Taciana Deprá Magrini
Avaliação da resposta celular devido a Terapia a Laser
de Baixa Intensidade em Culturas de Tumores Mamários
Santo André
2010
Taciana Deprá Magrini
Avaliação da resposta celular devido a Terapia a Laser
de Baixa Intensidade em Culturas de Tumores Mamários
Dissertação de mestrado apresentada ao
Centro de Ciências Naturais e Humanas
da Universidade Federal do ABC, para
a obtenção de Tı́tulo de Mestre em
Nanociências e Materiais Avançados, na
Área de Biossistemas e Biofotônica
Orientador: Herculano Martinho da Silva
Colaboradores:
Giselle Cerchiaro e
Nathalia Villa dos Santos
Santo André
2010
Ao meu querido Deus
Aos meus pais e irmã
E disse Deus: Haja luz; e houve luz. E viu Deus que era boa a luz.
Gênesis 1: 3,4
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, de tudo Conhecedor, e que através deste trabalho me ajudou
a também conhecer um pouco sobre sua criação.
À UFABC, PPG-NANO e à CAPES apoio institucional e suporte financeiro.
Ao orientador Herculano toda gratidão por me aceitar como aluna e com paciência e sabedoria
me instruiu ao longo deste curso.
À Giselle e Nathalia pela ajuda com o cultivo das células e com as discussões.
À Marcella pela disponibilidade em discutir os resultados.
Aos colegas orientandos Erika, Thami, Luı́s Felipe e Thiago pela companhia e apoio.
Ao grupo GBIOF pelas dicas e conselhos.
À minha famı́lia que de longe apóia e se orgulha de mim.
E por último, mas não menos importante, ao Daniel Alva pela companhia e incentivo em
todos os momentos.
Resumo
A terapia a laser de baixa intensidade (TLBI) é um tipo de terapia que faz uso de baixas
doses de irradiação com laser em tecidos, principalmente para fins de reparação. Além dos
aspectos clı́nicos, usualmente também são de interesse os mecanismos de ação da radiação em
culturas de células ou em tecidos, os quais podem levar à reparação tecidual e outros benefı́cios
clı́nicos, porém ainda não são bem entendidos. O objetivo deste trabalho é verificar a ocorrência
ou não de alterações fı́sico-bio-quı́micas, em outras palavras, os mecanismos secundários (que
ocorrem horas depois da irradiação) em células de adenocarcinoma mamário (MCF-7) depois
de irradiadas com luz de comprimento de onda de 633 nm. Foi utilizado um filtro espacial para
homogeneizar a distribuição de intensidade espacial da frente de onda (verificado com imagens
de ccd e manipulação de dados). Foram utilizadas três diferentes fluências com uma única
aplicação de luz cada experimento (quadruplicata), as amostras foram coletadas a cada 12 horas
por 6,5 dias para FT-IR e AFM e a cada 24 h para o teste de viabilidade. Foi empregado o
teste de exclusão de Tripan Blue, a técnica de micro-espectroscopia FT-IR e a de microscopia de
força atômica (AFM) para detectar os efeitos da luz sobre as células irradiadas, comparadas ao
grupo controle (não irradiado). Foi observado nos resultados dos espectros que não houveram
deslocamentos de bandas dos grupos irradiados em relação aos controles ao longo do tempo mas
houveram diferenças significantes quando analisada a área integrada de cada banda contra o
tempo, também houveram diferenças estatı́sticas no número de células (teste de viabilidade), e
nas dimensões (medidas de AFM).
Palavras-chave: TLBI, câncer, espectroscopia, AFM, viabilidade celular.
Abstract
Low Level Laser Therapy (LLLT) is a kind of therapy that makes use of low dose laser irradiation
in tissues mainly to repairing. Beyond clinical aspects, usually are of interest the mechanisms of
action of radiation on culture cells or tissues which can lead to wound healing and other clinical
benefits, but not yet well understood. The objective of this work is to verify the occurrence
or not of bio-physic-chemistry alterations, in other words, the secondary mechanisms (hours
after irradiation) in mammary adenocarcinoma cells (MCF-7) after the interaction with light of
wavelength 633 nm. It was used a spatial filter to homogenize the spatial intensity distribution
on the wave front (checked by ccd imaging and data manipulation). It was used three different
fluences with a single aplications of light to each experiment (quadruplicate), sample was collected on every 12 hours interval by 6,5 days for FT-IR and AFM and on every for the viability
test. It was employed the Trypan Blue excluding test, the micro FT-IR spectroscopy technique
and the atomic force spectroscopy (AFM) to detect the effects of the light on irradiated cells,
compared to the control group (not irradiated). It was observed in results of spectra that they
did not have displacements of groups’ bands irradiated in relation to controls over time, but
there were significant diferences when analy zed the integrated area of the bands against tima,
of irradiated and control group was plotted against time, also there were statistical diferences
in the cell number (viability test), and in the dimensions (AFM measures).
Key words: TLBI, cancer, spectroscopy, AFM, cell viability.
Lista de Figuras
3.1
(a) Figura de células MCF-7 em baixa confluência e (b) em alta confluência deste
experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Gráfico do número de publicações por ano pesquisado na base de dados web of
science pelas palavras “cell” e “irradiation” e “laser” por tópico. . . . . . . . . . .
3.3 Espectro de ação de células HeLa, o eixo da ordenada significa desintegrações por
minuto de H3 timidina para 4×104 células, ou a taxa de sı́ntese de DNA, e o eixo
da abssissa é o comprimento de onda em nm. Adaptado da referência [1]. . . . .
3.4 Esquema de mecanismo de caminho de sinalização retrógrado de interação da
mitocôndria com o núcleo, onde ↑ indica aumento e ↓ diminuição dos valores, [
] indicam concentração, ∆FFH significa mudanças na homeostase de fissão-fusão
da mitocôndria, AP-1 significa proteı́na ativadora 1, NF-𝜅B significa fator nuclear
kappa B e h𝜈 indica a radiação incidente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5 Gráfico da taxa de sı́ntese de DNA, com dose constante de 100 J/m2 , 𝜆 = 633 nm,
onde a abssissa mostra a potência aumentando ao mesmo tempo em que o tempo
de exposição diminui. O eixo da ordenada significa o número de desintegrações
por minuto de H3 timidina para 4×104 células. Adaptado da referência [2]. . . . .
3.6 Exemplos de vibrações que podem ocorrer em moléculas. . . . . . . . . . . . . . .
3.7 Caminho óptico em um interferômetro de Michelson. (LS: fonte de luz, L: lentes,
M: espelhos, BS: Feixe divisor). Figura retirada da referêcia [3]. . . . . . . . . . .
3.8 Diagrama de um espectrômetro comercial. (Q: fonte de radiação, DV: Divisor
de feixes, SM: varredura mecânica, A: abertura, D: detector, D𝐿 : detector do
laser,E1-E4: espelhos de foco, E: espelhos planos. Retirada da referência [4]. . .
3.9 (a) Interferograma de transmissão através de um filme de polietileno. Em detalhe
é mostrada a estrutura do polı́mero. (b) Espectro de feixe único (sb) e espectro
de absorbância (abs) de FT-IR de polietileno. Adaptados da referência [3]. . . . .
3.10 Esquema demonstrando a interação de um raio de luz de intensidade I0 incidente
em um filme sobre um substrato com uma amostra, resultando em parte dele
refletido especularmente (I𝑎𝑟 ), parte dele transmitido e refletido (I𝑠𝑟 ) e n é o ı́ndice
de refração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.11 Substrato de platina utilizado na obtenção dos espectros, com filmes de amostra.
3.12 Esquema de AFM, adaptado da referência [5] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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28
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4.1
33
Esquema de parâmetros de irradiação em duas placas de seis poços. . . . . . . .
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5.1
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5.6
5.7
5.8
5.9
(a) Fotografia de fenda circular obtida em microscópio óptico (aumento de 400
vezes); (b) Filtros ópticos; (c) Franjas de interferência de padrão circular da luz
(d) Irradiação de cultura de células em um dos poços, sem que a luz atinja os
demais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Esquema da caixa na qual estão inseridos os dispositivos ópticos para irradiação
das células. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Esquemas experimentais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gráfico da intensidade da frente de onda da luz sem utilização de filtro espacial
em número de pixels. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Teste para verificação de espalhamento de luz sobre a placa de cultura quando
utilizada e não utilizada a capa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Intensidade da frente de onda da luz com utilização de filtro espacial. . . . . . . .
Espectro representativo, grupo controle em tempo de 36 h. Lb significa espectro
ainda sem subtrair a linha base, slb significa que foi subtraı́da linha base, e slbnorm significa q foi subtraı́da a linha base e foi normalizado. Os pontos indicam os
locais escolhidos para a subtração da linha base. As linhas indicam a delimitação
da banda para cálculo de sua área. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Espectros de absorção no tempo de adaptação de 24 h. São mostrados os originais
e com linha de base subtraı́da para fins de comparação. . . . . . . . . . . . . . .
Contagens de células do teste 1 (a) cujo controle seguiu a tendência de aumento
crescente e do teste 2 (b) cujo controle não seguiu a tendência de aumento crescente do número de células, n=1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cristais de PBS observados em filme de amostra. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Número de células totais (vivas mais mortas) e vivas com barras de erro padrão
da média para n=4 para todas as três fluências. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
De cima para baixo ângulo de Feret médio, área média e densidade integrada
média, cálculo feito com em média 10 células por tempo com barras de erro
padrão da média. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Imagens de AFM com resolução de 512 px, do tempo de 36 h (a) controle e (b)
irradiado e 144 h (c) controle e (d) irradiado de irradiação de 28,8 mJ/cm2 . . . .
Box plot de todos os espectros (controles e irradiados, todos os tempos) de 28,8
mJ/cm2 cuja linha preta representa o espectro médio. Não foram verificados
ruı́dos nem diferenças visı́veis entre as bandas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gráficos das áreas das bandas 1, 2 e 3 dos espectros de amostras controle e
irradiadas com 5, 28,8 e 1 J/cm2 normalizados pela área do tempo de 12 h com
barras de erro padrão da média para n=4 (28,8 mJ/cm2 ) e n=3 (5 mJ/cm2 e 1
J/cm2 ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Gráficos das áreas das bandas 4, 5 e 6 dos espectros de amostras controle e
irradiadas com 5, 28,8 e 1 J/cm2 normalizados pela área do tempo de 12 h com
barras de erro padrão da média para n=4 (28,8 mJ/cm2 ) e n=3 ( 5mJ/cm2 e 1
J/cm2 ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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49
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51
52
5.10 Gráficos das áreas das bandas 7, 8 e 9 dos espectros de amostras controle e
irradiadas com 5, 28,8 e 1 J/cm2 normalizados pela área do tempo de 12 h com
barras de erro padrão da média para n=4 (28,8 mJ/cm2 ) e n=3 (5 mJ/cm2 e 1
J/cm2 ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.11 Suposições para os caminhos celulares envolvidos após a irradiação das células
com (a) 5 mJ/cm2 , (b) 28,8 mJ/cm2 e (c) 1 J/cm2 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54
C.1 Dois esquemas de ciclo celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
53
Lista de Tabelas
4.1
4.2
Parâmetros experimentais empregados nos experimentos piloto. . . . . . . . . . .
Parâmetros experimentais empregados nos experimentos finais. . . . . . . . . . .
32
33
5.1
5.2
Números de onda e correspondentes vibrações moleculares. . . . . . . . . . . . .
Tempos em que houve diferença estatı́stica entre a intensidade da banda da
amostra irradiada em relação ao controle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
B.1 Composição do meio RPMI - 1640 [6]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
50
Lista de Siglas
ACP Análise de componentes principais
AFD Análise de função discriminante
AFM Atomic Force Microscopy
ATCC American Type Culture Collection
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
EVA
Ethylene Vinyl Acetate ou em português “espuma vinı́lica acetinada”
FT-IR Fourier Transformed Infra Red
HD
Hard Disc
Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, ou Amplificação da Luz por
Emissão Estimulada de Radiação
LED
light-emitting diode
LLLT Low Light Laser Therapy
MCT Mercurio Cádmio Telúrio
PBS
Phosphate Buffered Saline
TFD Terapia Fotodinâmica ou em inglês Photodynamic Therapy (PDT)
TLBI Terapia a Laser de Baixa Intensidade
Sumário
1 Introdução
8
2 Objetivo
11
3 Revisão teórica
3.1 Câncer e células MCF-7 . . . . . . .
3.2 Terapia a Laser de Baixa Intensidade
3.3 Mecanismos de ação da TLBI . . . .
3.4 Instrumentação - Espectroscopia . .
3.5 Espectroscopia vibracional FT-IR . .
3.6 Microscopia de Força Atômica . . . .
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20
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4 Materiais e métodos
4.1 Parâmetros de irradiação . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Construção do aparato de irradiação . . . . . . . . . . .
4.3 Obtenção e tratamento dos espectros . . . . . . . . . . .
4.4 Obtenção de imagens de Microscopia de Força Atômica
4.5 Células e manuseio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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5 Resultados e discussão
5.1 Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Publicações e Trabalhos apresentados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
55
56
56
Referências Bibliográficas
57
A Definições
68
B Manuseio das células
B.1 Plaqueamento de células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B.2 Contagem de células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
71
73
C Ciclo celular
75
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TLBI
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D Mecanismos de morte celular
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Capı́tulo 1
Introdução
A fototerapia, aplicação de luz em tecidos biológicos, iniciou-se com as pesquisas de Niels Finsen,
inventor deste termo, o qual ganhou o prêmio Nobel em 1903 por suas descobertas, como a de
que a exposição à luz vermelha pode ser usada para o tratamento de varı́ola, e também de que
a luz ultravioleta do Sol poderia ser usada para tratar Tuberculose cutânea [7].
Posteriormente outros pesquisadores deram seguimento à pesquisas nesta linha, tais como
Endre Mester o qual testou em ratos o efeito da luz laser como possı́vel causadora de câncer, no
entanto, ao invés disso descobriu que o laser ajudou na cicatrização de feridas e então iniciou
estudos in vitro sobre a ação desta em fibroblastos, tendo publicado alguns artigos sobre o
assunto nas décadas de 1970 e 1980. Nos anos seguintes foram feitos experimentos para verificar
a cicatrização e a reparação de tecidos, principalmente nas células mais relacionadas a esses
processos, os fibroblastos (que foram estudados nos mais variáveis estados, saudáveis ou não, in
vivo, em cultura, tratados ou não) bem como seus subprodutos, o colágeno e a elastina. Depois
o uso do laser foi expandido para o tratamento de outros casos clı́nicos, como o câncer [8].
Existem dois vieses de tratamentos tendo como base a luz laser. Em um deles utiliza-se
apenas a luz como fonte do tratamento e é geralmente chamada de Terapia a Laser, a qual
possui duas vertentes diferindo basicamente quanto à fluência de luz empregada e são chamadas
de Terapia a Laser de Baixa Intensidade (TLBI) e Terapia a Laser de Alta Intesidade. No outro
tipo, além da luz é adicionado um fotofármaco, ou seja, um medicamento à base de corantes que
absorve luz em determinados comprimentos de onda e que na presença desta e de oxigênio leva à
geração de agentes citotóxicos como espécies reativas de oxigênio, tendo como principal resposta
a morte celular por via necrótica. Esta é chamada de Terapia Fotodinâmica (TFD), modalidade
que tem sido utilizada especialmente para tratamentos de neoplasias em estágios iniciais, com
Capı́tulo 1. Introdução
9
várias vantagens sobre os tratamentos tradicionais (Para mais detalhes sobre a TLBI e a TFD
veja o apêncice A).
Este trabalho será focado na Terapia a Laser de Baixa Intensidade cujos efeitos retratados
na literatura podem ser classificados em nı́vel molecular, celular e tecidual.
Efeitos a nı́vel molecular incluem mudanças na produção de espécies reativas de oxigênio
(EROs), na concentração do ı́on 𝐶𝑎+2 , no potencial transmembrana mitocondrial (∆Ψ𝑚 ), no
pH intracelular [9], na quantidade de ATP [10], dentre outros. Alguns efeitos a nı́vel celular
reportados são proliferação [11], diferenciação [12], viabilidade celular [13] e morte celular [14].
Segundo Karu [15] o efeito do LBI, dependendo dos parâmetros de irradiação pode provocar a ação de biomodulação, que é um efeito a nı́vel tecidual, ou seja, bioestimulação ou
bioinibição. A bioestimulação é caracterizada pelos fatores de cicatrização/reparação tecidual
e inflamação/drenagem linfática, enquanto a bioinibição é caracterizada pelo fator de analgesia/contenção de hipertrofia celular.
Resultados clı́nicos publicados do ponto de vista do tipo de fonte de radiação sendo coerente
ou não coerente não levaram à conclusões precisas de que lasers têm um maior potencial terapêutico do que diodos emissores de luz (LEDs) [16] pois em certos casos o efeito terapêutico do
laser parece ser maior do que LEDs [17] enquanto outros estudos levam à conclusão contrária.
Alguns experimentos a nı́vel celular têm provido evidências de que luz coerente e não coerente
com o mesmo comprimento de onda, intensidade e tempo de irradiação provém o mesmo efeito
biológico [18, 19, 20], no entanto, esta situação é diferente quando um tecido macroscópico é irradiado, sendo a coerência espacial a principal responsável na entrega de luz dentro do biotecido
[21].
Como se pode perceber, apesar de antiga, a TLBI ainda é fonte de controvérsias, portanto
pesquisas nesta área ainda são necessárias. Um dos motivos para isso é a carência de literatura
confiável no sentido de que muitas vezes os artigos não dão informações completas sobre o
método de entrega de luz, sobre os parâmetros de luz utilizados (dose, potência) e sobre o
tempo de irradiação. Além disso, a literatura é muito divergente em relação aos parâmetros de
irradiação e linhagem celular utilizados, de tal forma que existem muitos resultados, porém na
maioria das vezes não se pode chegar a um consenso a partir deles, especialmente quando se
trata de proliferação ou morte celular [22, 23].
Demonstrado o cenário atual da pesquisa em TLBI o estabelececimento de padrões de
parâmetros de irradiação como dose de luz e comprimento de onda do laser (vide Apêndice
A) tem se mostrado uma necessidade, pois em geral os resultados são muito diferentes quando
se utiliza diferentes tipos de células mesmo mantendo iguais esses parâmetros [24]. Também
Capı́tulo 1. Introdução
10
tem se mostrado muito importante a determinação de quais são os mecanismos e fatores fotobioquı́micos que levam as células à bioestimulação ou bioinibição [13]. No entanto, um fator
a se levar em consideração quando se fala em TLBI é que os resultados obtidos no estudo de
células em cultura nem sempre podem ser levados para uma aplicação in vivo sem a devida
experimentação, devido às diferenças de dimensões entre os sistemas.
Expostos os muitos problemas em aberto em se tratando de TLBI, achou-se ser de grande
contribuição um estudo da ocorrência ou não de alterações fı́sico-bio-quı́micas nas células de
adenocarcinoma mamário in vitro (células da linhagem MCF-7) após a interação destas com
luz coerente (633 nm), cujo parâmetro variado é a densidade de energia aplicada (5 mJ/cm2 ,
28,8 mJ/cm2 e 1 J/cm2 ), portanto as células MCF-7 foram submetidas a um experimento de
cinética, ou seja, de avaliação de seu comportamento ao longo de 6,5 dias após a irradiação.
Para tal verificação e subsequente análise, foi utilizado o método de micro-espectroscopia FT-IR,
técnica que vem sendo amplamente utilizada na área biológica para verificação de informações
moleculares, a microscopia de força atômica (AFM) para verificação de variações morfológicas,
bem como a tradicional contagem de células para verificação de viabilidade celular.
A escolha do tipo celular de carcinoma MCF-7 e das fluências foi devido ao potencial uso
dos resultados como base para outros estudos, como por exemplo de terapia fotodinâmica sobre
este mesmo tipo celular, e porque resultados para esta ordem de grandeza de fluências já foram
razoavelmente reportados, contribuindo portanto para a padronização dos parâmetros de irradiação. A utilização do tempo de acompanhamento de 6,5 dias teve como principal motivo o de
se ter um panorama da extensão de tempo dos efeitos da luz sobre as células.
Capı́tulo 2
Objetivo
Verificar e caracterizar a ocorrência (ou não) de alteraçãoes fı́sico-bio-quı́micas em células de
adenocarcinoma de mama ao longo de 6,5 dias após a interação destas com uma única dose
de luz via espectroscopia FT-IR, microscopia de força atômica e teste de viabilidade celular
pela técnica de exclusão do azul de tripano, variando-se a densidade de energia utilizada e
comparando-se os resultados com os já reportados na literatura para os mesmos parâmetros.
Capı́tulo 3
Revisão teórica
3.1
Câncer e células MCF-7
Câncer é uma palavra utilizada genericamente para representar um conjunto de mais de 100
doenças, incluindo tumores malignos de diferentes localizações. O câncer de mama é o segundo
mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres, a cada ano cerca de 22% dos casos
novos de câncer em mulheres são de mama segundo o Instituto Nacional de Câncer do Brasil
(INCA). São palavras de Luiz Antonio Santini Rodrigues da Silva, diretor geral do INCA:
“Compreender e controlar as doenças malignas requer conhecimentos cientı́ficos e
experiências que vão desde o conhecimento dos complexos mecanismos de regulação
molecular intracelular às escolhas individuais do estilo de vida. Também se exige
uma gestão competente e o melhor uso dos recursos disponı́veis para o planejamento,
execução e avaliação das estratégias de controle da doença. A prevenção e o controle
de câncer estão entre os mais importantes desafios, cientı́ficos e de saúde pública, da
nossa época”.
MCF-7 são uma linhagem de células imortalizadas de adenocarcinoma que foram extraı́das
e isoladas de glândulas mamárias de uma mulher caucasiana em 1970 e estabilizadas no ano
de 1973 no Michigan Cancer Foundation (daı́ a denominação MCF) [25, 26]. Possui morfologia
epitelial (Vide Fig. 3.1), caracterı́stica de aderência (a qual influencia nos protocolos de cultura
e contagem), habilidade para processar hormônio estradiol e tempo de duplicação de 29 horas
[26].
Capı́tulo 3. Revisão teórica
(a)
13
(b)
Figura 3.1: (a) Figura de células MCF-7 em baixa confluência e (b) em alta confluência deste
experimento.
3.2
Terapia a Laser de Baixa Intensidade - TLBI
A TLBI tem sido realizada clinicamente no intuito de reduzir dor, de curar inflamações e edemas,
cicatrização de feridas e de nervos e prevenir dano tecidual ao longo de quase quarenta anos desde
a invenção dos lasers [24]. O gráfico da Fig. 3.2 é resultado de uma pesquisa na base de dados
Web of Science com as palavras “cell”, “laser” e “irradiation” por tópico, o qual mostra que a
quantidade de artigos relacionados à irradiação de células com laser até 1990 era baixo e estável,
mas a partir deste ano aumentou consideravelmente.
A despeito do grande número de artigos existentes sobre o tema, os resultados parecem ser
controversos [23], além disso os mecanismos bioquı́micos que permeiam os resultados não são
completamente entendidos, em grande parte porque existe um grande número de parâmetros de
iluminação [24] e também porque a qualidade metodológica em geral é pobre[22].
Os artigos sobre TLBI geralmente se concentram na procura de danos ao DNA [27, 28],
na monitoração da atividade da mitocôndria [29, 10] e das espécies reativas de oxigênio (EROs)
[30, 10, 13], em estudos relativos aos mecanismos primários e secundários [1, 21], em comparação
de efeitos entre diferentes células [31, 32], em comparação de efeitos de diferentes fluências ou
fontes de luz [33, 34, 35], nos efeitos da luz na proliferação ou morte celular [36, 11, 30, 37, 38],
em estudos de cicatrização de feridas [39, 40, 41] ou em mais de um destes assuntos acoplados.
Capı́tulo 3. Revisão teórica
14
Figura 3.2: Gráfico do número de publicações por ano pesquisado na base de dados web of
science pelas palavras “cell” e “irradiation” e “laser” por tópico.
3.3
Mecanismos de ação da TLBI
Atualmente são propostos alguns mecanismos de ação da luz nas células, são os mecanismos
primários e secundários.
Os mecanismos primários de ação da luz são os que ocorrem no momento em que é efetuada
a irradiação e existem algumas propostas [1], quatro delas explicadas a seguir. Primeiramente,
tem sido sugerido que um possı́vel processo envolve aceleração de transferência de elétrons na
cadeia respiratória devido a mudanças nas propriedades redox dos carreadores de elétrons da
cadeia, como o NAD, FAD e citocromo c, seguindo fotoexcitação de seus estados eletrônicos [42].
Por segundo, é sugerido que durante a excitação de estados eletrônicos pela luz uma notável
fração da energia de excitação é convertida em calor, o que causa um aumento de temperatura
dos cromóforos. Esse aumento local transiente na temperatura de biomoléculas absorvedoras
poderia causar mudanças conformacionais e estruturais e desencadear atividades bioquı́micas
(reações secundárias no escuro) tal como ativação ou inbição de enzimas [43].
Por terceiro, supõe-se que alguns efeitos de laser de baixa potência podem ser relacionados
ao aumento da produção da espécie reativa oxigênio singlete o qual reage produzindo o peróxido
de hidrogênio, e cuja produção na mitocôndria está relacionada à regulação do metabolismo
celular [44]. É também possivel que sejam geradas espécies reativas como o oxigênio singlete
Capı́tulo 3. Revisão teórica
15
e peróxido de hidrogênio simplesmente modulando-se a atividade redox da mitocôndria e/ou o
estado redox da célula. Ou seja, o primeiro e terceiro mecanismo provém um resultado muito
similar.
Em quarto, certas moléculas fotoabsorvedoras como porfirinas e flavoproteı́nas (alguns componentes da cadeia respiratória pertencem a essa classe de componentes) podem ser reversivelmente convertidos em fotossensibilizadores e a absorção de luz por essas moléculas seria convertida em oxigênio singlete [45, 46]. Este podendo ser um mediador nos efeitos biológicos da
irradiação, pois estados quimicamente ativos de oxigênio com energias de 1 e 1,5 eV podem ser
importantes em alcançar efeitos biológicos.
Muitas publicações demonstraram que a mitocôndria deve ser a principal organela resposável
pela absorção de luz na célula e isso já foi estabelecido na literatura através de experimentos de
espectros de ação. Um espectro de ação (EA) (Fig. 3.3) foi feito para células HeLa cultivadas
em frascos de cintilação com um número inicial 1×105 células por frasco [47, 2]. Foi medida a
taxa de sı́ntese de DNA 1,5 ou 4 horas após a irradiação na fase log (de crescimento acelerado)
com precursores radioativos H3 timidina e C14 uridina (descrito em [48]). A intensidade da
luz foi mantida constante a 10 W/m2 (1 mW/cm2 ), variando-se a voltagem da lâmpada, com
tempo de irradiação de 10 segundos, fluência de 100 J/m2 (10 mJ/cm2 ) e comprimentos de
onda de 580 a 860 nm. Este espectro de ação é uma medida da sı́ntese de DNA em função do
comprimento de onda de luz incidido nas células, a partir do qual se pode deduzir quais são os
principais comprimentos de onda absorvidos quando se olha para apenas para a função de sı́ntese
de DNA. Para se determinar quem é o fotoaceptor que absorve a luz foram ajustadas lorentzianas
(tracejado) ao espectro de ação (os quadrados são os resultados experimentais e a linha cheia
é o ajuste às lorentzianas), as quais teoricamente seguem o espectro de absorção da molécula
fotoaceptora [49]. Apesar de o efeito verificado ser o de sı́ntese de DNA, os comprimentos de
onda absorvidos pela célula não tinham nenhuma relação com nenhum cromóforo do núcleo,
mas sim da mitocôndria. Por isso se diz que o caminho de sinalização ocorrido na célula devido
a luz é retrógrado, pois é a mitocôndria quem manda sinalização para o núcleo para produzir
DNA e não o contrário, como estabelecido anteriormente.
A absorção de luz pela mitocôndria depende do comprimento de onda de luz incidido, tendo
sido definidos até mesmo quais os comprimentos de onda absorvidos pela mitocôndria em cada
fase do ciclo respiratório [50, 51]. A absorção de luz pela mitocôndria tem sido verificada indiretamente pela quantidade de ATP produzido [52, 53, 54, 55], pela quantidade de oxigênio molecular
consumido [52, 54, 55], pelo potencial de membrana e pelo gradiente de prótons da membrana
mitocondrial. Foram feitos também espectros de ação para sı́ntese de DNA na fase platô (de
crescimento estagnado) e de sı́ntese de RNA na fase log e na fase platô. Também foi feito o
Capı́tulo 3. Revisão teórica
16
Figura 3.3: Espectro de ação de células HeLa, o eixo da ordenada significa desintegrações por
minuto de H3 timidina para 4×104 células, ou a taxa de sı́ntese de DNA, e o eixo da abssissa é
o comprimento de onda em nm. Adaptado da referência [1].
EA da adesão de células HeLa a um substrato de vidro, este porém com parâmetros um pouco
diferentes (intensidade de 1,3 W/m2 , tempo de irradiação de 40 segundos e dose de 52 J/m2 ).
Todos os cinco espectros de ação foram utilizados na dedução de qual seria o fotoaceptor de luz.
Para isso, cada banda dos espectros de ação foi analisada separadamente onde houveram quatro
bandas de absorção as quais foram relacionados com energias de transição eletrônicas de componentes especı́ficos (centros absorvedores, como por exemplo o Cobre) de algum fotoaceptor.
Portanto determinou-se de forma indireta que este fotoaceptor era o citocromo c oxidase [56-61],
cuja forma e função dentro da célula é bastante complexa [60, 62-67]. Também se concluiu que o
citocromo c oxidase não pode ser um fotoaceptor primário quando está completamente oxidado
ou reduzido, mas somente quando está nas formas intermediárias (parcialmente reduzido, ou de
valência mista) [1]. Outro candidato a fotoaceptor é uma flavoproteı́na como NADH desidrogenase a qual absorve luz azul e vermelha [56, 57]. Mais explicações sobre a dedução de que o
citocromo c é o principal fotoacpetor celular podem ser encontradas em [35] e [1].
As reações secundárias são as reações bioquı́micas que ocorrem horas ou dias após o pro-
Capı́tulo 3. Revisão teórica
17
cedimento de irradiação. Essas reações supostamente ocorrem como consequência da absorção
de luz por cromóforos como a molécula de citocromo c oxidase e/ou componentes flavı́nicos
como o NADH. Acredita-se que o foto-sinal percocorra uma cadeia de amplificação e transdução através da cadeia redox respiratória pois esta é capaz de controlar a homeostase celular
tendo como consequências alterações no potencial redox da mitocôndria e modulações de reações
bioquı́micas como a sı́ntese de ATP e de DNA levando a macroefeitos fotobiológicos como aumento da proliferação (marcado pela sı́ntese de DNA). Sabe-se que um pequeno aumento no pH
citoplasmático (estreitamente conectado com o estado redox da célula) é um dos componentes
necessariamente envolvidos na transmissão de sinais mitóticos na célula [58, 59, 60]. Tem sido
observados como efeito da irradiação mudanças na força motiva protônica (fmp), no potencial
elétrico da membrana mitocondrial, no pH citoplasmático e na sı́ntese de ATP [10, 61, 62], e
aumento no tamanho das mitocôndrias [63], indicativo de intensificação do metabolismo energético. Na Fig. 3.4 é mostrado esquematicamente os caminhos de sinalização retrógrado,
onde os caminhos marcados por flecha cheia são os experimentalmente provados e os de flecha
tracejada são os teoricamente sugeridos.
A lei da reciprocidade ou lei de Bunsen-Roscoe em fotobiologia proposta no século XIX
por R. Bunsen e H. E. Roscoe diz que o surgimento de algum efeito biológico devido à luz é
diretamente proporcional à dose de energia administrada, que é o produto da intensidade (ou
densidade de potência) pelo tempo de exposição. Porém esta lei tem sido posta à prova ao longo
de muitos anos e tem sido considerada imprópria devido aos resultados de alguns experimentos,
como por exemplo no experimento em que foi medida a taxa de sı́ntese de DNA de células
HeLa, irradiadas com laser de 633 nm à dose constante de 100 J/m2 , sendo que o tempo de
irradiação e a intensidade foram variados. O resultado pode ser visto na Fig. 3.5, onde a linha
tracejada representa o grupo controle e pode-se notar que há um aumento na taxa de sı́ntese
de DNA a partir de 4 mW/cm2 , chegando a um pico em 8 mW/cm2 (cujo tempo de irradiação
correspondente foi de 10-12 segundos), e então, um decaimento desta taxa.
Um fator que pode influenciar na forma como as células respondem à interação com a luz é
a fase do ciclo na qual a célula estava quando foi irradiada como por exemplo um experimento
foi realizado para a verificação da produção de ATP por células HeLa após irradiação com 632,8
nm, 10 mJ/cm2 por 10 s ao longo de 8 dias [64], porém a irradiação foi feita uma vez ao dia e a
quantidade de ATP foi medida 20 min após cada exposição, obteve como resultados uma intensa
produção de ATP no terceiro dia (correspondente à fase log de crescimento das células) em
comparação com o grupo não irradiado, o que indicou basicamente que a produção de ATP após
exposição com aquela fluência depende da fase de crescimento celular na qual ela estava quando
foi irradiada. Em outro experimento com estes mesmos parâmetros [65] cujas irradiações foram
Capı́tulo 3. Revisão teórica
18
Figura 3.4: Esquema de mecanismo de caminho de sinalização retrógrado de interação da mitocôndria com o núcleo, onde ↑ indica aumento e ↓ diminuição dos valores, [ ] indicam concentração, ∆FFH significa mudanças na homeostase de fissão-fusão da mitocôndria, AP-1 significa
proteı́na ativadora 1, NF-𝜅B significa fator nuclear kappa B e h𝜈 indica a radiação incidente.
feitas uma durante a fase exponencial e outra durante a fase platô das células revelou que há um
possı́vel aumento no número de células sintetizando DNA tanto na fase exponencial quanto na
fase logarı́tmica, mas na fase exponencial este aumento é maior. Em ambas fases este aumento
foi dependente do tempo, sendo que nas primeiras horas após a irradiação houve um aumento
brusco na produção e depois foi quase linear, portanto, a sı́ntese de DNA após a irradiação tem
uma dependência com a fase de crescimento, e com o tempo após a irradiação. Outro fator
que influencia os resultados obtidos é o comprimento de onda, como no espectro de ação onde
influenciou a sı́ntese de DNA, e nos resultados de [66] onde influenciou na proliferação celular.
Como visto anteriormente, vários são os fatores ligados aos efeitos biológicos nas células após
sua irradiação. A seguir, são brevemente relatados alguns estudos recentes, como por exemplo
um estudo feito com cultura de células de pele humana em cicatrização [33], o qual demon-
Capı́tulo 3. Revisão teórica
19
Figura 3.5: Gráfico da taxa de sı́ntese de DNA, com dose constante de 100 J/m2 , 𝜆 = 633 nm,
onde a abssissa mostra a potência aumentando ao mesmo tempo em que o tempo de exposição
diminui. O eixo da ordenada significa o número de desintegrações por minuto de H3 timidina
para 4×104 células. Adaptado da referência [2].
strou que quando irradiados com 5 J/cm2 houve estı́mulo da atividade mitocondrial levando
aos fibroblastos migrarem rapidamente indicando que eles estavam em processo de reparação e
também houve aumento da proliferação e viabilidade sem que houvesse aumento de dano molecular e celular. No entanto, com doses maiores, de 10 e 16 J/cm2 houve um decréscimo na taxa
de viabilidade e proliferação celular e dano à membrana celular e ao DNA. Outro estudo [34]
comparou o efeito de irradiação em fibroblastos de gengiva com 5% de déficit nutricional, ou
com 10 % de soro fetal bovino (controle) usando diferentes comprimentos de onda e fluência
fixa de 2 J/cm2 . Em condições normais as células com déficit nutricional apresentaram taxa de
proliferação menor do que as com suprimento nutricional ideal, no entanto quando irradiadas
apresentaram crescimento igual ou maior do que aquelas (não irradiadas) sendo que lasers de
igual potência de saı́da apresentaram efeitos similares sobre o crescimento celular independentemente de seus comprimentos de onda. Já outro estudo [36] utilizando altas fluências, de 120
J/cm2 e 80 J/cm2 em dois tipos de célula, adenocarcinoma de pulmão humano (ATSC-a-1), e
células de fibroblasto de macaco africano transformadas (COS-7) foram irradiadas com laser de
Capı́tulo 3. Revisão teórica
20
633 nm, cujo objetivo era induzir a apoptose e verificar qual a sequência de mecanismos que leva
a ela. Foi verificado dessa forma geração máxima de EROs em 60 s após a irradiação, diminuição
de membrana mitocondrial com mı́nimo após 50 min após a irradiação, ativação de caspase 3
entre 30 e 180 min após a irradiação, com apenas pequenas diferenças de tempo entre os tipos
celulares, e que a caspase-8 não foi afetada com esse experimento. Medindo-se os tempos em
que ocorreu formação máxima desses componentes pôde-se supor uma sequência de eventos que
antecediam a apoptose. Em outro trabalho [64], células HeLa foram irradiadas com luz de 633
nm com dose de 10 mJ/cm2 por 10 s e a sı́ntese de ATP foi medida por 50 min após a irradiação,
notou-se um aumento considerável de quantidade de ATP após 20 min de irradiação, sendo que
depois diminuiu, e a quantidade do grupo controle permaneceu contı́nua. A quantidade de ATP
por célula ao longo de 8 dias, comparado ao controle, e o grupo irradiado se mostrou muito
maior, mas com um máximo no tempo de três dias, como o controle.
3.4
Instrumentação - Espectroscopia
A espectroscopia vibracional oferece informações sobre a composição molecular, estrutural e
interações moleculares em uma amostra. A luz infravermelha de uma fonte contı́nua (usualmente
de 400 a 4000 cm−1 ) incidente nas moléculas, quando absorvida, causa a transição destas para
um estado de vibração mais alto, o que significa que os estados de energia vibracionais das
moléculas são excitados devido a absorção de luz.
O comprimento de onda e a energia da luz estão relacionados pela Eq. 3.1, onde h é a
constante de Planck, c é a velocidade da luz e 𝜆 é o comprimento de onda.
𝐸=
ℎ𝑐
𝜆
(3.1)
Considere-se uma molécula como um sistema massa-mola oscilante simples. Sua energia
vibracional é prevista quanticamente pela Eq. 3.2.
1
𝐸𝑣𝑖𝑏 = (𝑛 + )ℎ𝜈0
2
(3.2)
onde n é um número natural, chamado de número quântico vibracional, e 𝜈0 é a frequência
do oscilador harmônico clássico, dada pela Eq. 3.3.
Capı́tulo 3. Revisão teórica
21
1
𝜈0 =
2𝜋
√︃
𝑘
𝜇
(3.3)
onde k é a constante de força de ligação entre os átomos e 𝜇 é a massa reduzida dos átomos
que compõem a molécula (Eq. 3.4), onde m𝑖 é a massa do i-ésimo átomo.
𝑖=1
∑︁ 1
1
=
𝑚𝑟𝑒𝑑
𝑚𝑖
𝑛
(3.4)
A energia do oscilador harmônico quando n=0 (o estado vibracional fundamental) é conhecida
como a energia do ponto zero. Estamos interessados na energia responsável pela transição entre
os estados vibracionais, que é a energia absorvida. A diferença de energia envolvida na transição
do estado vibracional n para o estado m é dada pela Eq. 3.5.
∆𝐸 = 𝐸𝑚 − 𝐸𝑛
(3.5)
Pelas Equações 3.4 e 3.5, percebe-se que as moléculas somente absorvem frequências selecionadas de radiação. Para incidência de luz de frequências idênticas às das vibrações das
moléculas há absorção de energia, o que se traduz em picos ou bandas no espectro de absorção
da amostra. Note-se entretanto que nem todas as ligações em uma molécula são capazes de
absorver luz infravermelha, mesmo se a frequência da radiação é exatamente a mesma do movimento da ligação.
O conjunto das probabilidades de transição entre os possı́veis estados n e m é conhecido como
o conjunto das regras de seleção para as transições. No caso de uma molécula diatômica, só ocorre
absorção de energia se houver mudança no valor do momento de dipolo elétrico dessa molécula1
(⃗
𝑝), mesmo quando a molécula não tiver momento de dipolo permanente2 , e se o número quântico
vibracional mudar por uma unidade (∆n=±1), ou seja, somente serão possı́veis transições entre
nı́veis adjacentes. Essas regras de seleção são válidas apenas como primeira aproximação pois,
1
O momento de dipolo elétrico é definido como o produto da magnitude da carga elétrica de cada átomo pela
dist^
ancia entre o componente positivo e o negativo destas cargas.
2
Por exemplo, ligações como as de H2 ou de Cl2 não absorvem radiação infravermelha por que seu momento
de dipolo não muda com o tempo.
Capı́tulo 3. Revisão teórica
22
como se sabe, o potencial interatômico não é perfeitamente harmônico [67]. Portanto, tais regras
podem ocasionalmente falhar, mas se uma transição embora proibida pela regra ocorrer, o fará
com intensidade quase sempre muito pequena.
As vibrações de moléculas poliatômicas costumam ser analisadas tratando cada modo normal de vibração como um oscilador independente com seus próprios nı́veis de energia. A energia
vibracional total da molécula é então calculada como a soma das energias dos osciladores individuais
𝐸 = (𝑛1 + 1/2)ℎ𝜈1 + (𝑛1 + 1/2)ℎ𝜈1 + ... + (𝑛1 + 1/2)ℎ𝜈1
(3.6)
A introdução da anarmonicidade no estudo do comportamento vibracional de moléculas
poliatômicas faz com que os modos normais não possam mais ser tratados como independentes.
As regras de seleção, obtidas anteriormente para o caso de uma molécula diatômica, podem ser
estendidas a moléculas poliatômicas [67].
A intensidade de uma linha espectral depende da probabilidade de transição entre dois estados, dado pelas regras de seleção e pelo número de moléculas no estado inicial da transição.
Seja n𝑖 o número de moléculas no estado de maior energia e n𝑗 o número de moléculas, naquele
de menor energia. Considerando um sistema em equilı́brio térmico, a lei de Boltzmann da
distribuição de energia relaciona-os de acordo com a equação:
𝑛𝑖
𝑔𝑖
=
Δ𝐸
𝑛𝑗
𝑔𝑗 𝑒 𝐾𝑇
(3.7)
onde ∆E é a variação de energia entre os dois estados, T é a temperatura em Kelvin, g a
degenerescência ou o peso estatı́stico dos estados e k é a constante de Boltzmanm. Observe
que, se T é a temperatura ambiente, o número de moléculas em um estado excitado n𝑖 pode
ser desprezado. Assim, nos espectros à temperatura ambiente somente aquelas transições a
partir do estado fundamental são observadas, embora existam linhas que se originam a partir
de estados excitados. Por isso a intensidade é uma informação quantitativa e permite detectar
a concentração de uma espécie quı́mica .
A largura de uma linha espectral depende do tempo de permanência em um dado estado de
energia. Pelo princı́pio da incerteza de Heisenberg, se uma molécula permanece isolada por um
tempo (∆t) [68] em um dado estado de energia, a energia deste estado terá uma incerteza de
Capı́tulo 3. Revisão teórica
23
(Eq. 3.8 e 3.9).
∆𝐸 = ℎ∆𝜈 ∼
=
∆𝑡∆𝜈 =
ℎ
2𝜋∆𝑡
ℎ
2𝜋
(3.8)
(3.9)
Então, quanto mais tempo uma molécula permanecer em um dado nı́vel de energia, menor
será a incerteza da frequência. Para sistemas moleculares no estado fundamental, a energia
é mais precisamente definida do que em estados excitados, já que pela lei da distribuição da
energia de Boltzmann, o número de moléculas no estado fundamental é muito maior do que em
estados excitados.
A energia total de uma molécula, não considerando a energia devida aos movimentos translacionais, é a soma das energias eletrônica, vibracional e rotacional, esta última só no caso de
moléculas em fase gasosa.
Se em um sistema há N átomos não combinados, livres para se movimentarem em três
dimensões, o sistema possui 3N graus de liberdade. Contudo se estes átomos estão combinados
formando uma molécula não linear haverá 3N-6 graus de liberdade para as vibrações. Para
moléculas lineares não há rotação em torno do eixo internuclear e em conseqüência restam (3N5) graus de liberdade para as vibrações. Estes graus de liberdade corresponde aos diferentes
modos normais de vibração em uma molécula [68].
Um modo normal de vibração é aquele em que cada núcleo realiza uma oscilação harmônica
simples em torno de sua posição de equilı́brio e todos os núcleos se movem em fase com a
mesma freqüência e o centro de gravidade da molécula permanece inalterado. Por exemplo, o
benzeno C6 H6 apresentaria 3×12–6=30 modos normais de vibração. Porém, experimentalmente
(IV e Raman) observa-se apenas 20 modos normais de vibração. Este fato é explicado devido
à degenerescência, que é a existência de diferentes modos normais de transição apresentando a
mesma energia e em conseqüência, a mesma posição no espectro [68].
Os movimentos moleculares podem ser simplesmente agrupados em estiramento vibracional
(representado por 𝜎), deformações vibracionais no plano da molécula(𝛿) deformações vibracionais
fora plano da molécula (Fig. 3.6). Este evento de complexa movimentação dos átomos de moléculas envolve multiplicidade de energias, especialmente se os átomos possuem diferentes massas e
estão conectados com diferentes tipos de ligações, tais como, ligações únicas, duplas ou triplas.
Capı́tulo 3. Revisão teórica
24
Portanto, em se se tratando de moléculas, especialmente se forem biológicas, sua geometria é
grande influenciadora sobre as vibrações que ocorrem quando uma frequência é absorvida.
Figura 3.6: Exemplos de vibrações que podem ocorrer em moléculas.
Espectros com luz infra-vermelha podem ser feitos basicamente com dois tipos de técnicas:
a dispersiva e a não-dispersiva, ou espectroscopia interferométrica. Isso é devido ao modo de
construção de cada espectrômetro, a técnica dispersiva utiliza prismas e grades de difração para
a luz, enquanto que a interferométrica utiliza o interferômetro de Michelson, sendo que esta tem
algumas vantagens sobre a dispersiva [3].
Um espectrômetro interferométrico utiliza uma ferramenta matemática chamada transformada de Fourier e um interferômetro de Michelson, mas com um dos espelhos móvel (Fig. 3.7).
A interferometria funciona da seguinte maneira: a luz branca incide na lente L1 é separada pelo
divisor de feixe (é um elemento óptico que permite parte da luz seja refletida e parte transmitida), onde a parte refletida é focalizada no detector D depois de ser refletida pelo espelho
estacionário M1 e depois de uma segunda divisão pelo divisor de feixe. A parte transmitida
também é focalizada no detector após ser refletida pelo espelho M2 e dividido novamente pelo
divisor de feixe. A amostra é posicionada entre o divisor de feixe BS e a lente L2. Mudando o
espelho móvel M2 de uma certa distância, franjas de interferência são produzidas no detector
devido a diferença de fase entre os feixes parciais. Sua intensidade I(x) depende da posição x do
espelho M2, onde I(x) é chamada função de interferograma, que é dada pela Eq. 3.10:
′
𝐼 (𝑥) = 𝐼(𝑥) −
1
2
∫︁
0
𝐼(𝜈)𝑑𝜈 =
∞
1
2
∫︁
0
𝑐𝑜𝑠(4𝜋𝜈𝑥)𝑑𝜈
(3.10)
∞
onde x é a posição do espelho móvel, e 𝜈 é a frequência da luz.
Por razões técnicas o interferograma não é obtido continuamente, e sim ponto a ponto. Para
isso é utilizado o padrão de interferência de um laser, o qual é detectado em um detector de
diodo (Veja Fig. 3.8). O cruzamento entre ambos os feixes (na figura, o contı́nuo e o tracejado)
quando a fase da luz do laser é máxima em amplitude, define os pontos da posição x do espelho
móvel onde são obtidos os interferogramas.
Capı́tulo 3. Revisão teórica
25
Figura 3.7: Caminho óptico em um interferômetro de Michelson. (LS: fonte de luz, L: lentes,
M: espelhos, BS: Feixe divisor). Figura retirada da referêcia [3].
Figura 3.8: Diagrama de um espectrômetro comercial. (Q: fonte de radiação, DV: Divisor de
feixes, SM: varredura mecânica, A: abertura, D: detector, D𝐿 : detector do laser,E1-E4: espelhos
de foco, E: espelhos planos. Retirada da referência [4].
O interferograma é um sinal complexo da intensidade pelo tempo, mas seu padrão de onda
contém todas as frequências que pertencem ao espectro infravermelho. Um operação matemática
sabida como transformada de Fourier pode separar as frequências de absorção individuais do
interferograma, produzindo um espectro virtualmente idêntico àquele obtido com um espectrômetro dispersivo. A vantagem de um instrumento FT-IR é que ele adquire o interferograma
em menos que um segundo. Assim é possı́vel coletar dezenas de interferogramas da mesma
Capı́tulo 3. Revisão teórica
26
amostra e acumulá-las na memória do computador. Quando a transformada de Fourier é realizada sobre a soma dos inteferogramas acumulados, um espectro das absorções individuais pode
ser obtido.
Quando comparada com a técnica dispersiva, a interferométrica tem duas vantagens principais, sabidas como vantagem da energia e vantagem múltipla. A vantagem de energia se origina
do fato de que durante o perı́odo inteiro de medida quase sempre a intensidade total do feixe
atinge o detector. Isso significa que a detecção opera sobre um alto nı́vel de sinal, o que melhora
a taxa sinal-ruı́do. A vantagem múltipla se origina do fato de que a cada mudança do espelho
móvel é realizada uma varredura completa de todo o espectro e com isso varreduras individuais são combinadas resultando em uma melhor representação de absorbância, portanto, quanto
maior o número de varreduras, menor o ruı́do enquanto que em espectroscopia dispersiva N
partes de comprimentos ∆𝜈 do espectro são medidos sucessivamente. A Fig. 3.9a mostra um
interferograma de um filme de polietileno. Após transformado pela transformada de Fourier, é
obtido um espectro como o (sb) da Fig. 3.9b, também chamado feixe único [4].
(a)
(b)
Figura 3.9: (a) Interferograma de transmissão através de um filme de polietileno. Em detalhe
é mostrada a estrutura do polı́mero. (b) Espectro de feixe único (sb) e espectro de absorbância
(abs) de FT-IR de polietileno. Adaptados da referência [3].
A forma geral do espectro (sb) é determinada principalmente pelas caracterı́sticas da fonte
de luz e pelos elementos ópticos do caminho óptico, incluindo o detector. Se o espectrômetro é
operado sob condições ambientais adicionais, linhas de absorção de CO2 e de H2 O da atmosfera
aparecem. Desde que essas linhas não tenham relação com as propriedades da amostra a ser
analisada, o resultado do feixe único é usualmente dividido pelo espectro de background. O
Capı́tulo 3. Revisão teórica
27
logarı́tmo desta razão é graficado contra a energia da luz (em número de onda). A quantidade
obtida deste modo é a absorbância, a qual oferece uma caracterização muito melhor da amostra.
A transmissão observada é diretamente relacionada com a absorção de acordo com a lei de
Lambert (Eq. 3.11), e reflexões tem apenas uma pequena influência sobre o espectro.
𝐼(𝑥) = 𝐼0 𝑒−𝛼𝑙𝑐 = 𝑇
(3.11)
Onde I é a intensidade da luz transmitida após passar pelo material, I0 é a intensidade
de luz incidente, 𝛼 é o coeficiente de absorção ou absortividade molar da substância, l é a
espessura da amostra, c é a concentração de material e T é a transmitância. A absorbância é
definida como −𝛼𝑙𝑐. Atualmente os aparelhos de espectroscopia fazem todos esses procedimentos
automaticamente, obtendo-se diretamente o espectro de absorção.
Existem algumas condições de operação do espectrômetro que se desviam das ideais, sendo
que duas delas são muito importantes, o valor finito de mudança de lugar do espelho e como
consequência o número de registros durante a varredura é limitado. Como o espelho não pode
ser mudado de -∞ a +∞, a transformada de Fourier é truncada [3].
O espectrômetro utilizado nestes experimentos foi o micro-espectrômetro Varian 610 com a
técnica de reflectância especular. Essa técnica é bastante utilizada para medidas de camadas
monomoleculares em substratos, medidas de filmes finos em substratos refletivos e análise de
materiais massivos. Em geral dispensa prévio preparo das amostras. Ela fundamenta-se na
medida da intensidade da luz infravermelha refletida pela superfı́cie da amostra em determinado
ângulo, conforme mostrado na Fig. 3.10.
No caso de amostras muito espessas ou absorvedoras, I𝑡 será muito atenuado e a luz espalhada
será majoritariamente devido à reflexão especular I0 . Esta aumenta consideravelmente para
valores altos de 𝜃𝑖 e depende também do ı́ndice de refração do material. Então,por conta de
rugosidades na superfı́cie e de não homogeneidade da amostra, podem aparecer artefatos e
distorções nos espectros.
Portanto, a padronização do método de deposição do filme de amostra, a espessura correta
do material a ser empregado são parâmetros chave para a obtenção de espectros adequados,
reprodutı́veis e livres de artefatos, visto que uma má preparação pode levar a rugosidades e
ı́ndices de refração diferentes. As amostras podem ser alı́quotas a serem depositadas numa
lâmina recoberta de ouro, ou substratos de platina (Fig. 3.11), ou ainda material sólido em
pastilha.
Capı́tulo 3. Revisão teórica
28
Figura 3.10: Esquema demonstrando a interação de um raio de luz de intensidade I0 incidente
em um filme sobre um substrato com uma amostra, resultando em parte dele refletido especularmente (I𝑎𝑟 ), parte dele transmitido e refletido (I𝑠𝑟 ) e n é o ı́ndice de refração.
Figura 3.11: Substrato de platina utilizado na obtenção dos espectros, com filmes de amostra.
3.5
Espectroscopia vibracional FT-IR
Desde que a detecção micro-espectroscópica pode distinguir qualitativamente e quantitativamente as diferenças entre as caracterı́sticas espectrais de muitas moléculas, os perfis moleculares
e submoleculares, pesquisas tem utilizado espectroscopia para averiguação de distribuição de
compostos moleculares (lipı́dios, proteı́nas, ácidos nucléicos e carboidratos), para informação de
estrutura quı́mica e histológica de uma única célula em estudos de biologia celular [69, 70], e
para definir e diferenciar tecidos humanos doentes e saudáveis (incontáveis trabalhos [71, 72]).
Também tem sido feito estudos em identificação da natureza de desenvolvimento de colônias,
formação de biofilmes por microorganismos e fermentação microbiológica [73, 74], de caracteri-
Capı́tulo 3. Revisão teórica
29
zação funcional de tecidos de plantas e sementes[75, 76], da interação de implantes com sistemas
biológicos [77, 78], da detecção de abuso e distribuição de drogas em estudo forense [79, 80] e da
medição de taxas de CH2 /CH3 [81].
Métodos, especialmente os estatı́sticos têm tido ampla aplicação à espectroscopia. Alguns
dos métodos de análise de espectroscopia utilizados são por exemplo a análise de componentes
principais (ACP) [82, 69], a análise de função discriminante (AFD) [72], mı́nimos quadrados
parciais (MQP), teste-t [72, 83, 84], regressão logı́stica binária, ou análise discriminante ou
validação cruzada (baseado nos resultados de CP), dendograma e análise de cluster [85, 86],
redes neurais avançadas, redes neurais probabilı́sticas, análise quimiométrica. Também são
utilizadas as deconvoluções [87, 88, 89], a segunda derivada dos espectros [90] e imageamento
espectroscópico [91, 92]. Cada uma dessas análises encontra uma aplicabilidade de acordo com
o que se quer verificar.
3.6
Microscopia de Força Atômica
A Microscopia de Força Atômica (AFM) é a produção de imagens topográficas em escala
nanométrica e micrométrica através de um sistema de interação entre uma sonda ou ponta
com a amostra. Esta interação pode ser de contato ou de não-contato. A ponta fica localizada
na extremidade de um cantilever, feito de material piezoelétrico, ligado ao sistema de detecção
do sinal para produção da imagem. Na figura a seguir é esquematizado o sistema de obtenção
de imagens por AFM.
Neste caso a amostra é varrida enquanto o cantilever fica parado, movendo-se apenas verticalmente. A imagem é formada pela informação da altura que é obtida da luz laser refletida do
cantilever para o foto-detector, e da informação da posição da amostra. A força entre a ponta e
a amostra para pequenas distâncias é dada por [93]:
𝐹 (𝑟) = 12
𝐵
𝐷
−6 7
12
𝑟
𝑟
(3.12)
onde B e D são constantes que dependem do material da ponta e da amostra (como a
distribuição de carga elétrica) e r é a distância entre os átomos da ponta e da amostra. Esta é a
força de interação medida nas imagens de contato, onde a ponta encosta na amostra e portanto o
primeiro termo da equação é repulsivo e é dominante, pois é devido à interação de sobreposição
dos orbitais mais externos dos átomos da ponta e da amostra [94]. As imagens de não contato
Capı́tulo 3. Revisão teórica
30
Figura 3.12: Esquema de AFM, adaptado da referência [5]
são produzidas pela técnica chamada Microscopia de varredura por tunelamento (STM), onde
a ponta não encosta na amostra, mas fica tão perto que existe a probabilidade de tunelamento.
No entanto esta técnica pode somente ser utilizada em amostras condutoras ou semi-condutoras.
Além das imagens é possı́vel construir curvas de distância x força (curvas de força) que podem
fornecer informações sobre elasticidade, dureza, constante de Hamaker, adesão e densidade de
carga da superfı́cie além de uma análise de forças de superfı́cie. A força é medida pelo cantilever,
que por ser piezoelétrico produz uma diferença de potencial quando defletido pela amostra.
O AFM de contato vem sendo utilizado para o estudo de tecidos biológicos, células, organelas
e móléculas porque esta técnica não necessita que a amostra seja condutora. Algumas técnicas
de preparação de amostra têm sido desenvolvidas devido a condição de pouca dureza destas
quando vivas, no entanto, estudos também podem ser feitos de amostras não-vivas e secas.
Um tipo de medida recorrente na literatura é a de propriedades viscoelásticas de células
[94, 95], identificação de estruturas de membrana plasmática envolvidas em exocitose, tensão de
cisalhamento induzida em células endoteliais, propriedades de biomoléculas,
Capı́tulo 4
Materiais e métodos
Células de câncer de mama da linhagem MCF-7 foram previamente cultivadas conforme protocolo preconizado pela ATCC® [96] e então transferidas para placas de cultura em número
que satisfizesse a confluência desejada (vide Apêndice B) com 24 horas de antecedência da exposição à luz de comprimento de onda de 633 nm proveniente de um laser de Hélio-Neônio,
tempo necessário para a aderência das células à placa. Para a exposição à luz foi utilizado um
filtro espacial para uniformização da frente de onda desta e após a exposição única, as células
permaneceram em cultura até decorrido o tempo de adaptação que é o tempo entre a irradiação
e a retirada das amostras para avaliação por FT-IR e contagem. Todas as irradiações foram
precedidas de verificação de uniformidade da frente de onda, da verticalidade dos raios luminosos
incidentes nas células, e de verificação da potência de saı́da do laser e da fenda circular.
Foram realizados experimentos piloto para verificação de quais seriam as condições experimentais ideais da confluência das células, do tamanho do poço e do tempo de retirada das
células, portanto foram testadas duas confluências de 30 e 70%, dois tamanhos de poço de 2 cm2
(placa de 24 poços) e 10 cm2 (placa de 6 poços) e três tempos de retirada das células de 6, 12
e 24 horas. Ao fim desses experimentos determinou-se que a melhor confluência seria de 30%,
pois em 70% as células preencheriam o fundo do poço antes do tempo planejado de 6,5 dias de
experimento, o que poderia causar resultados falsos devido ao excesso de células. Foi escolhido o
tamanho de placa de 6 poços porque com a de 24 não haviam células suficientes para avaliação
decorrido o tempo de adaptação e também porque a fluência era menor do que na placa de 6
poços. O tempo de 12 h se mostrou um bom tempo para avaliação das mudanças celulares por
questões práticas de comparecimento ao laboratório.
Após os experimentos piloto foram realizados os experimentos de cinética, ao longo dos quais
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
32
foi acompanhada a reação das células por 6 dias e meio com retirada das amostras a cada 12
horas para avaliação por espectroscopia FT-IR e microscopia de força atômica e a cada 24 horas
para avaliação de viabilidade celular, os quais foram feitos em quadruplicata (foram utilizados
104 poços por fluência).
Os experimentos de irradiação e verificação da viabilidade celular foram realizados no Laboratório de Processos e Transformações II, L203 Bloco B, e a obtenção dos resultados de espectroscopia e de imagens AFM foi realizada na central multi-usuário da UFABC.
4.1
Parâmetros de irradiação
Na Tab. 4.1 é apresentado um resumo dos parâmetros de irradiação de experimentos piloto, os
quais foram úteis para o aprimoramento do método experimental.
Tabela 4.1: Parâmetros experimentais empregados nos experimentos piloto.
Tempos de
rada (h)
reti-
Teste 1
Teste 2
Teste 3
Teste 4
6; 12; 24
6; 12; 24
12; 24
12; 24
Potências (mW)
0; 5; 10 e 15
0; 5; 10 e 15
0; 4,5; 7,5
0; 5; 7,5; 10 e 15
Densidades
de
potência
(mW/cm2 )
0; 0,32; 0,48 e 0,97
0; 0,32; 0,48 e 0,97
0; 0,064; 0,096
0; 0,064; 0,096; 0,13;
0,20
Área de irradiação
por poço (cm2 )
9,8
9,8
2
2
Fluências
(mJ/cm2 )
0; 19,2; 39,0 e 58,2
0; 19,2; 39,0 e 58,2
0; 3,84; 5,76
0; 3,84; 5,76; 7,8 e
11,63
Tempo de irradiação (min.)
1
1
1
1
Em todos os testes foi adotada a confluência de 70% no momento da irradiação, alı́quotas de
2 𝜇L de amostra para os espectros e substrato de ouro para FT-IR. Um esquema de irradiação
do teste 1 pode ser visto na Fig. 4.1
Na Tab. 4.2 é apresentado um resumo dos parâmetros experimentais empregados nos experimentos finais.
Os parâmetros mais importantes desta tabela são a fluência (também chamada densidade de
energia), pois ela contém a informação de tempo, área e potência (veja Eq. 4.2) e a densidade
de potência (potência por unidade de área), embora se saiba que variando-se a densidade de
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
33
Figura 4.1: Esquema de parâmetros de irradiação em duas placas de seis poços.
Tabela 4.2: Parâmetros experimentais empregados nos experimentos finais.
Exp 5 (quadr.)
Exp 6 (quadr.)
Exp 7 (quadr.)
Tempo de retirada (h)
12
12
12
Potências (mW)
1,3
7,5
15
Densidades de potência
(mW/cm2 )
0,083
0,48
0,97
Área de irradiação por
poço (cm2 )
9,8
9,8
9,8
Fluências (mJ/cm2 )
5
28,8
1000
Tempo
(min.)
1
1
16,5
de
irradiação
potência e o tempo e mantendo-se fluência constante hajam variações nos efeitos celulares neste
trabalho foram utilizados os dados de fluência para as denominações. Para os experimentos da
Tab. 4.2 as células foram retiradas para contagem a cada 24 h, e para FT-IR a cada 12 horas
para o qual foram utilizados substratos de platina (HDs de computador) com alı́quotas de 20 𝜇l.
Os experimentos foram feitos em quadruplicata, ou seja, foram plaqueados 104 poços, 52 para
os controles e 52 para os irradiados com 1,71×105 células à uma confluência de 30%, porém,
durante a lavagem da amostras para remoção do sal algumas amostras foram perdidas, de tal
forma que a estatı́stica dos espectros do grupo irradiado dos experimentos 5 e 7 se refere a n=3.
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
4.2
34
Construção do aparato de irradiação
O objetivo da construção de um aparato de irradiação foi para que a intensidade da luz incidente nas células fosse o mais uniforme possı́vel dentro da área de um poço de uma placa de
cultura de 6 ou de 24 poços, e também que durante a irradiação o sistema estivesse isolado de
luz externa, tudo isso para garantir a reprodutibilidade do experimento. O aparato é formado
por duas caixas de isopor coladas uma à outra (de forma que o caminho óptico do feixe de luz
seja totalmente coberto), em cujo interior foram dispostos os dispositivos ópticos (lentes, fenda
circular, filtro óptico e o espelho defletor) e a irradiação ocorre no interior da caixa. A montagem do filtro espacial que alcançou nossas expectativas, de distribuição uniforme de energia,
é formada de duas lentes plano-convexas de distância focal de 1,5 cm cada, uma fenda circular
de 0,23 mm de diâmetro aproximadamente (Fig. 4.2a), uma lente bi-côncava de distância focal
de aproximadamente 12 cm em cada face. Para que se cumpra a uniformidade, são igualmente
importantes as distâncias entre os dispositivos ópticos. Substituindo-se os valores das distâncias
focais das duas lentes (de distâncias focais f1 e f2 ) plano-convexas na Eq. 4.1, no caso 1,5 cm, e
a distância entre as lentes de 2,1 cm, o resultado é de uma distância focal conjunta de 2,5 cm,
que seria o local correto de posicionamento da fenda circular, no entanto, experimentalmente
foi verificada uma maior uniformidade na distância de 6,5 cm. As medidas de distância foram
feitas a partir dos planos principais das lentes.
1
1
1
𝑑
=
+
−
𝑓
𝑓1 𝑓2 𝑓1 𝑓2
(4.1)
Quando se deseja mudar a intensidade da luz se adiciona um filtro óptico (Fig. 4.2b) de
acordo com a intensidade desejada, a qual é medida com um medidor de potência. Na Fig. 4.3
é mostrado um esquema do arranjo experimental e na 4.4a são mostrados os componentes do
filtro espacial, com as respectivas distâncias utilizadas sendo que o caminho óptico seguido pela
luz é da direita para a esquerda.
A luz passa pelas lentes plano convexas de forma que esta converge aproximadamente para
o lugar onde está posicionada a fenda circular. Neste ponto as frentes de onda apresentam um
padrão de difração em forma de franjas circulares (um exemplo pode ser visto na Fig. 4.2c).
A fenda circular é posicionada neste ponto a fim de deixar passar a franja de potência maior
(central) e barrar as de potências menores (periféricas), assim o padrão de intensidade de luz
resultante será mais homogêneo. A seguir a luz passa pelo filtro óptico, e então, pela lente
bi-côncava cuja função é expandir o feixe de luz para que este abranja a totalidadade de área
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
(a)
35
(b)
(c)
(d)
Figura 4.2: (a) Fotografia de fenda circular obtida em microscópio óptico (aumento de 400
vezes); (b) Filtros ópticos; (c) Franjas de interferência de padrão circular da luz (d) Irradiação
de cultura de células em um dos poços, sem que a luz atinja os demais.
de um poço de cultura. A função do espelho é defletir a luz para o poço sendo que em torno e
em cima da placa de cultura foi utilizada uma capa escura feita de EVA para que esta isolasse
a irradiação incidente em cada poço dos demais que não deviam receber luz (veja Fig. 4.2d).
É importante ressaltar que as medidas apresentadas na Fig. 4.4a não retratam as posições de
maneira exata, pois a cada vez que um experimento foi feito, o filtro precisava ser realinhado,
no entanto, a mudança era muito pequena, e não interferiu significativamente na intensidade de
luz. O alinhamento foi feito manualmente e de forma que as figuras de difração coincidissem
uma sobre as outras.
Foram feitos testes de potência diretamente no feixe de luz do laser para se saber se havia
flutuações de voltagem da rede elétrica, ou mesmo do laser. Para isso foi feito o background (da
luz ambiente), e a seguir foram tomadas medidas de potência da luz do laser a cada minuto por
15 a 20 minutos em diferentes partes do dia. A potência máxima de saı́da medida foi de 24,7 e
a mı́nima de 24,2 mW indicando que houve uma variação de apenas 2%.
Para a verificação da uniformidade da frente de onda utilizou-se o seguinte método. Posicionouse no filtro espacial, no local do espelho, uma folha de papel branco perpendicular ao feixe de luz
sobre o qual este irá incidir. Atrás da folha de papel posicionou-se uma câmera CCD paralela
ao papel e obteve-se uma fotografia deste (vide Fig. 4.4).
A fotografia foi submetida ao software Image J para se obter uma distribuição de intensidade
de luz. A Fig. 4.5a é uma fotografia do feixe de laser perpendicular à folha de papel, na
ausência de filtro espacial, e a Fig. 4.5b é uma distribuição de intensidade do referido feixe.
Pode-se perceber que a intensidade de luz não está distribuı́da de maneira uniforme e sim de
forma gaussiana, e além disso não cobre a área de irradiação de um poço de placa de 6 poços
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
36
Figura 4.3: Esquema da caixa na qual estão inseridos os dispositivos ópticos para irradiação das
células.
(aproximadamente 10 cm2 , sendo que na figura o cı́rculo indica o tamanho aproximado de um
poço de placa de 6 poços em relação ao tamanho do feixe).
Quando se utiliza o filtro espacial para uniformização e expansão do feixe, o resultado é
como mostra a fotografia da Fig. 4.7a (demarcado por um molde do tamanho de um poço de
uma placa de 6 poços), produzindo um gráfico da intensidade radial integrada pelo número de
pixels (no programa Image J, editado no programa Origin Pro 8) como o da Fig. 4.7b a partir
da qual pode-se perceber que o feixe de luz possui frente de onda consideravelmente uniforme,
pois a variação de intensidade do centro para a borda é de 27% para um tamanho de poço
de 10 cm2 . A partir dela foram calculadas no programa Origin Pro 8 as fluências empregadas
utilizando-se os dados de área integrada, número de pixels e áreas dos poços, e a variação de
intensidade foi calculada utilizando-se os dados de número de pixels e áreas dos poços. Para
obtenção das fluências calcula-se a área total sob o gráfico (potência), digamos que seja 15 mW,
a área correspondente ao limite do poço, e através de regra de três simples calcula-se a potência
apenas da área do poço. Digamos que seja 10 mW. Para se descobrir qual é a fluência basta
usar a seguinte equação [11], [97]:
∆𝑡 =
𝐽 ×𝐴
𝑃
(4.2)
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
37
(a) Esquema do aparato experimental de iluminação
(b) Esquema do modo de obtenção das fotografias
Figura 4.4: Esquemas experimentais.
Onde ∆t é o tempo em segundos, J é a fluência em J/cm2 , A é a área em cm2 e P é a
potência em W (1 W = 1 J/s). Digamos que o tempo de exposição é de 60 segundos, a área é
de aproximadamente 10 cm2 e a potência é de 10 mJ/s. A fluência portanto é aproximadamente
de 60 mJ/cm2 , diferindo à de 58,2 mJ/cm2 na Tab. 4.1 apenas devido a algumas aproximações
aqui feitas.
Também foi feito um teste para se verificar a efetividade da capa preta sobre um poço
individual de uma placa de cultura de células e detectar um possı́vel espalhamento de luz sobre
o material da placa que viesse a interferir nas demais culturas durante a irradiação. Para isso, foi
feita uma distribuição radial de fotografias tiradas por trás de um poço com as laterais cobertas
e do feixe de luz sem cobertura (Fig. 4.6) e, conforme se pode perceber, não há espalhamento
significativo para os poços vizinhos em comparação com o não coberto.
Para a irradiação foram utilizados laser He-Ne 633 nm de modo TEM00 Unilaser 08/23796,
E.V.A. para a capa das placas de cultura, duas lentes plano-côncavas de 25,4 mm de diâmetro
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
38
(a) Fotografia feita com c^amera Sony
Cyber-Shot 4.1 MP de feixe de laser
perpendicular à folha de papel
(b) Distribuição da intensidade de luz da fotografia, obtida com o
software Image J
Figura 4.5: Gráfico da intensidade da frente de onda da luz sem utilização de filtro espacial em
número de pixels.
e 150 mm de distância focal, Newport KP×100 PCX Lens BK7 P040858, fenda circular de 0,23
mm de diâmetro que foi feita com objeto pontiagudo em papel alumı́nio preso a um suporte, lente
bi-côncava, filtros ópticos, espelho, caixas de isolamento térmico e luminoso, suportes para lentes
modelo MC New Action VPH Series, para fenda modelo LH-1 M4, e para filtro óptico e espelho
o modelo Mitutoyo 7013B, óculos de proteção para laser, câmeras Digitais CCD Samsung NV8
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
39
Figura 4.6: Teste para verificação de espalhamento de luz sobre a placa de cultura quando
utilizada e não utilizada a capa.
8 MP e Sony Cyber-Shot 4.1 MP, computador para a análise das fotografias, Dell com sistema
operacional Windows Vista e Processador AMD 64 Athlon X2, medidor de potência N1034-2 U.
S. Laser Corp. ou Newport 841-PE e o software Image J (vs. 1.41o, Java 1.6.0 11).
4.3
Obtenção e tratamento dos espectros
A espectroscopia FT-IR foi realizada para se identificar as alterações bioquı́micas relevantes nas
células decorrentes do processo de estı́mulo luminoso através da técnica de reflectância especular.
Para aquisição dos espectros, as células foram desaderidas dos poços, foram lavadas conforme
descrito no Apêndice B, e então o sobrenadante retirado. Do pélete uma alı́quota de 1 (testes 1
a 4) ou 20 𝜇L (experimentos 5 a 7) foi retirada e colocada na lâmina de FT-IR sendo que a de 20
𝜇L foi utilizada devido à melhor qualidade dos espectros. Todas as alı́quotas foram colocadas em
lâmina de ouro ou em substrato de platina adequadamente limpos e podem ter sido liofilizadas à
vácuo à 30 °C por 5 minutos ou secas ao ar livre sendo que o tempo entre a secagem e obtenção
dos espectros foi de 1 a 8 semanas. Após secas as amostras, foi feita uma lavagem com água
ultra pura com o objetivo de que o sal fosse removido, ficando apenas as células depositadas e
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
40
(a) Fotografia feita com c^amera Sony
Cyber-Shot 4.1 MP de feixe de laser
perpendicular a uma folha de papel.
(b) Gráfico da intensidade radial integrada pelo número de pixels.
Figura 4.7: Intensidade da frente de onda da luz com utilização de filtro espacial.
os espectros foram obtidos com mı́nimo ruı́do. Os espectros de absorção pelo número de onda
foram obtidos com resolução espectral de 2 cm−1 , 200 acumulações, em aproximadamente 2
minutos por coleta e com área de escaneamento de 200×200 𝜇m (representado pelo quadrado
central da Fig. 5.3) e foram obtidos 3 espectros por alı́quota.
Os espectros foram submetidos a alguns tratamentos para eliminação de efeitos de preparação
da amostra e devido ao aparelho para facilitação de sua análise. Primeiramente foram subtraı́das as linhas de base com o software FitYK nos três pontos mais inferiores (vide Fig. 4.8) de
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
41
cada espectro, então foram normalizados pela unidade (“normalize to [0,1]”), após foi calculada
a média dos três espectros por amostra, e a seguir as áreas integradas das bandas espectrais, as
quais foram divididas visualmente (não foi feita a deconvolução) (Fig. 4.8). A Normalização, o
cálculo de área e a média dos espectros foram feitos com o software Origin, e um requisito para
a divisão das bandas para cálculo da área é o de que bandas acopladas foram calculadas conjuntamente, como por exemplo, uma banda com um ombro foram deixadas juntas. O esquema
seguido foi o seguinte:
Linha Base→ Normalização→ Média dos espectros→ Área integrada das bandas
Figura 4.8: Espectro representativo, grupo controle em tempo de 36 h. Lb significa espectro
ainda sem subtrair a linha base, slb significa que foi subtraı́da linha base, e slb-norm significa
q foi subtraı́da a linha base e foi normalizado. Os pontos indicam os locais escolhidos para a
subtração da linha base. As linhas indicam a delimitação da banda para cálculo de sua área.
O microespectrômetro utilizado neste trabalho atua na faixa do infravermelho médio (de 400
a 4000 cm−1 , ou de 10 a 40𝜇m) e está equipado com um detector MCT , o qual atua sob intensa
refrigeração mediante N2 lı́quido. A fonte de luz é a lâmpada New High Performance Duraglow™
de cerâmica resfriada a ar. Para a espectroscopia foram utilizados lâmina de ouro ou substrato
de platina (HD de computador) devido à maior disponibilidade sem que ocorresse perda de
Capı́tulo 4. Materiais e métodos
42
informação, espectrômetro 610 Varian associado à microscopia, picetas, água ultrapura e os
softwares FitYK 0.9.2 Copyright (©2001-2010 Marcin Wojdyr) e Origin Pro 8 v8.0724 (B724)
(©1991-2007 Origin Lab Corporation).
4.4
Obtenção de imagens de Microscopia de Força Atômica
As imagens de AFM foram obtidas da mesma fonte que os espectros (do substrato de platina),
pelo modo de contato, com uma resolução de 512 pixels, de 80x80 𝜇m de tamanho, ganho
proporcional (P) de 9% e integral de 4 ou 5% dependendo da amostra, pelo modelo 5500 Atomic
Force Microscope da Agilent Technologies.
4.5
Células e manuseio
Maiores detalhes sobre o manuseio e viabilidade celular podem ser encontrados no Apêndice B.
Capı́tulo 5
Resultados e discussão
A seguir são expostos os resultados das contagens de células, espectroscopia micro FT-IR e
AFM dos experimentos e dos quatro testes feitos. O primeiro teste foi feito para se verificar a
qualidade da contagem, dos espectros, e se haveria alteração destes pela influência de 3 fluências
distintas de luz. Foi feito com 12 amostras, cujos parâmetros são mostrados na Tab. 4.1, e cujo
esquema de irradiação é mostrado na Figura 4.1. Os espectros (mostrados do tempo de 24 h para
exemplificação na Fig. 5.1) apresentaram ampla região ruidosa entre 1400 e 1800 cm−1 , de tal
forma que não se pode interpretá-los com segurança. Além disso, o número de células do grupo
controle não obedeceu a forma esperada de crescimento exponencial com o tempo (Fig. 5.2a),
possivelmente por um erro de manuseio da cultura e/ou contagem.
Em vistas a melhorar a qualidade dos espectros e das contagens um seguinte teste (2) foi feito
com os mesmos parâmetros do primeiro experimento, porém eles continuaram muito ruidosos
(resultados não mostrados). Pensou-se que isso era devido à baixa concentração de células nas
amostras de FT-IR, então as células das amostras da lâmina foram ressuspendidas com 30 𝜇L de
água ultrapura e centrifugadas para que ficassem mais concentradas, novamente depositadas na
lâmina e os espectros refeitos. O resultado foi que o ruı́do diminuiu, mas persistia, no entando,
a contagem de céulas do grupo controle obedeceu ao esperado crescimento exponencial (Fig.
5.2b).
Um terceiro teste foi feito nos parâmentros de irradiação mostrados na Tab. 4.1 Teste 3.
Foram utilizadas placas de 24 poços com o intuito de se economizar material, no entanto com
a diminuição da área ocorre diminuição da potência de luz incidente e por consequência a
diminuição da fluência, segundo a Eq. 4.2, e embora se tenham feito esforços, não se conseguiu
mantê-la a mesma devido a limitações experimentais. Novamente ocorreu muito ruı́do na faixa
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
44
Figura 5.1: Espectros de absorção no tempo de adaptação de 24 h. São mostrados os originais
e com linha de base subtraı́da para fins de comparação.
espectral entre 1400 e 1800 cm−1 e ainda não se sabia exatamente o porquê, no entanto, foram
observados nas amostras ao microscópio do equipamento de FT-IR cristais (Fig. 5.3), os quais
deduziu-se que eram de sal PBS.
Para o quarto teste (Tab. 4.1, teste 4), devido a presença de PBS nos filmes de amostra, foi
feito o background de uma gota de PBS seca depositada sobre a lâmina, ao invés do background
apenas da lâmina e então os espectros apresentaram menos ruı́do do que antes na região de 1400
a 1800 cm−1 , o que demonstrou que este era devido a ao PBS, no entanto os espectros tiveram
alguns artefatos como bandas de CO2 invertidos.
Um dos motivos pelo qual obtivemos resultados um pouco dissonantes entre os testes tanto
nas contagens de células como nos espectros é houve certa dificuldade no cultivo e manuseio
das células MCF-7 pois ainda não havia familiaridade com a metodologia. A partir deles foi
definido o tamanho do poço, o modo de preparação das amostras para FT-IR e a padronização
do protocolo de contagem.
Os parâmetros experimentais da avaliação de cinética são mostrados na Tab. 4.2. Os resul-
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
45
Figura 5.2: Contagens de células do teste 1 (a) cujo controle seguiu a tendência de aumento
crescente e do teste 2 (b) cujo controle não seguiu a tendência de aumento crescente do número
de células, n=1.
Figura 5.3: Cristais de PBS observados em filme de amostra.
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
46
tados das contagens para as três fluências podem ser vistos na Fig. 5.4, onde o grupo controle
apresentou crescimento exponencial, aproximando-se da fase platô na fase final do experimento
(perto de 144 h). Todos os grupos (de células vivas) irradiados apresentaram semelhante número
de células ao controle até o tempo de 48 horas, distinguindo-se dele após esse tempo sendo que o
grupo que foi irradiado com a dose de 5 mJ/cm2 apresentou quantidades de células estatisticamente inferiores, aumentando no tempo de 144 horas em relação ao grupo controle possivelmente
devido a um erro na contagem de células, o grupo de 28,8 mJ/cm2 permaneceu no mesmo nı́vel
que o controle, decaindo no tempo de 120 horas e igualando-se novamente após, e no grupo de
1 J/cm2 houve aumento em relação ao controle após 48 horas, um decaimento no tempo de 120
horas e subsequente aumento. Essas pequenas variações no tempo de 120 horas podem dever-se
à troca de meio neste mesmo tempo e a discrepância do controle em relação ao irradiado de 5
mJ/cm2 no tempo de 144 h deve-se a um erro de contagem.
Figura 5.4: Número de células totais (vivas mais mortas) e vivas com barras de erro padrão da
média para n=4 para todas as três fluências.
Devido a não terem apresentado uma bioinibição ou bioestimulação as células do grupo de
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
47
28,8 mJ/cm2 foram submetidas a imageamento de AFM para verificação de possı́veis mudanças
topográficas nas células irradiadas em relação ao controle e a partir das imagens foram obtidas
informações sobre o tamanho das células. Na Fig. 5.5a têm-se o diâmetro de Feret1 médio, a
área média (Fig. 5.5b) e a intensidade integrada média (Fig. 5.5c) onde se pode perceber que
as três medidas permaneceram aproximadamente constantes até 84 h, com uma tendência de
diminuição após este tempo, tanto para o grupo controle quanto para o irradiado, o que pode
ser tanto por causa da diminuição do espaço como do alimento ao longo do tempo.
Quanto ao diâmetro de Feret foram observadas distinções estatı́sticas entre os grupos controle
e irradiado especificamente em 96 h, 108 h e 144 h, para a área média em 96-120 h e 144 h e para
a densidade integrada em 96-120 h, 144 h e 156 h. Visulamente não foram observadas variações
topográficas entre as células dos grupos controle e irradiado (como um exemplo veja a Fig. 5.6).
Os espectros médios do perı́metro de fingerprint podem ser vistos na Fig. 5.7, os quais em
geral se apresentaram muito homogêneos, e diferenças visı́veis entre as bandas em cada tempo
não podem ser percebidas. Cada banda corresponde a vibrações caracterı́sticas de ligações,
grupamentos ou moléculas presentes nas células e foram obtidos em nossos resultados vibrações
correspondentes a vários componentes celulares como DNA, RNA, nucleotı́deos, fosfato, aminoácidos, amida e grupo metil, conforme detalhado na Tab. 5.1.
Tabela 5.1: Números de onda e correspondentes vibrações moleculares.
Banda
N° de onda (cm−1 )
1
938-993
C-O e C-C de desoxirribose e C-C de ribose, e fosfato de
ácidos nucléicos
2
1008 a 1144
(Ombro à direita) indica um grau de dano oxidativo ao
DNA; C-O-C de ácidos nucléicos e fosfolipı́dios; Fosfato, que
pode ou não ser de ácidos nucléicos; (Ombro à esquerda) de
RNA
3
1143 a 1187
C-OH de Serina, treonina, tirosina
4, 5, 6
1190 a 1268
Fosfato de ácidos nucléicos
7,8
1272 a 1330
Amida III, colágeno e N-H de citosina e timina
9, 10
1360 a 1480
Vibrações de CH3 (grupo metil)
Principais vibrações moleculares
As áreas são diretamente proporcionais à intesidade das bandas e portanto à quantidade de
1
A dist^
acia projetada mais longa entre dois pontos quaisquer dentro do limite de seleção de um objeto [98].
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
48
Figura 5.5: De cima para baixo ângulo de Feret médio, área média e densidade integrada média,
cálculo feito com em média 10 células por tempo com barras de erro padrão da média.
material na célula, e serão chamadas aqui de intensidade da banda.
Nas Figuras 5.8, 5.9 e 5.10 tem-se os gráficos das áreas das bandas calculadas pelo tempo,
onde os gráficos na horizontal correspondem à mesma banda, e na verical correspondem à mesma
fluência. As áreas foram normalizadas pela área do tempo inicial (de 12 horas) para comparação
das mudanças com o tempo.
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
49
Figura 5.6: Imagens de AFM com resolução de 512 px, do tempo de 36 h (a) controle e (b)
irradiado e 144 h (c) controle e (d) irradiado de irradiação de 28,8 mJ/cm2 .
Pode-se verificar a variação dos grupos controle ocorreu em “zigue-zague”, o que pode ser um
reflexo do ciclo celular da célula, tendo-se em vista que o material nuclear é duplicado na fase
S do ciclo, é razoável dizer que quando existe um ponto máximo no gráfico, este corresponde
à fase S do ciclo e quando existe um mı́nimo, este corresponde à fase G0 . Isto também está
de acordo com o tempo de duplicação médio da MCF-7 que é em média de 29 horas. Maiores
detalhes sobre os tempos em que as bandas dos grupos irradiados tiveram diferenças estatı́sticas
em relação aos controles podem ser vistos na Tab. 5.2.
A seguir uma discussão discriminada por fluência de luz aplicada.
5 mJ/cm2
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
50
Figura 5.7: Box plot de todos os espectros (controles e irradiados, todos os tempos) de 28,8
mJ/cm2 cuja linha preta representa o espectro médio. Não foram verificados ruı́dos nem diferenças visı́veis entre as bandas.
Tabela 5.2: Tempos em que houve diferença estatı́stica entre a intensidade da banda da amostra
irradiada em relação ao controle.
Banda
5 mJ/cm2
28,8 mJ/cm2
1 J/cm2
1
24, 36, 48, 72, 84, 96, 108
Todos exceto 132
24, 36, 48, 72, 84, 96, 132
2
24, 72
Todos
24, 72, 84, 96, 156
3
24, 72, 156
Todos
24, 60, 72, 84, 96, 132, 156
4
72, 156
Todos exceto 132
24, 84, 96, 132, 156
5
72, 156
Todos exceto 84, 120, 132
24, 84, 96, 132, 156
6
24, 72, 156
48, 72, 96, 144, 156
24, 72, 84, 96, 132, 156
7
72
96
84, 96, 132, 156
8
72
Nenhum
84, 96
9
120
Nenhum
48
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
51
Figura 5.8: Gráficos das áreas das bandas 1, 2 e 3 dos espectros de amostras controle e irradiadas
com 5, 28,8 e 1 J/cm2 normalizados pela área do tempo de 12 h com barras de erro padrão da
média para n=4 (28,8 mJ/cm2 ) e n=3 (5 mJ/cm2 e 1 J/cm2 ).
Para uma fluência de 5,6 mJ/cm2 , intensidade de 0,6 mW/cm2 e 𝜆 = 632.8 nm foi encontrado
na literatura um resultado de aumento na concentração intracelular de [Ca+2 ]𝑖 nos primeiros
minutos depois da irradiação com laser em linfócitos [99]. Também foi verificado um máximo na
taxa sı́ntese de sı́ntese de RNA, bem como variações conformacionais da cromatina entre 2 e 5
horas após o tratamento, porém, apesar disto, os linfócitos não entraram na fase S e não houve
proliferação com relação ao grupo controle. Em nossos resultados para essa fluência e 𝜆 em células
MCF-7 foi verificado uma bioinibição celular, ou seja, diminuição da multiplicação de células em
relação ao grupo controle, o que foi correspondido ao resultado de espectroscopia, nas bandas de
ribose e desoxirribose, que são componentes do DNA, onde estas permaneceram em intensidades
inferiores às do grupo controle. Também não houve aumento do metabolismo celular, pelo
contrario, pelos resultados das demais bandas, que apresentaram intensidades inferiores ao grupo
controle, houve diminuição do metabolismo celular, cuja via supostamente foi um aumento na
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
52
Figura 5.9: Gráficos das áreas das bandas 4, 5 e 6 dos espectros de amostras controle e irradiadas
com 5, 28,8 e 1 J/cm2 normalizados pela área do tempo de 12 h com barras de erro padrão da
média para n=4 (28,8 mJ/cm2 ) e n=3 ( 5mJ/cm2 e 1 J/cm2 ).
produção de ROS na mitocôndria, o qual inibiu a respiração mitocondrial, levando por meio
de um caminho direto ao núcleo (sem a nessecidade de agentes de sinalização do núcleo) à
diminuição da expressão gênica (Fig. 5.11a). Como foi visto, existe uma diferença entre o
resultado da literatura, o que pode ser devido às diferenças de tipo celular, nas fluências, no
tempo de irradiação ou na densidade de potência.
28,8 mJ/cm2
Na literatura não foi encontrado nenhum resultado com a aplicação de luz de fluência e
comprimento de onda parecidos com esta. Para esta fluência não houveram diferenças estatı́sticas
no número de células entre os grupos controle e o irradiado, resultado não correspondido ao
de espectroscopia onde houve um aumento nas bandas de desoxirribose (banda 1), fosfato (2),
serina, treonina e tirosina (3) e de fosfato de ácidos nucléicos (4, 5 e 6) os quais foram requisitados
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
53
Figura 5.10: Gráficos das áreas das bandas 7, 8 e 9 dos espectros de amostras controle e irradiadas
com 5, 28,8 e 1 J/cm2 normalizados pela área do tempo de 12 h com barras de erro padrão da
média para n=4 (28,8 mJ/cm2 ) e n=3 (5 mJ/cm2 e 1 J/cm2 ).
pelas células para outros propósitos que não a proliferação celular. Nossa suposição é que a
banda de fosfato aumenta como um resultado de sı́ntese de ATP, a qual desencadeia produção
de enzimas e outros metabólitos, demonstrados pela banda 3 de serina, treonina e tirosina que
são importantes aminoácidos. Portanto, uma proposta de mecanismo de atuação para esta
fluência é a que não involve o caminho dos agentes de sinalização do núcleo, ou seja NF𝜅B e
AP-1 (figura 5.11b) e que por isso não influenciou na proliferação celular.
1 J/cm2
Com relação à fluência de 1 J/cm2 foi encontrado um resultado de efeito de proliferação
em células A2058 de melanoma humano irradiados com laser He-Ne 633 nm, que em relação ao
grupo não irradiado houve aumento de ATP intracelular [100], de potencial mitocondral ∆Ψ𝑚 , de
cAMP, e expressão da atividade de AP-1. Nossos resultados, embora com tipo celular diferente,
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
54
também apresentaram proliferação celular, correspondido pelo resultado de espectroscopia da
banda 1 de desoxirribose, cuja intensidade aumentou no grupo irradiado em relação ao grupo
controle, porém também pode-se deduzir que houve um aumento de metabolismo celular devido
ao aumento da banda de fosfato (banda 2), possivelmente devido ao aumento de ATP como
para a fluência de 28,8 mJ/cm2 , a qual foi superior ao controle em alguns tempos (24, 72, 84,
96 e 156 h). Portanto uma proposta para esta fluência é a que inclui caminhos de sinalização
via agentes de sinalização do núcleo NF𝜅B e AP-1 (Fig. 5.11c), devido à proliferação observada.
Neste caso, os resultados foram parecidos aos da literatura, provavelmente porque o tipo celular
é semelhante.
(a)
(b)
(c)
Figura 5.11: Suposições para os caminhos celulares envolvidos após a irradiação das células com
(a) 5 mJ/cm2 , (b) 28,8 mJ/cm2 e (c) 1 J/cm2 .
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
5.1
55
Conclusões
A luz de fato influenciou o comportamento celular em certa escala dependente da fluência e
por um perı́odo de tempo de até 6,5 dias, supostamente em cada uma das fluências ocorreram
mecanismos de sinalização diferentes.
- Para a fluência de 5 mJ/cm2 houve uma bioinibição e diminuição do metabolismo celular,
ocorrido supostamente por uma produção de ROS o qual provocou uma inibição da respiração
mitocondrial, responsável pela diminuição do metabolismo e expressão gênica.
- Para a fluência de 28,8 mJ/cm2 não houve proliferação, porém houve um aumento do
metabolismo celular, o qual foi relacionado com um mecanismo de ação retrógrado independente
de certos agentes sinalizadores do núcleo.
- Para a fluência de 1 J/cm2 houve uma bioestimulação celular com um aumento do metabolismo
celular, o qual foi relacionado com um mecanismo de ação dependente de agentes sinalizadores
do núcleo.
- A partir de nossos resultados pode-se definir como sendo de baixa intensidade uma fluência
utilizada de até 1J/cm2 com um tempo de irradiação de 16,5 minutos, pois com esses parâmetros
ainda não são observados efeitos drásticos no comportamento celular em termos de proliferação
e morte.
- Esta é uma área onde existe muito a ser descoberto pois quaisquer parâmetros de irradiação
que são alterados resultam em uma resposta celular diferente.
Capı́tulo 5. Resultados e discussão
5.2
56
Perspectivas
Como continuidade a este trabalho serão obtidas medidas de AFM para as demais fluências
(5 mJ/cm2 e 1 J/cm2 ), para verificação de possı́veis variações topográficas e do tamanho das
células. Nesta área existe uma grande demanda por pesquisas variando-se parâmetros como
comprimento de onda, densidade de potência, tempo de exposição e tipo celular estudado, além
disso, também seria interessante um estudo com células não neoplásicas para comparação com
as neoplásicas e verificação dos mecanismos bioquı́micos que permeiam a interação da luz com
estas. Será dada continuidade nesta linha de pesquisa durante o doutorado com a construção
de um sistema SERDS, Shifted Excitation Raman Difference Spectroscopy, ou raman diferencial,
para análise das modificações bioquı́micas via espectroscopia raman.
5.3
Publicações e Trabalhos apresentados
Apresentação oral no Congresso de Fı́sica Aplicado à Medicina (CONFIAM), Botucatu, SP,
2009. Apresentação de painel no International Workshop on Spectroscopy for Biology (IWSB),
São Sebastião, SP, 2010. Artigo submetido ao Proceedings da International Society for Optical
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Apêndice A
Definições
Fototerapia é um termo comumente utilizado quando se refere à utilização de luz visı́vel ou
próxima do visı́vel para tratamento de doenças [96] sem restrição com relação ao tipo de fonte
de luz. No entanto, existem algumas vantagens em se utilizar uma fonte de luz do tipo coerente
(laser), como o fato de ser monocromática e também de possuir melhor acesso às lesões através
de fibra ótica. Atualmente o laser tem tido cada vez mais aplicabilidade tanto para diagnóstico
como para tratamento de doenças [8].
Os benefı́cios da utilização do laser são classificados de acordo com o tipo de laser utilizado
(quanto à intensidade). Lasers de baixa intensidade (menor que 1 Watt, com variação de temperatura de 1°C) induzem efeitos fotofı́sico-quı́micos (ação em receptores ou aceptores celulares).
Eles podem ser utilizados tanto em diagnóstico (biópsia óptica) como em tratamento (terapia
fotodinâmica (TFD ) e biomodulação (Terapia a Laser de Baixa Intensidade - TLBI)) [8].
Lasers de alta intensidade (maior que 1 Watt) são mais usados para cirurgias, portanto são
também chamados de lasers cirúrgicos, e seus efeitos são fototérmicos (coagulação, carbonização e vaporização), fotomecanicoacústicos (corta com precisão), fotoablativos (destruir para
disrupção) e fotoionizantes (quebra ligação quaternária do DNA) [8].
Os tratamentos de TLBI e TFD possuem em comum a necessidade de irradiação com luz, no
entanto, a diferença entre eles é que o primeiro é realizado na presença de fotoaceptores nativos,
pré-existentes dentro da célula (fotoaceptor endógeno), e o segundo ocorre na presença de um
fotoaceptor que é colocado no local da lesão (ou na cultura de células, e também é chamado de
fotoaceptor exógeno, ou simplesmente de fotossensibilizador) e para indução de morte celular
deve ocorrer na presença de oxigênio molecular [8].
Algumas importantes variáveis com relação à irradiação listadas a seguir [101].
Apêndice A. Definições
69
1. O comprimento de onda (𝜆).
2. A densidade de potência (também chamada de irradiância ou intensidade).
3. A densidade de energia (também chamada de fluência ou dose), que é o produto da intensidade de luz pelo tempo de exposição.
4. Energia total sobre a área tratada.
5. Potência de saı́da do laser.
6. Tempo de irradiação.
7. Spot (área) da saı́da de luz do laser.
8. Tipo de emissão: contı́nua ou pulsada.
9. Tipo de célula a ser estudada.
10. Concentração de fotossensibilizador adicionado (somente no caso de TFD).
Apesar de ser denomidada de baixa intensidade, a TLBI pode ser de alta ou baixa fluência,
o que depende do tempo de exposição à luz e da potência do laser. Quanto maior a exposição
ao laser e maior sua potência, maior também será a fluência de luz empregada no tratamento.
A designação de alta ou baixa fluência não é clara [29]. Refere-se à alta fluência de irradiação
quando uma inibição de viabilidade celular óbvia é observada [14], de forma a se distinguir o
efeito de proliferação devido à baixa fluência, que tem sido reportado [102]. Alguns autores se
refrem à baixa fluência como sendo uma densidade de energia menor que 1 J/cm2 e alta fluência
sendo maior que 1 J/cm2 [8], outra referência, por exemplo, considera de baixa fluência uma
dose entre 10−2 e 102 J/cm2 [103].
Algumas outras nomenclaturas para a TLBI podem eventualmente ser encontradas na literatura, tais como: Laser de baixa intensidade de potência (LBIP); Low Level Laser Therapy
(LLLT); Laserterapia ou Lasertherapy; Fotobiomodulação; Low Power Laser ; Medical Laser
Therapy e também Low Intensity Laser Therapy [8].
Alguns exemplos de aplicações de TLBI são em reparação tecidual com diminuição do tempo
de cicatrização, aceleração do tempo de inflamação, aumento da sı́ntese de colágeno [23], melhoramentos em lesões esportivas e sindrome do túnel de carpo, redução de dor em artrite e
neuropatia e melhoria em danos de ataques do coração, golpes, lesões em nervos e toxicidade da
retina [24]. A TLBI é clinicamente utilizada principalmente nas áreas de dermatologia, saúde
bucal e fisioterapia.
Apêndice A. Definições
70
A TFD, por induzir morte celular, é utilizada em tratamentos de neoplasias tais como carcinoma brônquico, neoplasias de reto, bexiga estômago, esôfago, palato, laringe, pálpebra, pele,
dentre outros. É uma modalidade de tratamento local do câncer aplicada geralmente a pacientes com pequenos cânceres inoperáveis e refratários às técnicas convencionais de tratamento
(radioterapia e quimioterapia). Neste contexto, uma das grandes vantagens para os pacientes
que recebem TFD é a eliminação dos efeitos colaterais desagradáveis da quimioterapia e da radioterapia que podem provocar enjôos, vômitos e queimaduras na pele [104, 105]. Muitas vezes
se elimina a necessidade de cirurgia, não sendo necessária também a aplicação de anestesia.
Alem disto a TFD possui um aspecto estético importante para a qualidade de vida paciente: ela
induz a regeneração do tecido da pele, deixando cicatrizes leves; previne o afundamento do local
tratado e a perda de cartilagem.
Apêndice B
Manuseio das células
B.1
Plaqueamento de células
As células MCF-7 foram compradas da ATCC. Antes de serem plaqueadas elas ficam dentro
de grandes garrafas de cultivo e em processo de multiplicação. O plaqueamento é a colocação
destas células nas placas com poços, com números iguais de células em cada poço, de forma é
garantida a reprodutibilidade do experimento. A quantidade de células é pré-determinada para
cada confluência, por exemplo, para uma confluência desejada de 60 a 70% é necessário 4×104
células por cm2 , sendo que a confluência é a porcentagem de células que cobre a placa, a olho
vivo. Quando as células são desaderidas da garrafa e depois se readerem nos poços, todas as
células iniciam a mesma fase celular G0 [106], assim é garantido que durante o experimento pelo
menos a maioria delas estarão na mesma fase do ciclo celular. O processo de plaqueamento é
descrito a seguir.
O meio (RPMI-1640, vide composição na Tab. B.1 ) é retirado e colocado em tubo Falcon. É
colocada uma solução de tripsina mais PBS a uma concentração de 1:5 na garrafa onde as células
estão em uma alta confluência (a tripsina serve para desaderi-las) em quantidade suficiente para
cobrir as células. Depois a garrafa é colocada na estufa por 4 minutos, tempo necessário para
que as células desadiram, então são novamente colocadas no meio que antes foi retirado com a
tripsina e o PBS. São centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos, o sobrenadante é descartado e
adicionados 10 ml de meio (dependendo do tamanho do pélete pode ser um pouco a mais ou a
menos). A mistura de células e meio é homogeneizada e as células são contadas no microscópio
óptico com aumento de 400 vezes em câmara de neubauer, a média dos campos é multiplicada
pelo volume da câmara e pelo volume de diluição.
Apêndice B. Manuseio das células
72
Tabela B.1: Composição do meio RPMI - 1640 [6].
Sais Inorgânicos (mg/L)
Ca(NO3 )2 .4𝐻2 O (100), KCL (400), MgSO4 .7𝐻2 𝑂 (100),
NaCl (6000) NaHCO3 (800), 𝑁 𝑎2 𝐻𝑃 𝑂4 (2000)
Aminoácidos (mg/L)
L-cistina (50), L-ácidoglutâmico (20), L-glutamina (300),
glicina (10), L-arginina.HCL (200), L-histidina.HCL.H2 O
(15), L-asparigina.H2 O (50), L-hidroxiprolina (20), Lácido, aspártico (20), L-isoleucina (50), L-leucina (50),
L-lisina.HCL (40), L-metionina (15), L-fenilalanina (15)
L-triptofano (5), L-prolina (20), L-tirosina (28), L-serina
(30), L-valina (20), L-treonina (20)
Vitaminas (mg/L)
biotina (0,2), pantotenato de cálcio (0,250), cloreto de colina (3), ácido fólico (1), inositol (35), nicotinamida (1),
ácido p-aminobenzóico (1), piridoxina.HCL (1) riboflavina (0,2) tiamina.HCL (1), vitamina B12 (0,005)
Outros componentes (mg/L)
glicose (2000), glutatione (1), vermelho de fenol (5)
Digamos que foram contadas 84×105 células em 10 ml de meio (células mais meio). Em
uma placa de 24 poços, cada poço possui 2cm2 de área. Para uma confluência de 60 a 70 % são
necessárias 192×104 células ao total para a placa. Independente do número de células, em cada
poço devem ser colocados 500 𝜇l de solução total (composta por 90% de meio mais 10% de soro
e células), no caso de placa de 6 poços são 2 ml por poço, ou seja, em 24 poços são necessários
24×500 𝜇l que são 12 ml de solução total. Sabendo-se que em 12 ml deve-se ter 192×104 células,
para se saber a quantidade da solução de células mais meio necessária, se utiliza a seguinte
equação:
𝑐1 𝑣1 = 𝑐2 𝑣2
(B.1)
Onde c1 é igual a 192×104 células, v1 é igual a 12 ml, c2 é igual a 84×105 e v2 se quer
descobrir. É encontrado como sendo 2,74 ml o volume de solução necessária.
No entanto, dos 12 ml de solução total sabe-se que 10,8 ml (90%) devem ser de meio e 1,2 ml
(10%) devem ser de soro, portanto, àqueles 2,74 ml que são de meio mais células são adicionados
1,2 ml de soro e o resto é completado com meio (8,06 ml). Assim, tem-se os 12 ml necessários
Apêndice B. Manuseio das células
73
para a placa de 24 poços com a quantidade de células necessária para a confluência de 60 a 70%.
O mesmo procedimento é feito quando se necessita uma confuência de 30%, porém a quantidade
de células necessária é de 1,71×104 células por cm2 .
B.2
Contagem de células
A contagem de células foi feita para se diferenciar o quanto de células estava viva (viável) e o
quanto estava morta. Foi feita com o teste de viabilidade celular pela técnica de exclusão do
azul de tripano. Esse teste é baseado no princı́pio de que as células vivas possuem membranas
celulares intactas nas quais o corante não pode entrar, e que células mortas possuem algum
rompimento pelo qual o corante entra e torna seus citoplasmas azuis. A contagem também foi
feita para se verificar se haviam diferenças entre o número de células do grupo irradiado em
relação ao grupo controle.
Para a contagem foi utilizado o protocolo do laboratório, a saber. Em fluxo, o meio do
poço a ser contado é colocado em um tubo Falcon, depois lava-se as células com PBS-EDTA
autoclavado, adiciona-se 200 𝜇l (em placa de 24 poços ou 1 ml em placa de 6 poços) de solução
de tripsina 1:4 PBS-EDTA autoclavado, deixando-as em estufa a 37°C por 4 minutos. Deve-se
retirá-las da estufa e colocá-las no tubo com o meio que foi retirado anteriormente para que este
inative a tripsina. Então centrifuga-se a 2.000 rpm por 3 minutos, descarta-se o sobrenadante
e faz-se a lavagem das células com 1 ml de PBS não autoclavado uma vez (a lavagem consiste
em adicionar PBS, centrifugar e descartar o sobrenadante). Após isso, adiciona-se 100 𝜇l de
PBS para diluir as células (dependendo do tamanho do pélete, dilui-se em maior volume de
PBS). Homogeiniza-se, retira-se uma alı́quota de 20 𝜇l e esta é adicionada a uma solução de
Azul de Tripano (100 𝜇l de Azul de Tripano e 80 𝜇l de PBS). A seguir, conta-se em câmara de
Neubauer as vivas (incolores) e as mortas(azuis). É contado cada quadrante e feita uma média
das contagens a qual é multiplicada pelo volume da câmara (×104 ) e pelo volume de diluição de
PBS utilizado.
Para a cultura e teste de viabilidade das células foram utilizados capela de fluxo laminar Trox
Technic, placas de 6 poços BD Falcon Poliestireno de área de crescimento de aproximadamente
10 cm2 , placas de 24 poços BD Falcon Poliestireno de área de crescimento de aproximadamente
2 cm2 , meio para cultura de células Sigma, pipetas Pipetman/Gilson CE, estufa Thermo Fisher
Scientific Hepa Class 100, tripsina Sigma, solução tampão Phosphate buffered saline (PBS)
composto de cloreto de sódio (NaCl), fosfato de sódio (NaHPO4 ), fosfato de sódio monobásico
(NaH2 PO4 ), todos Sigma, e água ultrapura, microscópio óptico invertido com aumento de 400
Apêndice B. Manuseio das células
74
vezes Olympus IX71, câmara de Neubauer New Optik, tubo Eppendorfe (ou “tubo plástico de 1
e meio”), tubo Falcon (ou “tubo plástico de 15”), centrı́fuga Eppendorf Centrifuge 5810 R, azul
de Tripano Sigma.
Apêndice C
Ciclo celular
O ciclo celular tem como divisão padrão quatro fases, Mitose (M), Gap 1 (G1), Sı́ntese (S), Gap
2 (G2), o qual decorre tempos diferentes para cada tipo celular (Fig. C.1) . Gap 1 é o intervalo
entre o fim da mitose e o começo da sı́ntese de DNA, onde a célula monitora o ambiente e seu
próprio tamanho para então decidir se fará a duplicação do DNA. Caso sim, a célula duplica
seu material nuclear, a qual é chamada fase de sı́ntese, e então ocorre um novo intervalo onde
a célula se assegura que a replicação do DNA estava completa e reparação de possı́veis erros
que é chamado Gap 2. Por fim a célula completa seu ciclo com a formação dos cromossomos e
duplicação celular, chamada fase M [107]. Quando se trata de uma cultura de células plaqueada
em pequena concentração, a contagem nos estágios iniciais segue uma tendência de crescimento
contı́nuo chamada fase log, até atingir um máximo e estagnar, chamada de fase platô.
Figura C.1: Dois esquemas de ciclo celular.
Apêndice D
Mecanismos de morte celular
Atualmente existem várias propostas de caminhos de morte celular. As mais comuns são a
apoptose (dependente de caspases) e a necrose [108]. A necrose é resultado de altos nı́veis de
danos celulares onde a integridade da membrana plasmática é perdida e a partir da qual são
disparados processos de inflamação e lise celular, com conseqüente extravasamento de material
intracelular no meio extracelular [109] e é visto como um processo acidental [108]. Apoptose
é a morte fisiológica da célula, um processo normal e essencial de controle do desenvolvimento
do tecido. É um suicı́dio regulado, controlado por processos intra e extra-celulares seguindo em
uma seqüência de mudanças morfológicas e bioquı́micas, e terminando na morte programada
da célula [109]. É dependente de algumas proteases conhecidas como caspases, as quais quando
ativadas reagem em cascata. Dentre os alvos celulares no processo de apoptose, a mitocôndria
é a organela central neste processo. Os sinais dos receptores de morte celular ou dos sı́tios
danificados convergem para a mitocôndria, permeando suas membranas e dissipando o potencial
interno transmembranal [110, 111].
Todos os tipos de morte celular programada envolvem caminhos extremamente complexos e
até agora não completamente desvendados. Como exemplo, a apoptose mediada por caspases
possui vários caminhos diferentes de ocorrência [112, 113, 114, 115] e mesmo a quantidade
de ocorrências ou a expressão de proteı́nas especı́ficas de apoptose pode variar em uma mesma
linhagem de células advindas de diferentes laboratórios [113]. Além disso, existem outros tipos de
morte celular programada independente de caspases atualmente aceitas, porém, menos comuns,
como a autofagia, a paraptose, e a catástrofe mitótica, que são caminhos importantes quando
as rotas mediadas por caspase falham, mas podem também ser desencadeadas em resposta a
agentes citotóxicos ou outros estı́mulos de morte [108].