UNIVERSIDADE JOSÉ DO ROSÁRIO VELLANO – UNIFENAS
JULIANA DA SILVA MENEZES
AÇÃO ANTIMICROBIANA IN VITRO DE Psidium guajava L. CONTRA
Staphylococcus aureus ISOLADOS DE LEITE MASTÍTICO
Alfenas – MG
2013
JULIANA DA SILVA MENEZES
AÇÃO ANTIMICROBIANA IN VITRO DE Psidium guajava L. CONTRA
Staphylococcus aureus ISOLADOS DE LEITE MASTÍTICO
Dissertação apresentada à Universidade José do
Rosário Vellano, como parte das exigências do
Mestrado em Ciência Animal para obtenção do
título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. João Evangelista Fiorini
Coorientador (a): Prof. ª Dr(a). Nelma Mello Silva Oliveira
Alfenas – MG
2013
Menezes, Juliana da Silva
Ação antimicrobiana in vitro de Psidium guajava L.
contra Staphylococcus aureus isolados de leite
mastítico/.—Juliana da Silva Menezes.-- Alfenas , 2013.
64 f..
Orientador : Prof. Dr João Evangelista Fiorini
Dissertação (Mestrado em Ciência animal)Universidade José do Rosário Vellano
1.Bovinos 2.Extrato vegetal 3. Goiabeira 4. Mastite 5.
Microbiologia I. Título
CDU : 579:637.11(043)
JULIANA DA SILVA MENEZES
AÇÃO ANTIMICROBIANA IN VITRO DE Psidium guajava L. CONTRA
Staphylococcus aureus ISOLADOS DE LEITE MASTÍTICO
Dissertação apresentada como parte das exigências do curso de Mestrado em
Ciência Animal para obtenção do título de Mestre da Universidade José do Rosário
Vellano.
Aprovada em: ___________________________.
_______________________________________________________________
Prof. Dr. João Evangelista Fiorini (Orientador)
Universidade José do Rosário Vellano
_______________________________________________________________
Prof. ª Dr(a). Nelma Mello Silva Oliveira (Coorientadora)
Universidade José do Rosário Vellano
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Fabiano Gomes Boriollo
Universidade José do Rosário Vellano
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Jorge Kleber Chavasco - Suplente
Universidade Federal de Alfenas
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos do Nascimento - Suplente
Universidade Federal de Alfenas
Sonhe com aquilo que você quiser.
Seja o que você quer ser,
porque você possui apenas uma vida
e nela só se tem uma chance
de fazer aquilo que se quer.
Tenha felicidade bastante para fazê-la doce.
Dificuldades para fazê-la forte.
Tristeza para fazê-la humana.
E esperança suficiente para fazê-la feliz.
As pessoas mais felizes
não têm as melhores coisas.
Elas sabem fazer o melhor
das oportunidades que aparecem
em seus caminhos.
A felicidade aparece para aqueles que choram.
Para aqueles que se machucam.
Para aqueles que buscam e tentam sempre.
E para aqueles que reconhecem
a importância das pessoas que passam por suas vidas.
O futuro mais brilhante
é baseado num passado intensamente vivido.
Você só terá sucesso na vida
quando perdoar os erros
e as decepções do passado.
A vida é curta, mas as emoções que podemos deixar
duram uma eternidade.
A vida não é de se brincar
porque um belo dia se morre.
AUTOR DESCONHECIDO
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, quero agradecer a Deus a dádiva de viver e a sede
incessante da busca pelo conhecimento. Obrigada, minha Nossa Senhora
Aparecida, que me cobre com seu manto de proteção e luz.
Aos meus queridos pais, Nilza e Edilson, amados e respeitados,
meus exemplos, meu porto seguro. Aos meus lindos irmãos, Flávia e Rafael, as
partes que me completam e me fazem encontrar uma razão essencial para
continuar e jamais desistir. Minha avó Ivone, um anjo, uma companheira. Muito
obrigada, minha família, meu tudo, meu ser. Amo vocês infinitamente.
Ao meu avô precioso, amigo e tão amado. Eu sei, eu sinto sua
presença e seu olhar dos céus. Sei como acreditou e acredita em mim. Te amo,
te amarei, te lembrarei.
Aos familiares distantes que torcem pelo meu sucesso. Obrigada!
Aos meus amigos, todos, que deram a força que eu precisava em
tantas horas. Aqueles que me deram a melhor risada relaxante nos momentos
difíceis. Vocês, sem dúvida, são os donos dos meus mais lindos sorrisos.
Aos Professores, Dr. João Evangelista Fiorini e Dr (a). Nelma de
Mello Silva Oliveira, pelo carinho, confiança e ensinamentos primordiais nesta
conquista. Serei eternamente grata. São meus espelhos.
À banca examinadora, pela disponibilidade e presença.
À Unifenas e à CAPES, pela bolsa concedida e apoio necessário para a
concretização do mestrado.
À empresa Ourofino, pela parceria e patrocínio nesta jornada.
Aos colegas do laboratório, por estarem comigo em tanto trabalho, me
apoiando, me fortalecendo, me ensinando. Luciana Rosa Alves Rufino, querida,
você é uma pessoa muito iluminada, serei sempre grata pelo carinho. Obrigada!
Aos amigos do mestrado, conseguimos! É a primeira vitória das muitas
que virão. Obrigada. Jamais os esquecerei.
Enfim, muito obrigada a todos que, direta ou indiretamente, emanaram
boas vibrações que culminaram nesta conquista. Amo muito vocês!
RESUMO
MENEZES, Juliana da Silva. Ação antimicrobiana in vitro de Psidium guajava L.
contra Staphylococcus aureus isolados de leite mastítico. Orientador: João
Evangelista Fiorini. Alfenas: UNIFENAS, 2013. Dissertação (Mestrado em Ciência
Animal, área de concentração Patologia e Farmacologia Animal).
A mastite é a infecção intramamária que acomete o gado leiteiro bovino, causada
mais frequentemente pela bactéria Staphylococcus aureus. O leite pode ser
contaminado pelo contato direto com tetos infectados. Devido ao uso indiscriminado
de antimicrobianos utilizados para o tratamento, é notório o aparecimento de microorganismos resistentes. Uma alternativa pode ser o uso de extratos vegetais, a
exemplo Psidium guajava L.. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de
sensibilidade microbiana in vitro de isolados de Staphylococcus aureus provenientes
de leite mastítico contra antimicrobianos e extrato hidroalcoólico da folha de Psidium
guajava L.. A colheita foi realizada em três propriedades rurais da região da cidade
de Alfenas, MG. A amostragem dos animais foi não probabilística. As amostras de
leite foram processadas e inoculadas em meios de cultura seletivos para verificar a
presença de Staphylococcus sp. Os isolados foram identificados quanto à espécie
Staphylococcus aureus e submetidos a diferentes testes para verificar a
sensibilidade aos antimicrobianos. Foi preparado o extrato hidroalcoólico das folhas
e os testes antimicrobianos realizados pela técnica de poços. Foi confirmada a
contaminação por Staphylococcus aureus em 55% das amostras. Os antibióticos de
maior ação foram clindamicina, eritromicina e rifampicina. Penicilina G foi o
antimicrobiano que apresentou menores índices de sensibilidade. O extrato da folha
apresentou atividade antimicrobiana contra todos os isolados, inibindo o crescimento
em todas as concentrações testadas. Portanto, a utilização deste extrato vegetal
pode ser uma alternativa à crescente resistência microbiana aos antimicrobianos
comercializados, sendo um potencial campo de estudos.
Palavras-chave: Bovinos, extrato vegetal, goiabeira, mastite, microbiologia.
ABSTRACT
MENEZES, Juliana da Silva. In vitro antimicrobial activity of Psidium guajava L.
against Staphylococcus aureus isolated from mastitic milk. Advisor: João
Evangelista Fiorini. Alfenas: UNIFENAS, 2013. Dissertation (Master of Animal
Science, concentration area Animal Pathology and Pharmacology).
Mastitis is a disease that affects dairy cattle, an intramammary infection.
Staphylococcus aureus are the major mastitis causing bacteria and the milk can be
contaminated by the contact with infected teats. For treatment, due to the
indiscriminate use of antimicrobials drugs commercialized, the appearing of multiresistant strains is notorious. An alternative to the antimicrobial resistance problem is
the use of plant extracts like Psidium guajava L. The objective of this study was to
evaluate, in vitro, the microbial sensibility profile of Staphylococcus aureus isolated
from milk samples of cows infected with mastitis, against antimicrobial agents and
hydroalcoholic leaf of Psidium guajava L. Plants were harvested in three rural
properties located in the municipality of Alfenas/MG region. Sampling animals was
not probabilistic. Milk samples were cultured for presence of Staphylococcus sp.
Additionally, the isolated bacteria were identified as Staphylococcus aureus and
subjected to many tests to check the antimicrobial sensibility. The hydroalcoholic
extract of Psidium guajava L. was prepared and antimicrobial tests were performed
by the technician in wells. Contamination by Staphylococcus aureus was confirmed
in 55% of the analyzed samples. The most effective antibiotics were clindamycin,
erythromycin and rifampin. Penicillin G was the antimicrobial that showed the lower
levels of sensibility. The hydroalcoholic extract of the leaf of Psidium guajava L.
showed antimicrobial activity against all strains of isolated Staphylococcus aureus by
inhibiting microbial growth in all tested concentrations. Therefore the use of this plant
extract can be an alternative method to combat the increase incidence of
microorganisms resistant to antimicrobial drugs sold, besides a potential field of
study.
Key Words: Cattle, guava, mastitis, microbiology, plant extract.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Páginas
Figura 1 –
Folhas
de
Psidium
guajava
L.
(goiabeira).................................................................................
Figura 2 -
29
Antibiograma realizado em Ágar Mueller – Hinton com os
antimicrobianos
penicilina
G,
vancomicina,
gentamicina,
cefepima,
clindamicina,
rifampicina,
ciprofloxacina,
cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina e oxacilina....................
38
Figura 3 –
Etest Vancomicina...................................................................
44
Figura 4 -
Etest Oxacilina..........................................................................
45
Figura 5 -
Testes antimicrobianos com extrato de Psidium guajava L.
contra Staphylococcus aureus – Técnica de poços/ 1: 400
µg/ml; 2: 800 µg/ml; 3: 1600 µg/ml; 4: Água destilada; CLI:
Clindamicina..............................................................................
47
LISTA DE TABELAS
Páginas
Tabela 1 –
Sensibilidade a 11 antimicrobianos apresentada pelos isolados
de Staphylococcus aureus provenientes de 33 amostras de
leite
mastítico
disponibilizada
bovino.
Classificação
pela
segundo
tabela
NCCLS
(2005)...........................................................................................
Tabela 2 –
40
Atividade antimicrobiana de Psidium guajava L. – Medição dos
halos (em mm) .............................................................................
48
LISTA DE GRÁFICOS
Página
Gráfico 1 -
Resistência aos antimicrobianos, da esquerda para a direita:
cefepima,
ciprofloxacina,
cloranfenicol,
clindamicina,
eritromicina, gentamicina, oxacilina, penicilina G, rifampicina,
tetraciclina e vancomicina. Os números se referem aos
percentuais................................................................................
41
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%
Porcentagem
°C
Graus Celsius
pH
Potencial Hidrogeônico
CCS Contagem de células somáticas
CMT California Mastitis Test
g
Gramas
µg
Microgramas
mm
Milímetro
cm
Centímetros
ml
Mililitros
µl
Microlitro
BHI
Ágar Brain Heart Infusion
CPM Cefepime
CIP
Ciprofloxacina
CLI
Clindamicina
CLO Cloranfenicol
ERI
Eritromicina
GEN Gentamicina
OXA Oxacilina
PEN Penicilina G
RIF
Rifampicina
TET
Tetraciclina
VAN Vancomicina
CIM
Concentração Inibitória Mínima
CMM Concentração Microbicida Mínima
E-test Epsilometer test
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO .............................................................................................. 134
2.
REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 166
2.1.
LEITE ............................................................... Erro! Indicador não definido.6
2.2.
MASTITE .......................................................... Erro! Indicador não definido.7
2.3.
Staphylococcus aureus ................................................................................... 19
2.4.
SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA – ANTIBIOGRAMAErro! Indicador não
definido.3
2.5.
RESISTÊNCIA BACTERIANA .......................... Erro! Indicador não definido.5
2.6.
EXTRATOS VEGETAIS: ALTERNATIVA À RESISTÊNCIAErro!
Indicador
não definido.7
2.7.
Psidium guajava L. .......................................................................................... 28
3.
OBJETIVOS .................................................................................................. 300
3.1.
GERAIS ......................................................................................................... 300
3.2.
ESPECÍFICOS .............................................................................................. 300
4.
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 311
4.1.
AMOSTRAGEM................................................ Erro! Indicador não definido.1
4.2.
SEMEADURA E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICAErro! Indicador não
definido.2
4.3.
CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA/BIOQUÍMICA......………………………...32
4.4.
ANTIBIOGRAMA……………………………………………………………………33
4.5.
PREPARAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO......................................34
4.6. TESTES ANTIMICROBIANOS - Psidium guajava L...........................................34
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 366
5.1.
Staphylococcus aureus: PREVALÊNCIA ......... Erro! Indicador não definido.6
5.2.
ANTIBIOGRAMA: SENSIBILIDADE E RESISTÊNCIA .................................... 37
5.3.
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA - Psidium guajava L. .................................... 46
6.
CONCLUSÕES ............................................................................................. 522
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 533
14
1 INTRODUÇÃO
Os produtos de origem animal enquadram-se como elementos funcionais
e essenciais da dieta humana. São fontes ricas em constituintes importantes para
um desenvolvimento contínuo, adequado e sadio do organismo. O leite e os seus
derivados compõem as refeições diárias de inúmeras famílias. Devido à sua
assiduidade rotineira, há uma constante preocupação quanto à qualidade e à
eliminação dos fatores contaminantes presentes no processo de obtenção destes
produtos.
O Brasil ocupa uma posição de destaque quando observados os índices
de produção da pecuária leiteira mundial. Como um país, em sua essencialidade,
promotor da atividade agropecuária, fiscaliza todas as etapas de processamento do
leite por meio de diversos órgãos competentes, bem como enfermidades que
acometam desde os animais até os consumidores, decorrentes de qualquer
irregularidade de manejo e higiene.
Entre as doenças mais expressivas que acometem o gado bovino leiteiro,
encontra-se a mastite, a qual consiste na infecção intramamária oriunda,
principalmente, da presença de micro-organismos patogênicos. As bactérias são
aqueles mais comumente encontrados. A mastite acarreta inúmeros prejuízos
econômicos, entre eles, diminuição da produção leiteira, descarte de animais,
possibilidade de disseminação da infecção entre o plantel e gastos com
medicamentos. Ainda, constitui um alerta à saúde pública, pois o manejo ou o
tratamento inadequado possibilitam a presença destes patógenos ou de resíduos de
antimicrobianos no leite destinado ao consumo humano, acarretando casos de
intoxicações alimentares.
De acordo com diversos estudos, Staphylococcus aureus, bactérias Gram
positivas, patógenos oportunistas e de grande infectividade, são os microorganismos mais frequentemente isolados de amostras de leite de vacas portadoras
de mastite em inúmeras propriedades rurais em todo o mundo, podendo ser
encontrados em até 70% dos casos analisados.
15
Para o tratamento, são testados e utilizados muitos antimicrobianos.
Entretanto, a realização de antibiogramas, que demonstrem a sensibilidade e/ou a
resistência dos micro-organismos às drogas usadas, tem sido essencial para o
conhecimento do poder de ação dos fármacos comercializados, potencialidade de
infecção e disseminação dos patógenos. Os resultados encontrados, durante os
últimos anos, mostram-se preocupantes, visto que há um notável aparecimento de
linhagens multirresistentes. Isto, possivelmente, deve-se ao uso incorreto e/ou
indiscriminado de dosagens de medicamentos e à má higienização durante o
manejo.
Como uma alternativa à resistência gradativa dos micro-organismos aos
fármacos utilizados em grande escala e em dosagens errôneas, é crescente o
estudo do potencial da atividade antimicrobiana de plantas em suas inúmeras
variedades e partes.
O extrato da folha de Psidium guajava L. (popularmente
conhecida como goiabeira), em estudos utilizando-se cepas padrão, apresentou
ação antimicrobiana contra patógenos. Sendo, portanto, coerente seu teste contra
micro-organismos isolados diretamente do leite de vacas portadoras de mastite,
infecção esta que pode acarretar infindáveis prejuízos quanto à produção leiteira
destes animais.
Pesquisas que evidenciam o estudo e o controle microbiológico de
doenças são importantes para encontrar e praticar métodos que amenizem a
disseminação e aumentem a eficácia dos tratamentos, visando à saúde e ao bemestar humano e animal.
16
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Leite
Denomina-se leite, sem outra especificação, o produto normal, fresco,
integral, oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condições de higiene, de
vacas sadias, bem alimentadas e descansadas (FONSECA e SANTOS, 2000).
No ano de 2012, o Brasil obteve a terceira posição no ranking dos
maiores países produtores de leite do mundo, com produção equivalente a 33,2
milhões de toneladas métricas aproximadamente (IBGE, 2012). Entre os maiores
produtores na última década, apresentou a maior taxa de crescimento anual de
produtividade, o que reforça a argumentação do elevado potencial da produção
nacional (MACHADO et al., 2008).
O leite e os seus derivados desempenham um papel nutricional
importante para o homem, particularmente nos primeiros anos de vida, uma vez que
fornecem proteínas, carboidratos, gorduras e sais minerais necessários ao
desenvolvimento do organismo. Sabe-se que o consumo de um litro de leite por dia
supre todas as necessidades proteicas de crianças com até seis anos de idade e
mais de 50% do conteúdo de proteínas requisitado pelos adultos. Em relação ao
cálcio, o consumo de um litro de leite diário supre 100% das necessidades deste
mineral. É de se esperar, portanto, uma grande preocupação em assegurar a
integridade e a qualidade intrínseca do leite e dos produtos lácteos destinados ao
consumo humano (FONSECA e SANTOS, 2000).
Também, por possuir inúmeros nutrientes, é um meio de cultivo ideal para
o desenvolvimento de micro-organismos. A contaminação do alimento pode ocorrer
pelo contato direto com tetos de animais infectados ou pelo crescimento de microorganismos, decorrente da má higienização, em resíduos presentes nos utensílios
de ordenha. Esta multiplicação tem o inconveniente de provocar alterações físicas e
químicas que limitam a estabilidade do leite produzido. Em consequência disso,
problemas econômicos e sanitários são gerados, como a presença, no produto final,
17
de resíduos de antimicrobianos utilizados no tratamento das infecções (MIGUEL,
2010).
A ocorrência de resíduos de antibióticos no leite tem sido objeto de
preocupação constante por parte das autoridades sanitárias, devido, sobretudo, aos
efeitos tóxicos destes compostos sobre a saúde humana. Tais resíduos podem
aparecer no leite devido ao tratamento parenteral e/ou intramamário de animais em
lactação e representam o principal ponto crítico de controle de contaminação
química no leite. Os riscos à saúde do consumidor são apresentados,
principalmente, pelo desencadeamento de fenômenos alérgicos em indivíduos
sensíveis, pelos efeitos tóxicos e carcinogênicos, por alterações no equilíbrio da
microbiota intestinal e pela seleção de bactérias resistentes no trato digestivo dos
consumidores (MANSUR et al., 2003).
A qualidade do leite in natura é influenciada por muitas variáveis, entre as
quais se destacam fatores zootécnicos associados ao manejo, alimentação,
potencial genético dos rebanhos e fatores relacionados à obtenção e armazenagem
do leite. Uma das causas que exerce influência extremamente prejudicial sobre a
composição e as características físico-químicas do leite é a mastite, acompanhada
por um aumento na contagem de células somáticas (CCS). Com esse aumento, a
composição do leite, a atividade enzimática, o tempo de coagulação, a produtividade
e a qualidade dos derivados lácteos são influenciados negativamente (MACHADO et
al., 2008).
2.2 Mastite
A mastite ou mamite é o processo inflamatório da glândula mamária de
evolução aguda ou crônica. É a enfermidade mais frequente dos animais destinados
à produção leiteira e tem contribuído para grandes perdas econômicas tanto em
fazendas como na área de laticínios (LANGONI et al., 1991; COSTA, 1998). Esses
prejuízos são diminuição na produção e qualidade do leite, gastos com tratamento,
descarte de animais e do leite contaminado, gastos com reposição do plantel, além
de representar importante problema de saúde pública, devido à possibilidade de
18
veiculação de micro-organismos, toxinas e resíduos de antimicrobianos (OLIVEIRA
et al., 2002).
A mastite bovina é um grande problema para a indústria leiteira apesar
das inúmeras pesquisas voltadas para o controle desta enfermidade (FREITAS et
al.,
2005).
A
elevada
ocorrência
e
as
perdas
econômicas
decorrentes,
principalmente da diminuição da produção láctea (COSTA et al., 2000), fazem com
que esta enfermidade seja considerada a mais dispendiosa nas propriedades
leiteiras (ANDRADE et al., 2000).
As consequências econômicas negativas causadas pelas mastites são
extremamente elevadas, correspondendo a 30% das perdas econômicas, em que
14% é devido à morte de animais, 8%, descarte e 8%, gastos com tratamento. O
custo por vaca fica ao redor de US$ 184,00 e cada caso clínico gera um prejuízo de
US$ 100,00 devido à redução da produção e à perda por descarte (RIBEIRO et al.,
2003).
É uma enfermidade complexa, resultante da interação do agente e do
meio ambiente, incluindo determinantes humanos e hospedeiros, sendo que
diversos micro-organismos podem estar implicados nessa doença, assim como
várias fontes de infecção podem veicular e disseminar esses agentes. Sua
importância tem crescido à medida que se tem intensificado e tecnificado a
exploração leiteira (ANDRADE, 2001).
As formas de classificação da mastite se dividem em subclínica e clínica,
o que dependerá da intensidade e severidade do processo inflamatório. A clínica se
caracteriza por sinais visíveis de inflamação, como aumento de volume e
temperatura do quarto mamário afetado, dor, vermelhidão e mudanças na aparência
do leite. A forma subclínica é a mais importante devido à maior prevalência nos
rebanhos. É a responsável por até 70% das perdas de produção, sendo essas, na
maioria das vezes, imperceptíveis, necessitando de exames complementares
(RIBEIRO et al., 2003). A enfermidade tem grande importância sobre a qualidade do
leite devido à presença de micro-organismos e suas toxinas e à resposta
inflamatória do úbere e suas consequências, como aumento de células somáticas e
alterações dos componentes do leite (BOTTEON et al., 2006).
Do ponto de vista do agente causador, pode ser classificada em
contagiosa ou ambiental. A mastite ambiental é causada por micro-organismos que
vivem no ambiente de ordenha ou do curral, principalmente no esterco, e até mesmo
19
na água de bebida ou de limpeza. São agentes oportunistas. Os coliformes e
estreptococos ambientais são os micro-organismos responsáveis pela doença e o
confinamento predispõe sua ocorrência (HACHEM, 2005).
A mastite contagiosa é transmitida por patógenos cujo habitat é a
superfície da pele e dos tetos do animal. É a mais comum. Entre os agentes mais
importantes, estão as bactérias. Os gêneros e as espécies bacterianas mais
frequentes são Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Corynebacterium sp e
Mycoplasma bovis (QUIXABEIRA, 2006).
A contaminação ocorre por meio de um elemento de ligação de vaca para
vaca e/ou entre um quarto doente e um quarto sadio. Outra forma de contaminação
é o costume nas propriedades em oferecer o leite de vacas tratadas com antibióticos
a bezerras desmamadas precocemente. Se tiverem contato uma com as outras,
praticarão um hábito comum que é lamber mutuamente a região do úbere e, como
ingeriram leite ainda contaminado, há a facilidade para a entrada de bactérias no
aparelho mamário, aumentando, assim, o número de casos de mastite em
primíparas. Além disso, é notório um aumento de resistência aos tratamentos
habituais quando a doença aparece (QUIXABEIRA, 2006).
Devido à considerável incidência em rebanhos do mundo todo, inclusive
do Brasil, é de grande importância estudar a etiologia desta enfermidade, as causas
e os tipos mais comuns. Assim, pode-se formar uma base teórica para dissertar a
respeito de métodos de prevenção e de tratamento eficazes, visando, sobretudo,
melhorar a qualidade do leite produzido e minimizar as perdas econômicas
(HACHEM, 2005).
O controle da mastite nos rebanhos leiteiros constitui um importante
passo para a elaboração de produtos de boa qualidade e para a diminuição dos
riscos à população (BARBALHO e MOTTA, 2001).
2.3 Staphylococcus aureus
Staphylococcus
aureus
são
bactérias
Gram
positivas,
coagulase
positivas, o que indica potencial patogênico. Possuem o formato de cocos, são
20
imóveis, anaeróbios facultativos, apresentando metabolismo fermentativo com
produção de ácido e não de gás, não fotossintéticos, não esporulados e capazes de
se multiplicarem em meio, contendo 10% de cloreto de sódio. São micro-organismos
mesófilos, com temperatura de desenvolvimento de 7 a 48ºC, com ótima de 37ºC e
pH na faixa de 4,0 a 10,0, com ótimo de 6,0 a 7,0 (HIRSH e ZEE, 2003).
São as bactérias mais frequentemente isoladas em amostras de leite
provenientes de vacas portadoras de mastite e com maior prevalência em todo o
mundo. É estimado que 19 a 70% das vacas dos rebanhos mundiais são infectadas
por esses agentes (LANGONI et al., 1991; OLIVEIRA et al., 2000).
Estão, geralmente, associados a infecções subclínicas, o que leva ao
aumento da contagem das células somáticas. A transmissão ocorre principalmente
durante a ordenha pelas teteiras e outros fômites, utilização de panos e esponjas de
múltiplo uso, mãos do ordenhador e entre animais portadores e sadios (FONSECA e
SANTOS, 2000).
Possuem vários fatores de virulência que contribuem para sua
persistência no tecido mamário e, embora medidas preventivas que visem ao
controle das mastites sejam amplamente praticadas, aquelas causadas por este
patógeno ainda são bastante comuns (PHILPOT, 1984; SANTOS et al., 2003).
Uma vez instalados no interior da glândula mamária, esses microorganismos têm a propriedade de se fixar às células epiteliais e estabelecer uma
infecção por meio de múltiplos mecanismos patogênicos como a produção de
toxinas (BRITO et al., 2002). Isso pode resultar em necrose do estroma e
parênquima mamários, estabelecendo um foco de infecção local. A necrose resulta
em perda da função secretora e consequente redução na produção de leite, pois os
agentes se instalam em partes profundas da glândula. Além disso, geralmente, há a
formação de tecido conjuntivo fibroso no foco da infecção constituindo “bolsões” de
bactérias, o que impede o acesso dos antibióticos ao local. Essa é uma das
principais características destes agentes: infecções de longa duração, com
tendência à cronicidade e baixa taxa de cura, tanto espontânea como com a
utilização de antibióticos (NADER FILHO et al., 1986).
São conhecidos como micro-organismos causadores de várias doenças
purulentas tanto em humanos como em animais (BEAN e GRIFFIN, 1990), sendo
também, uma das causas mais importantes de intoxicação alimentar (PENNA et al.,
1998) devido à presença de enterotoxinas nos alimentos (OMOE et al., 2002). Dessa
21
forma, o leite e os seus derivados são importantes veículos destas bactérias e,
comumente, estão envolvidos em surtos de intoxicação alimentar, representando um
risco para a saúde pública (BERGDOLL, 1989).
A intoxicação por bactérias do gênero Staphylococcus sp pode ser
apontada como um dos tipos mais comuns de doença transmissível por alimentos,
sendo Staphylococcus aureus a espécie mais frequente devido à produção de
enterotoxinas (ARCURI et al., 2006).
Embora a mastite possa ser causada por inúmeros micro-organismos,
Staphylococcus aureus são reconhecidos como sendo os agentes etiológicos mais
isolados em vários países do mundo (SÁ et al., 2004). Observações semelhantes
foram realizadas por Langoni et al. (1998) e Brabes et al. (1999) em rebanhos
leiteiros do estado de São Paulo.
Pereira et al. (2007) avaliaram a ocorrência de mastite subclínica em 31
rebanhos no sul do estado de Minas Gerais e verificaram que, entre as 2.368 vacas
submetidas ao California Mastits Test (CMT), os principais patógenos isolados foram
Staphylococcus coagulase positiva (35,57%).
Em análises realizadas por Machado et al. (2008), das amostras positivas
ao exame microbiológico, foram isolados 997 agentes microbianos entre bactérias e
fungos de diferentes gêneros e espécies. Do total de agentes, verificou-se a
presença de 355 isolados de bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus sp.
Dos isolados de Staphylococcus sp, 69% foram classificadas como Staphylococcus
coagulase positiva.
Mota et al. (2004) verificaram uma frequência de 59,27% para amostras
de leite positivas ao CMT e 81,63% positivas ao exame microbiológico, destacandose como micro-organismos prevalentes Staphylococcus aureus (52,16%) em
propriedades no estado de Pernambuco.
Por meio do estudo etiológico da mastite clínica em bovinos, Costa et. al.
(1995) examinaram vacas em diferentes estágios de lactação e verificaram que, do
total de amostras analisadas, 78% foram positivas e os principais agentes isolados
foram Staphylococcus sp (34%).
Almeida et al. (2005), em propriedades na região sul do estado de Minas
Gerais, analisaram amostras de leite provenientes de 96 rebanhos, sendo a maior
frequência microbiológica de isolamento Staphylococcus aureus (64,55%).
22
Em Israel, Chaffer (1998) examinou vacas primíparas e encontrou quartos
infectados por Staphylococcus sp, sendo que em 20% deles os micro-organismos
foram identificados como Staphylococcus coagulase positiva.
Um estudo realizado nos EUA durante a década de 1990, no qual foram
avaliadas culturas microbiológicas de amostras de leite, identificou 49% como
positivas para algum agente patogênico da mastite. Em relação à percentagem total,
em 9% isolaram-se Staphylococcus aureus (RIBEIRO et al., 2003). Já, no Brasil,
segundo Santos et al. (2003), a prevalência dessas bactérias nas amostras de leite
colhidas varia de 38% a 71%.
Na região de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, Nader Filho et al.
(1985) avaliaram a prevalência da mastite bovina nas propriedades investigadas;
11,1% das amostras foram confirmadas e os agentes etiológicos isolados, dentre os
quais, Staphylococcus aureus foram o de maior incidência - 52% dos casos.
Segundo Freitas et al. (2005), os agentes mais prevalentes nos casos de
mastite bovina no agreste do estado de Pernambuco foram Staphylococcus aureus
(14%). Também, no mesmo estado, Sá et al. (2000) verificaram que os microorganismos mais comuns nos casos analisados foram Staphylococcus sp. (33%).
Entre os estafilococos isolados, a espécie Staphylococcus aureus apresentou a
maior prevalência (66%).
No estudo realizado por Quixabeira (2006), das oito amostras de leite
mastítico cultivadas, quatro apresentaram crescimento microbiano. Dessas, em 50%
foram isolados Staphylococcus aureus. O resultado condiz com Andrade (2001), que
indica Staphylococcus aureus, agentes contagiosos, como os principais causadores
da mastite subclínica.
Ferreira (2004) encontrou 77 isolados de Staphylococcus aureus oriundos
de amostras de leite procedentes de 40 vacas da raça holandesa que apresentaram
mastite subclínica em uma propriedade rural no estado de São Paulo. Constatou,
também, quatro padrões distintos resistentes aos antimicrobianos testados;
mostrando, assim, a heterogeneidade genética dessas bactérias nas mastites
bovinas.
23
2.4 Sensibilidade antimicrobiana - antibiograma
As bactérias Staphylococcus aureus, além de serem responsáveis por
grandes prejuízos à pecuária leiteira, podem apresentar resistência a diversos
antibióticos utilizados rotineiramente no tratamento da mastite. Dessa forma, é de
grande importância o isolamento e a identificação desses agentes em laboratório e a
análise in vitro da sensibilidade microbiana para um melhor controle da enfermidade
por meio de terapêutica adequada (ANDRADE, 2001).
O antibiograma é um teste que oferece como resultado padrões de
resistência ou sensibilidade de uma bactéria específica a antimicrobianos
(antibióticos ou quimioterápicos). Os resultados desse teste possuem grande
importância e são aplicados na triagem dos fármacos. Assim, há a necessidade da
opção por um antibiótico de alto poder bactericida, que atue no maior número
possível de agentes causadores de mastite. A aferição da sensibilidade é
fundamental para a certeza da utilização do produto certo e que melhor se aplica no
combate aos agentes em cada propriedade (FERNANDES, 1992).
A sensibilidade a antimicrobianos é também avaliada por meio da
determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). Esse método está
padronizado, possui detalhamento técnico bem definido e fornece resultados
quantitativos. Os resultados obtidos podem ser interpretados considerando as
características farmacológicas e farmacocinéticas dos antimicrobianos e a
concentração mínima a ser alcançada no úbere (NCCLS, 2005).
Nos antibiogramas realizados por Andrade (2001), verificou-se que
neomicina e estreptomicina obtiveram bons resultados. Porém, cada uma das
amostras de Staphylococcus aureus apresentou padrão intermediário a um desses
antimicrobianos. Ampicilina, penicilina G, sulfonamidas e cloranfenicol não foram
indicados para o tratamento das mastites nas propriedades analisadas pelo autor. A
ampicilina obteve boa difusão na glândula mamária, ao contrário da penicilina G.
Tetraciclina e polimixina B tiveram ação intermediária.
Costa et al. (1995) submeteram isolados de Staphylococcus aureus a
testes de sensibilidade microbiana e detectaram 28% de sensibilidade à penicilina G
e 53% à gentamicina. Langoni et al. (1991), também pesquisando a ação in vitro da
gentamicina e da penicilina G, observaram que a sensibilidade dos micro-
24
organismos isolados a essas drogas foi de 72% e de 14% respectivamente. Já,
Domingues et al. (1994) verificaram que a sensibilidade à penicilina G foi de 10% e à
gentamicina, de 54%.
Os estudos de 15 drogas antimicrobianas, realizados por Nader Filho et
al. (1986) mostraram que a gentamicina e a amicacina foram as que apresentaram
maior eficácia.
Vargas et al. (1996) pesquisaram a sensibilidade in vitro de isolados de
Staphylococcus aureus no período de 1988 a 1994. Desses, aproximadamente 90%
foram sensíveis à gentamicina, enrofloxacina, cefaperazona e kanamicina e 24%, à
penicilina G (antibiótico de menor ação). A gentamicina foi o antibiótico de maior
ação, dados que se aproximam dos resultados de Nader Filho et al. (1986).
No estudo realizado por Andrade et al. (2000), gentamicina, enrofloxacina,
cefaperazona e kanamicina apresentaram níveis de sensibilidade superiores a 87%.
Nader Filho et al. (2007) observaram que a eritromicina, a exemplo da
gentamicina, foi o antimicrobiano que apresentou a maior ação in vitro contra
Staphylococcus aureus isolados de mastites nas propriedades objetos da
investigação. Esse achado foi superior aos verificados por Nader Filho et al. (1986),
Fagliari et al. (1990) e Barberio et al. (2002). A análise mostrou ainda que a
penicilina G foi o antibiótico que apresentou menor ação in vitro sobre
Staphylococcus aureus. Os resultados desse trabalho evidenciaram também que
nenhum dos princípios ativos ensaiados, agindo de forma única, pôde ser ativo
contra qualquer dos isolados experimentados.
O estudo da sensibilidade de Staphylococcus aureus ante os diferentes
antimicrobianos comercializados e utilizados no tratamento das enfermidades
animais é de grande importância, pois fornece subsídios à terapia animal e melhoras
a todos os animais do rebanho submetidos às mesmas condições de manejo e,
portanto, sob os mesmos riscos de infecção (NADER FILHO et al., 2007).
25
2.5 Resistência bacteriana
A resistência bacteriana pode ser definida como o fenômeno biológico
que possibilita aos micro-organismos a capacidade de multiplicação ou persistência
na presença de níveis terapêuticos do antimicrobiano testado. Os micro-organismos
resistentes não se inibem pelas concentrações habitualmente alcançadas no sangue
ou tecidos do correspondente antimicrobiano, nem apresentam mecanismos de
resistência específicos para o agente estudado (MIGUEL, 2010).
O desenvolvimento de resistência por certas bactérias patogênicas é mais
rápido que a capacidade da indústria para produzir novas drogas. No caso de
Staphylococcus aureus, as bactérias são oriundas, principalmente, do uso
inadequado e/ou indiscriminado de antibióticos (NASCIMENTO et al., 2001).
Segundo Brito et al. (2001), diversos estudos, que tratam da sensibilidade
a antimicrobianos de patógenos relacionados à mastite bovina, apontam para um
aumento crescente no padrão de resistência, principalmente para Staphylococcus
aureus, um dos agentes infecciosos mais frequentes.
Nader Filho et al. (2007) verificaram que todos os isolados testados em
suas pesquisas apresentaram resistência simultânea a pelo menos dois antibióticos.
A predominância de micro-organismos resistentes simultaneamente à
penicilina G e à ampicilina foi observada por Lange et al. (1997) no estado do Rio
Grande do Sul e Pereira (2001) no estado de Minas Gerais. Acredita-se que tais
achados possam ser atribuídos à provável capacidade de produção de
betalactamases pelos isolados de Staphylococcus aureus nos estudos (ARCHER et
al.,1994), à frequente utilização desses princípios ativos nas propriedades rurais
(FREITAS et al., 2005) e ao uso inadequado desses medicamentos (FAGLIARI et
al., 1990; ANDRADE et al., 2000).
Costa et al. (1995) também referiram-se a uma maior resistência de
Staphylococcus aureus isolados de casos de mastite clínica e subclínica aos
antimicrobianos do grupo dos betalactâmicos. Esses micro-organismos produzem
betalactamases, enzimas com capacidade de cindir o anel betalactâmico da
estrutura do antimicrobiano, constituindo-se no principal mecanismo de resistência.
Nesta investigação, isolados foram examinados quanto à sensibilidade a antibióticos
26
e um total de 24,5% foi resistente a pelo menos um antimicrobiano testado. A
resistência à penicilina G e à sulfadimetoxina foram as mais comuns.
Em seus estudos, Brito et al. (2001) obtiveram resultados que revelaram
altos índices de resistência tanto para a amoxicilina quanto para a penicilina G.
Segundo Zafalon et al. (2007), no leite mastítico pesquisado, houve maior
prevalência de isolados com resistência única à penicilina G (48,3%). No trabalho
realizado em 2005, pelo mesmo autor, 21 padrões de resistência foram identificados
para Staphylococcus aureus.
Para Andrade et al. (2000), a grande variação desses percentuais de
sensibilidade in vitro talvez possa ser atribuída à utilização empírica e indiscriminada
dos princípios ativos no tratamento da mastite bovina causada por Staphylococcus
aureus, proporcionando o aparecimento de linhagens resistentes.
Araújo (1998) observou ocorrências de uma mesma amostra de
Staphylococcus aureus resistente a mais de um princípio ativo, o que se tornou um
motivo de preocupação por trazer dificuldades no tratamento dos animais. O
isolamento de micro-organismos resistentes a diferentes grupos de antibióticos
utilizados no combate à mastite pode estar condicionado, entre outros fatores, ao
mau uso de produtos por aplicação de subdosagens ou por um período insuficiente
de tratamento. Associados às normas higiênicas mal conduzidas de manejo de
ordenha, a existência de portadores de bactérias resistentes pode ser favorecida e a
transmissão entre animais em um mesmo ambiente facilitada, inclusive pelas mãos
do ordenhador e por utensílios ligados à ordenha.
Em suas análises, Oliveira et al. (2002) observaram um alto percentual de
multirresistência revelado pelos isolados de Staphylococcus aureus nos municípios
estudados. O resultado foi preocupante, pois muitos dos antibióticos disponíveis no
mercado não teriam efeito contra as bactérias, dificultando ou impossibilitando o
tratamento dos animais portadores de mastite e trazendo maiores gastos e prejuízos
para os proprietários.
O aumento da prevalência de Staphylococcus aureus multirresistentes
causadores de mastite bovina é grave, com a redução da efetividade de
antimicrobianos e o aumento da morbidade e dos custos para combater a doença
(SABOUR et al., 2004; FAGUNDES e OLIVEIRA, 2004).
27
2.6 Extratos vegetais: alternativa à resistência
As primeiras evidências do uso de plantas com fins terapêuticos datam de
460 a.C. No entanto, as primeiras informações sobre o uso sistemático de plantas
como
medicamentos
datam
da
Índia
Antiga.
O
desenvolvimento
desse
conhecimento acompanhou a aprendizagem do homem nos cuidados da saúde
humana e animal. Essa abordagem do conhecimento tradicional pode servir à
geração de tecnologias que satisfaçam as demandas de novos sistemas de
produção agrícola, baseados na utilização de insumos renováveis gerados na
própria comunidade, portanto equânimes e participativos, integrando o tradicional e
o cientificamente desenvolvido (WANZALA et al., 2005).
No Brasil, bem como em outros países da America Latina, a fitoterapia,
por exemplo, constitui uma alternativa terapêutica econômica em relação aos
medicamentos alopáticos uma vez que se caracteriza pela utilização direta de
plantas no tratamento de doenças (CARVALHO et al., 2002).
Além disso, extratos vegetais ou substâncias ativas vêm sendo utilizados
na Medicina Veterinária para o tratamento de parasitoses e enfermidades
infecciosas, inclusive em casos de mastite (COSTA, 1998).
O tratamento da mastite bovina é convencionalmente realizado por
antibioticoterapia. Entretanto, o uso ostensivo e inadequado proporciona resistência
bacteriana a diversos princípios ativos. Os agentes patogênicos em estudo,
Staphylococcus aureus, apresentam alta resistência aos antimicrobianos disponíveis
no mercado. Para reduzir ou eliminar esse problema, a busca por meios alternativos,
como o uso de compostos naturais, vem sendo estimulada (TORTORA, 2000).
Trabalhos empíricos têm trazido base científica ao uso popular de plantas
medicinais. Alguns estudos comprovam o efeito antimicrobiano de plantas da família
Myrtaceae. Nesse contexto, inúmeras pesquisas vêm comprovando cientificamente
a eficácia de algumas plantas, a exemplo da goiabeira (Psidium guajava L.), como
alternativa terapêutica para certas patologias (CARVALHO et al., 2002).
28
2.7 Psidium guajava L.
Psidium guajava L. (goiabeira) é uma planta amplamente distribuída no
território nacional e bem adaptada. O seu cultivo é destinado à venda de frutos “in
natura” e à industrialização com produção de polpa. Além disso, outras utilidades da
goiaba têm sido exploradas, como a produção de variados doces e farinha com alto
potencial nutricional (SCHUCH et al., 2008).
É uma árvore de pequeno porte, pertencente à família Myrtaceae, que
apresenta caule tortuoso e esgalhado, recoberto por casca fina muito aderente e
fruto globoso ou piriforme, amarelado em geral, de 3 a 6 cm de diâmetro. Existem
dois tipos mais comuns, a vermelha e a branca, sendo a vermelha mais saborosa e
nutritiva. Pode ser cultivada a partir das sementes. Possui quantidade regular de
ácidos, açúcares e pectinas. Seus principais constituintes são taninos, flavonóides,
óleos essenciais, alcoóis sesquiterpenóides e ácidos triterpenóides. (CARVALHO et
al., 2002).
Popularmente, esta espécie é reconhecida como medicinal, sendo
utilizada contra cólicas e diarreias. Apresenta, ainda, atividade antimicrobiana e
hipoglicemiante. As partes utilizadas da planta são a casca, os brotos, as folhas e as
raízes. Seus extratos têm mostrado, in vitro, atividade inibitória contra diferentes
micro-organismos (CARVALHO et al., 2002).
Salix e Rodrigues (2004), em um experimento envolvendo 100 pessoas
com diarréia aguda, demonstraram que a tintura de folhas de goiabeira curou
clinicamente 92% dos pacientes em 72 horas.
Na investigação realizada por Carvalho et al. (2002), os extratos
hidroalcoólicos da folha e do caule de Psidium guajava L. apresentaram atividade
antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas: Escherichia coli, Salmonela sp,
Shigella sp, Proteus sp e Pseudomonas aeruginosa.
Em um estudo desenvolvido na Universidade Federal do Rio de Janeiro,
foi avaliado o extrato de folhas de goiabeira contra cepas padrão de Staphylococcus
aureus (ATCC 25923), sendo comprovada a inibição do crescimento bacteriano
(MENEZES, et al., 2004). Revelações semelhantes foram descritas por Ribeiro
(2008) em Belém, Pará.
29
Em suas pesquisas, Gnan e Demello (1999) referiram-se a uma atividade
antimicrobiana do extrato aquoso da folha de goiabeira (FIG. 1) contra
Staphylococcus aureus.
Maia et al. (2009) identificaram ação antimicrobiana de Psidium guajava
L.
contra
isolados
estafilocócicos
de
origem
humana
e
caracterizadas
fenotipicamente como sensíveis e resistentes ao antibiótico meticilina em João
Pessoa, estado da Paraíba. Na mesma região, Pereira et al. (2010) avaliaram o
extrato da mesma planta contra isolados de Staphylococcus aureus de origem
bovina e os testes evidenciaram a positividade, inibindo o crescimento.
Holetz et al. (2002) testaram extratos hidroalcoólicos de 13 plantas
brasileiras utilizadas como medicinais contra bactérias e fungos de importância
clínica. Entre elas, Psidium guajava L. apresentou atividade antimicrobiana e as
menores concentrações inibitórias mínimas.
FIGURA 1 – Folhas de Psidium guajava L (goiabeira)
Fonte: http://www.ileorixa.com.br/oficinas/oficina_ervas.html
30
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
• Avaliar o perfil de sensibilidade e/ou resistência microbiana in vitro de
isolados de Staphylococcus aureus do leite proveniente de gados bovinos
leiteiros portadores de mastite.
3.2 ESPECÍFICOS
• Selecionar gado bovino leiteiro com suspeita de mastite por meio de
testes específicos e coletar frações de leite.
• Isolar e identificar fenotipicamente isolados de Staphylococcus aureus
e criopreservar para futuras investigações.
• Analisar o perfil de sensibilidade e/ou resistência frente aos diversos
antimicrobianos empregados na prática clínica veterinária.
• Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de folhas
de Psidium guajava L. contra os Staphylococcus aureus isolados.
31
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostragem
A colheita do leite foi realizada em três propriedades rurais de produção
leiteira bovina, com diferentes tipos de manejo, da região da cidade de Alfenas, sul
do estado de Minas Gerais.
A amostragem de animais foi não probabilística, pois nem todos os
elementos da população-alvo possuíam a mesma probabilidade de pertencer à
amostra. Foram utilizados 60 gados bovinos leiteiros portadores de mastite clínica e
subclínica, não tratados previamente com antimicrobianos comerciais.
Os animais, em diferentes estágios de lactação, foram examinados. Nos
casos de mastite clínica, a confirmação foi dada mediante a observação da presença
de sinais e locais com edema, endurecimento, palpitação e aumento de temperatura
do úbere, além da presença de grumos no leite submetido ao teste da caneca de
fundo preto, segundo Rangel (2007).
Os demais animais foram submetidos ao teste CMT (California Mastits
Test) para a detecção da mastite subclínica. Observado o grau de coagulação, foi
realizada a comparação com o padrão para o diagnóstico conforme descrito por
Schalm et al. (1971).
A colheita do leite foi realizada imediatamente antes da ordenha. No
início, foi efetuada a higienização das mãos do ordenhador e dos tetos dos animais
com solução de água e sabão. Em seguida, foram secados com papel toalha
descartável.
De cada animal, foram colhidos, aproximadamente, 50 ml de leite em
frascos estéreis identificados. Ao final das colheitas de leite nas três propriedades
rurais, totalizaram-se 60 amostras. Estas foram acondicionadas em caixas
isotérmicas, transportadas sob refrigeração e encaminhadas ao Laboratório de
Biologia e Fisiologia de Micro-organismos, Universidade José do Rosário Vellano,
UNIFENAS, Campus Alfenas, MG.
32
4.2 Semeadura e caracterização morfológica
As amostras foram diluídas (10-1 – 10-3) e semeadas em Ágar BHI para
enriquecimento, incubadas a 37°C por 24 horas. Depois, foram semeadas em Ágar
Baird Parker, moderadamente seletivo para Staphylococcus aureus, enriquecido
com gema de ovo + telurito de potássio, incubadas a 37°C por 48 horas. Após o
período de incubação, foram observados o crescimento e a morfologia das colônias.
Estas foram caracterizadas como Staphylococcus sp por análise morfológica
(colônias de cor escura, brilhantes, com zona de precipitação circundada por halo
claro) e bacterioscopia, empregando-se o método de coloração de Gram. Em
sequência, as lâminas foram observadas ao microscópio e o gênero bacteriano
identificado pela forma de cocos agrupados de coloração arroxeada, conforme
Machado (2006).
4.3 Caracterização fisiológica/bioquímica
Após análise morfológica, as amostras foram submetidas a testes
bioquímicos para a identificação da espécie Staphylococcus aureus (provas de
catalase, coagulase, DNase e Manitol), conforme Machado (2006).
O teste da catalase consistiu no gotejamento do peróxido de hidrogênio
(H2O2) sobre uma lâmina contendo a biomassa microbiana. A prova foi considerada
positiva quando houve borbulhamento devido à liberação do oxigênio.
A prova da coagulase consistiu na junção, em um tubo de ensaio, de 0,5
ml de plasma sanguíneo liofilizado de coelho e uma suspensão de micro-organismos
de 0,1 ml. Os tubos foram incubados em banho maria durante 24 horas a 35ºC e a
formação de coágulos foi interpretada como reação positiva.
Para o teste da Dnase, utilizou-se o meio Ágar Dnase, no qual os isolados
foram repicados e incubados a 35ºC por 24 horas. Após, o meio foi acrescido de HCl
1 N para revelar a atividade enzimática. A formação de uma zona transparente em
volta da colônia indicou a reação positiva.
33
O teste do Manitol consistiu na repicagem dos micro-organismos em Ágar
Manitol salgado, contendo 7,5% de cloreto de sódio e indicador de pH vermelho de
fenol, incubados a 37ºC por 24 horas. A reação foi interpretada como positiva
quando o meio ao redor das colônias se tornou amarelo, indicando a fermentação.
4.4 Antibiograma
Os testes de sensibilidade foram realizados pela técnica de difusão
(BAUER e KIRBY, 1966), empregando-se discos padronizados impregnados com os
antimicrobianos, seguindo critérios estabelecidos pelo National Committee for
Clinical Laboratory Standarts (NCCLS, 2005). As colônias, cultivadas em Ágar BHI,
foram calibradas na escala de turbidez 0,5 de McFarland e semeadas, com o auxílio
de swabs estéreis, em placas contendo Ágar Mueller-Hinton. Em seguida, foram
colocados, assepticamente e equidistantes, discos contendo os antimicrobianos,
segundo Rangel (2007).
Foram empregados os discos Sensidisc, desenvolvidos e comercializados
pela empresa Ourofino
, de vancomicina (30 µg), cefepima (30 µg), rifampicina (5
µg), penicilina G (10 µg), gentamicina (10 µg), clindamicina (2 µg), ciprofloxacina (5
µg), cloranfenicol (30 µg), eritromicina (15 µg), tetraciclina (30 µg) e oxacilina (1 µg).
Objetivando a realização de testes comparativos, foram utilizadas duas cepas de
Staphylococcus aureus oxacilina resistente e oxacilina sensível; sendo estas
Staphylococcus aureus ATCC 29213 (sensível à oxacilina) e Staphylococcus aureus
ATCC 43300 (resistente à oxacilina) (NCCLS, 2005).
A leitura foi realizada com o auxílio de um paquímetro após 24 horas de
incubação a 37°C. Os diâmetros dos halos de inibição, obtidos em milímetros, foram
comparados conforme tabela disponibilizada pela NCCLS (2005). Assim, os isolados
foram classificados em sensíveis ou resistentes ao antimicrobiano testado
(RANGEL, 2007).
Na Concentração Inibitória Mínima (CIM), o inóculo bacteriano foi
preparado pela técnica do método direto com turbidez ajustada na escala 0,5 de
McFarland, sendo espalhado, com o auxílio de swab estéril, na superfície do Ágar
34
Mueller-Hinton adicionado de 2% de NaCl. Foi utilizada a técnica do Etest
(Epsilometer test), em que fitas finas e inertes contendo os antimicrobianos oxacilina
e vancomicina, calibradas com escala visual, indicando a concentração das drogas,
foram colocadas sobre o inóculo. Em seguida, foram incubados a 35°C por 24 horas.
Os halos de inibição do crescimento foram inspecionados cuidadosamente,
utilizando-se luz transmitida para a detecção de pequenas colônias ou escasso
crescimento dentro da zona de inibição (NCCLS, 2005).
4.5 Preparação do extrato hidroalcoólico
As folhas de Psidium guajava L. foram colhidas na Universidade José do
Rosário Vellano, UNIFENAS, Campus Alfenas, no mês de outubro/2012. Após a
colheita, as folhas foram separadas e secadas em estufa a 35°C durante uma
semana para eliminação da umidade e estabilização do conteúdo enzimático. O
material foi reduzido a pó em moinho elétrico e pesado. Os extratos foram obtidos
em etanol/água a 70%, na proporção de 800 ml/150 g do material botânico, por
maceração durante 15 dias em recipiente de vidro com capacidade para 2000 ml,
tampado, à temperatura ambiente, protegido da luz e com agitação diária
(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010). O extrato foi filtrado, concentrado em
evaporador rotatório e liofilizado. No momento da utilização, o mesmo foi
ressuspenso em água destilada estéril e esterilizado por filtração em filtro Millipore
de 0,22 µm, segundo Carvalho et al. (2002).
4.6 Testes antimicrobianos – Psidium guajava L.
Os micro-organismos foram cultivados em Ágar BHI para enriquecimento
e semeados em Ágar Mueller-Hinton com o auxílio de swabs estéreis. Os testes
antimicrobianos foram realizados utilizando-se a técnica de poços. O extrato de
Psidium guajava L. foi diluído em água estéril. Em seguida, foram adicionados 75 µl,
150 µl e 300 µl em cada poço, correspondentes às concentrações 400 µg/ml, 800
35
µg/ml e 1600 µg/ml respectivamente. Foi utilizado controle negativo composto por
água destilada e controle positivo representado pelo antimicrobiano clindamicina, um
dos que apresentaram maior ação inibitória observada no antibiograma realizado. A
atividade antimicrobiana in vitro baseou-se na formação de halos de inibição de
crescimento para as concentrações testadas de acordo com o método descrito por
Bauer e Kirby (1966).
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada nos extratos
que apresentaram atividade inibitória no teste de difusão em Ágar. Os testes foram
realizados em microplacas, nas quais foram colocados 100 µl do caldo MuellerHinton concentrado (2x) e 10 µl da suspensão microbiana com turvação equivalente
ao tubo 0,5 da escala de McFarland em todos os poços. No primeiro poço, foi
adicionado o extrato com concentração de 1600 µg/ml e, a partir deste, foram
preparadas diluições seriadas decrescentes.
A Concentração Microbicida Mínima (CMM) foi realizada nas
concentrações do extrato que apresentaram inibição para o crescimento bacteriano.
Os testes foram realizados em placa de Petri contendo Ágar Mueller-Hinton. Na
superfície do ágar, foram estriadas essas concentrações contendo o inóculo e
incubadas a 37ºC por 24 horas. Em seguida, as placas foram analisadas com
observação da presença ou ausência de crescimento microbiano.
36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Staphylococcus aureus: prevalência
De julho a outubro de 2012, foram colhidas amostras de leite de vacas
acometidas por mastite clínica e subclínica em três propriedades rurais na região da
cidade Alfenas, estado de Minas Gerais. Do total de 60 animais positivos aos testes,
foi identificada e comprovada, por provas microbiológicas morfológicas e
bioquímicas, a contaminação no leite pela presença de isolados de Staphylococcus
aureus em 55% das amostras (33/60).
Em
levantamentos
epidemiológicos
nacionais
e
internacionais,
Staphylococcus aureus podem estar presentes em até 70% das infecções da
glândula mamária de bovinos leiteiros (ZANETTE et al., 2010; FERREIRA et al.,
2007).
Nader Filho et al. (1985) avaliaram animais portadores de mastite em
propriedades da região da cidade de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, e
observaram que Staphylococcus aureus foram os agentes etiológicos de maior
incidência (52%). Vianni et al. (1992), no município de Itaguaí, estado do Rio de
Janeiro, investigaram 180 amostras de leite mastítico, das quais estes microorganismos foram isolados em 52,2% das análises.
Foi
confirmada
a
contaminação pela
presença de
isolados
de
Staphylococcus aureus em 50% das amostras de leite cultivadas por Quixabeira
(2006). Mota et al. (2004) verificaram uma frequência de 59,27% para amostras de
leite positivas ao CMT, sendo que as bactérias em estudo foram prevalentes em
52,16% dos casos. Achados esses que se assemelham aos observados nesta
investigação.
Outros pesquisadores acharam cifras inferiores. No trabalho realizado por
Andrade et al. (2000), das 667 amostras de leite positivas ao CMT, identificaram-se
291 isolados de Staphylococcus aureus (43,63%). Longo et al. (1994), estudando a
mastite subclínica em quatro rebanhos, compostos por 118 vacas leiteiras,
verificaram que Staphylococcus aureus foram isolados em 44,7% dos casos.
37
Langoni et al. (1991) isolaram estas bactérias em 35,53% das 702
amostras de leite procedentes de vacas portadoras de mastite subclínica. Brabes et
al. (1999), analisando 127 amostras de leite de cinco propriedades leiteiras dos
estados de São Paulo e Minas Gerais, encontraram uma prevalência de 40,15%
para esta espécie bacteriana.
Almeida et al. (2005) obtiveram uma frequência de isolamento de 64,55%
para Staphylococcus aureus no leite mastítico analisado. Amostras de leite de 63
animais acometidos por mastite foram avaliadas por Saeki et al. (2011), sendo que
38 (60,32%) apresentaram o crescimento dos micro-organismos em questão. Esses
percentuais apresentam-se condizentes a outros discutidos na literatura.
Zanette et al. (2010) observaram Staphylococcus aureus em 70,9% das
análises e Ferreira et al. (2007) identificaram o gênero Staphylococcus sp. em 74,6%
dos casos. Resultados superiores ao descrito neste estudo.
A constante frequência dessas bactérias nos casos de mastite pode ser
explicada pelo fato de que a pele do úbere e dos tetos são os principais sítios de
localização dos agentes, o que facilita as infecções por esses micro-organismos.
Também pode sugerir que, nos rebanhos avaliados, não são realizadas medidas
eficientes de controle da enfermidade (ZANETTE et al., 2010).
Pesquisas demonstram que a alta prevalência da mastite pode estar
associada às más condições de higiene do ordenhador, bem como dos tetos e
úberes das vacas antes, durante e após a ordenha (OLIVEIRA et al., 2009).
5.2 Antibiograma: sensibilidade e resistência
O antibiograma realizado pela técnica de difusão em discos (BAUER e
KIRBY, 1966) possibilitou como resultado padrões de resistência e/ou sensibilidade
de Staphylococcus aureus isolados de leite mastítico aos antimicrobianos
empregados na prática clínica veterinária (FIG. 2).
38
FIGURA 2 – Antibiograma realizado em Ágar Mueller – Hinton com os antimicrobianos
vancomicina, cefepima, rifampicina, penicilina G, gentamicina, clindamicina, ciprofloxacina,
cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina e oxacilina.
Após medição, os halos formados foram classificados em sensíveis ou
resistentes de acordo com a tabela fornecida pela NCCLS (2005), que também
preconiza
os
antimicrobianos
destinados
ao
tratamento
de
infecções
comprovadamente causadas por bactérias Gram positivas, sendo esses os
utilizados nesta avaliação.
39
Verificaram-se
os
seguintes
percentuais
de
resistência
aos
antimicrobianos: cefepime, 24% (8/33); ciprofloxacina, 3% (1/33); cloranfenicol, 3%
(1/33); clindamicina, 0% (0/33); eritromicina, 0% (0/33); gentamicina, 15% (5/33);
oxacilina, 73% (24/33); penicilina G, 97% (32/33); rifampicina, 0% (0/33); tetraciclina,
12% (4/33) e vancomicina, 12% (4/33) (TAB. 1 e GRAF. 1).
40
TABELA 1. Sensibilidade a 11 antimicrobianos apresentada pelos isolados de
Staphylococcus aureus provenientes de 33 amostras de leite mastítico bovino.
Classificação segundo tabela disponibilizada pela NCCLS (2005).
Amostras
CPM
CIP
CLO
CLI
ERI
GEN
OXA/
PEN
RIF
TET
Etest
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
S
S
R
S
S
S
S
R
S
S
R
R
S
R
R
R
S
S
S
S
S
S
S
R
R
R
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S: Sensível
R: Resistente
R*: Resistente em todas as concentrações
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
R
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
S
S
S
S
S
S
S/R
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
R/S
S/S
R/S
S/S
S/S
R/S
R/S
R/S
S/S
R/S
R/S
S/S
S/S
R/S
R/S
R/S
S/S
S/S
VAN/
Etest
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S/S
S/S
S/S
R/S
S/S
S/S
S/S
S/S
S/S
S/S
R/S
S/S
S/S
S/S
S/S
R/S
S/S
S/S
S/S
S/S
S/S
S/S
S/R*
S/S
S/S
S/S
S/S
S/S
S/S
S/R*
S/S
R/S
S/S
41
O gráfico a seguir representa os valores obtidos em percentagem,
indicando os níveis de resistência das bactérias isoladas aos antimicrobianos
testados:
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
COM
CIP
CLI
CLO
ERI
GEN
OXA
PEN
RIF
TET
VAN
GRÁFICO 1 – Resistência aos antimicrobianos, da esquerda para a direita: cefepima, ciprofloxacina,
cloranfenicol, clindamicina, eritromicina, gentamicina, oxacilina, penicilina G, rifampicina, tetraciclina e
vancomicina. Os números se referem aos percentuais.
A terapia antimicrobiana é uma das principais ferramentas para o controle
da mastite provocada por Staphylococcus aureus e a aplicação de testes de
sensibilidade pode direcionar a escolha do melhor tratamento (MORONI et al.,
2006).
A maioria dos antibióticos testados apresentou potencial atividade
antimicrobiana in vitro contra os micro-organismos isolados. Essa comprovação
pode indicar que, devido aos índices de resistência encontrados nas propriedades
investigadas, notória e frequentemente, são utilizados os mesmos princípios ativos
no tratamento da inflamação mamária, outros princípios que sejam de boa
sensibilidade, podem ainda ser aplicados para o controle da enfermidade. Nesse
contexto, é evidente a importância da realização de antibiogramas, possibilitando o
uso correto dos medicamentos.
42
Os antibióticos de maior ação foram clindamicina, eritromicina e
rifampicina, com 100% de eficácia. Ciprofloxacina, cloranfenicol, tetraciclina e
vancomicina apresentaram também significativa ação, com índices de sensibilidade
próximos ou superiores a 90%.
Saeki et al. (2011) observaram níveis de sensibilidade de 100% para
gentamicina e ciprofloxacina. Resultados superiores aos relatados nesta análise.
Esse autor, semelhante ao presente estudo, também avaliou níveis de 13,51% para
amostras resistentes à tetraciclina.
Diferentemente dos antibiogramas realizados por Andrade (2001), o
cloranfenicol apresentou boa ação, podendo ser indicado para o tratamento dos
animais pertencentes às propriedades objetos da investigação.
Assim como observado por Nader Filho et al. (2007), a eritromicina foi um
antimicrobiano que apresentou alto percentual de sensibilidade in vitro contra
Staphylococcus aureus isolados de mastite bovina. Os achados desta pesquisa
foram superiores aos verificados por Nader Filho et al. (1986), Fagliari et al. (1990) e
Barberio et al. (2002).
Os resultados diferiram daqueles encontrados por Andrade et al. (2000),
em que 23,71% dos isolados apresentaram sensibilidade à penicilina G. No entanto,
assim como no presente estudo, a penicilina G foi o antimicrobiano de menor ação,
provavelmente devido à ação de betalactamases. A mesma constatação pode ser
observada no trabalho realizado por Nader Filho et al. (2007).
Penicilina G (3,03%) e oxacilina (27,27%) foram os antimicrobianos contra
os quais os micro-organismos isolados apresentaram menores índices de
sensibilidade e, portanto, maior resistência.
A predominância de isolados resistentes à penicilina G também foi
observada por Lange et al. (1997) no estado do Rio Grande do Sul e Pereira (2001)
no estado de Minas Gerais.
Maiores índices de resistência à penicilina G podem ser explicados pelo
uso indiscriminado e inadequado (subdosagens) desse antimicrobiano na Medicina
Veterinária, sendo o mais comercializado entre as propriedades rurais. A utilização
errônea, sem o devido isolamento microbiano e o pedido prévio de antibiogramas,
possibilita a seleção de isolados resistentes pela eliminação dos sensíveis e, ainda,
pela presença de betalactamases, como referido anteriormente, em alguns isolados
de Staphylococcus aureus. Esta enzima consegue romper o anel betalactâmico,
43
uma estrutura molecular fundamental para a ação desse antibiótico (ANDRADE et
al., 2000).
Costa et al. (1995) também referiram-se a uma maior resistência de
Staphylococcus aureus isolados de casos de mastite clínica e subclínica aos
antimicrobianos do grupo dos betalactâmicos. Achados semelhantes foram relatados
por Brito et al. (2001) e Zafalon et al. (2007).
A resistência à oxacilina é um sério problema de saúde pública no meio
rural. Está relacionada a vários fatores, como a presença do gene mecA, que torna
os micro-organismos intrinsecamente resistentes também a outros antimicrobianos
(FREITAS et al., 2005).
Observaram-se ocorrências de uma mesma amostra bacteriana resistente
a mais de um princípio ativo, o que é um motivo de preocupação por trazer
dificuldades ao tratamento dos animais. O isolamento de Staphylococcus aureus
resistentes a diferentes grupos de antibióticos para o combate à mastite pode estar
condicionado, entre outros fatores, ao mau uso de produtos por aplicação de
subdosagens ou por um período insuficiente de tratamento. Associados às normas
higiênicas mal conduzidas de manejo de ordenha, pode-se favorecer a existência de
portadores de micro-organismos resistentes e facilitar a transmissão entre animais
em um mesmo ambiente, inclusive por mãos do ordenhador e de utensílios ligados à
ordenha (ARAÚJO, 1998).
O aumento de prevalência de Staphylococcus aureus multirresistentes
causadores de mastite bovina é grave, principalmente devido à redução da
efetividade dos antimicrobianos, aumento da morbidade e dos custos para combater
a doença. Além disso, o uso indiscriminado pode levar ao acúmulo de antibióticos
nos alimentos, afetando a saúde humana (POL e RUEGG, 2007). Os resíduos de
antibióticos no leite podem gerar fenômenos alérgicos em indivíduos sensíveis,
efeitos tóxicos e carcinogênicos por alterações no equilíbrio da microbiota intestinal
(FREITAS et al., 2005).
O conhecimento dos padrões de sensibilidade e resistência aos diferentes
antibióticos
empregados
no
tratamento
da
mastite
bovina
causada
por
Staphylococcus aureus é necessário e fundamental para o desenvolvimento de
métodos preventivos que sejam efetivos, assim como para a construção de
estratégias de tratamento (ARAÚJO, 1998).
44
Seguem as figuras (FIG. 3 e FIG. 4) representativas da técnica do Etest,
fitas impregnadas com gradientes de concentração de vancomicina e oxacilina
contra Staphylococcus aureus.
FIGURA 3 – Etest Vancomicina
45
FIGURA 4 – Etest Oxacilina
As variações de sensibilidade encontradas entre os testes de difusão e o
Etest para os antimicrobianos podem estar relacionadas às diferenças entre as
metodologias empregadas segundo NCCLS (2005). Isto se deve, principalmente,
aos diferentes valores de concentrações utilizados.
Zafalon et al. (2012), estudando estafilococos oriundos de mastite
subclínica em ovinos, avaliaram sete isolados resistentes à oxacilina pelo Etest.
Testes adicionais não foram realizados, mas sugere-se que esses isolados possam
ser hiperprodutores de betalactamases ou apresentem mecanismos de resistência
adicionais, como sugerido também por Martineau et al. (2000) e Terasawa (2006).
Nesse mesmo estudo, micro-organismos resistentes à oxacilina apresentaram maior
resistência contra outros antibióticos, principalmente à penicilina G, cefepima e
gentamicina, quando comparados com os demais micro-organismos sensíveis à
oxacilina. Resultados semelhantes de multirresistência foram verificados por
Turutoglu et al. (2006) que detectaram Staphylococcus aureus e estafilococos
coagulase negativos fenotipicamente resistentes à oxacilina, dentre os quais 100%
dos Staphylococcus aureus foram também resistentes à penicilina G, amoxicilina,
cloxacina e gentamicina.
46
Staphylococcus aureus que apresentam resistência à oxacilina são,
frequentemente, resistentes a outros grupos de agentes antimicrobianos mais
comuns, como os aminoglicosídeos, macrolideos, cloranfenicol, tetraciclina e
fluoroquinolonas, tornando-se um grande risco para o homem e animais em casos
de infecções (PAIANO e BENDENO, 2009).
Oliveira et al. (2001) avaliaram a tolerância à vancomicina em isolados
hospitalares
de
Staphylococcus
aureus
resistentes
à
oxacilina,
os
quais
apresentaram valores de concentrações inibitórias mínimas variáveis de 0,5 a 4
µg/ml. Nesse estudo, observou-se uma relação direta entre maior percentual de
tolerância à vancomicina e níveis mais elevados da CIM. Houve um aumento
paralelo dos valores, até que isolados com CIM de 4 µg/ml apresentaram 100% de
tolerância.
Paiano e Bendeno (2009), estudando a presença de Staphylococcus
aureus em recém-nascidos humanos saudáveis, detectaram isolados resistentes à
oxacilina (CIM: 8 µg/ml).
O aumento crescente da frequência de Staphylococcus aureus resistentes
à oxacilina e a possibilidade do aparecimento de amostras resistentes à vancomicina
tornam imprescindível o desenvolvimento de novas drogas com atividade
antiestafilocócica (FREITAS et al., 2005).
5.3 Atividade antimicrobiana - Psidium guajava L.
O extrato hidroalcoólico da folha de Psidium guajava L., por meio da
realização da técnica de poços (FIG. 5), apresentou atividade antimicrobiana contra
todos os isolados de Staphylococcus aureus, inibindo o crescimento microbiano em
todas as concentrações testadas (1600 µg/ml, 800 µg/ml e 400 µg/ml). A inibição foi
verificada devido à formação de halos. Os valores dos halos (em mm) obtidos na
medição foram crescentes, seguindo o aumento da concentração avaliada (TAB. 2).
47
FIGURA 5 - Testes antimicrobianos com extrato de Psidium guajava L. contra Staphylococcus aureus
– Técnica de poços/ 1: 400 µg/ml; 2: 800 µg/ml; 3: 1600 µg/ml; 4: Água destilada; CLI: Clindamicina.
48
TABELA 2. Atividade antimicrobiana de Psidium guajava L. – Medição dos halos (em
mm).
Amostras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Padrão
CN
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CP
34
25
32
32
31
35
33
36
33
34
29
29
26
31
32
28
30
33
32
30
30
30
29
26
27
30
28
30
27
26
28
25
26
26
C1
21
27
19
21
22
26
21
25
24
25
20
17
13
20
25
22
19
24
22
19
19
19
20
17
16
20
17
20
20
24
19
21
17
17
C2
22
28
22
23
25
27
24
26
26
27
23
21
16
22
26
24
24
25
23
23
21
24
23
19
19
21
18
22
21
25
20
22
20
19
C3
26
29
24
26
26
28
26
28
27
29
24
23
17
26
27
25
25
26
26
25
22
25
25
20
20
23
20
24
22
26
24
23
24
20
CN: Controle negativo (Água destilada).
CP: Controle positivo (Clindamicina – valor de referência de sensibilidade dos halos: 24 a 30 mm)
(NCCLS, 2005).
C1: 400 µg/ml.
C2: 800 µg/ml.
C3: 1600 µg/ml.
49
Nessa pesquisa, foi observada a formação de halos de inibição, cujos
diâmetros variaram de 13 a 36 mm para as concentrações testadas.
Testando extratos aquosos de Psidium guajava L., Menezes et al. (2004)
obtiveram resultados positivos para a ação antimicrobiana, com halos de inibição de
crescimento em torno de 25 mm para Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
Gonçalves et al. (2008), em seus estudos in vitro com micro-organismos
extraídos de camarão, relataram que o melhor efeito inibitório foi observado com
extrato metanólico das folhas de Psidium guajava L. contra Staphylococcus aureus.
Os halos de inibição variaram entre 8,25 e 9,25 mm sob a concentração estimada de
96,87 µg/ml, baseada nos dados apresentados pelos Autores.
Pereira et al. (2008) avaliaram e comprovaram a atividade antimicrobiana
dos
extratos glicólicos de Psidium guajava L. contra cepas padrão de
Staphylococcus aureus (ATCC 6538).
Holetz et al. (2002) encontraram ação antimicrobiana do extrato
hidroalcoólico das folhas de Psidium
guajava L. contra Candida albicans,
Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os resultados indicaram que as folhas
desta planta poderiam ser utilizadas para tratar patologias causadas por tais microorganismos devido ao seu efeito antimicrobiano.
Sanches et al. (2005) também obtiveram efeito inibitório por meio dos
extratos hidroalcoólicos e aquosos de Psidium guajava L. contra cepas padrão de
Staphylococcus aureus.
No estudo realizado por Fonseca e Botelho (2010), avaliando microorganismos patogênicos da cavidade oral humana, o extrato bruto das folhas de
Psidium guajava L. demonstrou atividade antimicrobiana in vitro, reforçando a
indicação popular da planta também como antisséptica.
Gonçalves et al. (2005) observaram que Streptococcus pyogenes,
Proteus mirabilis e Staphylococcus aureus apresentaram sensibilidade contra o
extrato de Psidium guajava L., não sendo constatada ação contra Escherichia coli e
Pseudomonas aeruginosa.
Chah et al. (2006), utilizando o método de disco-difusão em Ágar,
descreveram a ação antibacteriana de extratos da folha e da raiz de Psidium
guajava
L.
contra
Staphylococcus
micro-organismos
aureus,
Streptococcus
causadores
mutans,
de
infecções
Pseudomonas
intestinais:
aeruginosa,
Salmonella enteritidis, Bacillus cereus, Proteus sp, Shigella sp e Escherichia coli.
50
Gutierrez et al. (2008), em revisão bibliográfica, fizeram referência a três
estudos
que relataram
substâncias antibacterianas
presentes em
extratos
metanólicos da raiz e das folhas de Psidium guajava L., derivadas da quercetina das
folhas, um flavonóide natural.
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais pode ser avaliada através
da determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o
crescimento
do
micro-organismo
testado,
esse
valor
é
conhecido
como
Concentração Inibitória Mínima (CIM). Um aspecto bastante relevante na
determinação da CIM de extratos vegetais é a preocupação em relação aos
aspectos toxicológicos, microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais
ou suas combinações (PINTO et al., 2003).
Foram testadas as concentrações de 1600; 800; 400; 200; 100; 50; 25;
12,50; 6,25; 3,125; 1,5625 e 0,78125 µg/ml do extrato liofilizado resuspenso em
água destilada estéril.
Todos os micro-organismos isolados apresentaram halos de inibição no
teste de difusão em Ágar e, também, apresentaram CIM nas concentrações de 200;
400; 800 e 1600 µg/ml do extrato hidroalcoólico de Psidium guajava L.
Mahfuzul Hoque et al. (2007) encontraram como CIM para Staphylococcus
aureus 100 µg/ml em testes in vitro com extratos etanólicos de folhas de goiabeira.
Sanches et al. (2005), usando o ensaio de microdiluição em caldo com
extratos aquosos e hidroetanólicos das folhas, raízes e casca do caule de Psidium
guajava L. contra Staphylococcus aureus, encontraram as respectivas CIMs: 500,
250 e 125 µg/ml, sendo os extratos hidroetanólicos os mais ativos.
Na presente pesquisa, todos os isolados de Staphylococcus aureus
apresentaram CMM de 1600 µg/ml e 800 µg/ml (maiores concentrações testadas),
nas quais não foi observado crescimento microbiano em placas.
Garcia (2010) constatou uma CMM de 46,75 µg/ml do extrato de Psidium
guajava L. contra isolados de Staphylococcus aureus oriundos de casos de
infecções hospitalares. O extrato obteve ação antimicrobiana contra 84,6% dos
isolados.
Uma tentativa de manter o uso de antimicrobianos atuais pode ser
encontrada em sua combinação com outros produtos, como os produtos naturais,
que representariam uma opção terapêutica no tratamento de infecções causadas por
51
Staphylococcus aureus e outros patógenos no que diz respeito ao aparecimento
crescente de resistência múltipla (MUSUMECI et al., 2003; PEREIRA, 2000).
No estudo desenvolvido por Maia et al. (2009), os resultados obtidos da
associação
do
extrato
de
goiabeira
com
cefalexina
contra
isolados
de
Staphylococcus aureus, oriundas de amostras bovinas, variaram de uma
concentração inibitória de 1:4 a 1:256 µg/ml. A associação norfloxacina e goiabeira
variou de concentrações de 1:16 a 1:64 µg/ml.
Betoni et al. (2006), utilizando extratos etanólicos de folhas de goiabeira
com concentração de 131,75 µg/ml contra isolados de Staphylococcus aureus,
conseguiram diminuir a CIM de 52 para 13 µg/ml, realizando associações desse
extrato com antibióticos (tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina, vancomicina,
oxacilina, cefalotina, ampicilina, cefoxitina, cotrimoxazole) e a eficácia foi de 47,68%.
Os resultados obtidos na atual pesquisa estão coerentes com o histórico
da atividade antimicrobiana da espécie vegetal estudada, quanto à ação microbicida
e à demonstração de que isolados de Staphylococcus aureus mostraram-se
sensíveis ao extrato hidroalcoólico utilizado. No entanto, é importante ressaltar que a
análise da atividade antimicrobiana nos diversos estudos citados foi realizada por
diferentes metodologias e concentrações, o que torna difícil uma análise
comparativa fidedigna (PEREIRA et al., 2008).
As variações referentes à determinação da CIM de extratos de plantas
podem ser atribuídas a muitos fatores. Dentre eles, pode-se citar a técnica aplicada,
o micro-organismo e a cepa utilizada no teste, a origem da planta, a época da
colheita, se os extratos foram preparados a partir das plantas frescas ou secadas e a
quantidade de extrato testada. Assim, não existe método padronizado para
expressar os resultados de testes antimicrobianos de produtos naturais (FENNER et
al., 2006).
De acordo com Pereira et al. (2010), esses métodos e suas variantes
devem ser adaptados e escolhidos conforme as facilidades operacionais que
permitam ensaios relativamente rápidos e simples, com custo compatível. É
importante que as adaptações sejam testadas e padronizadas para se obter
reprodutibilidade e garantir, assim, que os resultados sejam confiáveis.
52
6 CONCLUSÕES
•
Nas propriedades rurais objetos da investigação, Staphylococcus
aureus apresentaram alta prevalência nas infecções.
•
A maioria dos antimicrobianos testados apresentou boa ação in
vitro contra Staphylococcus aureus. Assim, a realização de
antibiogramas é de grande importância para que novos princípios
ativos sejam utilizados, minimizando casos resistentes no plantel e
facilitando o tratamento de enfermidades que acometam os
animais destinados à produção leiteira.
•
A utilização do extrato hidroalcoólico da folha de Psidium guajava
L. poderia ser uma alternativa à crescente resistência dos microorganismos aos antimicrobianos comercializados e empregados na
prática veterinária. Outros estudos, associados àqueles in vivo,
poderiam agregar informações potencialmente favoráveis ao uso
deste extrato no tratamento da mastite em gado bovino leiteiro.
53
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