3H inclui as estruturas, assim como outras
enzimas da classe DHODH, o substrato DHO, o cofator FMN e um agente inibidor
antiproliferativo A771726 (A26), apresentando uma atividade contra artrite reumatoide
(LIU et al., 2000).
A Artrite Reumatoide (AR) é uma doença crônica, inflamatória, cuja principal
característica é a inflamação das articulações. A AR é caracterizada como uma
patologia autoimune, ou seja, é uma condição em que o sistema imunológico, que
normalmente defende o nosso corpo de infecções, passa a atacar o próprio organismo
(GOELDNER et al., 2011). A inflamação persistente das articulações, se não tratada de
forma adequada, pode levar à destruição das juntas, o que ocasiona deformidades e
limitações para o trabalho e para as atividades da vida diária. O tratamento adequado e
precoce pode prevenir a ocorrência de deformidades e melhorar a qualidade de vida de
quem tem a doença (LAURINDO et al., 2004).
A HsDHODH vem sendo estudada como alvo promissor para o tratamento da
AR por apresentar ação antiproliferativa e atividade imunomoduladora (LIU et al.,
2000). Recentemente, foram sintetizados inibidores a base de hidroxifurazanas, que
apresentaram atividade inibitória frente a esta enzima bastante satisfatória, o que
demonstrou benefício potencial para tratamento da AR (LOLLI et al., 2012). Estes
inibidores são utilizados quando a patologia está com efeitos tóxicos irregulares devido
a toxicidade do tratamento convencional, que utiliza a combinação de drogas
antiinflamatórios e antirreumáticas. Embora essas drogas proporcionem alívio
sintomático, eles não modificam o curso da doença, causando efeitos colaterais como
toxicidade gástrica (SILVEIRA DWS et al., 2006).
737
OBJETIVO GERAL:
Realizar o estudo teórico de parâmetros físico-químicos de inibidores derivados
do hidroxifurazanil com potente atividade antiproliferativa para a enzima HsDHODH.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Otimizar a estrutura do inibidor complexado da enzima HsDHODH, A26, a
nível B3LYP/6-31G (d,p).
Otimizar as estruturas de 12 inibidores derivadas do hidroxifurazanil a nível
B3LYP/6-31G (d,p).
Obter as carga das estruturas otimizadas aqui estudadas
Obter o mapa do potencial eletrostático (MPE) dos inibidores de menor energia.
Analisar os inibidores mais estáveis e com atividade inibitória satisfatória para
realizar o processo de Docagem Molecular.
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METODOLOGIA:
Inicialmente as estruturas dos inibidores foram desenhadas bidimensionalmente
no programa CHEMDRAW ULTRA 9 e posteriormente desenhadas
tridimensionalmente e minimizadas através da mecânica clássica MM++ no programa
CHEM 3D ULTRA 9 (Cambridge Soft Corporation, Cambridge, MA). A partir desses
resultados, foram realizados cálculos para a estabilização e otimização da energia
usando o funcional híbrido B3LYP e o conjunto de funções de base 6-31G (d,p) no
programa Gaussian 03 (FRISCH, 2003). A otimização das estruturas foram baseadas no
método da Teoria do Funcional de Densidade (TFD), o qual considera a densidade
eletrônica como variável chave para descrever a distribuição de cargas em átomos,
moléculas e sólidos. Este método é útil no estudo de grandes sistemas moleculares
descrevendo realisticamente (Morgon, 1995). A visualização das estruturas otimizadas
foi realizada com o programa Visual Molecular Dimanycs (VMD) (XU; MARTIN;
SCHULTEN, 1996).
A partir dos resultados de minimização dos inibidores,os quais apresentaram
significativos resultados referentes a energia de otimização (Ha) e atividade inibitória
(IC50) de acordo com a literatura foram realizados o Mapa do Potencial Eletrostático
(MPE). O MPE é uma ferramenta altamente informativa para a distribuição de cargas
nuclear e eletrônica de uma dada molécula. O MPE tem sido aplicado no estudo de
interações biológicas e na definição de padrões de reatividade molecular (CUBERO;
LUQUE; OROZCO, 1998, VAN DUYNE et al., 1991), bem como já foram
demonstradas e comprovadas através do MEP regiões de reatividade molecular
responsáveis pelo mecanismo catalítico de várias enzimas (LAMEIRA et al., 2010,
ARAUJO SILVA; LAMEIRA; ALVES, 2012; CARNEIRO; LAMEIRA; ALVES,
2012). As superfícies de MPE foram descritas como ponto de carga, e derivadas do
método B3LYP/6-31G (d,p) calculados no programa Gaussian 03 (FRISCH, 2003) e
geradas pelo programa Molekel Visualization (VARETTO, 2009).Essas superfícies
correspondem a um valor de isodensidade igual a 0,05 a.u.
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
As estruturas dos inibidores sintetizados por Lolli e colaboradores partem de
uma estrutura básica, o hidroxifurazanil (Figura 1). A síntese basicamente se resume a
adição e/ou substituição de Hidrogênio, Flúor e grupos funcionais em R1, R2 e R3 do anel
bifenilo. A seguir está a molécula de hidroxifurazanil e a tabela com os 12 inibidores
aqui estudados com seus respectivos substituintes.
Figura 1. Estrutura base da hidroxifurazanil.
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Tabela 1. Inibidores estudados e seus respectivos substituintes R1, R2 e R3.
Moléculas
R1
R2
R3
H
Mol 01
H
CF3
Mol 02
H
H
Ph
4-CF3Ph
Mol 03
H
H
Mol 04
H
H
3-CF3Ph
Mol 05
F
H
Ph
Mol 06
F
F
Ph
Mol 07
F
H
3-CF3Ph
4-CF3Ph
Mol 08
F
H
4-CF3Ph
Mol 09
F
F
Mol 10
F
F
3-CF3Ph
Mol 11
F
F
3-OCF3Ph
Mol 12
Ph
H
H
De acordo com os resultados de energia, a molécula 12 obteve um valor de
-968,1408 Ha (Tabela 2), quando comparada com os demais inibidores, esta apresentou
o menor valor de energia, ou seja, maior estabilidade. Este resultado se deve
basicamente a dois fatores: a sua menor quantidade de átomos; e pela ausência do
elemento o Flúor em sua constituição, o que a torna menos eletronegativa que as demais
moléculas aqui estudadas. Entretanto, esta apresentou atividade inibitória moderada
(LOLLI et al, 2012). A estrutura tridimensional otimizada da molécula 12 pode ser
visualizada na Figura 2.
Figura 2. Estrutura tridimensional derivada dos cálculos com o método B3LYP/6-31 G(d,p)
para a molécula12.
Na Tabela 2 estão listadas atividade inibitória (IC50) de cada estrutura otimizada
com seus respectivos valores de energias (HF) e o desvio padrão (DP). Incluiu-se
também para fins de comparação, o metabólito ativo A26 complexado na enzima
HsDHODH.
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Tabela 2. Resultados após otimizações.
INIBIDORES
HF (Ha)
IC50±DP (µM)
A26
-1022,2381
0,02±0,002
Mol 01
-1074,1337
4,3±0,7
Mol 02
-968,1436
11±1
Mol 03
-1305,2045
49±4
Mol 04
-1305,2044
25±2
Mol 05
-1067,3763
0,88±0,08
Mol 06
-1166,6089
0,066±0,006
Mol 07
-1404,4367
0,87±0,11
Mol 08
-1404,4367
2,3±0,1
Mol 09
-1503,6692
0,49±0,04
Mol 10
-1503,3669
0,12±0,02
Mol 11
-1578,8929
0,05±0,05
Mol 12
-968,1408
45±3
Legenda: HF – Energia de otimização (Hatree). DP – Desvio Padrão.
IC50 – Atividade Inibitória (Micro Molar).
A análise dos resultados mostram que as moléculas 10 e 11 apresentaram os
maiores valores de energia, onde para a molécula 10 o valor observado foi de
-1503,6693 Ha e para a molécula 11 foi de -1578,8929 Ha. Esses resultados quando
comparados com a energia do metabolito ativo A26 -1022,2369 Ha são elevados, porém
suas atividade inibitória foram satisfatórias.Segundo Lolli e colaboradores, as estruturas
que apresentam maior número de átomos de Flúor em sua constituição apresentaram
atividade inibitória satisfatória na enzima HsDHODH, com os valores de IC50 de
0,12±0,02 e0,05±0,05 para as moléculas 10 e 11, respectivamente (Tabela 2). As
estruturas tridimensionais das moléculas 10 e 11 após a otimização são observadas na
Figura 3.
(a)
(b)
Figura 3. Estrutura tridimensional derivada dos cálculos com o método B3LYP/6-31 G(d,p)
para as moléculas (a) 10 e (b)11.
Os resultados do mapa do potencial eletrostático (MEP) demonstram as regiões
nucleofílicas (potencial eletrostático negativo), são mostrados em vermelho, enquanto
que as regiões eletrofílicas (potencial eletrotático positivo), são mostrados em azul. A
Figura 4 mostra as superfícies do MPE para as moléculas 10 e 11, onde destacam-se
grandes regiões com potencial eletrostático negativo ao redor dos átomos de Oxigênio
741
dos grupos hidroxílicos em ambas moléculas. Enquanto que os potenciais eletrostáticos
positivos podem ser encontrados emtorno dos átomos de hidrogênio.
(a)
(b)
Figuras 4. Mapa de Potencial Eletrostático derivados dos cálculos com o método
B3LYP/6-31 G(d,p) para as moléculas (a)10 e (11).
A importância do estudo de MPE se dá para saber em qual região o correrá
interações com os resíduos de aminoácidos do sítio catalítico da enzima, tais interações
são de suma importância, pois são elas que determinam o grau de atividade inibitória de
cada estrutura otimizada.
CONCLUSÃO:
De acordo com os resultados obtidos, dentre os 12 inibidores sintetizados, as
moléculas 10 e 11 apesar de apresentar energia de otimização elevada, suas atividade
inibitórias foram consideradas satisfatórias. Este mecanismo de inibição pode ser
utilizado quando a patologia está com efeitos tóxicos irregulares devido a toxicidade do
tratamento convencional, que utiliza a combinação de drogas antiinflamatórias e
antirreumáticas. Embora esses fármacos proporcionem alívio sintomático, eles não
modificam o curso da doença, causando efeitos colaterais. Portanto, as moléculas 10 e
11 podem ser alvo promissor para pesquisas e desenvolvimento de um novo fármaco
substituindo o tratamento convencional para amenização destes efeitos indesejáveis do
tratamento, os quais dificultam a adesão do paciente.
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