VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Dra. Adriane Medeiros Nunes
Laboratório de Metrologia Química
Departamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel
Pelotas, 26 de Outubro 2010
Introdução
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas
está sendo cada vez mais exigida e reconhecida. Através da sua:
Comparabilidade
Rastreabilidade
Confiabilidade
Resultados Analíticos não confiáveis podem conduzir:
Decisões desastrosas
Prejuízos financeiros irreparáveis
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Introdução
Para garantir que um novo método analítico gere
informações
Confiáveis
Interpretáveis
Sobre a amostra
Ele deve sofrer uma avaliação denominada
validação
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Conceitos do processo de validação
Vários autores definem validação de métodos
conceitos estão em
continua evolução
Algumas definições podem ser transcritas:
-“A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às
exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados”
(ANVISA).
- “Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o método
sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicação
requer” (ISO/IEC 17025).
- “A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro,
sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma evidência
documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para fazer” (USP).
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Validação de métodos
Dentro do âmbito geral do termo validação de métodos é possível
distinguir dois tipos:
- Validação no laboratório (“in house validation”)
Consiste das etapas de validação dentro de um único laboratório, seja para
validar um método novo que tenha sido desenvolvido ou para verificar
que um método adotado está bem aplicado.
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Validação de métodos
- Validação completa
Envolve todas as características de desempenho e um ESTUDO
INTERLABORATORIAL.
Utilizado para verificar como a metodologia se
comporta com uma determinada matriz em
vários laboratórios
-Estabelecendo a reprodutibilidade da metodologia
- Incerteza expandida associada à metodologia como um todo
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Legislação
No Brasil, existem duas agências credenciadoras para verificar a
competência de laboratórios de ensaios:
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Industrial.
Disponibilizam guias para o procedimento de validação de métodos analíticos
Resoluções: são documentos com poder de lei, que devem ser obedecidos.
Guias: são documentos que sugerem uma linha a ser seguida e são, portanto,
abertos para interpretação: “recomendações”.
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Parâmetros analíticos para validação de métodos
- Parâmetros de desempenho analítico
- Características de desempenho
- Parâmetros de mérito
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1- Seletividade ou Especificidade
Uma amostra, de maneira geral, consiste:
Amostra
- Analitos a serem medidos;
- Matriz;
- Outros componentes.
(que podem ter algum efeito na medição)
 Um método que produz resposta para apenas um analito é chamado de
específico.
Um método que produz resposta para vários analitos, mas que pode
distinguir a resposta do analito da de outros, é chamado seletivo.
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Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade
relativa de matriz pode diminuir
HG AAS
Consiste na formação de hidretos voláteis a partir do elemento em
solução ácida na presença de um agente redutor adequado
Tabela 1- Propriedades de alguns Hidretos empregados para AAS
Hidreto
Ponto de Fusão
(°C)
AsH3
- 116,3
Ponto de Ebulição
(°C)
- 62,4
Solubilidade em H2O
(µg.ml-1)
696
GeH4
- 164,8
- 88,1
insolúvel
SbH3
- 88
- 18,4
4100
SeH2
- 65,7
- 41,3
37700-68000
10
1- Seletividade ou Especificidade
Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade
relativa de matriz pode diminuir
Hidreto + Ar + H2 +
traços de O2
Fig. 1- Sistema de Geração de Hidretos em batelada (adaptado de Welz & Melcher,1983)
11
2- Linearidade e Faixa de aplicação
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, dentro de
uma determinada faixa de concentração.
 A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta
medida e a concentração do analito;
 A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como
expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser
determinado na amostra real.
Curva de
Calibração
12
Regressão linear
y = ax + b
y = resposta medida (absorvância, altura ou área do pico, etc.);
x = concentração;
a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x=0.
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Coeficiente de correlação linear (r):
-indica o quanto pode ser considerada adequada a reta como
modelo matemático.
-> 0,90 é ideal.
-Qualidade da curva obtida: quanto mais próximo de 1, menor a
dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza
dos coeficientes de regressão estimados.
14
3- Limite de Detecção (LD)
O LD representa a menor concentração de analito que pode ser detectada,
mas
não
necessariamente
quantificada,
utilizando
um
determinado
procedimento experimental.
menor concentração de analito na
amostra que produz um sinal que pode
ser distinguido do sinal do branco,
dentro de certo critério estatístico.
3s B
LOD =
a
sendo “a” a inclinação da curva de calibração e “s” o desvio-padrão de
10 medidas do branco.
15
4 - Limite de Quantificação
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser
determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas.
10s B
LOD =
a
sendo “a” a inclinação da curva analítica “s” o desvio-padrão de 10
medidas do branco.
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5- Precisão e Exatidão
São dois termos muito importante em química analítica.
Precisão é uma medida da reprodutibilidade de um resultado.
Ex. se uma grandeza for medida várias vezes e os valores forem muito próximos uns
dos outros, a medida é precisa.
Exatidão se refere a quão próximo um valor de uma medida está do “valor real”.
Ex. se um padrão conhecido estiver disponível (Material de referência), a exatidão é
o quão próximo o valor determinado está do valor padrão.
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Precisão e Exatidão
Um dado constituinte em um mesmo material é determinado por três
métodos diferentes, (a), (b), e (c), onde foram feitas 5 medidas em cada
método.
Xv
(valor verdadeiro)
(a)
Medidas precisas e exatas
(b)
Medidas precisas, mas
inexatas
(c)
Medidas imprecisas e
inexatas
16
17
18
19
20
21
22
18
Exatidão
É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação
ao valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro.
Checagem da Exatidão (“Validação”)
- Materiais certificados de referência (CRMs)
- Técnicas alternativas
- Teste da recuperação
19
20
Testes de recuperação
A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de
amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo
(spike).
As amostras podem ser adicionadas com o analito em pelo menos
três diferentes concentrações:
próximo ao limite de detecção;
próximo à concentração máxima permissível;
concentração próxima à média da faixa de uso do método.
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Limitação do procedimento:
-O analito adicionado não está necessariamente na mesma forma
que a presente na amostra. A presença de analitos adicionados em
uma forma mais facilmente detectável pode ocasionar avaliações
excessivamente otimistas da recuperação.
onde:
C1 = concentração determinada na amostra adicionada.
C2 = concentração determinada na amostra não adicionada.
C3 = concentração adicionada.
22
Metas - LABmequi
 Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas para a determinação de
metais em produtos alimentícios de carne por Espectrometria de Absorção
Atômica (AAS).
23
Determinação de Na e K em carnes
processadas após tratamento com TMAH
por FAES
24
Atualmente....
25
Introdução
NaCl
- Principal aditivo para a conservação da carne
- Controla o crescimento microbiológico
- Intensifica o paladar do alimento
77% Comida Processada
6% Adição na
Ingestão
12% Ocorrência
Natural
5% Comida
Caseira
Pesquisas indicam a carne como
sendo a segunda maior fonte de sal
na dieta, sendo que os cereais são
os principais.
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Main Product Category
1. Meat Products
Sub Categories (where relevant)
Current 2010
Targets
Revised 2010 Targets
(g salt or mg sodium
(g salt or mg sodium per
per 100g)*
100g)*
1.1 Bacon
Includes all types of injection cured
bacon, e.g. sliced back, streaky, smoked
and unsmoked bacon, bacon joints etc.
Excludes all dry and immersion cured
bacon.
3.5g salt or 1400mg
sodium (average)
1.2 Ham/other cured meats
Includes hams, cured pork loin and
shoulder etc. Excludes ‘Protected
Designation of Origin’ and traditional
speciality guaranteed products,.
2.5g salt or 1000mg
sodium (average)
1.3 Sausages
1.3.1 Sausages Includes all fresh, chilled
and frozen meat sausages, e.g. pork,
beef, chicken, turkey, etc.
1.4g salt or 550mg
sodium (maximum)
1.3.2 Cooked sausages and sausage
meat products Includes all cooked
sausages and sausage meat products
e.g. stuffing, turkey roll with stuffing etc.
Excludes Scotch eggs (see category
22.1).
1.4 Meat Pies
1.4.1 Delicatessen, pork pies and
sausage rolls Includes all delicatessen
pies, pork pies and sausage rolls e.g.
game pie, cranberry topped pork pie,
Melton Mowbray pork pie etc.
Targets for 2012
(g salt or mg
sodium per 100g)*
3.13g salt or 1250mg sodium
(average)
2.88g salt or 1150mg
sodium (average p)
≈11%
≈20%
2.0g salt or 800mg sodium
(average)
≈20%
1.63g salt or 650mg
sodium (average p)
≈35%
1.13g salt or 450mg
sodium (maximum)
1.8g salt or 700mg
sodium (maximum)
1.63g salt or 650mg sodium
(maximum)
1.5g salt or 600mg
sodium (maximum)
1.5g salt or 600mg
sodium (maximum)
1.38g salt or 550mg sodium
(maximum)
≈10%
≈20%
≈20%
1.13g salt or 450mg
sodium (maximum)
27
≈8%
≈25%
Atualmente, industrias alimentícias (que pertencem a Comunidade Européia)
têm respondido de forma positiva a redução do nível de sal em seus produtos
alimentícios.
Fabricantes de produtos cárneos vêm investindo no desenvolvimento de
metodologias alternativas para a redução da concentração de sal (NaCl)
nas comidas processadas
Vários trabalhos estão sendo desenvolvidos com este objetivo
Substituindo o máximo possível de Na+ por K+, bem como por
outros antioxidantes naturais
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Segundo Romans et al. (2001)
Para carnes curadas a concentração de Na+ pode ser reduzida por uma mistura de
até 50:50 de NaCl com KCl, por possuir sabor aceitável.
> 50% de substituição – resulta em sabores indesejáveis resultantes do k+
Cheng et al. (2007)
Investigaram a interação da oxidação lipídica e a oxidação do pigmentos causados
pela substituição do NaCl por KCl em amostras de carnes suínas
-Foi verificado que a redução do nível de NaCl não alterou significativamente a
pigmentação durante o período de refrigeração.
-Com 50% de substituição – não houve diferenças significativas nos valores de
pH, pigmentos totais e ferro heme.
29
Objetivo
Avaliar o uso de TMAH no preparo das amostras de carnes processadas para a
determinação de Na e K por Espectrometria de Emissão Atômica com Chama
(FAES) / Propor uma metodologia simples e barata para o controle desses
elementos em amostras de carnes destinadas a exportação.
 Os resultados serão comparados através de diferentes
procedimentos de preparo de amostras;
 Através do uso de diferentes técnicas analíticas;
30
Espectrômetro 1 (FAES1/FAAS)
 Espectrômetro de Absorção Atômica (Shimadzu) - modelo AA-6300
 Corretor de Fundo de Deutério;
 Chama ar-aceliteno foi utilizada para todas as determinações;
 Lâmpada de Cátodo Oco de Na (589.0 nm) e K (766.5 nm);
31
Espectrômetro 2 (FAES 2)
 Fotômetro de Chama (Micronal) – modelo B462;
 Chama – Gás butano;
 Volume de amostra – 5 mL mim-1;
32
Amostras
Amostras comerciais (Diferentes fabricantes):
 Almôndega;
 Carne Bovina Fatiada;
 Salsicha.
Tratamento das Amostras
 Inicialmente lavadas com Água Milli-Q;
 Cortadas;
 Homogeneizadas – microprocessador;
 Mantidas sob refrigeração à -16 °C em frascos de PEAD;
 Antes da análise as amostras foram descongeladas e homogeneizadas.
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Metodologia
Almôndega
Carne fatiada
Salsicha
≈ 250,0 mg de amostra moída e úmida foram tratadas e aferidas a 50 mL
Digestão Ácida
2,5 mL HNO3
2,0 mL H2O2
T ≈ 90 ºC
º
t=2h
Solubilização com CH2O2
Solubilização com TMAH
10,0 mL
Tº ≈ 50 ºC no US
400 µL de TMAH (25,0 % m/v)
t=2h
Concentração final – 0,2% m/v TMAH
Solubilização T° ambiente
Simples
Seguro
Reprodutível
34
DIGESTÃO ÁCIDA
Força do ácido
Poder complexante
Ponto de ebulição
Segurança na manipulação
Poder oxidante
Pureza
HCl, HNO3, H2SO4, HF e H3PO4; H2O2
PONTO DE EBULIÇÃO À PRESSÃO ATMOSFÉRICA
Ácido
Concentração
P.E. (°C)
HCl
37% (m/v)
110
HF
49% (m/v)
108
HNO3
70% (m/v)
120
Água-régia
(HCl:HNO3 3:1) v/v
112
H2SO4
98,3% (m/v)
338
H3PO4
85% (m/v)
150
35
DIGESTÃO ÁCIDA
Temperaturas desejáveis para a digestão de
amostras biológicas
Decomposição com HNO3 (apresenta o menor Ponto de Ebulição)
 Altos teores de GORDURAS
(queijo, manteiga, óleo vegetal)
170 °C
 Altos teores de PROTEÍNAS
(carne bovina, soro, albumina)
150 °C
 Altos teores de CARBOHIDRATOS
(trigo, milho, áçúcar, etc.)
140 °C
36
DIGESTÃO ÁCIDA
37
SOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAH
Amostras biológicas em geral podem ser facilmente solubilizadas com
TMAH em temperatura ambiente, sem a necessidade de aplicação de
energias para o aquecimento, como as microondas ou ultra-sônicas.
500 µL de TMAH (25% m/v)
~ 250 mg de
amostra seca
Solução resultante:
 Apresentam características de suspensão;
 Baixo fator de solubilização;
 Permanecendo estável durante meses
 Estocadas a temperatura ambiente
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SOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAH
INCONVENIENTES:
 Odor de amina;
 Alta viscosidade da solução;
 Otimização do procedimento de análise;
 Possíveis interferências não-espectrais
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Resultados e Discussão
mg/g (média ± SD) (RSD)
O emprego das amostras úmidas
Amostras Secas
Amostras Úmidas
K
3,25 ± 0,06 (1,8)
3,18 ± 0,06 (1,9)
250 mg da amostra moída
Na
12,69 ± 0,04 (0,3)
13,67 ± 0,05 (0,4)
foram suficiente para obter
Salsicha
K
3,23 ± 0,11 (3,4)
3,33 ± 0,04 (1,2)
Na
29,34 ± 0,12 (0,4)
30,53 ± 0,20 (0,6)
K
4,86 ± 0,05 (1,0)
5,02 ± 0,10 (2,0)
Na
10,90 ± 0,13 (1,2)
10,52 ± 0,04 (0,4)
ou secas apresentaram resultados
de concentrações similares.
resultados exatos e precisos
Carne Bovina
Almôndega
Amostras tratadas
com TMAH
40
Parâmetros de mérito para as três metodologias de preparo de amostra:
Analito
Faixa de
Calibração
(mg L-1)
TMAH
CH2O2
HNO3
a
(mg L‑1)
LD
(µg L-1)
R
a
(mg L‑1)
LD
(µg L-1)
R
a
(mg L‑1)
LD
(µg L-1)
R
K
0,2 – 0,8
0,5922
4,6
0,9986
0,5697
5,7
0,9986
0,6048
2,8
0,9989
Na
0,1 – 0,6
0,8679
1,4
0,9992
0,8004
3,6
0,9977
0,8275
1,0
0,9942
Boa Linearidade das curvas de calibração;
Sensibilidades semelhantes.
41
Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas após
tratamento com diferentes procedimentos de preparo de amostras por FAES.
Analito
K
Na
Amostra
TMAH
A
Ve
(mg g-1)
3,18±0,05
B
C
3,33±0,03
5,02±0,10
0,9
2,0
A
13,67±0,05
0,4
B
C
30,53±0,20
10,52±0,04
0,6
0,4
CH2O2
RSD LOD
(%) (µg g-1)
1,6
2,0
0,8
Ve
(mg g-1)
3,39±0,04
HNO3
RSD LOD
(%) (µg g-1)
1,2
3,0
3,59±0,08
5,70±0,03
2,2
0,5
14,18±0,20
1,4
31,56±0,30
9,98±0,10
0,9
1,0
2,0
A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.
Ve
(mg g-1)
3,11±0,04
RSD
(%)
1,3
3,22±0,01
5,21±0,03
0,3
0,6
13,85±0,08
0,6
30,92±0,19
9,68±0,16
0,6
1,6
LOD
(µg g-1)
1,5
0,6
 Das amostras de carne analisadas a salsicha foi que apresentou maior conc. de Na;
 Comparado com as metas atuais exigidas pela EU a concentração de Na nas amostras
de Salsicha é 6X maior;
 As amostras analisadas apresentaram concentrações de Na muito maior que as
informadas no rótulo;
 Exemplo: 0,68 m/g de Na (Rótulo) – 10 mg/g (Valor Encontrado).
42
Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas por FAAS
e FAES 2, após tratamento com TMAH.
Analito
Amostra
K
Na
FAES
A
B
Ve
(mg g-1)
3,52±0,26
3,47±0,02
RSD
(%)
7,4
0,6
C
5,37±0,48
8,9
A
B
13,63±0,54
31,93±0,58
4,0
1,8
C
9,82±0,16
1,6
FAAS
R
0,9966
0,9980
Ve
(mg g-1)
3,21±0,17
3,27±0,05
RSD
(%)
5,3
1,5
5,45±0,20
3,7
13,32±0,18
29,60±0,50
1,3
1,7
10,69±0,05
0,5
A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.
R
0,9988
0,9954
As soluções foram
preparadas em meio de
CsCl2 (0,09% m/v)
43
Conclusão
 As altas concentrações de Na encontradas nas amostras analisadas e a
grande discrepância nos níveis desse elemento informado em seus rótulos,
enfatizam a importância do Brasil em reduzir o teor de sal nos alimentos
processados e implementar um controle de qualidade.
O método de preparação das amostras com TMAH mostrou-se:
 Ser uma metodologia simples que fornece resultados exatos e precisos para a
determinação de Na e K por FAES;
 Empregando poucas quantidades de amostras e reagentes;
 Sendo eficiente na solubilização das amostras estudadas mesmo com um
elevado teor de gordura, o mesmo comportamento não foi observado com a
digestão ácida em copo aberto.
 Em conclusão, o procedimento desenvolvido pode substituir com sucesso os
procedimentos convencionais, pois não foram observadas diferenças
significativas com um nível de confiança de 95%.
44
AGRADECIMENTOS
Pelo apoio financeiro e bolsas concedidas:
45
AGRADECIMENTOS
46
SOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAH
47