Jose Dias Resende Junior
ANÁLISE DAS MUTAÇÕES DOS GENES HFE,
FATOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA, GLUTATHIONA-S
TRANSFERASE, METILENOTETRAHIDROFOLATO-REDUTASE E O
RISCO DE DOENÇA VENO-OCLUSIVA HEPÁTICA EM PACIENTES
SUBMETIDOS A TRANSPLANTE ALOGÊNICO DE CÉLULAS
TRONCO HEMATOPOIÉTICAS
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do título de
Mestre em Ciências.
São Paulo
2010
Jose Dias Resende Junior
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DOS GENES HFE,
FATOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA, GLUTATHIONA-S
TRANSFERASE, METILENOTETRAHIDROFOLATO-REDUTASE E O
RISCO DE DOENÇA VENO-OCLUSIVA HEPÁTICA EM PACIENTES
SUBMETIDOS A TRANSPLANTE ALOGÊNICO DE CÉLULAS
TRONCO HEMATOPOIÉTICAS
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do título de
Mestre em Ciências.
Orientador:
Prof. Dr. José Salvador Rodrigues de
Oliveira.
Co-orientadora:
Profª. Drª. Maria Stella Figueiredo.
São Paulo
2010
Junior, José Dias Resende
Análise de polimorfismos dos genes HFE, fator V de Leiden, protrombina,
glutationa-S transferase, metilenotetrahidrofolato e o risco de doença veno-oclusiva
hepática em pacientes submetidos a transplante alogênico de células tronco
hematopoiéticas: Estudo clínico observacional. / José Dias Resende Junior. – São Paulo,
2009.
xxiv, 113f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina.
Programa de Pós-Graduação em Hematologia.
Título em Inglês: Analysis genetic polymorphisms of HFE, prothrombin, factor V Leiden,
methylenetetrahydrofolate reductase, glutathione S-transferase in hepatic veno-occlusive
disease after hematopoietic stem cell transplantation: a observe clinical study.
1. Transplante de Medula Óssea. 2. Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas. 3.
Transplante Homólogo. 4. Fatores de Risco. 5. Hepatopatia Veno-Oclusiva. 6. Polimorfismo
Genético
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE HEMATOLOGIA
Chefe da disciplina de Hematologia e Hemoterapia:
Profª. Drª. Maria Stella
Figueiredo
Chefe departamento de oncologia clínica e experimental: Prof. Dr. José Orlando
Bordin.
iii
Jose Dias Resende Junior
ANÁLISE DA MUTAÇÃO DOS GENES HFE,
FATOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA, GLUTATHIONA-S
TRANSFERASE, METILENOTETRAHIDROFOLATO-REDUTASE E O
RISCO DE DOENÇA VENO-OCLUSIVA HEPÁTICA EM PACIENTES
SUBMETIDOS A TRANSPLANTE ALOGÊNICO DE CÉLULAS
TRONCO HEMATOPOIÉTICAS
Presidente da banca:
Prof. Dr. Jose Salvador R. De Oliveira
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Fábio Rodrigues Kerbauy
Prof. Dr. Helio Moraes de Souza
Prof. Dr. Israel Bendit
Prof. Dr. Celso Arrais Rodrigues da Silva
iv
Dedicatória
Aos meus pais,
pelo exemplo de ética e moral.
v
À Ludmilla,
pelo amor, companheirismo, amizade e paciência.
vi
Ao meu filho
João Gabriel, pelo amor incondicional.
vii
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Jose Salvador Rodrigues de Oliveira, por ter-me recebido, pela
oportunidade a mim proporcionada, pela orientação científica e pelos ensinamentos
em Transplante de Medula Óssea.
À Profª. Drª. Maria Stella Figueiredo, pelos conselhos, pela atenciosa ajuda, pelo
apoio, pela leitura crítica e contribuições apresentadas.
À Profª. Drª. Mihoko Yamamoto, por seus ensinamentos.
À enfermeira Maria Aparecida, pela amizade, pela confiança e pela enorme
dedicação em todos os momentos desse trabalho.
À Profª. Drª. Maria Gerbase de Lima e sua equipe, pela cooperação e pela
possibilidade de realização dos exames em seu Laboratório.
Ao Prof. Dr. José Orlando Bordin, pelo estímulo à pesquisa, pelo exemplo e pelo
apoio.
À Profª. Drª. Maria de Lourdes L. Ferrari Chauffaille, pelos seus preciosos
ensinamentos.
À Profª. Drª. Gisele Wally Braga Colleoni, pelo apoio e estímulo constantes.
Ao Adriano, pela amizade,disponibilidade e pela parceria durante esse estudo.
A Drª. Adriana Seber, Medica Responsável pela Unidade de Transplante de Medula
Óssea do Graac/IOP, pela inclusão de pacientes desta Instituição no estudo.
Ao Wolnei, pela presença constante como amigo e profissional, em todas as etapas
deste estudo, partilhando os momentos de incertezas e de acertos.
viii
Aos amigos Rodrigo Pavani e Alex Sandes, pela amizade e companheirismo desde
os primeiros anos dessa jornada.
Aos amigos Carlos, Márcio e Klaus, pela amizade e parceria.
A Bruna e Arthur pela disponibilidade, companherismo e parceria
Aos amigos pós-graduandos, residentes, médicos e funcionários da Disciplina de
Hematologia e Hemoterapia da UNIFESP, pela convivência agradável.
Aos colegas do Serviço de Hematologia e Transplante de Medula Óssea do Hospital
Santa Marcelina, pela amizade e apoio.
Aos pacientes, que consentiram e fizeram parte deste estudo, pelo carinho e
comprometimento com o tratamento, e a intensa e viva disponibilidade em colaborar
com os avanços da medicina.
Ao Hospital Santa Marcelina e à comissão de ensino e pesquisa, pela
disponibilidade, companheirismo e amizade das irmãs Marcelinas.
ix
Esse trabalho foi desenvolvido com apoio financeiro da CAPES
Processo no.: 0510596
x
Sumário
Dedicatória ............................................................................................................................ v
Agradecimentos ................................................................................................................... viii
Lista de figuras .................................................................................................................... xv
Lista de quadros .................................................................................................................. xvi
Lista de tabelas................................................................................................................... xvii
Lista de abreviaturas.......................................................................................................... xxiii
Resumo ............................................................................................................................. xxiv
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1
1.1 Doença venoclusiva hepática ......................................................................................... 2
1.2 Glutationa S-transferase ................................................................................................. 4
1.3 Gene HFE (Hemocromatose Hereditária) ....................................................................... 5
1.4 Mutação da protrombina ................................................................................................. 6
1.5 Fator V Leiden ................................................................................................................ 7
1.6 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHF) ...................................................................... 7
2. OBJETIVOS.................................................................................................................... 10
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 13
3.1 Casuística..................................................................................................................... 14
3.2 Metodologia .................................................................................................................. 18
3.2.1
Extração e amplificação de DNA .............................................................................. 18
3.2.2
Identificação da presença do polimorfismo .............................................................. 19
3.2.3
Glutationa-S Transferase (GST) .............................................................................. 19
3.2.4
Gene HFE ................................................................................................................ 24
3.2.5
Mutação da protrombina 20210G→A e Fator V Leiden G1691A .............................. 28
3.2.6
Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) ............................................................. 30
3.3 Análise estatística......................................................................................................... 32
4. RESULTADOS ............................................................................................................... 33
4.1 Estudo dos polimorfismos............................................................................................. 34
4.1.1
Polimorfismo da GST -  e condicionamentos relacionados ao Bussulfan ............... 34
4.1.2
Polimorfismo da GST -  e condicionamentos relacionados a ciclofosfamida .......... 34
4.1.3
Polimorfismo da GST -  e condicionamentos relacionados a TBI ........................... 35
4.1.4
Polimorfismo da GST -  e condicionamentos Mieloablativos e Não-mieloablativos 36
4.1.5
Polimorfismo da GST -  e uso de nutrição parenteral total ..................................... 36
4.1.6
Polimorfismo da GST -  e positividade do receptor ao CMV ................................... 37
xi
4.1.7
Polimorfismo da GST -  e enzimas hepáticas pré-TCTH do receptor ..................... 37
4.1.8
Polimorfismo da GST -  e uso de vancomicina no TCTH ....................................... 38
4.1.9
Polimorfismo da GST -  e grupos de diagnostico ................................................... 38
4.1.10 Polimorfismo da GST - e condicionammentos baseados em bussulfan................. 39
4.1.11 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos baseados em ciclofosfamida ............ 40
4.1.12 Polimorfismo da GST -  e condicionammentos baseados em TBI .......................... 40
4.1.13 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos Mieloablativos e Não-mieloablativos 41
4.1.14 Polimorfismo da GST -  e uso de nutrição parenteral total ..................................... 41
4.1.15 Polimorfismo da GST -  e positividade do receptor ao CMV ................................... 42
4.1.16 Polimorfismo da GST -  e enzimas hepaticas pré-TCTH ........................................ 42
4.1.17 Polimorfismo da GST -  e uso de vancomicina ....................................................... 43
4.1.18 Polimorfismo da GST -  e grupos de diagnóstico.................................................... 44
4.1.19 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados ao Bussulfan ............... 44
4.1.20 Polimorfismo da GST  e condicionamentos relacionados a ciclofosfamida ............ 45
4.1.21 Polimorfismo da GST  e condicionamentos relacionados a TBI ............................. 46
4.1.22 Polimorfismo da GST  e condicionamentos mielo e não-mieloablativos ................. 46
4.1.23 Polimorfismo da GST  e uso de nutrição parenteral total........................................ 47
4.1.24 Polimorfismo da GST  e sorologia do receptor ao CMV ......................................... 47
4.1.25 Polimorfismo da GST  e enzimas hepáticas pré-TCTH .......................................... 48
4.1.26 Polimorfismo da GST  e uso de vancomicina ......................................................... 48
4.1.27 Polimorfismo da GST  e grupos de diagnostico...................................................... 49
4.1.28 Fator V de Leiden (Fator V Leiden G1691A) e condicionamento com Bussulfan .... 50
4.1.29 Fator V de Leiden e condicionamento com ciclofosfamida ....................................... 50
4.1.30 Fator V de Leiden e condicionamento com TBI ........................................................ 51
4.1.31 Fator V de Leiden e condicionamentos mielo e não-mieloablativos ......................... 51
4.1.32 Fator V de Leiden e uso de nutrição parenteral total ................................................ 52
4.1.33 Fator V de Leiden e sorologia do receptor ao CMV .................................................. 52
4.1.34 Fator V de Leiden e enzimas hepáticas pré-TCTH................................................... 53
4.1.35 Fator V de Leiden e uso de vancomicina ................................................................. 53
4.1.36 Fator V de Leiden e grupos de diagnostico .............................................................. 54
4.1.37 Mutação da protrombina (mutação da protrombina 202021G→A ) e
codicionamento contendo bussulfan ........................................................................ 55
4.1.38 Mutação da protrombina e condicionamento contendo ciclofosfamida ..................... 55
4.1.39 Mutação da protrombina e condicionamento contendo TBI ...................................... 56
4.1.40 Mutação da protrombina e condicionamentos mielo e não-mieloablativos ............... 56
4.1.41 Mutação da protrombina e uso de nutrição parenteral total ...................................... 57
4.1.42 Mutação da protrombina e sorologia do receptor ao CMV ....................................... 57
xii
4.1.43 Mutação da protrombina e enzimas hepaticas pre-TCTH ........................................ 58
4.1.44 Mutação da protrombina e uso de vancomicina ....................................................... 59
4.1.45 Mutação da protrombina e grupos de diagnostico .................................................... 59
4.1.46 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento contendo Bussulfan ............... 60
4.1.47 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento contendo ciclofosfamida ........ 61
4.1.48 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento com TBI................................. 61
4.1.49 Mutação HFE – H63D e tipo de condicionamento mielo e não-mieloablativo ........... 62
4.1.50 Mutação HFE – H63D e uso de NPT ....................................................................... 62
4.1.51 Mutação HFE – H63D e positividade ao CMV no receptor ....................................... 63
4.1.52 Mutação HFE – H63D e enzimas hepáticas pré TCTH ............................................ 63
4.1.53 Mutação HFE – H63D e uso de vancomicina ........................................................... 64
4.1.54 Mutação HFE – H63D e grupos de diagnóstico........................................................ 64
4.1.55 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo bussulfan ............... 65
4.1.56 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo ciclofosfamida ........ 66
4.1.57 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo TBI ......................... 66
4.1.58 Mutação HFE – S65C e tipo de regime de condicionamento ................................... 67
4.1.59 Mutação HFE – S65C e uso de Nutrição parenteral total ......................................... 67
4.1.60 Mutação HFE – S65C e positividade do receptor ao CMV ....................................... 68
4.1.61 Mutação HFE – S65C e enzimas hepáticas pré-TCTH ............................................ 68
4.1.62 Mutação HFE – S65C e uso de vancomicina ........................................................... 69
4.1.63 Mutação HFE – S65C e grupos de diagnóstico ........................................................ 69
4.1.64 Mutação MTHR C677T regime de condicionamento contendo Bussulfan ................ 70
4.1.65 Mutação MTHR C677T e regimes de condicionamento contendo ciclofosfamida. ... 71
4.1.66 Mutação MTHR C677T e regimes de condicionamento contendo TBI ..................... 71
4.1.67 Mutação MTHR C677T e tipos de condicionamentos mielo a não-mielo-ablativos ... 72
4.1.68 Mutação MTHR C677T e uso de nutrição parenteral ............................................... 73
4.1.69 Mutação MTHR C677T e positividade do receptor ao CMV ..................................... 73
4.1.70 Mutação MTHR C677T e enzimas hepáticas ........................................................... 74
4.1.71 Mutação MTHR C677T e uso de vancomicina ......................................................... 75
4.1.72 Mutação MTHR C677T e grupos de diagnósticos .................................................... 75
4.1.73 Resultados obtidos entre a associação de polimorfismos e características
estudadas de predisposição à DVOH ...................................................................... 76
4.1.74 Polimorfismo da GST -  e diagnóstico DVOH ........................................................ 78
4.1.75 Polimorfismo da GST - θ e diagnóstico DVOH ........................................................ 78
4.1.76 Polimorfismo da GST -  e diagnóstico DVOH ........................................................ 79
4.1.77 Fator V de Leiden e diagnóstico de DVOH............................................................... 79
4.1.78 Mutação Protrombina e diagnóstico de DVOH ......................................................... 80
4.1.79 Mutação HFE – H63D e diagnostico de DVOH ........................................................ 80
xiii
4.1.80 Mutação HFE S65C e diagnóstico de DVOH ........................................................... 81
4.1.81 Mutação MTHR C677T e diagnóstico de DVOH ...................................................... 81
4.1.82 Resultados analisados do estudo entre os polimorfismos e diagnóstico de DVOH .. 82
4.1.83 Regime de condicionamento contendo Bussulfan e DVOH ...................................... 82
4.1.84 Regime de condicionamento contendo Ciclofosfamida e DVOH .............................. 83
4.1.85 Regime de condicionamento contendo TBI e DVOH .............................................. 83
4.1.86 Análise dos tipos de condicionamentos e DVOH ..................................................... 84
4.1.87 Análise do uso de NPT e DVOH. ............................................................................. 85
4.1.88 Análise da positividade sorológica do receptor ao CMV versus DVOH .................... 85
4.1.89 Análise de alteração de enzimas hepáticas no pré-TCTH versus DVOH ................ 86
4.1.90 Análise do uso de vancomicina e DVOH .................................................................. 86
4.1.91 Resultados da análise entre as variáveis de interesse do estudo e DVOH .............. 87
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 94
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 103
7. ANEXOS ....................................................................................................................... 106
8. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 109
Abstract
Bibliografia consultada
xiv
Lista de figuras
Figura 1. Metabolismo da homocisteína................................................................................ 9
Figura 2. PCR GST P1. ...................................................................................................... 23
Figura 3. PCR GST M1 e T1. .............................................................................................. 23
Figura 4. PCR e Digestão C282Y. ...................................................................................... 27
Figura 5. Produtos da digestão do polimorfismo HFE H63D com a enzima de restrição
Dpnll ou Mbol (Ferramentas). .............................................................................. 27
Figura 6. Produto da Digestão do polimotfismo HFE S65C com a enzima de restrição
HinfI. .................................................................................................................... 28
Figura 7. Produto do PCR Multiplex para o Gene da Protombina. ...................................... 29
Figura 8. Produto do PCR multiplex para o Gene do Fator V de Leiden. ............................ 30
Figura 9. Produto da digestão com a enzima de restrição Hinfl do PCR do Polimorfismo
MTHFR C677T. ................................................................................................... 32
xv
Lista de quadros
Quadro 1. Critérios diagnósticos de DVOH ....................................................................... 15
Quadro 2. Seqüência de primers utilizados para amplificação dos genes GST- μ e
GST- θ, seu sentido e tamanho do produto obtido. .......................................... 19
Quadro 3. Análise dos resultados da PCR multiplex para diagnóstico de polimorfismo
dos genes GST- μ e GST- θ ............................................................................ 20
Quadro 4. Seqüência de primers utilizados para amplificação da GST- π, seu sentido
e tamanho do produto obtido. .......................................................................... 21
Quadro 5. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação do
polimorfismo do gene GST- π e fragmentos obtidos após digestão. ................ 22
Quadro 6. Relação dos primers, sentido e tamanho do produto da PCR para as
mutações C282Y, H63D e S65C do gene HFE ................................................ 24
Quadro 7. Mutação do gene HFE analisada, localização, enzima de restrição utilizada
e seqüência de clivagem específica. ................................................................ 25
Quadro 8. Fragmentos obtidos após digestão do produto de PCR e seu significado. ....... 26
Quadro 9. Características mutação Protrombina (G20210A) e FVLeiden. ........................ 29
Quadro 10. Seqüência de primers utilizados para amplificação da MTHFR, seu sentido
e tamanho do produto obtido. .......................................................................... 30
Quadro 11. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação da
mutação C677T da MTHFR e fragmentos obtidos após digestão. ................... 31
Quadro 12. Resultados de polimorfismos encontrados em cada paciente analisado do
estudo, chamando atenção os pacientes grifados em vermelho, os quais
desenvolveram doença veno-oclusiva hepática. .............................................. 88
xvi
Lista de tabelas
Tabela A. Caracteristicas clínicas do estudo. ......................................................................16
Tabela 1. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento BU. .................................................................................................................... 34
Tabela 2. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento CY. .................................................................................................................... 35
Tabela 3. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento TBI. ................................................................................................................... 35
Tabela 4. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Tipo de
condicionamento. .............................................................................................. 36
Tabela 5. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e NPT. ............................ 36
Tabela 6. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e positividade ao
receptor ao CMV. .............................................................................................. 37
Tabela 7. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Enzimas Hepaticas
Pré TCTH do receptor. ...................................................................................... 37
Tabela 8. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e uso de Vancomicina. ... 38
Tabela 9. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e grupos de
diagnostico. ....................................................................................................... 39
Tabela 10. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento BU. .................................................................................................................... 39
Tabela 11. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento CY. .................................................................................................................... 40
Tabela 12. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento TBI. ................................................................................................................... 40
Tabela 13. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e condicionamentos
mielo e não-mieloablativos. ............................................................................... 41
xvii
Tabela 14. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e NPT. ............................ 42
Tabela 15. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e positividade do
receptor ao CMV ............................................................................................... 42
Tabela 16. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e enzimas hepáticas
pré-TCTH. ......................................................................................................... 43
Tabela 17. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e uso da vancomicina. .... 43
Tabela 18. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Diagnóstico. ................. 44
Tabela 19. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e condicionamentos
baseados em bussulfan. .................................................................................... 45
Tabela 20. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e condicionamentos
baseados em CY. .............................................................................................. 45
Tabela 21. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e condicionamentos com
TBI. ................................................................................................................... 46
Tabela 22. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e Tipo de
condicionamento. .............................................................................................. 47
Tabela 23. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e NPT. .............................. 47
Tabela 24. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e sorologia do receptor
ao CMV. ............................................................................................................ 48
Tabela 25. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e enzimas hepática préTCTH................................................................................................................. 48
Tabela 26. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e Vancomicina. ................. 49
Tabela 27. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e grupos de diagnostico. ... 49
Tabela 28. Distribuição da amostra quanto às variáveis. .................................................... 50
Tabela 29. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Condicionamento - CY... 50
Tabela 30. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Condicionamento - TBI. . 51
xviii
Tabela 31. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e condicionamentos
mielo e não-mieloablativos. ............................................................................... 52
Tabela 32. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e NPT ............................... 52
Tabela 33. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e sorologia do receptor
ao CMV. ............................................................................................................ 53
Tabela 34. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Enzima Hep. Pré
TCTH................................................................................................................. 53
Tabela 35. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e uso de vancomicina. ..... 54
Tabela 36. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e grupos de diagnostico. .. 54
Tabela 37. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e Condicionamento
- BU. .................................................................................................................. 55
Tabela 38. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
Condicionamento com CY. ................................................................................ 55
Tabela 39. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
Condicionamento com TBI. ............................................................................... 56
Tabela 40. Distribuição da amostra quanto às variáveis mutação da protrombina e
condicionamentos mielo e não-mieloablativos. .................................................. 57
Tabela 41. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e NPT. .. 57
Tabela 42. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e sorologia do
receptor ao CMV. .............................................................................................. 58
Tabela 43. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e enzimas
hepáticas pré-TCTH. ......................................................................................... 58
Tabela 44. Distribuição da amostra quanto às variáveis mutação da protrombina e uso
de vancomicina. ................................................................................................ 59
Tabela 45. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
grupos de diagnóstico. ...................................................................................... 60
xix
Tabela 46. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Condicionamento
com Bu .............................................................................................................. 60
Tabela 47. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e
Condicionamento-CY. ....................................................................................... 61
Tabela 48. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e
Condicionamento-TBI. ....................................................................................... 61
Tabela 49. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Tipo de
condicionamento. .............................................................................................. 62
Tabela 50. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e NPT. ..................... 62
Tabela 51. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e CMV Recp. ........... 63
Tabela 52. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Enzima Hep. Pré
TCTH................................................................................................................. 63
Tabela 53. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Vancomicina. ........ 64
Tabela 54. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Diagnóstico. .......... 65
Tabela 55. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e condicionamento com Bu. ............................................................................................................. 65
Tabela 56. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Condicionamento Cy ...................................................................................................................... 66
Tabela 57. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Condicionamento TBI. ................................................................................................................... 66
Tabela 58. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Tipos de
condicionamentos.............................................................................................. 67
Tabela 59. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e NPT. ........................ 67
Tabela 60. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e CMV Recp. .............. 68
Tabela 61. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Enzima Hep. Pré
TCTH................................................................................................................. 68
xx
Tabela 62. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e uso de
vancomicina. ..................................................................................................... 69
Tabela 63. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e grupos de
diagnósticos ...................................................................................................... 70
Tabela 64. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e
condicionamentos com Bu................................................................................. 70
Tabela 65. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e
condicionamentos com CY. ............................................................................... 71
Tabela 66. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e
Condicionamento - TBI. ..................................................................................... 72
Tabela 67. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e Tipos de
condicionamentos mielo a não-mialoablativos. .................................................. 72
Tabela 68. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e NPT. ................... 73
Tabela 69. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e positividade do
receptor ao CMV. .............................................................................................. 74
Tabela 70. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e enzimas
hepáticas pré-TCTH. ......................................................................................... 74
Tabela 71. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e vancomicina. ...... 75
Tabela 72. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e grupos de
diagnóstico. ....................................................................................................... 76
Tabela 73. Resultados do estudo de associação entre os polimorfismos e as demais
características de interesse na pesquisa. .......................................................... 76
Tabela 74. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e DVOH. ......................... 78
Tabela 75. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e DVOH. ......................... 78
Tabela 76. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e DVOH. ......................... 79
Tabela 77. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e DVOH ............................ 79
xxi
Tabela 78. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e DVOH. .................. 80
Tabela 79. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e DVOH. .................. 80
Tabela 80. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e DVOH...................... 81
Tabela 81. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e DVOH ................. 81
Tabela 82. Resultados do estudo de associação entre os polimorfismos e a variável
DVOH. ............................................................................................................... 82
Tabela 83. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - BU e DVOH. .. 83
Tabela 84. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - CY e DVOH. .. 83
Tabela 85. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - TBI e DVOH. . 84
Tabela 86. Distribuição da amostra quanto às variáveis tipos de condicionamentos:
mieloablativo e não-mieloablativo versus DVOH. .............................................. 84
Tabela 87. Distribuição da amostra quanto às variáveis NPT e DVOH. .............................. 85
Tabela 88. Distribuição da amostra quanto às variáveis positividade sorológica do
receptor ao CMV versus DVOH ......................................................................... 85
Tabela 89. Distribuição da amostra quanto às variáveis alterações de enzimas hepáticas
pré-TCTH versus DVOH. ................................................................................... 86
Tabela 90. Distribuição da amostra quanto às variáveis uso de vancomicina versus
DVOH ................................................................................................................ 87
Tabela 91. Resultados do estudo de associação entre as variáveis de interesse e a
DVOH. ............................................................................................................... 87
xxii
Lista de abreviaturas
AIT
Acidente isquêmico transitório
AVCI
Acidente vascular cerebral isquêmico
DNA
Ácido desoxirribonucléico
MTHFR
Metileno-tetrahidrofolato redutase
RNA
Ácido ribonucléico
TVP
Trombose venosa profunda
TCTH
Transplante de Medula Óssea
Bu
Bussulfan
Cy
Ciclofosfamida
TBI
Irradiação corporal Total
HFE
Hemocromatose hereditária
DVOH
Doença veno-oclusiva hepática
GST
Glutationa S-transferase
PAI-1
Inibidor da ativação plasminogênio
tPA
Fator ativador do Plasminogênio
THT
Tetrahidrotiofeno
HLA
Antígeno de histocompatibilidade leucocitária
xxiii
Resumo
Introdução: Polimorfismos genéticos estão associados com um aumento do risco de
tromboembolismo venoso (TEV) e outras doenças cardiovasculares. Estudos prévios
sugerem que a doença venooclusiva hepática (DVOH), que se desenvolve intra
transplante de medula óssea pode ser atribuída à polimorfismos gênicos. Objetivos:
Avaliar a correlação entre polimorfismos genéticos e o risco de doença venooclusiva
hepática no transplante de medula óssea e a associação com a presença de
variáveis como o uso de vancomicina, drogas citotóxicas usadas no regime de
condicionamento, presença de disfução hepática anterior ao transplante, presença
de infecção por citomegalovírus, e grupos de doenças avaliáveis. Pacientes e
métodos: Este estudo caracteriza-se por um estudo clinico observacional
multicêntrico. Foram avaliados 120 pacientes, submetidos a transplante alogênico de
medula óssea. Cada paciente foi avaliado propectivamente para DVOH, confirmado
pelo critério de Seattle modificado, idade variando de 2 a 65 anos. Fatores de risco
para DVOH severo foram analisados usando modelos estatisticos de avaliação.
Detectamos simultaneamente através de PCR seguido de digestão e detecção
através de eletroforese em gel de agarose, mutação do HFE C282Y, H63D, S65C;
MTHFR C677T; Fator V de Leiden, Protrombina 20210A e glutationa S-tranferase.
Resultados: Neste estudo observacional de pessoas, submetidas a transplante de
medula óssea alogênico, a presença de disfução hepática pré transplante foi um
fator de risco significante para DVOH. Nós tambem observamos uma associação
entre a presença de mutação HFE S65C e disfunção hepática. Conclusões: Em
resumo, nossos dados sugerem que disfunção hepatica observada pré transplante
de medula óssea é um fator de risco estatisticamente significante para DVOH e que
a presença da mutação do HFE S65C apresenta uma tendência ao desenvolvimento
de dano hepático. Contudo, não evidenciamos associação dos polimorfismos
estudados com DVOH.
Palavras chave: 1. Transplante de Medula Óssea. 2. Transplante de Células-Tronco
Hematopoéticas. 3. Transplante Homólogo. 4. Fatores de Risco. 5. Hepatopatia
Veno-Oclusiva. 6. Polimorfismo Genético
xxiv
1. INTRODUÇÃO
Introdução |2
1.1 Doença venoclusiva hepática
A doença venoclusiva hepática (DVOH) é uma síndrome clínica caracterizada
por sobrecarga hídrica secundária à retenção renal de sódio, hepatomegalia
dolorosa, rápido ganho ponderal, ascite e icterícia. Este quadro clínico se inicia, na
maioria das vezes, dentro dos primeiros vinte dias após o transplante de célulastronco hematopoiéticas (TCTH). Alguns estudos relataram a ocorrência da DVOH
tardia, que é conseqüente ao uso de regimes de condicionamento contendo
bussulfan, onde as alterações sindrômicas são observadas após trinta dias. A
incidência da DVOH varia de 10 a 60%, com mortalidade acima de 67% na forma
grave (Kulkarni et al., 1999; DeLeve et al., 2002; Coppell et al., 2003; Senzolo et al.,
2007).
A DVOH é clinicamente classificada em: 1- DVOH leve, que é autolimitada e
geralmente resolve-se sem tratamento; 2- DVOH moderada quando requer
tratamento; mas usualmente os pacientes se recuperam e 3- DVOH severa que é
definida como dano hepático não resolvido até o dia 100 pós -TCTH ou que tem
evolução fatal (McDonald et al., 1993; Litzow et al., 2002; Coppell et al., 2003).
A DVOH é resultado de lesões nas células endoteliais sinusoidais e nos
hepatócitos da zona 3, do centro lobular do ácino hepático, desencadeadas por
deposição de fibrina dentro do lúmen destes sinusóides e das vênulas hepáticas
(Coppell et al., 2003).
Não há consenso, na literatura médica vigente, na abordagem terapêutica
desta síndrome. Entre as medidas profiláticas mais efetivas na redução da DVOH,
as mais admitidas são a redução da intensidade do condicionamento e o maior
fracionamento da irradiação corporal total. Medidas de suporte como balanço
hídrico, hemodiálise, paracenteses e restrição protéica com lactulose oral são úteis
para reduzir o risco de progressão para encefalopatia hepática (Kulkarni et al., 1999;
DeLeve et al., 2002; Litzow et al. 2002; Coppell et al., 2003; Senzolo et al., 2007).
Houve, entretanto, impacto no manuseio desta complicação com o emprego
do defibrotide, ácido polideoxirribonucleico derivado de mucosa bovina, que tem
propriedades fibrinolíticas e anti-trombóticas. O mecanismo de ação permanece
Introdução |3
indeterminado, porém estudos “in vitro” e “in vivo” mostraram sua eficácia no
estímulo à liberação da trombomodulina, do fator ativador tissular do plasminogenio
(tPA), da prostaciclina e do prostaglandina E2, diminuição na geração de trombina,
expressão do fator tissular, liberação do inibidor da ativação do plasminogenio (PAI1) e atividade de endotelina (Kulkarni et al., 1999; Park et al., 2002; Coppell et al.,
2003; Senzolo et al., 2007; Tay et al., 2007).
São fatores considerados como capazes de aumentar a predisposição à
DVOH: 1)- Dano hepático pré-existente, secundário à irradiação abdominal, hepatite
ativa, excessiva ingestão de álcool caracterizados por transaminases alteradas. 2)Segundo TCTH, responsável pelo aumento em 20 % na incidência da DVOH. 3)Regime de condicionamento de maior intensidade ablativa e terapia citotóxica
empregada em tratamentos quimioterápicos anteriores. 4)-Tipo de transplante:
estudos de coortes prospectivos e multicêntricos mostraram que receptores de
transplantes alogênico são mais propensos a desenvolver DVOH do que no
transplante autologo, 5)- Fatores genéticos como mutações e polimorfismos gênicos
capazes de alterar o metabolismo das drogas usadas no regime de condicionamento
(Kami et al. 1997; DeLeve et al., 2002; Vogelsang, Dalal, 2002; Coppell et al., 2003;
Kumar et al., 2003).
Dentre os fatores genéticos capazes de influir na incidência e/ou gravidade da
DVOH destacam-se os polimorfismos da
glutationa S-transferase (GST)
(Bredschneider et al., 2002; Srivastava et al., 2004), mutações no gene associado à
Hemocromatose hereditária (HFE) (Kallianpur et al., 2005), mutação do gene da
protrombina e do fator V Leiden (Akar et al., 1997; Duggan et al., 1999; Bauduer,
Lacombe, 2005), e polimorfismos da metilenotetrahidrofolato redutase (Friedman
et al., 1999).
Introdução |4
1.2 Glutationa S-transferase
Muitos agentes citotóxicos usados em TCTH são metabolizados pelo fígado,
órgão principal na patogênese desta síndrome. Os hepatócitos da zona 3 são ricos
em GST e citocromo P450, mas contém baixos níveis de glutationa. Estas enzimas
em conjunto com glutationa convertem as drogas em substancias estáveis, solúveis
em água e depuram espécies oxigênio reativas. A relativa deficiência de glutationa
na zona 3 do hepatócito e nas células endoteliais sinusoidais confere maior
sensibilidade destas células à injúria pelas toxinas geradas durante o regime de
condicionamento. Sabendo que muitas drogas citotóxicas usadas nos regimes de
condicionamento são consideradas como fatores causais mais significantes para
desenvolver DVOH, baixos níveis intrínsecos ou droga-induzido de glutationa em
hepatócitos poderiam contribuir para este dano (Bredschneider et al., 2002;
Srivastava et al., 2004).
Os
dois
principais
agentes
citorredutores
usados
na
terapia
de
condicionamento para TCTH, bussulfan e ciclofosfamida, envolvem a enzima
glutationa s transferase (GST) e glutationa no processo de metabolização. A maior
via de metabolização do bussulfan é a conjugação com glutationa na presença de
GST e a oxidação do seu metabólito lipofílico resultante, tetraidrotiofeno (THT), pela
enzima citocromo P450 antes da excreção deste. Por outro lado, a ciclofosfamida é
inicialmente transformada pelo citocromo P 450 resultando no metabólito ativo 4hidroxi-ciclofosfamida, o qual requer glutationa e GST para promover o seu
metabolismo. Portanto, essas enzimas são um elo metabólico entre estas duas
drogas, que freqüentemente são usadas seqüencialmente no TCTH (Bredschneider
et al., 2002; Srivastava et al., 2004).
Existem quatro sub-famílias de GST descritas e denominadas GST A1, M1,
T1 e P1,
podendo estar associadas ao risco de desenvolvimento da DVOH.
(Srivastava et al., 2004).
Um estudo conduzido em 2004 por Srivastava e colaboradores, avaliou 114
indivíduos portadores de β-Talassemia maior, submetidos a TCTH, apresentando
uma incidência aumentada de doença veno-oclusiva hepática em pacientes com o
Introdução |5
polimorfismo nulo da Glutationa S-Transferase M1 comparado com o genótipo
normal; isto foi devido ao dano dos hepatócitos mediado
pelo metabolismo do
bussulfan, através da diminuição do pool celular da glutationa.
1.3 Gene HFE (Hemocromatose Hereditária)
Outro polimorfismo que pode estar relacionado à predisposição da DVOH, é a
presença do alelo C282Y, associado a hemocromatose hereditária do tipo 1
(Kallianpur et al., 2005). A hemocromatose do tipo 1 é geralmente relacionada ao
funcionamento inadequado da proteína transmembrana HFE, sendo que esta
proteína normalmente permanece na membrana celular formando um complexo com
receptor de transferrina, onde provavelmente inibe a interação receptor de
transferrina (Kallianpur et al., 2005).
Foram descritas várias mutações no lócus HFE, localizado no cromossomo 6,
porém a mutação do alelo C282Y é a de maior relevância. Sua prevalência é de uma
mutação em cada dez indivíduos, em heterozigose e um em cada duzentos e
cinqüenta indivíduos, em homozigose. Esta mutação, que ocorre no nucleotídeo
845, resulta na troca do aminoácido 282 de cisteina para tirosina, diminuindo a
densidade de proteína HFE na membrana celular. Os homozigotos evoluem com
acúmulo de ferro e os heterozigotos estão mais predispostos a este acúmulo. Como
conseqüência dessa alteração molecular tem-se a perda do mecanismo de restrição
de incorporação do ferro plasmático em diferentes células, com seu conseqüente
acúmulo intracelular do íon. Este acúmulo de ferro leva à liberação de Fe +2 das
moléculas de ferritina, com posterior conversão citosólica em Fe +3 em processo que
libera os radicais superóxidos e hidroxila livre. Após a conversão do superóxido em
H2O2 pela superóxido dismutase tem-se o ataque e a peroxidação de lipídeos de
membrana e de diversas organelas citoplasmáticas, como mitocôndrias e
microssomos. Em situação de acúmulo intenso de ferro, a conseqüência inexorável
é a perda de função dos órgãos alvos, que progressivamente vão sendo substituídos
por fibrose (Kallianpur et al., 2005).
Introdução |6
Portanto, o genótipo HFE C282Y, heterozigoto ou homozigoto, devido ao alto
conteúdo de ferro hepático e níveis plasmáticos de ferro reativo, pode predispor a
DVOH, pelo grande estresse oxidativo e depleção de antioxidantes hepáticos.
(Kallianpur et al., 2005).
Kallianpur et al. (2005), analisaram o genótipo HFE associado a fatores de
risco como uso de vancomicina, regime de condicionamento e diagnóstico, em uma
população de 166 pacientes, submetidos a TCTH – 30(18,07%) destes pacientes
desenvolveram a DVOH pelos critérios de Baltimore; Daqueles 166 pacientes, 13
eram heterozigotos para HFE C282Y, dos quais cinco (38%) apresentaram DVOH;
sete eram homozigotos para esta mutação, apresentando DVOH em 3(43%).
Concluindo que pacientes portadores de pelo menos um genótipo mutado do
polimorfismo C282Y, predispõe a DVOH como fator independente, sendo que os
portadores em homozigose elevam este risco em relação aos heterozigotos.
1.4 Mutação da protrombina
Outro fator genético descoberto em 1980, envolvido na etiologia do
tromboembolismo, de herança autossômica dominante, caracterizado pela transição
da arginina pela glutamina no nucleotídeo 20210 na região 3’ do gene do fator 2 da
coagulação, foi associado ao aumento de protrombina. O aumento da protrombina
resulta em formação aumentada de trombina e maior risco de tromboembolismo
venoso (TEV). A mutação da protrombina, G20210A, é encontrada em 1-3% de
indivíduos da população geral, e em 6-18% de pacientes com tromboembolismo
venoso, sendo considerada a segunda anormalidade genética mais freqüente
associada ao TEV (Duggan et al., 1999; Bauduer, Lacombe, 2005).
Devido ao excesso de geração de trombina, levando ao estado de
hipercoagulabilidade secundário à variação genética, pode haver dano do endotélio
vascular hepático e predisposição a DVOH (Duggan et al., 1999; Bauduer, Lacombe,
2005).
Em estudo desenvolvido por Duggan et al. (1999), analisando 209 pacientes
submetidos a TCTH alogênico, encontrou-se um aumento de incidência do
Introdução |7
polimorfismo da protrombina em pacientes que desenvolveram DVOH (13%),
comparada a incidência da mutação na população geral que é de aproximadamente
1%, sugerindo um aumento do risco de DVOH.
1.5 Fator V Leiden
O fator V é uma molécula que é neutralizada pela proteína C ativada, a qual
funciona como enzima proteolítica, digerindo a molécula do fator V em três sítios. A
presença da troca de G-A na posição 1691 do gene resulta na substituição de
arginina por glutamina na posição do aminoácido 506, ocorrendo resistência à
neutralização pela proteína C ativada. Esta mutação está associada a um estado de
hipercoagulabilidade e susceptibilidade aumentada para ocorrência de TEV. O fator
V de Leiden, como é chamada esta mutação, aumenta o risco de trombose em
aproximadamente três a oito vezes em heterozigose e 50 a 100 vezes em
homozigose (Akar et al., 1997; Bauduer, Lacombe, 2005).
Esta mutação é altamente prevalente em diversas populações, sendo o
defeito genético mais freqüente envolvido na etiologia das trombofilias, podendo ser
um fator predisponente a desenvolvimento de DVOH (Bauduer, Lacombe, 2005).
Ertem e Akar (2000), analisando TCTH alogênico em 10 crianças com
doenças diferentes, com presença de DVOH em 4 delas, notou-se a presença desta
mutação em 3 pacientes. Conclui-se que a mutação do fator V de Leiden pode
predispor a DVOH, apesar da pequena casuística estudada.
1.6 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHF)
A hiperhomocisteinemia é um fator de risco estabelecido para trombose
venosa, sendo que variáveis genéticas e ambientais interagem para determinar os
níveis plasmáticos de homocisteína. Causas adquiridas de hiperhomocisteinemia
incluem deficiências nutricionais de vitaminas B6, B12, ácido fólico, idade avançada,
IRC(Insuficiencia renal crônica) e uso de anti-folatos (Friedman et al., 1999). O alto
consumo de metionina, tabagismo, consumo de café, uso de medicamentos
Introdução |8
(metotrexato, ciclosporina, anticonvulsivantes), sexo, idade e a função tiroideana são
importantes determinantes do nível da homocisteína (D'Angelo et al., 2003).
Defeitos genéticos envolvendo a enzima metilenotetrahidrofolato redutase
(MTHFR), que participa do metabolismo intracelular de homocisteína, resultam em
deficiência
enzimática
e
hiperhomocisteinemia.
Numerosas
mutações
na
Metilenotetrahidrofolato foram identificadas, mas duas delas merecem citação:
MTHFR C677T (em homozigose) é associada à produção de uma proteína
termolábil com atividade enzimática reduzida, resultando em hiperhomocisteinemia
leve a moderada (Kang et al., 1988); e a mutaçao A1298C (Friedman et al., 1999)
que apresenta atividade semelhante, sem contudo induzir a produção de enzima
termolábil.
Em uma metanálise (Den Heijer et al., 2005), foram analisados 53 estudos
envolvendo 8364 casos, sobre a associação entre o genótipo 677TT da MTHFR e a
ocorrência de TEV. O genótipo 677TT associou-se com aumento em 20% no risco
(IC95% 8-32), quando comparado ao genótipo 677CC.
De modo geral, portanto, existem evidências de uma modesta associação
entre homocisteína e TEV. O risco associado ao genótipo 677TT na metanálise dos
estudos não-americanos, favorece a hipótese de que essa associação seja causal e
não conseqüência do evento trombotico e conseqüentemente, o desencadeando
(Den Heijer et al., 2005), podendo com isso associar a presença do polimorfismo e
predisposição à DVOH.
Introdução |9
Proteína (dieta)
Ácido Fólico
CH3
THF
CH3
Compostos
Metilados
Metionina
MTR
5-10 MTHF
Vit. B12
MTHFR
5 MTHF
Homocisteína
CBS
REMETILAÇÃO
Serina
Vit. B6
Cisteína
TRANSULFURAÇÃO
THF: tetrahidrofolato; 5 MTHF: 5-metil-tetrahidrofolato; 5-10 MTHF: 5-10-metileno-tetrahidrofolato
(Rodrigues, 2006).
Figura 1. Metabolismo da homocisteína.
Na via da remetilação, a homocisteína pode novamente originar a metionina,
processo que é dependente das enzimas metileno-tetrahidrofolato redutase
(MTHFR) e metionina sintase (MTR), da vitamina B12 e do folato. Na via de
transulfuração, parte da homocisteína reage com a serina para formar a cistationina,
em reação catalisada pela enzima cistationina -sintase (CBS) e seu cofator, a
piridoxina (Friedman et al.,1999).
2. OBJETIVOS
O b j e t i v o s | 11
1- Verificar a presença da mutação dos genes da glutationa S-transferase e da
metilenotetrahidrofolato redutase e as mutações dos genes da HFE, protrombina e
fator V Leiden
em pacientes submetidos ao TCTH alogênico, e a eventual
associação destes com a DVOH.
2- Avaliar a importância dos fatores genéticos acima citados na gênese e severidade
da DVOH.
3- Correlacionar a presença de genes mutados e variáveis como: tipo de regime de
condicionamento, uso de vancomicina, presença de citomegalovírus, uso de nutrição
parenteral, alteração da função hepática, e o tipo de doenças englobadas, e o risco
de desenvolver DVOH.
O b j e t i v o s | 12
3. MATERIAL E MÉTODOS
M a t e r i a l e M é t o d o s | 14
3.1 Casuística
Este projeto utilizou amostras de sangue periférico de pacientes submetidos a
TCTH,
assim
distribuídos:
(UNIFESP/EPM), 41
41
pacientes
do
Hospital
São
Paulo
(HSP)
do Hospital Santa Marcelina (HSM) e 38 do Instituto de
Oncologia Pediátrica (IOP-GRAAC), totalizando 120 amostras analisadas. Estas
amostras foram obtidas no período pré - TCTH.
Os dados clínicos dos pacientes foram compilados dos arquivos e bancos de
dados das unidades de transplante destas instituições. 92 pacientes dispunham de
DNA em biblioteca construída no laboratório de Histocompatibilidade da Disciplina
de Imunogenética do Departamento de Pediatria da UNIFESP/EPM, onde pacientes
e familiares têm seus testes de compatibilidade HLA executados. Esta biblioteca
mantém alíquotas de DNA extraídas de células mononucleares de sangue periférico,
obtidas no momento da tipagem HLA. A quantidade de DNA empregada em nossos
ensaios foi de aproximadamente 80 - 100 nanogramas. Os demais vinte e oito
pacientes tiveram suas amostras colhidas antes de iniciar o regime de
condicionamento para o TCTH.
Os pacientes que estiveram em seguimento pós -TCTH foram submetidos a
termo de consentimento, os quais foram previamente assinados, autorizando que
parte de seu DNA estocado fosse destinado a este estudo. Dos 120 pacientes
avaliados, 62 eram do gênero masculino e 58 do gênero feminino; desses 11 eram
portadores de Anemia Aplastica Severa, designados como Falência medular; 30 de
Doenças Mieloproliferativas Crônicas (19 pacientes portadores de LMC, dos quais
cinco (5) foram transplantados em fase crônica, 14 em fase acelerada, e 11
portadores de Síndrome Mielodisplásica). Analisamos 58 pacientes com leucoses
agudas, sendo vinte e oito (28) LMA e trinta (30) LLA; 21 foram classificados como
portadores de Doenças Linfoproliferativas Crônicas (uma Leucemia Linfoide
Crônica(LLC), quatro Mieloma Múltiplo (MM), 14 Linfomas Não Hodgkin (LNH) e dois
Linfoma de Hodgkin (LH) ).
M a t e r i a l e M é t o d o s | 15
No diagnostico clinico e de severidade da DVOH foram seguidos os critérios
adotados por Seattle Modificado (Shulmann, Hinterberger, 1992), como no quadro
abaixo, sendo também colocado em destaque critérios utilizados por outros autores,
com finalidade comparativa:
Quadro 1. Critérios diagnósticos de DVOH
1 – Critério de Seattle (McDonald et al., 1984).
Desenvolvimento de pelo menos 2 de 3 quadros clínicos apresentados abaixo:
1- Icterícia
2- Hepatomegalia com dor no quadrante superior do hipocôndrio direito.
3- Ascite e ou ganho de peso inexplicado.
2 – Critério de Baltimore (Jones et al., 1987).
Desenvolvimento de hiperbilirrubinemia no soro > 2 mg/dL dentro de 21 dias após o TCTH e pelo
menos 2 sinais clínicos e sintomas abaixo:
1. Hepatomegalia dolorosa
2. Ganho de peso superior a 5% do peso de entrada
3. Ascite.
3 – Critérios de Seattle Modificado (Shulman, Hinterberger, 1992).
Desenvolvimento de pelo menos 2 de 3 quadros clínicos dentro de 20 dias após o TCTH:
1. Hiperbilirrubinemia no soro > 2 mg/dL
2. Hepatomegalia com dor no quadrante superior do hipocôndrio direito
3. Ganho de peso > 2% do peso de entrada devido à retenção de líquido.
As características das variáveis analisadas que predispõem ao evento
pesquisado, estão descritas abaixo, e sumarizadas na tabela A.
1. Regimes de condicionamento

1A-Regimes de condicionamento à base de ciclofosfamida (Cy) constituindose dos seguintes protocolos: [(Cy120mg/Kg + Mel140mg/m 2) (Smith, 2006);
(Cy120mg/Kg + TBI1200) (Clift et al., 1991; Blaise et al., 1992); (Cy120mg/Kg
+ Bu16mg/Kg) (Copelan et al, 1992), (Cy150mg/Kg + Bu16mg/Kg + VP 16-
M a t e r i a l e M é t o d o s | 16
1200/m2) (Spitzer et al., 1989); (Cy120mg/Kg + TBI1200 + Flu90mg/m2) (Storb
et al., 2001).

1B- Regimes de condicionamento à base de busulfan, constituindo-se nos
seguintes condicionamentos: [(Bu16mg/Kg + Cy120mg/Kg) (Copelan et al.,
1992), (Bu16mg/Kg + Flu90mg/m2) (Iravani et al., 2007); (Bu 16mg/Kg
+
Cy150mg/Kg); (Bu16mg/Kg + Cy120mg/Kg + VP16 1200mg/m 2) (Spitzer et
al., 1989); (Bu16mg/Kg + Mel200mg/m2); (Bu 8mg/Kg + ATG 40mg/Kg +
Flu150mg/m2) (Schetelig et al., 2004).

1C- Regimes de condicionamento à base de irradiação corpórea total,
aqueles que utilizaram TBI com: [(TBI1200 + Cy120mg/Kg) (Clift et al., 1991;
Blaise et al., 1992); (TBI1320 + Cy120mg); (TBI + Mel140mg/m2). Outros
protocolos:
(Flu90mg/m2
+
Mel140mg/m2);
(Ida-Flag);
(Bu8mg/Kg
-
2
ATG40mg/Kg + Flu150mg/m ) (Schetelig et al., 2004).

1D- Os seguintes protocolos Cy120mg/Kg + Mel140mg/m 2; Cy120mg/Kg +
TBI1200; Cy120mg/Kg + Bu16mg/Kg; Cy150mg/Kg + Bu16mg/Kg + VP161200/m2 ; Cy120mg + TBI1200 + Flu90mg/m2; Bu16mg/Kg + Cy120mg/Kg;
Bu16mg/Kg + Flu90mg/m2; Bu16mg/Kg + Cy150mg/Kg; Bu16mg/Kg +
Cy120mg + VP16- 1200mg/m2; Bu16mg/Kg + Mel20mg/m2; TBI1200 +
Cy120mg; TBI1320 + Cy120mg/Kg; TBI1200 + Mel140mg/m 2 (Bearman et al.,
1993) foram considerados como mieloablativos.

1E- Os os protocolos Mel100mg/m2; Flu90mg/m2 +TBI1200; Flu90mg/m2 +
Mel140mg/m2; Ida-Flag; Bu8mg/Kg + ATG40mg/Kg + Flu150mg/m 2 foram
considerados como não-mieloablativos.
2. Uso de NPT(Nutrição parenteral). A indicação de NPT ocorreu nos pacientes com
as seguintes condições clínicas: mucosite grau II ou superior, perda ponderal de
10% do peso de entrada, náuseas e vômitos incoercíveis e diarréia persistente.
3. Sorologia pré-TCTH do receptor para o citomegalovirus (McDonald et al., 1993;
Kami et al., 1997).
M a t e r i a l e M é t o d o s | 17
4. Alterações de função hepática pré-TCTH. A alteração de TGP e TGO foi
considerada como variável de risco para toxicidade e DVOH (Jones et al.,1987;
McDonald et al., 1993; Kami et al.,1997).
5. O uso da vancomicina pré-TCTH e intra-TCTH (McDonald et al., 1993).
6. As doenças foram agrupadas em: A – Leucose Aguda. B – Doenças
Mieloproliferativas Crônicas, C – Doenças Linfoproliferativas Crônicas. D –
Falência Medular.
As variáveis acima citadas, a associação entre elas e os polimorfismos foram
analisados como fatores de risco para DVOH.
Tabela A. Caracteristicas clínicas do estudo.
Centro de Transplante
Idade
Características
Frequência (%)
HSP
1-41(34%)
CSSM
2- 41(34%)
IOP-GRAAC
3- 38(32%)
Minimo
2 anos
Máximo
69 anos
Média
28,5 anos
Masculino
62(52%)
Feminino
58(48%)
Leucose Aguda
58(48%)
Doenças Mieloproliferativas Crônicas
30(25%)
Doenças Linfoproliferativas Crônicas
21(18%)
Falências Medulares.
11(9%)
Bussulfan (Sim/Não)
67/53(56%/44%)
p = 0,17
Ciclofosfamida (Sim/Não)
92/28(77%/23%)
p = 0,17
Irradiação corpórea total (Sim/Não)
37/83(31%/69%)
p = 0,85
Mieloablativo
91(76%)
Não Mieloablativo
29(24%)
Sim
43(26,7%)
Não
76(63,3%)
Sim
65(54%)
Não
55(46%)
Sexo
Valor p
p = 0,16
Diagnosticos
Regimes de
Condicionamento
contendo:
Tipo de TCTH
p = 0,41
NPT
p = 0,11
Vancomicina
p = 0,19
M a t e r i a l e M é t o d o s | 18
Positivo
102(86%)
negativo
17(14%)
Elevada
1 – 12
Normais
2 – 108
CMV receptor
p = 0,63
TGO/TGP/FA/GGT/Ferritina
O trabalho foi aprovado pelos Comitês de Ética das Instituições participantes
(Anexo 1). Os pacientes em seguimento após o transplante assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).
3.2 Metodologia
3.2.1 Extração e amplificação de DNA
O DNA foi extraído através do método DTAB/CTAB (dodecyl trimethylammonium bromide/cetyl trimethyl –ammonium bromide) de acordo com Gustincich
et al. (1991).
Em um tubo de 2 ml foram colocados 450 l de sangue total e 450 l de
solução de DTAB (dodecyl trimethyl-ammonium bromide) a 12%. Após incubação
em banho-maria a 68º C, por 5 minutos, foram adicionados 900 l de clorofórmio e
imediatamente agitado o tubo em vórtex. Os tubos foram centrifugados a 10.000
rpm, durante 2 minutos, resultando na separação do material em três fases.
Aproximadamente 500 l da fase superior foram transferidos para um tubo de 1,5 ml,
contendo 900 l de H2O destilada e 100 l de CTAB (cetyl trimethyl-ammonio
bromide) a 5%,que foi invertido até que o precipitado de DNA-CTAB estivesse
formado. Após centrifugação a 10.000 rpm, por 2 minutos, o pellet de DNA foi
dissolvido em 300 l de solução de NaCl 1,2 M. Foram adicionados a seguir 750 l
de etanol 99,5 % e, inverteu-se o tubo manualmente por 1 ou 2 minutos, sendo o
DNA novamente precipitado. A amostra foi centrifugada a 13.000 rpm, durante 2
minutos. O sobrenadante foi descartado e o DNA lavado mais uma vez com 1 ml de
etanol 70%, seguindo-se centrifugação a 13.000 rpm, por 2 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o DNA, dissolvido em 50 a 200 l de H2O destilada.
M a t e r i a l e M é t o d o s | 19
A concentração final do DNA foi de aproximadamente 100 ng/l e foi medida
através de um espectrofotômetro (UltroSpec III, Pharmacia Biothech, Uppsala,
Suécia) por meio da leitura das absorbâncias a 260, 280 e 320 nm. A pureza do
DNA foi determinada pela razão (A260/A280), que esteve entre 1,65 e 1,80
(Gustincich et al., 1991).
3.2.2 Identificação da presença do polimorfismo
A partir do DNA extraído, foram utilizadas diferentes estratégias diagnósticas,
a partir da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), para análise dos
polimorfismos dos genes HFE, Fator V, Protrombina, Glutathiona-S Transferase
(GST) e Metilenotetrahidrofolato-redutase (MTHFR). Em todas as amplificações
utilizou-se termociclador Gene Amp/PCR System 9700 (Applied Biosystems).
3.2.3 Glutationa-S Transferase (GST)
Os genes da GST mu e teta, (GST- μ e GST- θ) respectivamente, foram
amplificados por PCR multiplex (Wilson et al., 2000). O polimorfismo do gene GST
π, foi identificado pela PCR seguido de digestão com enzima específica (Lu et al.,
2006).
Para identificação do polimorfismo dos genes GST- μ e GST- θ foram
utilizados primers específicos além de primers para o gene da globina beta que
serviu como controle interno da reação, conforme descrito na Quadro 2.
Quadro 2. Seqüência de primers utilizados para amplificação dos genes GST- μ e GST- θ, seu
sentido e tamanho do produto obtido.
Primer
Seqüência
Tamanho
GST- μ
GST μ (sense)
5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'
GST μ (antisense)
5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG 3'
GST- θ
215 pb
M a t e r i a l e M é t o d o s | 20
GST θ (sense)
5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 3'
GST θ (antisense)
5' TCACCGGATCATGGCCAGCA 3'
480 pb
-globina
H5 (sense)
5’ – GAAGAGCCAAGGACAGGTAC – 3´
H6 (antisense)
5’ – CAACTTCATCCACGTTCACC – 3’
268 pb
Esta reação foi feita para um volume final de 50l utilizando-se 0,2mM de
cada DNTP; 10pmol de cada primer; 2,5mM de MgCl2; 100ng DNA genômico e
1,25U de Taq Polimerase (DNA polimerase termo estável, Invitrogen). Após
desnaturação inicial de 2 minutos a 95ºC, foram realizados 40 ciclos assim
determinados: desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 58°C por 1 minuto,
e extensão a 72°C por 1 minuto. Após o ultimo ciclo, a mistura foi incubada em 72°C
por 10 minutos.
Os produtos da reação foram observados em gel de agarose 2% em tampão
TEB 1X por 1 hora a 80 volts sob coloração com brometo etídio para visualização
sob iluminação ultravioleta. O resultado mostrou sempre a presença do fragmento
da -globina de 268pb (controle interno da reação). Na presença de indivíduo normal
para os genes GST- μ e GST- θ, observou-se também os fragmentos de 215 e
480pb. Já nos pacientes GST- μ nulo, somente o fragmento de 480pb pode ser
visto, enquanto que naqueles GST- θ nulo foi visualizado apenas o fragmento de
215pb. Indivíduos negativos para ambos os genes apresentaram somente o controle
interno (Quadro 3).
Quadro 3. Análise dos resultados da PCR multiplex para diagnóstico de polimorfismo dos
genes GST- μ e GST- θ
Resultado
GST- μ
GST- θ
-globina
Indivíduo normal
215pb
480pb
268pb
GST- μ nulo
--
480pb
268pb
GST- θ nulo
215pb
--
268pb
GST- μ e θ nulo
--
--
268pb
M a t e r i a l e M é t o d o s | 21
Para pesquisa do polimrofismo da GST-π foi utilizada a PCR seguida por
digestão do seu produto com enzima específica. No Quadro 4 estão relacionadas as
seqüências dos primers, seu sentido e o tamanho do produto de amplificação obtido.
Quadro 4. Seqüência de primers utilizados para amplificação da GST- π, seu sentido e
tamanho do produto obtido.
Primer
Seqüência
GST π (sense)
5’ – GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG – 3´
GST π (antisense)
5’ – AGCCACCTGAGGGGTAAG – 3’
Tamanho
433 pb
Para esta amplificação foram utilizados os primers GST π. Nesta reação, feita
para um volume final de 50l, utilizou-se 0,25mM de cada DNTP; 30pM de cada
primer; 3,0mM de MgCl2; 250ng DNA genômico e 1,5U de Taq Polimerase
(Invitrogen). Após desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, foram realizados 30
ciclos assim determinados: 1 ciclo com desnaturação a 94°C por 30 segundos,
anelamento a 64°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 30 segundos; 1 ciclo com
desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 63°C por 30 segundos,
extensão a 72°C por 30 segundos; 1 ciclo com desnaturação a 94°C por 30
segundos, anelamento a 62°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 30 segundos;
1 ciclo com desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 61°C por 30
segundos, extensão a 72°C por 30 segundos; 1 ciclo com desnaturação a 94°C por
30 segundos, anelamento a 60°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 30
segundos e 25 ciclos com desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a
59°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 30 segundos. Após o último ciclo, foi
realizada extensão a 72ºC por 5 minutos. O fragmento obtido apresentava tamanho
correspondente a 433pb e pode ser observado sob iluminação ultravioleta após
eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TEB 1X por 1 hora a 80 volts sob
coloração com brometo etídio.
M a t e r i a l e M é t o d o s | 22
3.2.3.1 Digestão do DNA amplificado pela enzima de restrição
Para identificação da mutação utilizou-se a enzima BsmAI nas seguintes
condições: para cada reação foram utilizados Tampão 1x, 3,0mM MgCl 2, 0,25mM de
DNTPs (Trifosfato de Deoxiribonucleotideos), 0,3mM de Primer Sense, 0,3 mM de
Primer Antisense e 1,5U de Taq Polimerase para um volume total de
25ul.(Invitrogem). As condições da PCR foram 94ºC por 5min de desnaturação
inicial, seguidos por 5 ciclos onde a temperatura de anelamento decresceu em 1ºC a
cada ciclo (1 ciclo: 30s a 94ºC, 30s a 64ºC, 30s a 72ºC), em seguida foram 25 ciclos
de 94ºC por 30s, 59ºC por 30s, 72ºC por 30s e uma extensão final de 72ºC por 5min.
Dez microlitos de produto da PCR (433pb) foram digeridos em 5 unidades da enzima
de restrição BsmAI (Fermentas) a 37ºC, “overnight” em termomixer (Eppendorf); os
produtos da digestão, listados no Quadro 5, foram separados por eletroforese em gel
de agarose a 2% nas mesmas condições descritas anteriormente.
Quadro 5. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação do polimorfismo do
gene GST- π e fragmentos obtidos após digestão.
Mutação
GST- π
.
Enzima de
Restrição
Fragmentos (pb)
Normal
Homozigoto
Heterozigoto
328 e 105pb
222, 106 e 105pb
328, 222, 106 e 105pb
BsmA I
M a t e r i a l e M é t o d o s | 23
Figura 2. PCR GST π.
O indivíduo 25 apresenta as bandas de 222, 106 e 105 pb definido como GG (mutado); os
indivíduos 27 e 29 apresentam as bandas de 328, 222, 106 e 105pb definidos como AG
(heterozigotos), enquanto que os demais apresentam as bandas de 328 e 105pb, considerados
AA (não mutados).
Figura 3. PCR GST μ e θ.
Os indivíduos 126, 130, 131, 145, 150 e 155 apresentam fragmentos de 215pb (GST μ), 268pb
(β-Globina) e 480pb (GST θ) sendo considerados não mutados; os indivíduos 152, 164 e 165
apresentam ausência da banda de 215pb (GST μ), sendo considerados mutados; os indivíduos
117 e 144 apresentam ausência da banda de 480pb (GST θ), sendo considerados mutados.
M a t e r i a l e M é t o d o s | 24
3.2.4 Gene HFE
Para análise das mutações C292Y, H63D e S65C do gene HFE foi utilizada a
amplificação de regiões específicas do gene HFE por PCR seguida de digestão
enzimática dos sítios de mutação. A reação de PCR foi feita utilizando-se primers
específicos (Simonsen et al., 1999; Feder et al., 1996) conforme relacionado no
Quadro 6:
Quadro 6. Relação dos primers, sentido e tamanho do produto da PCR para as mutações
C282Y, H63D e S65C do gene HFE
Primer
Seqüência
Tamanho
Mutação C282Y (Simonsen et al., 1999; Feder et al., 1996)
Cys-F6 (sense)
5´-TGCCTCCTTTGGTGAAGGTGACAC-3´
Cys-R5 (antisense)
5´-CTCAGGCACTCCTCTCAACC-3´
343 pb
Mutações H63D e S65C (Simonsen et al., 1999)
His-F1 (sense)
5´-TCACACTCTCTGCAGTACCTCTTCATGG-3`
His-R4 (antisense)
5´-TACACAGTGAACATGTGATCCCACC-3´
224 pb
Para amplificação do fragmento que contem a mutação C282Y foram
utilizados os primers Cys-F6/Cys-R5 (Simonsen et al., 1999; Feder et al., 1996).
Nesta reação, feita para um volume final de 25l, utilizou-se 0,2mM de cada DNTP
(deoxinucleotídeo); 10pM de cada primer; 2,5mM de MgCl2; 250ng DNA genômico e
0,675U de Taq Polimerase (DNA polimerase termo estável, Invitrogen). A reação
consistiu de 35 ciclos assim determinados: desnaturação a 94°C por 30 segundos,
anelamento a 67°C por 30 segundos, e extensão a 72°C por 30 segundos. Após o
ultimo ciclo, a mistura foi incubada em 72°C por 5 minutos. O fragmento obtido
apresentava tamanho correspondente a 343pb (pares de base).
Para amplificação do fragmento que contem as mutações H63D e S65C,
foram utilizados os primers His-F1/His-R4 (Simonsen et al., 1999). Para um volume
final de 50 l utilizou-se 0,2mM de cada DNTP; 10pM de cada primer; 2,0mM de
M a t e r i a l e M é t o d o s | 25
MgCl2; 500ng DNA genômico e 1,25U de Taq Polimerase (Invitrogen). A mistura foi
submetida às mesmas condições de amplificação descritas à cima, sendo
observados um produto de amplificação equivalente a 224 pb.
Os produtos da reação foram observados em gel de agarose 2% em tampão
TEB (tris-EDTA-botato) 1X por 1 hora a 80 volts sob coloração com brometo etídio
para visualização sob iluminação ultravioleta.
3.2.4.1 Digestão do DNA amplificado pelas enzimas de restrição
As enzimas de restrição utilizadas são especificas para confirmação de cada
mutação, conforme observado no Quadro 7.
Quadro 7. Mutação do gene HFE analisada, localização, enzima de restrição utilizada e
seqüência de clivagem específica.
Mutação
Localização
Enzima de restrição
Clivagem
C282Y
Exon 4
Rsa I
GTAC
H63D
Exon 2
Dpn II
GATC
S65C
Exon 2
Hinf I
GAnTC
Para a mutação C282Y foi utilizada a enzima Rsa I (Gibco-BRL ou New
England Biolab) do seguinte modo: 10l do produto da PCR, 1l da enzima, 2l do
tampão correspondente para um volume final de 20l. Esta mistura foi incubada por
4 horas a 37C. O produto da digestão foi visualizado, por luz ultravioleta, após
eletroforese em gel de agarose a 2% com tampão TEB 1X por 1 hora e 30 minutos a
80 volts com brometo de etídeo. A identificação do indivíduo sem mutação, do
heterozigoto e do homozigoto mutante foi feita segundo número de fragmentos
obtidos após digestão conforme listado no Quadro 8.
Para a mutação H63D foi utilizada a enzima Dpn II (Gibco-BRL ou New
England Biolab) nas seguintes condições: 10l do produto da PCR, 1l da enzima,
M a t e r i a l e M é t o d o s | 26
2l do tampão correspondente para um volume final de 20l. A incubação foi de
18hs a 37ºC e os produtos da digestão, listados no Quadro 8, foram visualizados sob
luz ultravioleta após corrida em gel de agarose a 2% conforme descrito acima.
Para a mutação S65C, utilizou-se a enzima Hinf I (Gibco-BRL ou New
England Biolab) conforme descrito: 5l do produto da PCR, 1l da enzima e 1l do
tampão correspondente para um volume final de 10l. Após incubação a 37°C
durante aproximadamente 18 horas, os produtos da digestão, listados no Quadro 8,
foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2% nas mesmas condições
descritas anteriormente.
Quadro 8. Fragmentos obtidos após digestão do produto de PCR e seu significado.
Fragmentos obtidos após digestão (pb)
Enzima de Restrição
Normal
Homozigoto
Heterozigoto
Rsa I
203 e 140
203, 111 e 29
203, 140, 111 e 29
Dpn II
118 e 105
224
224, 118 e 105
Hinf I
112 e 69
181
181, 112 e 69
M a t e r i a l e M é t o d o s | 27
200
150
100
50
Figura 4. PCR e Digestão C282Y.
Os indivíduos 31, 32 e 33 represetam o produto da reação de PCR – banda de 343pb. Os
indivíduos 31d e 32d representam o produto da digestão do PCR com a enzima RSAI, as
bandas de 140 e 203pb indicam indivíduos normais. Não foram indentificados indivíduos
heterozigotos e homozigotos (mutados).
Figura 5. Produtos da digestão do polimorfismo HFE H63D com a enzima de restrição Dpnll ou
Mbol (Ferramentas).
O indivíduo 205 apresenta as bandas de 105, 118 e 223pb caracterizando heterozigoto mutado;
os demais indivíduos são normais.
M a t e r i a l e M é t o d o s | 28
Figura 6. Produto da Digestão do polimotfismo HFE S65C com a enzima de restrição HinfI.
Os indivíduos 36 e 38 apresentam as bandas de 69 e 112pb, sendo portanto normais e os
indivíduos 190, 201 e 205 apresentam as bandas de 69, 112 e 181pb, caracterizados como
heterozigotos mutados. Não foram detectados indivíduos homozigotos mutados.
3.2.5 Mutação da protrombina 20210G→A e Fator V Leiden G1691A
As
mutações
da
protrombina
G20210A
e
FVL
foram
avaliadas
simultaneamente pela técnica de multiplex utilizando-se amplificação por reação em
cadeia mediada pela polimerase (PCR) descrita por Gómez et al. (1998).
Para cada reação de multiplex foram utilizados Tampão 1x, 1,5mM MgCl2,
0,2mM de DNTPs (Trifosfato de Deoxiribonucleotideos), 20pmol de cada Primer
Sense, 20pmol de cada Primer Antisense e 2,5U de Taq Polimerase para um volume
de 50ul.
As condições da PCR foram 94ºC por 05min de desnaturação inicial,
seguidos por 30 ciclos com desnaturação a 94ºC por 45s, anelamento de 45s a
57ºC, e 1min a 72ºC de extensão, seguida por 72ºC por 5min de extensão final.
O produto da PCR de 345pb (G20210A) e 220pb (FVL) foi digerido a
37ºC/overnight com 2,5U da enzima Hind III e 2,5 U de Mnl I, respectivamente
específicos para G20210A e FVL.
O fragmento de 345pb foi quebrado em 272 e 73pb em indivíduos sem
mutação para G20210A e 249, 73 e 23pb para indivíduos homozigotos para a
M a t e r i a l e M é t o d o s | 29
mutação. O produto de 220pb após a digestão apresentou 3 fragmentos de 116, 67,
e 37pb na ausência da mutação e 153 e 67pb, na presença do FVL.
Os produtos das digestões foram separados em gel de agarose low melting
point a 2%, corado com brometo de etidio. Foi usando um marcador de peso
molecular de 50pb.
Quadro 9. Características mutação Protrombina (G20210A) e FVLeiden.
Mutação
Enzima de
restrição
Fragmentos (pb)
PCR
Normal
Homozigoto
Heterozigoto
G20210A
Hind III
345
272, 73
249, 73,23
272, 249, 73, 23
FVL
Mnl I
220
116, 67, 37
153, 67
153, 116, 67, 37
89
107
350
300
250
200
150
116
100
58
50
23
Figura 7. Produto do PCR Multiplex para o Gene da Protombina.
O indivíduo 89 apresenta as bandas de 272, 116, 73/67, 37pb, caracterizando ausência de
mutação; o indivíduo 107 apresenta as bandas de 272, 249, 116, 73/67, 37/23pb, caracterizando
um heterozigoto mutado.
M a t e r i a l e M é t o d o s | 30
5
6
130
153
Figura 8. Produto do PCR multiplex para o Gene do Fator V de Leiden.
O indivíduo 130 apresenta as bandas de 272, 116, 73/67, 37pb, caracterizando ausência de
mutação; o indivíduo 153 apresenta as bandas de 272, 153, 116, 73/67, 37pb, caracterizando um
heterozigoto mutado.
3.2.6 Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)
A pesquisa da mutação C677T da MTHFR foi realizada pela PCR seguida por
digestão do produto da PCR com enzima específica segundo Frosst e cols. (1995) e
Friedman e cols.(1999) (Quadro 10).
Quadro 10. Seqüência de primers utilizados para amplificação da MTHFR, seu sentido e
tamanho do produto obtido.
Primer
Seqüência
MTHFR1 (sense)
5’ – TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA – 3’
MTHFR1 (antisense)
5’ – AGGACGGTGGCGGTGAGAGTG – 3’
Tamanho
198 pb
M a t e r i a l e M é t o d o s | 31
Para esta amplificação foram utilizados os primers MTHFR1. Nesta reação,
feita para um volume final de 50l, utilizou-se 0,2mM de cada DNTP; 10pM de cada
primer; 1mM de MgCl2; 100ng DNA genômico e 2,5U de Taq Polimerase
(Invitrogen). A reação consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos,
seguida de 30 ciclos: desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por
30 segundos, e extensão a 72°C por 30 segundos, além de extensão final a 72ºC
por 5 minutos. O fragmento obtido apresentava tamanho correspondente a 198pb.
Os produtos da reação foram observados em gel de agarose 2% em tampão
TEB 1X por 1 hora a 80 volts sob coloração com brometo etídio para visualização
sob iluminação ultravioleta.
3.2.6.1 Digestão do DNA amplificado pela enzima de restrição
Para identificação do Fator V Leiden utilizou-se a enzima Hinf I nas seguintes
condições: 5L do produto da PCR, 2,5U da enzima e 1L de tampão para um
volume final de 10L. Após incubação a 37°C durante aproximadamente 18 horas,
os produtos da digestão, listados no Quadro 11, foram separados por eletroforese
em gel de agarose low melting a 2% nas mesmas condições descritas anteriormente
(Frosst et al., 1995; Friedman et al., 1999).
Quadro 11. Detalhamento da enzima de restrição utilizada para identificação da mutação C677T
da MTHFR e fragmentos obtidos após digestão.
Mutação
Enzima de
Restrição
MTHFR
(C677T)
Hinf I (GANTC)
Fragmentos (pb)
Normal
Homozigoto
Heterozigoto
198pb
175 e 23pb
198, 175 e 23pb
M a t e r i a l e M é t o d o s | 32
38
39
44
40
45
131
Figura 9. Produto da digestão com a enzima de restrição Hinfl do PCR do Polimorfismo MTHFR
C677T.
Os indivíduos 38, 39 e 40 apresentam a banda de 198pb caracterizando normais; os indivíduos
44, 45 e 131 apresentam as bandas de 175 e 198pb caracterizando heterozigotos mutados.
3.3 Análise estatística
Os dados e as características clínicas foram comparados empregando-se os
testes exatos de Fisher, utilizando análise univariada. Esse procedimento visou à
obtenção de indicações do comportamento dos dados e ao enriquecimento das
conclusões que foram tomadas ao final da análise. Assim, em cada seção, foram
construídas tabelas de freqüências que mostram as distribuições conjuntas de
interesse. Nas tabelas de resultados, aparecem com destaque as associações
detectadas na amostra. Foram considerados significantes, os valores de p<0,05.
4. RESULTADOS
R e s u l t a d o s | 34
4.1 Estudo dos polimorfismos
4.1.1 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos relacionados ao
Bussulfan
Foram
analisados
102
pacientes,
sendo
que
55(53,9%)
receberam
condicionamento com busulfan, destes 36 (65,4%) foram normais para a mutação
GST
- e 19 (34,6%) foram nulos. De 47 pacientes que receberam outros
condicionamentos que não incluíram Bu, 27 (57,4%) foram normais e 20 (42,6%)
nulos (p=0,661).
Tabela 1. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento - BU.
Condicionamento - BU
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
27
36
63
Nulo
20
19
39
Total
47
55
102
4.1.2 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos relacionados a
ciclofosfamida
Foram analisados 75 de 102 analisadas, receberam condicionamento com
Cy, destes 48 (64%) foram normais para a mutação GST -  e 27 (36%) foram
nulos. De 27 pacientes que receberam outros condicionamentos que não incluíram
Cy, 15 (55,5%) foram normais e 12 (44,5%) nulos (p=0,422).
R e s u l t a d o s | 35
Tabela 2. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento - CY.
Condicionamento – CY
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
15
48
63
Nulo
12
27
39
Total
27
75
102
4.1.3 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos relacionados a TBI
Dezoito de 31 (58,06%) pacientes que receberam TBI foram normais para
GST -  e 13 (41,9%) nulos; 45 de 71 (63,4%) que não receberam foram normais e
26 (36,6%) nulos. (p=0,492).
Tabela 3. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST - e Condicionamento - TBI.
Condicionamento – TBI
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
45
18
63
Nulo
26
13
39
Total
71
31
102
Não houve diferença entre os pacientes condicionados com Bu, Cy ou TBI
versus aqueles não condicionados com estes regimes no tocante à GST -  normal
ou nulo, daí a toxicidade desencadeada por estes condicionamentos e a presença
de GST - normal ou nulo não pode ser avaliada.
R e s u l t a d o s | 36
4.1.4 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos Mieloablativos e Nãomieloablativos
Apenas
11
de
102
pacientes
receberam
condicionamentos
não-
mieloablativos, destes 6 (54,5%) mostraram-se com GST - normal e 5 (46,5%)
nulos. Dos pacientes que receberam condicionamentos mieloablativos, 57 (62,6%)
de 91 foram normais e 34 (37,3%) nulos. A avaliação da toxicidade desencadeada
pela normalidade do gene GST -  ficou prejudicada pelo número baixo de pacientes
que receberam condicionamentos não-mieloablativos (p- 0,745).
Tabela 4. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Tipo de condicionamento.
Tipo de condicionamento
GST - 
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
57
6
63
Nulo
34
5
39
Total
91
11
102
4.1.5 Polimorfismo da GST -  e uso de nutrição parenteral total
Foram analisados 38 (37,1%) pacientes que receberam NPT de um total de
101 casos; destes, 25 (65,7%) foram normais para a mutação GST -  e 13 (34,2%)
foram nulos. De 63 (62,3%) pacientes que não receberam NPT, 38 (60,3%) foram
normais e 25 (39,6%) nulos (p=0,673)
Tabela 5. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e NPT.
NPT
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
38
25
63
Nulo
25
13
38
Total
63
38
101
R e s u l t a d o s | 37
4.1.6 Polimorfismo da GST -  e positividade do receptor ao CMV
Foram analisados 87 pacientes CMV positivos num total de 101 casos;
destes, 53 (60,9%) foram normais para a mutação GST -  e 34 (39%) foram nulos.
De 14 (13,8%) pacientes que eram CMV negativos, 9 (64,2%) foram normais e 5
(35,7%) nulos (p=0,999)
Tabela 6. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e positividade ao receptor ao
CMV.
CMV Recp
GST - 
Total
Negativo
Positivo
Normal
9
53
62
Nulo
5
34
39
Total
14
87
101
4.1.7 Polimorfismo da GST -  e enzimas hepáticas pré-TCTH do
receptor
Foram analisados 11 pacientes que apresentavam enzimas hepáticas
alteradas pré-TCTH numa amostragem de 100 casos; destes, 6 (54,5%) foram
normais para a mutação GST -  e 5 (45,5%) foram nulos. De 89 (89%) pacientes
que não apresentaram alteração de enzimas hepáticas pré-TCTH, 55 (61,7%) foram
normais e 34 (38,2%) nulos (p=0,747)
Tabela 7. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Enzimas Hepaticas Pré TCTH
do receptor.
Enzima Hep. Pré TCTH
GST - 
Total
Normal
Alterado
Normal
55
6
61
Nulo
34
5
39
Total
89
11
100
R e s u l t a d o s | 38
4.1.8 Polimorfismo da GST -  e uso de vancomicina no TCTH
Foram analisados 73 casos que usaram vancomicina pré e intra-- TCTH numa
casuística de 102 pacientes; destes, 47 (64,4%) foram normais para a mutação GST
- e 26 (35,6%) foram nulos. De 29 (28,4%) pacientes que não usaram
vancomicina pré e intra-TCTH, 16 (55,1%) foram normais e 13 (44,8%) nulos
(p=.0,499)
Tabela 8. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e uso de Vancomicina.
Vancomicina
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
16
47
63
Nulo
13
26
39
Total
29
73
102
4.1.9 Polimorfismo da GST -  e grupos de diagnostico
Foram analisados 26 pacientes que tinham como diagnostico doença
mieloproliferativa crônica, numa população de 102 casos; destes, 17 (65,3%) foram
normais para a mutação GST- e 9 (34,6%) foram nulos. Nas Leucoses Agudas em
48 pacientes analisados de 102, 29 (60,4%) foram normais para mutação GST- 19
(39.6%) foram nulos. De 9 (8,8%) pacientes com diagnóstico de falência medular
analisados em 102 pacientes, 6 (66,6%) foram normais para mutação GST- e 3
(33,3%)
nulos.
De
19
(18,6%)
pacientes
com
diagnóstico
de
doenças
linfoproliferativas analisados em 102 casos, 11 (57,8%) foram normais para mutação
GST- e 8 (42,1%) nulos. (p=.0,957)
R e s u l t a d o s | 39
Tabela 9. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e grupos de diagnostico.
Diagnóstico
GST - 
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
11
6
29
17
63
Nulo
8
3
19
9
39
Total
19
9
48
26
102
4.1.10 Polimorfismo da GST - e condicionammentos baseados em
bussulfan
Foram analisados 57 pacientes que receberam condicionados com bussulfan,
entre 105 analisados; destes, 52 (91,2%) foram normais para a mutação GST- e 5
(8,7%) foram nulos. De 48 pacientes que receberam outros condicionamentos que
não incluíram Bu, 43 (89,5%) foram normais e 5 (10,4%) nulos (p=0,169).
Tabela 10. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento - BU.
Condicionamento – BU
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
43
52
95
Nulo
5
5
10
Total
48
57
105
R e s u l t a d o s | 40
4.1.11 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos baseados em
ciclofosfamida
Foram analisados 78 pacientes que receberam condicionados com Cy numa
amostra de 105; destes, 70 (89,7%) foram normais para a mutação GST - e 8
(10,2%) foram nulos. De 27 pacientes que receberam outros condicionamentos que
não incluíram Cy, 25 (92,5%) foram normais e 2 (8%) nulos (p=0,999)
Tabela 11. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento - CY.
Condicionamento – CY
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
25
70
95
Nulo
2
8
10
Total
27
78
105
4.1.12 Polimorfismo da GST -  e condicionammentos baseados em TBI
Vinte e sete (25,7%) de 105 pacientes que receberam TBI foram normais para
GST-  e 5 (4,7%) nulos; 68 (93,1%) de 73 pacientes que não receberam TBI foram
normais e 5 (6,8%) nulos para GST-  (p=0,999)
Tabela 12. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Condicionamento - TBI.
Condicionamento – TBI
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
68
27
95
Nulo
5
5
10
Total
73
32
105
R e s u l t a d o s | 41
4.1.13 Polimorfismo da GST -  e condicionamentos Mieloablativos e
Não-mieloablativos
Apenas 11 (10,4%) de 105 pacientes receberam condicionamentos nãomieloablativos; destes, 10(90,9%) mostraram-se com GST -  normal e 1(9,1%) nulo.
Dos pacientes que receberam condicionamentos mieloablativos, 85(90,4%) de 94
foram normais e 9 (9,5%) nulos. A avaliação da toxicidade desencadeada pela
anormalidade do gene GST -  ficou prejudicada pelo número baixo de pacientes
que receberam condicionamentos não-mieloablativos (p=.0,999)
Tabela 13. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e condicionamentos mielo e
não-mieloablativos.
Tipo de condicionamento
GST - 
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
85
10
95
Nulo
9
1
10
Total
94
11
105
4.1.14 Polimorfismo da GST -  e uso de nutrição parenteral total
Foram analisados 38 entre 104 pacientes, que receberam NPT; destes, 35
(92,1%) foram normais para a mutação GST - e 3 (7,8%) foram nulos. De 66
(63,4%) pacientes que não receberam NPT, 59 (89,3%) foram normais e 7 (10,6%)
nulos (p=0,743).
R e s u l t a d o s | 42
Tabela 14. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e NPT.
NPT
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
59
35
94
Nulo
7
3
10
Total
66
38
104
4.1.15 Polimorfismo da GST -  e positividade do receptor ao CMV
Foram analisados 90 (86,5%) de 104 pacientes que eram CMV positivos;
destes, 80 (88,8%) foram normais para a mutação GST - e 10 (11,2%) foram
nulos. De 14 (13,5%) pacientes que eram CMV negativos, 14 (100%) foram normais
e 0 (0%) foi nulo (p=0,351).
Tabela 15. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e positividade do receptor ao
CMV
CMV Recp
GST - 
Total
Negativo
Positivo
Normal
14
80
94
Nulo
0
10
10
Total
14
90
104
4.1.16 Polimorfismo da GST -  e enzimas hepaticas pré-TCTH
Foram analisados 12 (11,6%) de 103 pacientes que apresentavam enzimas
hepáticas alteradas pré-TCTH; destes, 10 (83,3%) foram normais para a mutação
GST - e 2 (16,7%) foram nulos. De 91 (88,4%) pacientes que não apresentaram
R e s u l t a d o s | 43
alteração de enzimas hepáticas pré TCTH, 83 (91,2%) foram normais e 8 (8,8%)
nulos (p=0,329).
Tabela 16. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e enzimas hepáticas pré-TCTH.
Enzima Hep. Pré TCTH
GST - 
Total
Normal
Alterado
Normal
83
10
93
Nulo
8
2
10
Total
91
12
103
4.1.17 Polimorfismo da GST -  e uso de vancomicina
Foram analisados 75 (71,4%) numa amostragem de 105 pacientes, que
usaram vancomicina pré e intra-TCTH; destes, 68 (90,6%) foram normais para a
mutação GST - e 7 (9,4%) foram nulos. De 30 (28,6%) pacientes que não usaram
vancomicina pré e intra-TCTH, 27 (90%) foram normais e 3 (10%) nulos (p=0,999).
Tabela 17. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e uso da vancomicina.
Vancomicina
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
27
68
95
Nulo
3
7
10
Total
30
75
105
R e s u l t a d o s | 44
4.1.18 Polimorfismo da GST -  e grupos de diagnóstico
Foram analisados 26 (24,7%) de 105 pacientes, que tinham como diagnostico
doença mieloproliferativa crônica, destes 24 (89,8%) foram normais para a mutação
GST - e 2 (10,2%) foram nulos. Para as Leucoses Agudas em 49 pacientes
analisados , 44 (89,7%) foram normais para mutação GST-e 5 (10,2%)nulos. De
11 (10,4%) pacientes com diagnostico de falência medular, 9 (81,8%) foram normais
para mutação GST -  e 2 (8,2%) nulos. De 19 (18,1%) pacientes com diagnostico
de doenças linfoproliferativas, 17 (89,4%) foram normais para mutação GST -  e 2
(10,6%) nulos. (p=0,471)
Tabela 18. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e Diagnóstico.
Diagnóstico
GST - 
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
17
9
44
24
94
Nulo
2
2
5
2
11
Total
19
11
49
26
105
4.1.19 Polimorfismo da GST - e condicionamentos relacionados ao
Bussulfan
Foram analisados 61 (54%) pacientes que receberam condicionamentos com
bussulfan numa amostragem de 113; destes, 21 (34,4%) foram normais para a
mutação GST - e 40 (65,6%) foram nulos. De 52 pacientes que receberam outros
condicionamentos que não incluíram Bu, 14 (30%) foram normais e 38 (70%) nulos
(p=0,375).
R e s u l t a d o s | 45
Tabela 19. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e condicionamentos baseados
em bussulfan.
Condicionamento - BU
GST 
Total
Não
Sim
Normal
14
21
35
Nulo
38
40
78
Total
52
61
113
4.1.20 Polimorfismo da GST  e condicionamentos relacionados a
ciclofosfamida
Foram analisados 84 (74,3%) pacientes que receberam condicionamentos
com Cy, numa amostragem de 113, destes 26 (31%) foram normais para a mutação
GST - e 58 (69%) foram nulos. De 29 pacientes que receberam outros
condicionamentos que não incluíram Cy, 9 (31%) foram normais e 20 (69%) nulos
(p=0,421).
Tabela 20. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e condicionamentos baseados
em CY.
Condicionamento - CY
GST 
Total
Não
sim
Normal
9
26
35
Nulo
20
58
78
Total
29
84
113
R e s u l t a d o s | 46
4.1.21 Polimorfismo da GST  e condicionamentos relacionados a TBI
Foram analisados 34 (30%) pacientes que receberam condicionamentos com
TBI numa amostra de 113; destes, 8 (23,5%) foram normais para a mutação GST e
26
(76,5%)
foram
nulos.
De
79
pacientes
que
receberam
outros
condicionamentos que não incluíram TBI, 27 (34,1%) foram normais e 52 (65,9%)
nulos (p=0,999).
Tabela 21. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e condicionamentos com TBI.
Condicionamento – TBI
GST 
Total
Não
Sim
Normal
27
8
35
Nulo
52
26
78
Total
79
34
113
4.1.22 Polimorfismo da GST  e condicionamentos mielo e nãomieloablativos
Apenas 12 (10,6%) pacientes que receberam condicionamentos nãomieloablativos, numa amostra de 113; destes, 4 (33,3%) mostraram-se com GST - 
normal e 8 (66,7%) nulos. Dos pacientes que receberam condicionamentos
mieloablativos, 31(30,6%) de 101 foram normais e 70 (69,4%) nulos. A avaliação da
toxicidade desencadeada pela normalidade do gene GST -  ficou prejudicada pelo
número baixo de pacientes que receberam condicionamentos não-mieloablativos
(p=.0,999).
R e s u l t a d o s | 47
Tabela 22. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e Tipo de condicionamento.
Tipo de condicionamento
GST 
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
31
4
35
Nulo
70
8
78
Total
101
12
113
4.1.23 Polimorfismo da GST  e uso de nutrição parenteral total
Foram analisados 42 pacientes que receberam NPT numa amostra de 112
casos; destes, 12 (28,5%) foram normais para a mutação GST - e 30 (71,5%)
foram nulos. De 70 (62,5%) pacientes que não receberam NPT, 23 (32,8%) foram
normais e 47 (67,2%) nulos (p=0,679).
Tabela 23. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e NPT.
NPT
GST 
Total
Não
Sim
Normal
23
12
35
Nulo
47
30
77
Total
70
42
112
4.1.24 Polimorfismo da GST  e sorologia do receptor ao CMV
Foram analisados 97(86,6%) pacientes que eram CMV positivos entre 112;
destes, 30 (30,9%) foram normais para a mutação GST - e 67 (69,1%) foram
nulos. De 15 (13,3%) pacientes que eram CMV negativos, 5 (33,3%) foram normais
e 10 (66,7%) nulos (p=.0,999).
R e s u l t a d o s | 48
Tabela 24. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e sorologia do receptor ao CMV.
CMV Recp
GST 
Total
Negativo
Positivo
Normal
5
30
35
Nulo
10
67
77
Total
15
97
112
4.1.25 Polimorfismo da GST  e enzimas hepáticas pré-TCTH
Foram analisados 13 (11,7%) pacientes entre 111, que apresentavam
enzimas hepáticas alteradas pré TCTH; destes, 5 (38,4%) foram normais para a
mutação GST - e 8 (61,6%) foram nulos. De 98 (88,3%) pacientes que não
apresentaram alteração de enzimas hepáticas pré TCTH, 30 (30,6%) foram normais
e 68 (69,4%) nulos (p=0,544).
Tabela 25. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e enzimas hepática pré-TCTH.
Enzima Hep. Pré TCTH
GST 
Total
Normal
Alterado
Normal
30
5
35
Nulo
68
8
76
Total
98
13
111
4.1.26 Polimorfismo da GST  e uso de vancomicina
Foram analisados 80(70,7%) casos entre 113 pacientes, que usaram
vancomicina pré e intra-TCTH; destes, 21 (26,2%) foram normais para a mutação
GST - e 59 (73,8%) foram nulos. De 33 (29,2%) pacientes que não usaram
R e s u l t a d o s | 49
vancomicina pré e intra-TCTH, 14 (42,4%) foram normais e 19 (57,6%) nulos
(p=0,118)
Tabela 26. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e Vancomicina.
Vancomicina
GST 
Total
Não
Sim
Normal
14
21
35
Nulo
19
59
78
Total
33
80
113
4.1.27 Polimorfismo da GST  e grupos de diagnostico
Foram analisados 26 de 105 pacientes que tinham como diagnóstico doença
mieloproliferativa crônica; destes, 25 (96,1%) foram normais para a mutação GST e 1 (3,9%) nulo. Nas Leucoses Agudas, entre 49 pacientes analisados, 44 (89,7%)
foram normais para mutação GST - e 5 (10,3%) nulos. De 11 (10,4%) pacientes
com diagnóstico de falência medular, 9 (81,8%) foram normais para mutação GST -
e 2 (18,2%) nulos. De 19 (18%) pacientes com diagnóstico de doenças
linfoproliferativas, 17 (89,4%) foram normais para mutação GST -  e 2 (10,6%)
nulos. (p=0,199).
Tabela 27. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST  e grupos de diagnostico.
Diagnóstico
GST – T
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
17
9
44
25
95
Nulo
2
2
5
1
10
Total
19
11
49
26
105
R e s u l t a d o s | 50
4.1.28 Fator V de Leiden (Fator V Leiden G1691A) e condicionamento
com Bussulfan
Foram analisados 50 (55,5%) pacientes que receberam condicionamentos
com bussulfan
numa amostra de 90; destes, 49 (98%) foram normais para a
mutação Leiden e 1 (2%) nulo. De 40 (44,4%) pacientes que receberam outros
condicionamentos que não incluíram Bu, 40 (100%) foram normais (p=0,999).
Tabela 28. Distribuição da amostra quanto às variáveis.
Condicionamento – BU
Leiden
Total
Não
Sim
Normal
40
49
89
Hetero
0
1
1
Total
40
50
90
4.1.29 Fator V de Leiden e condicionamento com ciclofosfamida
Foram analisados 66(73,3%) de 90 pacientes, que receberam condicionados
com Cy; destes, 65 (98,4%) foram normais para a mutação Leiden e 1 (1,6%) foi
nulo. De 24 (26,7%) pacientes que receberam outros condicionamentos que não
incluíram Cy, 24 (100%) foram normais (p=.0,999).
Tabela 29. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Condicionamento - CY.
Condicionamento – CY
Total
Leiden
Não
Sim
Normal
24
65
89
Hetero
0
1
1
Total
24
66
90
R e s u l t a d o s | 51
4.1.30 Fator V de Leiden e condicionamento com TBI
Vinte e cinco (27,7%) pacientes que receberam TBI numa amostra de 90,
foram normais para mutação Leiden e 0 (0%) nulo; 64 (98,4%) de 65 que não
receberam condicionamento com
TBI, foram normais
e um (1,6%) foi
nulo
(p=0,999).
Tabela 30. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Condicionamento - TBI.
Condicionamento – TBI
Leiden
Total
Não
Sim
Normal
64
25
89
Hetero
1
0
1
Total
65
25
90
4.1.31 Fator V de Leiden e condicionamentos mielo e não-mieloablativos
Apenas 9 (10%) de 90 pacientes receberam condicionamentos nãomieloablativos. Destes, 9 (100%) não apresentaram mutação fator V de Leiden e 0
(0%)
foi
nulo.
Dos
pacientes
que
receberam
outros
condicionamentos
mieloablativos, 80 (98,7%) de 81 não apresentaram mutação Leiden e 1 (1,3%) foi
nulo. A avaliação da toxicidade desencadeada pela mutação Leiden ficou
prejudicada pelo número baixo de pacientes que receberam condicionamentos nãomieloablativos (p=0,999)
R e s u l t a d o s | 52
Tabela 31. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e condicionamentos mielo e
não-mieloablativos.
Tipo de condicionamento
Leiden
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
80
9
89
Hetero
1
0
1
Total
81
9
90
4.1.32 Fator V de Leiden e uso de nutrição parenteral total
Foram analisados 31(34,8%) pacientes que receberam NPT numa amostra de
89, sendo 30 (96,7%) normais para a mutação Leiden e 1 (3,3 %) nulo. De 58
(65,1%) pacientes que não receberam NPT, 58 (100%) foram normais e 0 (0%) foi
nulo (p=0,348).
Tabela 32. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e NPT
NPT
Leiden
Total
Não
Sim
Normal
58
30
88
Hetero
0
1
1
Total
58
31
89
4.1.33 Fator V de Leiden e sorologia do receptor ao CMV
Foram analisados 79 (87,7%) pacientes CMV positivos numa amostragem de
90 casos. Destes, 78 (98,7%) foram normais para a mutação Fator V de Leiden e 1
(1,3%) nulo. De 11 (12%) pacientes que eram CMV negativos, 11 (100%) foram
normais e 0 (0%) foi nulo (p=0,999)
R e s u l t a d o s | 53
Tabela 33. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e sorologia do receptor ao CMV.
CMV Recp
Leiden
Total
Negativo
Positivo
Normal
11
78
89
Hetero
0
1
1
Total
11
79
90
4.1.34 Fator V de Leiden e enzimas hepáticas pré-TCTH
Foram analisados 10 (11,2%) pacientes que apresentavam enzimas hepáticas
alteradas pré-TCTH numa população de 89 casos sendo 10 (100%) normais para a
mutação Leiden e 0 (0%) nulo. De 79 (88,7%) pacientes que não apresentaram
alteração de enzimas hepáticas pré-TCTH, 78 (98,7%) foram normais e 1 (1,3%) foi
nulo (p=0,999).
Tabela 34. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e Enzima Hep. Pré TCTH.
Enzima Hep. Pré TCTH
Leiden
Total
Normal
Alterado
Normal
78
10
88
Hetero
1
0
1
Total
79
10
89
4.1.35 Fator V de Leiden e uso de vancomicina
Foram analisados 62 (68,2%) casos que usaram vancomicina pré e intraTCTH de 90 pacientes, sendo 62 (100%) normais para a mutação Leiden. De 28
(31,8%) pacientes que não usaram vancomicina pré e intra-TCTH, 27 (96,4%) foram
normais e 1 (3,6%) nulo (p=.0,311).
R e s u l t a d o s | 54
Tabela 35. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e uso de vancomicina.
Vancomicina
Leiden
Total
Não
Sim
Normal
27
62
89
Hetero
1
0
1
Total
28
62
90
4.1.36 Fator V de Leiden e grupos de diagnostico
Foram analisados 15(17%) casos que tinham como diagnóstico, doença
mieloproliferativa crônica numa amostragem de 89. Destes, 14 (93,5%) foram
normais para a mutação Leiden e 1 (6,5%) foi heterozigoto. Para as Leucoses
Agudas em 43(48%) pacientes analisados, todos pacientes foram normais. De 15
(17%) pacientes com diagnóstico de falência medular analisados, nenhum
apresentou a presença da mutação. De 16 (18%) pacientes com diagnóstico de
doenças linfoproliferativas, todos foram normais para a presença da mutação do
fator V de Leiden.(p=0,535).
Tabela 36. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e grupos de diagnostico.
Diagnóstico
Leiden
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
16
15
43
14
88
Heterozigoto
0
0
0
1
1
Total
16
15
43
15
89
R e s u l t a d o s | 55
4.1.37 Mutação da protrombina (mutação da protrombina 202021G→A ) e
codicionamento contendo bussulfan
Foram analisados 45 (54,8%) pacientes que receberam condicionados com
bussulfan, de 82 casos, sendo 44 (97,7%) normais para a mutação protrombina e 1
(2,3%) mutado. De 37 pacientes que receberam outros condicionamentos que não
incluíram Bu, 35 (94,5%) foram normais e 2(5,5%) nulos (p=0,999).
Tabela 37. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e Condicionamento – BU.
Condicionamento – BU
Protrombina
Total
Não
Sim
Normal
35
44
79
Hetero
2
1
3
Total
37
45
82
4.1.38 Mutação da protrombina e condicionamento contendo
ciclofosfamida
Foram analisados 61(74,3%) de 82 pacientes, que receberam condicionados
com Cy, destes, 58 (95%) foram normais para a mutação Protrombina e 3 (5%)
foram nulos. De 21(25,6%) pacientes que receberam outros condicionamentos que
não incluíram Cy, 21 (100%) foram normais e 0(%) foi nulo (p=.0,586)
Tabela 38. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
Condicionamento com CY.
Condicionamento – CY
Protrombina
Total
Não
Sim
Normal
21
58
79
Hetero
0
3
3
Total
21
61
82
R e s u l t a d o s | 56
4.1.39 Mutação da protrombina e condicionamento contendo TBI
Vinte e três (95,8%) de 24 (29,2%), que receberam TBI foram normais para
Mutação Protrombina e 1 (4,2%) foi nulo; 56(96,5%) de 58 que não receberam TBI
foram normais e 2 (3,5%) nulos (p=0,566).
Tabela 39. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e
Condicionamento com TBI.
Condicionamento – TBI
Protrombina
Total
Não
Sim
Normal
56
23
79
Hetero
2
1
3
Total
58
24
82
4.1.40 Mutação da protrombina e condicionamentos mielo e nãomieloablativos
Dos pacientes que receberam condicionamentos não-mieloablativos, 9
(100%) não apresentaram Mutação da Protrombina e 0 (%) foi nulo. Dos pacientes
que
receberam
condicionamentos
mieloablativos,
70
(95,8%)
de
73
não
apresentaram Mutação Protrombina e 3 (4,2%) foram nulos. A avaliação da
toxicidade desencadeada pela Mutação Protrombina ficou prejudicada pelo número
baixo de pacientes que receberam condicionamentos não-mieloablativos (p=0,999)
R e s u l t a d o s | 57
Tabela 40. Distribuição da amostra quanto às variáveis mutação da protrombina e
condicionamentos mielo e não-mieloablativos.
Tipo de condicionamento
Protrombina
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
70
9
79
Hetero
3
0
3
Total
73
9
82
4.1.41 Mutação da protrombina e uso de nutrição parenteral total
Foram analisados 27(33,3%) de 81 pacientes, que receberam NPT; destes,
27 (100%) foram normais para a mutação protrombina e 0 (0%) foi nulo. De 54
(66,7%) pacientes que não receberam NPT, 51 (94,4%) foram normais e 3 (5,6%)
nulos (p=0,547).
Tabela 41. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e NPT.
NPT
Protrombina
Total
Não
Sim
Normal
51
27
78
Hetero
3
0
3
Total
54
27
81
4.1.42 Mutação da protrombina e sorologia do receptor ao CMV
Foram analisados 74(90,2%) de 82 pacientes, que eram CMV positivos;
destes, 71 (95,9%) foram normais para a mutação protrombina e 3 (4,1%) foram
nulos. De 8 (9,8%) pacientes que eram CMV negativos, 8 (100%) foram normais e
0(0%) foi nulo (p=0,999)
R e s u l t a d o s | 58
Tabela 42. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e sorologia do receptor ao
CMV.
CMV Recp
Protrombina
Total
Negativo
Positivo
Normal
8
71
79
Hetero
0
3
3
Total
8
74
82
4.1.43 Mutação da protrombina e enzimas hepaticas pre-TCTH
Foram analisados 10 pacientes que apresentavam enzimas hepáticas
alteradas pré-TCTH numa amostra de 81 casos; destes, 9 (90%) foram normais para
a mutação protrombina e 1 (10%) foi nulo. De 71 (87.6%) pacientes que não
apresentaram alteração de enzimas hepáticas pré TCTH, 69 (97,1%) foram normais
e 2 (2,9%) nulos (p=.0,330)
Tabela 43. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e enzimas hepáticas préTCTH.
Enzima Hep. Pré TCTH
Protrombina
Total
Normal
Alterado
Normal
69
9
78
Hetero
2
1
3
Total
71
10
81
R e s u l t a d o s | 59
4.1.44 Mutação da protrombina e uso de vancomicina
Foram analisados 57(69,5%) pacientes que usaram vancomicina pré e intraTCTH numa população de 82 casos, sendo 55 (96,4%) normais para a mutação
protrombinae 2 (3,6%) nulos. De 25 (30,5%) pacientes que não usaram
vancomicina pré e intra-TCTH, 24 (96%) foram normais e 1 (4%) nulo (p=0,999).
Tabela 44. Distribuição da amostra quanto às variáveis mutação da protrombina e uso de
vancomicina.
Vancomicina
Protrombina
Total
Não
Sim
Normal
24
55
79
Hetero
1
2
3
Total
25
57
82
4.1.45 Mutação da protrombina e grupos de diagnostico
Foram
analisados
22
(24,4%)
pacientes
com
diagnóstico
doença
mieloproliferativa crônica entre 90 casos; destes, 21 (95,4%) foram normais para a
mutação protrombina e 1 (4,6%) nulo. Para as Leucoses Agudas em 42(46,6%)
pacientes analisados , 42 (100%) foram normais e nenhum apresentou a mutação
protrombina. De 9 (10%) pacientes com diagnostico de falência medular, 9 (100%)
foram
normais.
De
17
(18,8%)
pacientes
com
linfoproliferativas, 17 (100%) foram normais. (p=0,255).
diagnostico
de
doenças
R e s u l t a d o s | 60
Tabela 45. Distribuição da amostra quanto às variáveis Mutação da Protrombina e grupos de
diagnóstico.
Diagnóstico
Leiden
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
17
9
42
21
89
Hetero
0
0
0
1
1
Total
17
9
42
22
90
4.1.46 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento contendo
Bussulfan
Foram analisados 57(53,2%) pacientes que receberam condicionamentos
com bussulfan, de uma amostra de 107 casos, sendo 46 (80,7%) normais para a
mutação HFE – H63D e 11 (19,3%) nulos. De 50(46,8%) pacientes que receberam
outros condicionamentos que não incluíram Bu, 34 (68%) foram normais e 16 (32%)
nulos (p=0,223.)
Tabela 46. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Condicionamento com Bu
Condicionamento – Bu
HFE - H63D
Não
Sim
Total
Normal
34
46
80
Hetero
16
11
27
Total
50
57
107
R e s u l t a d o s | 61
4.1.47 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento contendo
ciclofosfamida
Foram analisados 79(73,8%) pacientes que receberam condicionamentos
com Cy numa amostra de 107 casos; destes, 59 (74,6%) foram normais para a
mutação HFE - H63D e 20 (25,3%) foram nulos. De 28 (26,1%) pacientes que
receberam outros condicionamentos que não incluíram Cy, 21 (75%) foram normais
e 7(25%) nulos (p=0,181).
Tabela 47. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Condicionamento - CY.
Condicionamento - CY
HFE - H63D
Total
Não
Sim
Normal
21
59
80
Hetero
7
20
27
Total
28
79
107
4.1.48 Mutação HFE – H63D e regime de condicionamento com TBI
Vinte e um (65,6%) de 32 pacientes que receberam TBI foram normais para
HFE - H63D e 11 (24,4%) nulos; 59(78,6%) de 75 pacientes que não receberam TBI
foram normais e 16 (21,4%) nulos. (p=0,999)
Tabela 48. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Condicionamento - TBI.
Condicionamento – TBI
HFE - H63D
Total
Não
Sim
Normal
59
21
80
Hetero
16
11
27
Total
75
32
107
R e s u l t a d o s | 62
4.1.49 Mutação HFE – H63D e tipo de condicionamento mielo e nãomieloablativo
Foram analisados 11 (10,2%) pacientes que receberam condicionamentos
Não mieloablativos numa amostra de 107; destes, 8 (72,7%) foram normais para a
mutação HFE - H63D e 3 (27,3%) foram nulos. De 96 (89,7%) pacientes que
receberam condicionamentos mieloablativos, 72 (75%) foram normais e 24 (25%)
nulos (p=0,999)
Tabela 49. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Tipo de condicionamento.
Tipo de condicionamento
HFE - H63D
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
72
8
80
Hetero
24
3
27
Total
96
11
107
4.1.50 Mutação HFE – H63D e uso de NPT
Foram analisados 40 (37,7%) pacientes que receberam NPT entre 106 casos;
destes, 31 (77,5%) foram normais para a mutação HFE - H63D e 9 (22,5%) foram
nulos. De 66 (62,2%) pacientes que não receberam NPT, 48 (72,7%) foram normais
e 18(27,3%) nulos (p=0,651).
Tabela 50. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e NPT.
NPT
HFE - H63D
Total
Não
Sim
Normal
48
31
79
Hetero
18
9
27
Total
66
40
106
R e s u l t a d o s | 63
4.1.51 Mutação HFE – H63D e positividade ao CMV no receptor
Foram analisados 92 (86,7%) pacientes que eram CMV positivos entre 106
casos; destes, 70 (76,1%) foram normais para a mutação HFE - H63D e 22 (23,9%)
foram nulos. De 14 (13,2%) pacientes que eram CMV negativos, 10 (71,4%) foram
normais e 4 (28,6%) nulos (p=0,742)
Tabela 51. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e CMV Recp.
CMV Recp
HFE - H63D
Total
Negativo
Positivo
Normal
10
70
80
Hetero
4
22
26
Total
14
92
106
4.1.52 Mutação HFE – H63D e enzimas hepáticas pré TCTH
Foram analisados 12 (11,4%) entre 105 pacientes, que apresentavam
enzimas hepáticas alteradas pré TCTH; destes, 8 (66,6%) foram normais para a
mutação HFE - H63D e 4 (23,4%) foram nulos. De 93 (88,5%) pacientes que não
apresentaram alteração de enzimas hepáticas pré TCTH, 71 (76,3%) foram normais
e 22 (23,7%) nulos (p=0,486)
Tabela 52. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Enzima Hep. Pré TCTH.
Enzima Hep. Pré TCTH
HFE - H63D
Total
Normal
Alterado
Normal
71
8
79
Hetero
22
4
26
Total
93
12
105
R e s u l t a d o s | 64
4.1.53 Mutação HFE – H63D e uso de vancomicina
Foram analisados 75 (70,1%) pacientes que usaram vancomicina pré e intra
TCTH numa amostra de 107; destes, 56 (74,6%) foram normais para a mutação
HFE - H63De 19 (25,4%) foram nulos. De 32 (29,9%) pacientes que não usaram
vancomicina pré e intra TCTH, 24 (75%) foram normais e 8 (25%) nulos (p=0,999)
Tabela 53. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Vancomicina.
Vancomicina
HFE - H63D
Total
Não
Sim
Normal
24
56
80
Hetero
8
19
27
Total
32
75
107
4.1.54 Mutação HFE – H63D e grupos de diagnóstico
Foram analisados 22(26,8%) pacientes que tinham como diagnóstico doença
mieloproliferativa crônica entre 82 casos; destes, 22 (100%) foram normais para a
mutação HFE - H63D.. Para as Leucoses Agudas em 37(45,1%) pacientes
analisados, 35 (94,6%) foram normais para mutação HFE – H63D e 2 (5,4%)
heterozigotos. De 6 (7,3%) pacientes com diagnóstico de falência medular, 5
(83,3%) foram normais e 1 (16,7%) heterozigoto. De 17 (20,7%) pacientes com
diagnóstico de doenças linfoproliferativas, todos (100%) foram normais. (p=0,248)
R e s u l t a d o s | 65
Tabela 54. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e Diagnóstico.
Diagnóstico
Protrombina
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
17
5
35
22
79
Hetero
0
1
2
0
3
Total
17
6
37
22
82
4.1.55 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo
bussulfan
Foram analisados 56 (53,8%) entre 104 pacientes, que receberam
condicionamentos com bussulfan; destes, 53 (94,6%) foram normais para a mutação
HFE S65C e 3 (5,4%) foram heterozigotos. De 48(46,1%) pacientes que receberam
outros condicionamentos que não incluíram Bu, 46 (95,8%) foram normais e 2
(4,2%) heterozigotos (p=0,633).
Tabela 55. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e condicionamento – com
Bu.
Condicionamento – BU
HFE S65C
Total
Não
Sim
Normal
46
53
99
Hetero
2
3
5
Total
48
56
104
R e s u l t a d o s | 66
4.1.56 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo
ciclofosfamida
Foram
analisados
76
(73%)
entre
104
pacientes,
que
receberam
condicionamentos com Cy; destes, 73 (96%) foram normais para a mutação HFE
S65C e 3 (4%) heterozigotos. De 28(26,9%) pacientes que receberam outros
condicionamentos que não incluíram Cy, 26 (96,8%) foram normais e 2 (3,2%)
heterozigotos (p=0,999)
Tabela 56. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Condicionamento - Cy
Condicionamento – CY
HFE S65C
Total
Não
Sim
Normal
26
73
99
Hetero
2
3
5
Total
28
76
104
4.1.57 Mutação HFE – S65C e regime de condicionamento contendo TBI
Vinte e nove (93,5%) entre 31 pacientes, que receberam TBI foram normais
para mutação HFE S65C e 2 (6,5%) heterozigotos; 70 (95,9%) de 73 pacientes que
não receberam TBI foram normais e 3 (4,1%) nulos (p=0,609).
Tabela 57. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Condicionamento – TBI.
Condicionamento – TBI
HFE S65C
Total
Não
Sim
Normal
70
29
99
Hetero
3
2
5
Total
73
31
104
R e s u l t a d o s | 67
4.1.58 Mutação HFE – S65C e tipo de regime de condicionamento
Foram analisados 11 (10,5%) entre 104 pacientes, que receberam
condicionamentos com busulfan; destes, 10 (90,9%) foram normais para a mutação
HFE S65C e 1 (9,1%) foi nulo. De 93(89,4%) pacientes que receberam outros
condicionamentos que não incluíram Bu, 89 (95,6%) foram normais e 4 (4,4%)
heterozigotos (p=0,435).
Tabela 58. Distribuição
condicionamentos
da
amostra
quanto
às
variáveis
HFE
S65C
e
Tipos
de
Tipo de condicionamento
HFE S65C
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
89
10
99
Hetero
4
1
5
Total
93
11
104
4.1.59 Mutação HFE – S65C e uso de Nutrição parenteral total
Foram analisados 38(36,9%) entre 103 pacientes, que receberam NPT;
destes, 37 (97,3%) foram normais para a mutação HFE S65C e 1 (2,7%) foi nulo. De
65 (63,1%) pacientes que não receberam NPT, 61 (93,8%) foram normais e 4(6,2%)
heterozigotos (p=0,649)
Tabela 59. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e NPT.
NPT
HFE S65C
Total
Não
Sim
Normal
61
37
98
Hetero
4
1
5
Total
65
38
103
R e s u l t a d o s | 68
4.1.60 Mutação HFE – S65C e positividade do receptor ao CMV
Foram analisados 89(86,4%) entre 103 pacientes, que eram CMV positivos;
destes, 84 (94,3%) foram normais para a mutação HFE S65C e 5 (5,7%) foram
heterozigotos. De 14 (13,5%) pacientes que eram CMV negativos, todos (100%)
foram normais (p=0,999).
Tabela 60. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e CMV Recp.
CMV Recp
HFE S65C
Total
Negativo
Positivo
Normal
14
84
98
Hetero
0
5
5
Total
14
89
103
4.1.61 Mutação HFE – S65C e enzimas hepáticas pré-TCTH
Foram analisados 11(10,7%) entre 102 pacientes, que apresentavam enzimas
hepáticas alteradas pré-TCTH; destes, 9 (81,8%) foram normais para a mutação
HFE S65C e 2 (18,2%) heterozigotos. De 91 (89,3%) pacientes que não
apresentaram alteração de enzimas hepáticas pré -TCTH, 88 (96,7%) foram normais
e 3 (3,3%) nulos (p=0,049)
Tabela 61. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e Enzima Hep. Pré TCTH
Enzima Hep. Pré TCTH
HFE S65C
Total
Normal
Alterado
Normal
88
9
97
Hetero
3
2
5
Total
91
11
102
R e s u l t a d o s | 69
4.1.62 Mutação HFE – S65C e uso de vancomicina
Foram analisados 73(70,1%) entre 104 pacientes, que usaram vancomicina
pré e intra-TCTH; destes, 70 (95,9%) foram normais para a mutação HFE S65C e 3
(4,1%) heterozigotos. De 31 (29,9%) pacientes que usaram vancomicina pré e intraTCTH, 29 (93,5%) foram normais e 2 (6,5%) heterozigotos (p=0,633).
Tabela 62. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e uso de vancomicina.
Vancomicina
HFE S65C
Total
Não
Sim
Normal
29
70
99
Hetero
2
3
5
Total
31
73
104
4.1.63 Mutação HFE – S65C e grupos de diagnóstico
Foram analisados 26(25%) entre 104 pacientes, que tinham como diagnóstico
doença mieloproliferativa crônica; destes, 24 (92,3%) foram normais para a mutação
HFE S65C e 2 (7,7%) foram heterozigotos. Para as Leucoses Agudas em 50(48%)
pacientes analisados, 48 (96%) foram normais para mutação HFE S65C
eforamheterozigotos. De 6 (5,7%) pacientes com diagnóstico de falência
medular, 6 (100%) foram normais. De 22 (21,1%) pacientes com diagnóstico de
doenças linfoproliferativas, 21 (95,4%) foram normais e 1 (4,6%) heterozigotos.
(p=0,876)
R e s u l t a d o s | 70
Tabela 63. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e grupos de diagnósticos
Diagnóstico
HFE S65C
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
21
6
48
24
99
Hetero
1
0
2
2
5
Total
22
6
50
26
104
4.1.64 Mutação MTHR C677T regime de condicionamento contendo
Bussulfan
Foram
analisados
53(58,2%)
entre
91
pacientes,
que
receberam
condicionamentos com bussulfan; destes, 35 (66%) foram normais para a mutação
MTHR C677T e 5 (9,5%) foram mutados homozigotos e 13 (24,5%) foram mutados
heterozigotos. De 38 (41,7%) pacientes que receberam outros condicionamentos
que não incluíram Bu, 22 (57,9%) foram normais e 7 (18,4%) foram mutados
homozigotos e 9 (23,7%) foram mutados heterozigotos (p=0,216).
Tabela 64. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e condicionamentos com
Bu
Condicionamento – BU
MTHR C677T
Total
Não
Sim
Normal
22
35
57
Mutado homozigoto
7
5
12
Mutado heterozigoto
9
13
22
Total
38
53
91
R e s u l t a d o s | 71
4.1.65 Mutação MTHR C677T e regimes de condicionamento contendo
ciclofosfamida.
Foram
analisados
64
(70,3%)
entre
91
pacientes,
que
receberam
condicionamentos com Cy; destes, 37(57,8%) foram normais para a mutação MTHR
C677T, 10 (15,6%) mutados homozigotos e 17 (26,6%) mutados heterozigotos. De
27 (29,6%) pacientes que receberam outros condicionamentos que não incluíram
Cy, 20 (74%) foram normais, 2 (7,4%) mutados homozigotos e 5 (18,6%) mutados
heterozigotos (p=0,476).
Tabela 65. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e condicionamentos com
CY.
Condicionamento – CY
MTHR C677T
Total
Não
Sim
Normal
20
37
57
Mutado homozigoto
2
10
12
Mutado heterozigoto
5
17
22
Total
27
64
91
4.1.66 Mutação MTHR C677T e regimes de condicionamento contendo
TBI
Onze (50%), de 22 pacientes, que receberam TBI foram normais para MTHR
C677T, 5 (22,7%) foram mutados homozigotos e 6 (27,3%) mutados heterozigotos;
46 (66,6%) de 69 que não receberam TBI foram normais, 7(10,1%) foram mutados
homozigotoss e 16 (23,3%) mutados heterozigotos (p=0,397).
R e s u l t a d o s | 72
Tabela 66. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e Condicionamento - TBI.
Condicionamento – TBI
MTHR C677T
Total
Não
Sim
Normal
46
11
57
Mutado homozigoto
7
5
12
Mutado heterozigoto
16
6
22
Total
69
22
91
4.1.67 Mutação MTHR C677T e tipos de condicionamentos mielo a nãomielo-ablativos
Foram analisados 10 (11%) de 91 pacientes, que receberam condicionados
com bussulfan; destes, 7 (70%) foram normais para a mutação MTHR C677T , um
(10%) foi mutado homozigoto e 2 (20%) foram mutados heterozigotos. De 81(89%)
pacientes que receberam outros condicionamentos que não incluíram Bu, 50(61,7%)
foram
normais,
11(13,5%)
mutados
homozigotos
e
20
(24,8%)
mutados
heterozigotos (p=0,999)
Tabela 67. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e Tipos de
condicionamentos mielo a não-mialoablativos.
Tipo de condicionamento
MTHR C677T
Total
Mieloablativo
Não Mieloablativo
Normal
50
7
57
Mutado homozigoto
11
1
12
Mutado heterozigoto
20
2
22
Total
81
10
91
R e s u l t a d o s | 73
4.1.68 Mutação MTHR C677T e uso de nutrição parenteral
Foram analisados 37 (41,1%) de 90 pacientes, que receberam NPT; destes,
20 (54%) foram normais para a mutação MTHR C677T, 6 (16,2%) mutados
homozigotos e 11 (29,7%) mutados heterozigotos. De 53 (58,9%) pacientes que
não receberam NPT , 36 (68%) foram normais, 6 (11,3%) mutados homozigotos e 11
(20%) mutados heterozigotos (p=0,405).
Tabela 68. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e NPT.
NPT
MTHR C677T
Total
Não
Sim
Normal
36
20
56
Mutado homozigoto
6
6
12
Mutado heterozigoto
11
11
22
Total
53
37
90
4.1.69 Mutação MTHR C677T e positividade do receptor ao CMV
Foram analisados 74 (82,2%) de 90 pacientes, que eram CMV positivos;
destes, 47 (63,5%) foram normais para a mutação MTHR C677T, 11 (14,8%)
mutados homozigotos e 16 (21,6%) mutados heterozigotos. De 16 (17,7%) pacientes
que eram CMV negativos, 9 (56,2%) foram normais, um (6,2%) foi mutado
homozigoto e 6 (37,5%) foram mutados heterozigotos (p=0,371).
R e s u l t a d o s | 74
Tabela 69. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e positividade do receptor
ao CMV.
CMV Recp
MTHR C677T
Total
Negativo
Positivo
Normal
9
47
56
Mutado homozigoto
1
11
12
Mutado heterozigoto
6
16
22
Total
16
74
90
4.1.70 Mutação MTHR C677T e enzimas hepáticas
Foram analisados 9(10,1%) de 89 pacientes, que apresentavam enzimas
hepáticas alteradas pré-TCTH; destes, 6 (66,6%) foram normais para a MTHR
C677T, um (11,1%) mutado homozigoto e 2(22,3%) foram mutados heterozigotos.
De 80 (89,9%) pacientes que não apresentaram alteração de enzimas hepáticas préTCTH, 49 (61,2%) foram normais, 11 (13,7%) mutados homozigotos e 20 (25%)
mutados heterozigotos (p=0,999).
Tabela 70. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e enzimas hepáticas préTCTH.
Enzima Hep. Pré TCTH
MTHR C677T
Total
Normal
Alterado
Normal
49
6
55
Mutado homozigoto
11
1
12
Mutado heterozigoto
20
2
22
Total
80
9
89
R e s u l t a d o s | 75
4.1.71 Mutação MTHR C677T e uso de vancomicina
Foram analisados 65 (71,4%) de 91 pacientes, que usaram vancomicina pré e
intra- TCTH; destes, 39 (60%) foram normais para a mutação MTHR C677T, 9
(13,8%) mutados homozigotos e 17(26,1%) mutados heterozigotos. De 26 (28,6%)
pacientes que usaram vancomicina pré e intra-TCTH, 18 (69,2%) foram normais, 3
(11,5%) mutados homozigotos e 5(19,2%) mutados heterozigotos (p=0,739).
Tabela 71. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e vancomicina.
Vancomicina
MTHR C677T
Total
Não
Sim
Normal
18
39
57
Mutado homozigoto
3
9
12
Mutado heterozigoto
5
17
22
Total
26
65
91
4.1.72 Mutação MTHR C677T e grupos de diagnósticos
Foram analisados 23 (25,2%) de 91 pacientes, que tinham como diagnóstico
doença mieloproliferativa crônica; destes, 13 (56,5%) foram normais para a mutação
MTHR C677T, 5 (21,7%) mutados homozigotos e 5 (21,7%) mutados heterozigotos.
Para as Leucoses Agudas em 42 (46,1%) pacientes analisados, 26 (61,9%) foram
normais 5 (11,9%) mutados homozigotos e 11 (26,2%) mutados heterozigotos. De 6
(6,5%) pacientes com diagnóstico de falência medular, 5 (83,3%) foram normais e
um (16,7%) foi mutado heterozigoto. De 20 (22%) pacientes com diagnóstico de
doenças linfoproliferativas, 13 (65%) foram normais, 2 (10%) mutados homozigotos
e 5 (25%) mutados heterozigotos (p=0,900).
R e s u l t a d o s | 76
Tabela 72. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e grupos de diagnóstico.
Diagnóstico
MTHR C677T
Total
DL
FM
LA
MC
Normal
13
5
26
13
57
Mutado homogêneo
2
0
5
5
12
Mutado heterogêneo
5
1
11
5
22
Total
20
6
42
23
91
4.1.73 Resultados obtidos entre a associação de polimorfismos e
características estudadas de predisposição à DVOH
Tabela 73. Resultados do estudo de associação entre os polimorfismos e as demais
características de interesse na pesquisa.
(Continua)
Polimorfismo
Característica
Nível
descritivo
Polimorfismo
Característica
Nível
descritivo
GST - 
Condicionamento - CY
0,422
Protrombina
Condicionamento – CY
0,586
GST - 
Condicionamento - TBI
0,492
Protrombina
Condicionamento – TBI
0,566
GST - 
Condicionamento - Bu
0,661
Protrombina
Condicionamento – Bu
0,999
GST - 
Tipo de condicionamento
0,745
Protrombina
Tipo de condicionamento
0,999
GST - 
NPT
0,673
Protrombina
NPT
0,547
GST - 
CMV Recp
0,999
Protrombina
CMV Recp
0,999
GST - 
Enzima Hep. Pré TCTH
0,747
Protrombina
Enzima Hep. Pré TCTH
0,330
GST - 
Vancomicina
0,499
Protrombina
Vancomicina
0,999
GST - 
Diagnóstico
0,957
Protrombina
Diagnóstico
0,255
GST - 
Condicionamento - CY
0,999
HFE - H63D
Condicionamento – CY
0,181
GST - 
Condicionamento - TBI
0,999
HFE - H63D
Condicionamento – TBI
0,999
GST - 
Condicionamento - Bu
0,169
HFE - H63D
Condicionamento – Bu
0,223
GST - 
Tipo de condicionamento
0,999
HFE - H63D
Tipo de condicionamento
0,999
R e s u l t a d o s | 77
Tabela 73. Resultados do estudo de associação entre os polimorfismos e as demais
características de interesse na pesquisa, chamando atenção para o resultado em vermelho,
pela associação entre polimorfismo HFE S65C e a predisposição de alteração de enzimas
hepáticas.
(Conclusão)
Polimorfismo
Característica
Nível
descritivo
Polimorfismo
Característica
Nível
descritivo
GST - 
NPT
0,743
HFE - H63D
NPT
0,651
GST - 
CMV Recp
0,351
HFE - H63D
CMV Recp
0,742
GST - 
Enzima Hep. Pré TCTH
0,329
HFE - H63D
Enzima Hep. Pré TCTH
0,486
GST - 
Vancomicina
0,999
HFE - H63D
Vancomicina
0,999
GST - 
Diagnóstico
0,471
HFE - H63D
Diagnóstico
0,248
GST - 
Condicionamento - CY
0,421
HFE S65C
Condicionamento – CY
0,999
GST - 
Condicionamento - TBI
0,999
HFE S65C
Condicionamento – TBI
0,609
GST - 
Condicionamento - Bu
0,375
HFE S65C
Condicionamento – Bu
0,633
GST - 
Tipo de condicionamento
0,999
HFE S65C
Tipo de condicionamento
0,435
GST - 
NPT
0,679
HFE S65C
NPT
0,649
GST - 
CMV Recp
0,999
HFE S65C
CMV Recp
0,999
GST - 
Enzima Hep. Pré TCTH
0,544
HFE S65C
Enzima Hep. Pré TCTH
0,049
GST - 
Vancomicina
0,118
HFE S65C
Vancomicina
0,633
GST - 
Diagnóstico
0,199
HFE S65C
Diagnóstico
0,876
Leiden
Condicionamento - CY
0,999
MTHR C677T
Condicionamento – CY
0,476
Leiden
Condicionamento - TBI
0,999
MTHR C677T
Condicionamento – TBI
0,397
Leiden
Condicionamento - Bu
0,999
MTHR C677T
Condicionamento – Bu
0,216
Leiden
Tipo de condicionamento
0,999
MTHR C677T
Tipo de condicionamento
0,999
Leiden
NPT
0,348
MTHR C677T
NPT
0,405
Leiden
CMV Recp
0,999
MTHR C677T
CMV Recp
0,371
Leiden
Enzima Hep. Pré TCTH
0,999
MTHR C677T
Enzima Hep. Pré TCTH
0,999
Leiden
Vancomicina
0,311
MTHR C677T
Vancomicina
0,739
Leiden
Diagnóstico
0,535
MTHR C677T
Diagnóstico
0,900
R e s u l t a d o s | 78
4.1.74 Polimorfismo da GST -  e diagnóstico DVOH
Foram analisados 18 (94,7%) de 19 pacientes que apresentaram DVOH;
destes, 12 (66,6%) foram normais e 6 (33,4%) foram nulos para GST-. De 84
(82,3%) pacientes que não apresentaram DVOH, 51 (61%) foram normais para GSTe 33 (39%) nulos para GST-(p=0,791), concluindo – se que a mutação GST não
teve relação com DVOH.
Tabela 74. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e DVOH.
DVOH
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
51
12
63
Nulo
33
6
39
Total
84
18
102
4.1.75 Polimorfismo da GST - θ e diagnóstico DVOH
Foram analisados 19 (100%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 18
(94,7%) foram normais para GST- e 1 (5,3%) foi nulo para GST- . De 86 (81,9%)
pacientes que não apresentaram DVOH, 77 (89,5%) foram normais para GST- e 9
(10,5%) nulos para GST -. (p=0,685).
Tabela 75. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e DVOH.
DVOH
GST - 
Total
Não
Sim
Normal
77
18
95
Nulo
9
1
10
R e s u l t a d o s | 79
Total
86
19
105
4.1.76 Polimorfismo da GST -  e diagnóstico DVOH
Foram analisados 18 (94,7%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 6
(33,3%) foram normais para GST -  e 12 (66,7%) foram nulos para GST - . De 95
(84,1%) pacientes que não apresentaram DVOH, 29 (30,5%) foram normais para
GST -  e 66 (69,5%) nulos para GST -. (p=0,788).
Tabela 76. Distribuição da amostra quanto às variáveis GST -  e DVOH.
DVOH
GST 
Total
Não
Sim
Normal
29
6
35
Nulo
66
12
78
Total
95
18
113
4.1.77 Fator V de Leiden e diagnóstico de DVOH
Foram analisados 15 (78,9%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 14
(93,3%) foram normais para Leiden e 1 (6,7%) foi heterozigoto para Leiden . De 75
(83,3%) pacientes que não apresentaram DVOH, 75 (100%) foram normais para
Leiden e 0 (%) heterozigoto para Leiden (p=0,167).
Tabela 77. Distribuição da amostra quanto às variáveis Leiden e DVOH
DVOH
Leiden
Total
Não
Sim
Normal
75
14
89
Hetero
0
1
1
R e s u l t a d o s | 80
Total
75
15
90
4.1.78 Mutação Protrombina e diagnóstico de DVOH
Foram analisados 15(78,9%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 14
(93,3%) foram normais para mutação da protrombina e 1 (6,7%) foi heterozigoto.
De 67 (81,7%) pacientes que não apresentaram DVOH, 65 (97%) foram normais
para esta mutação e 2 (3%) foram heterozigotos (p=0,459)
Tabela 78. Distribuição da amostra quanto às variáveis Protrombina e DVOH.
DVOH
Protrombina
Total
Não
Sim
Normal
65
14
79
Hetero
2
1
3
Total
67
15
82
4.1.79 Mutação HFE – H63D e diagnostico de DVOH
Foram analisados 16(84,2%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 14
(87,5%) foram normais para HFE - H63D e 2 (12,5%) foram heterozigoto para HFE H63D. De 91(85%) pacientes que não apresentaram DVOH, 66 (72,5%) foram
normais para HFE - H63D e 25 (27,4%) heterozigoto para HFE - H63D . (p=0,348)
Tabela 79. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE - H63D e DVOH.
DVOH
HFE - H63D
Total
Não
Sim
Normal
66
14
80
Hetero
25
2
27
R e s u l t a d o s | 81
Total
91
16
107
4.1.80 Mutação HFE S65C e diagnóstico de DVOH
Foram analisados 15(78,9%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 15
(100%) foram normais para HFE S65C e 0 (0%) foi heterozigoto para HFE S65C .
De 89 (85,5%) pacientes que não apresentaram DVOH, 84 (94,4%) foram normais
para HFE S65C e 5 (5,6%) heterozigotos (p=0,999).
Tabela 80. Distribuição da amostra quanto às variáveis HFE S65C e DVOH.
DVOH
HFE S65C
Total
Não
Sim
Normal
84
15
99
Hetero
5
0
5
Total
89
15
104
4.1.81 Mutação MTHR C677T e diagnóstico de DVOH
Foram analisados 15 (78,9%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 10
(66,6%) foram normais para MTHR C677T e 3 (20%) foram homozigotos para
MTHR C677T e 2 (13,4%) heterozigotos. De 76(83,5%) pacientes que não
apresentaram DVOH, 47 (61,8%) foram normais para MTHR C677T 9 (11,8%)
homozigotos e 20 (26,3%) heterozigotos (p=0,444)
Tabela 81. Distribuição da amostra quanto às variáveis MTHR C677T e DVOH
DVOH
MTHR C677T
Total
Não
Sim
Normal
47
10
57
Mutado homozigoto
9
3
12
R e s u l t a d o s | 82
Mutado heterozigoto
20
2
22
Total
76
15
91
4.1.82 Resultados analisados do estudo entre os polimorfismos e
diagnóstico de DVOH
Não houve relação entre os polimorfismos analisados e a ocorrência
da DVOH.
Tabela 82. Resultados do estudo de associação entre os polimorfismos e a variável DVOH.
Polimorfismo
Nível descritivo
GST - 
0,791
GST - 
0,685
GST - 
0,788
Leiden
0,167
Protrombina
0,459
HFE - H63D
0,348
HFE S65C
0,999
MTHR C677T
0,444
4.1.83 Regime de condicionamento contendo Bussulfan e DVOH
Foram analisados 19 (16%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 11
pacientes (57,9%) não foram submetidos ao condicionamento com bussulfan e 8
(42,1%) foram condicionados com bussulfan. De 101(84,2%) pacientes que não
apresentaram DVOH, 44 (43,5%) não foram submetidos ao condicionamento com
bussulfan e 57 (56,5%) foram submetidos ao condicionamento com bussulfan.
(p=0,318).
R e s u l t a d o s | 83
Tabela 83. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - BU e DVOH.
DVOH
Condicionamento - BU
Total
Não
Sim
Não
44
11
55
Sim
57
8
65
Total
101
19
120
4.1.84 Regime de condicionamento contendo Ciclofosfamida e DVOH
Foram analisados 19 (16%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 2
pacientes (10,5%) não foram submetidos ao condicionamento com ciclofosfamida e
17 (89,5%) o foram. De 101 (84,1%) pacientes que não apresentaram DVOH , 27
(26,7%) não foram submetidos ao condicionamento com ciclofosfamida e 74 (73,2%)
foram submetidos a ciclofosfamida (p=0,156).
Tabela 84. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - CY e DVOH.
DVOH
Condicionamento - CY
Total
Não
Sim
Não
27
2
29
Sim
74
17
91
Total
101
19
120
4.1.85 Regime de condicionamento contendo TBI e DVOH
Foram analisados 19 (16%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 13
pacientes (68,4%) não foram submetidos ao condicionamento com Irradiação
corporal Total (TBI) e 6 (31,6%) foram condicionados com Irradiação corporal Total
R e s u l t a d o s | 84
(TBI). De 101(84,1%) pacientes que não apresentaram DVOH, 70 (69,3%) não
foram submetidos ao condicionamento com Irradiação corporal Total (TBI) e 31
(30,7%) foram submetidos (p=0,999).
Tabela 85. Distribuição da amostra quanto às variáveis Condicionamento - TBI e DVOH.
DVOH
Condicionamento – TBI
Total
Não
Sim
Não
70
13
83
Sim
31
6
37
Total
101
19
120
4.1.86 Análise dos tipos de condicionamentos e DVOH
Foram analisados 19 (16%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 18
pacientes (94,7%) foram submetidos ao condicionamento mieloablativo e 1 (5,3%)
foi submetido a condicionamento não-mieloablativo. De 101 pacientes que não
apresentaram
DVOH,
90
(89,1%)foram
submetidos
ao
condicionamento
mieloablativo e 11 (10,9%) foram submetidos ao condicionamento não-mieloablativo
(p=0,688).
Tabela 86. Distribuição da amostra quanto às variáveis tipos de condicionamentos:
mieloablativo e não-mieloablativo versus DVOH.
DVOH
Tipo de condicionamento
Total
Não
Sim
Mieloablativo
90
18
108
Não Mieloablativo
11
1
12
Total
101
19
120
R e s u l t a d o s | 85
4.1.87 Análise do uso de NPT e DVOH.
Foram analisados 19 (16%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 9
(47,3%) não receberam NPT e 10 (52,7%) receberam NPT. De 100 pacientes (84%)
que não apresentaram DVOH, 67 (67%) não receberam NPT e 33 (33%) receberam
NPT (p=0,122).
Tabela 87. Distribuição da amostra quanto às variáveis NPT e DVOH.
SOS
NPT
Total
Não
Sim
Não
67
9
76
Sim
33
10
43
Total
100
19
119
4.1.88 Análise da positividade sorológica do receptor ao CMV versus
DVOH
Foram analisados 19 (16%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 2
(10,5%) eram CMV negativos e 17 (89,4%) eram CMV positivos.
De 100
pacientes(84%) que não apresentaram DVOH 15 (15%) eram CMV negativos, 85
(85%) eram CMV positivos. (p=0,999).
Tabela 88. Distribuição da amostra quanto às variáveis positividade sorológica do receptor ao
CMV versus DVOH
DVOH
CMV Recp
Total
Não
Sim
Negativo
15
2
17
Positivo
85
17
102
R e s u l t a d o s | 86
Total
100
19
119
4.1.89 Análise de alteração de enzimas hepáticas no pré-TCTH versus
DVOH
Foram analisados 19 (15,5%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 13
(68,4%) apresentaram enzimas hepáticas pré-TCTH normais e 6 (31,6%)
apresentaram enzimas hepáticas pré TCTH alteradas. De 99 (83,9%) pacientes que
não apresentaram DVOH, 92 (93%) apresentaram enzimas hepáticas pré-TCTH
normais, e 7 (7%) apresentaram enzimas hepáticas pré-TCTH alteradas, (p=0,007);
portanto, houve relação entre as alterações de enzimas hepáticas pré_TCTH e
ocorrência de DVOH.
Tabela 89. Distribuição da amostra quanto às variáveis alterações de enzimas hepáticas préTCTH versus DVOH.
DVOH
Enzima Hep. Pré TCTH
Total
Não
Sim
Normal
92
13
105
Alterado
7
6
13
Total
99
19
118
4.1.90 Análise do uso de vancomicina e DVOH
Foram analisados 19(16%) pacientes que apresentaram DVOH; destes, 3
(15,8%) não fizeram uso de vancomicina pré ou intra-TCTH e 16 (84,2%) fizeram
uso de vancomicina pré ou intra-TCTH. De 101 pacientes (84,2%) que não
apresentaram DVOH, 32 (31,7%) não fizeram uso de vancomicina pré ou intra-TCTH
e 69 (68,3% ) fizeram uso de vancomicina pré ou intra-TCTH (p=0,270).
R e s u l t a d o s | 87
Tabela 90. Distribuição da amostra quanto às variáveis uso de vancomicina versus DVOH
DVOH
Vancomicina
Total
Não
Sim
Não
32
3
35
Sim
69
16
85
Total
101
19
120
4.1.91 Resultados da análise entre as variáveis de interesse do estudo e
DVOH
Tabela 91. Resultados do estudo de associação entre as variáveis de interesse e a DVOH.
Variável
Nível descritivo
Condicionamento – BU
0,318
Condicionamento – CY
0,156
Condicionamento – TBI
0,999
Tipo de condicionamento
0,688
NPT
0,122
CMV Recp
0,999
Enzima Hep. Pré TCTH
0,007
Vancomicina
0,270
Diagnóstico
0,223
R e s u l t a d o s | 88
Quadro 12. Resultados de polimorfismos encontrados em cada paciente analisado do estudo,
chamando atenção os pacientes grifados em vermelho, os quais desenvolveram doença venooclusiva hepática.
(Continua)
GST
GST
GST
Leiden
Protrombina
HFE C282Y
HFE H63D
HFE S65C
MTHR C677T
M
T
P
1691GA
20210GA
13
Normal
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
8
Normal
normal
GG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Hetero
Normal
Mut Homo
Não
124
nulo M
normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
82
nulo M
normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
12
nulo M
normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Hetero
Normal
Normal
Não
31
nulo M
normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
98
Normal
Normal
GG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Homo
Não
106
Sem DNA
Sem DNA
Nao
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Mut Homo
Não
7
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
4
nulo M
normal
GG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Mut Hetero
Não
91
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
25
normal
Normal
GG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Normal
Não
173
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
5
normal
Normal
AA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Sim
28
nulo M
normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
9
normal
Normal
GG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
51
nulo M
normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Homo
Sim
10
normal
Nulo T
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
23
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
174
nulo M
normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
11
normal
Nulo T
AA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
27
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
30
normal
Nulo T
AA
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Normal
Não
22
nulo M
normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Hetero
Mut Hetero
Não
18
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Normal
Não
86
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Não
32
normal
Normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Não
SOS
R e s u l t a d o s | 89
Quadro 12. Resultados de polimorfismos encontrados em cada paciente analisado do estudo,
chamando atenção os pacientes grifados em vermelho, os quais desenvolveram doença venooclusiva hepática.
(Continuação)
GST
GST
GST
Leiden
Protrombina
HFE C282Y
HFE H63D
HFE S65C
MTHR C677T
M
T
P
1691GA
20210GA
6
Sem DNA
Sem DNA
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Mut Homo
Não
3
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
153
normal
Normal
AA
Hetero
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Homo
Sim
130
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
99
normal
Normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Hetero
Normal
Normal
Não
15
Sem DNA
Sem DNA
AA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Mut Homo
Não
16
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
17
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
19
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
20
Sem DNA
Sem DNA
AG
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Não
21
Sem DNA
Sem DNA
AA
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
24
Sem DNA
Sem DNA
AA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
26
nulo M
normal
AA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
33
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
70
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Não
34
nulo M
normal
AG
Normal
Hetero
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
155
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
150
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Homo
Não
50
normal
Normal
AG
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
149
nulo M
normal
GG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Homo
Não
85
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
95
normal
Normal
AA
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
162
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Normal
Não
133
normal
Normal
AA
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
59
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
56
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
79
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
SOS
R e s u l t a d o s | 90
Quadro 12. Resultados de polimorfismos encontrados em cada paciente analisado do estudo,
chamando atenção os pacientes grifados em vermelho, os quais desenvolveram doença venooclusiva hepática.
(Continuação)
GST
GST
GST
Leiden
Protrombina
HFE C282Y
HFE H63D
HFE S65C
MTHR C677T
M
T
P
1691GA
20210GA
76
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
156
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
191
normal
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Não
69
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
194
nulo M
normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Hetero
Mut Hetero
Não
78
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Não
202
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
197
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
198
nulo M
normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Não
205
Sem DNA
Sem DNA
AA
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Homo
Não
152
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Sem DNA
Não
195
nulo M
normal
GG
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Não
158
normal
Nulo T
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Normal
Não
140
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Hetero
Sem DNA
Não
53
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
126
Sem DNA
Sem DNA
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
148
normal
Normal
AA
Sem DNA
Normal
Sem DNA
Hetero
Normal
Mut Hetero
Sim
128
Sem DNA
Nulo T
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Não
62
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
103
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Não
201
normal
Normal
AA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Mut Homo
Sim
103
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Não
203
Sem DNA
Sem DNA
AG
Normal
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Não
SOS
201
Sem DNA
Sem DNA
AG
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
61
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
35
normal
Normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
36
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Sim
R e s u l t a d o s | 91
Quadro 12. Resultados de polimorfismos encontrados em cada paciente analisado do estudo,
chamando atenção os pacientes grifados em vermelho, os quais desenvolveram doença venooclusiva hepática.
(Continuação)
GST
GST
GST
Leiden
Protrombina
HFE C282Y
HFE H63D
HFE S65C
MTHR C677T
M
T
P
1691GA
20210GA
107
normal
Normal
AA
Normal
Hetero
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
89
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
80
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
38
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
39
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
40
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
41
nulo M
normal
AA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
42
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
43
normal
Normal
GG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Não
131
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Hetero
Não
44
nulo M
normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
45
nulo M
normal
AG
Normal
Sem DNA
Normal
Hetero
Sem DNA
Mut Hetero
Não
144
normal
Nulo T
GG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
46
normal
Normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
47
nulo M
normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
48
nulo M
normal
AA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
49
normal
Nulo T
AG
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
146
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Normal
Não
147
nulo M
normal
AG
Normal
Hetero
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
145
normal
Normal
AG
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Hetero
Sem DNA
Sem DNA
Sim
154
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Não
161
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Sim
110
nulo M
normal
AG
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Não
143
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Mut Homo
Não
165
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Mut Hetero
Não
182
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Não
183
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Sem DNA
Hetero
Normal
Normal
Não
SOS
R e s u l t a d o s | 92
Quadro 12. Resultados de polimorfismos encontrados em cada paciente analisado do estudo,
chamando atenção os pacientes grifados em vermelho, os quais desenvolveram doença venooclusiva hepática.
(Conclusão)
GST
GST
GST
Leiden
Protrombina
HFE C282Y
HFE H63D
HFE S65C
MTHR C677T
M
T
P
1691GA
20210GA
185
normal
Nulo T
AA
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Sem DNA
Não
186
nulo M
normal
Sem DNA
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sim
187
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
188
Sem DNA
Sem DNA
AG
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Não
SOS
189
Sem DNA
Sem DNA
GG
Normal
Normal
Normal
Hetero
Normal
Sem DNA
Não
190
Sem DNA
Nulo T
AG
Normal
Normal
Sem DNA
Normal
Normal
Sem DNA
Não
97
normal
Normal
AA
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
199
nulo M
normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
81
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sem DNA
Sim
90
Sem DNA
Nulo T
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sim
117
normal
Normal
AG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Não
134
normal
Normal
GG
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Sem DNA
Não
Obs. Devido à grande quantidade de pacientes com amostras de DNA
previamente estocados, com uma quantidade de volume aquém do necessário, para
o desenvolvimento da técnica de PCR, não foi possível estudar os polimorfismos na
totalidade, em toda a população descrita deste estudo. Os quadrados em vermelho,
significam pacientes com diagnostico de doença veno oclusiva hepática.
R e s u l t a d o s | 93
5. DISCUSSÃO
D i s c u s s ã o | 95
A incidência de DVOH em nosso estudo foi de 16%, compatível com o
encontrado na literatura que varia de 5% a 60% (Jones et al., 1987; Littzow et al.,
2002, Vogelsang, Dalal, 2002), sendo esta variação devido aos diferentes critérios
de inclusão, os quais levaram em consideração regime de condicionamento,
diagnóstico, presença de CMV no doador e receptor, uso de vancomicina pré e pósregime de condicionamento, irradiação abdominal, lesão hepática pré-TCTH e outros
critérios analisados e citados neste estudo (McDonald et al., 1993; Coppell et al.,
2003). Os critérios utilizados em nosso estudo para o diagnóstico de DVOH, foi o de
Seattle modificado, com sensibilidade e especificidade de 88% (Shulman,
Hinterberger, 1992).
Têm se observado que a freqüência global de DVOH apresentou mudanças
significativas nos últimos anos, mostrando que a suspeita do diagnóstico e medidas
profiláticas e a instituição de tratamento no início do quadro pode ser de grande
valia no prognóstico da doença (Park et al., 2002; Tay et al., 2007). As medidas de
suporte geral incluindo balanço hídrico, hemodiálise, paracentese e restrição
protéica contribuíram para os resultados atuais (DeLeve et al., 2002; Coppell et al.,
2003; Kumar et al., 2003). Acrescentando-se a isto, alguns trabalhos mostraram que
o uso de defibrotide, que tem propriedade anti-fibrinolítica e anti-trombótica,
apresentaram resolução completa acima de 42% dos sinais clínicos de DVOH, com
pouca ou nenhuma incidência de toxicidade e nenhum efeito no perfil da coagulação
(Coppell et al., 2003). O mecanismo de ação do defibrotide ainda não está claro,
mas estudos in vitro sugerem que há estimulação de liberação de trombomodulina,
TPA, prostaciclina e prostaglandina E2 e diminuição da geração de trombina,
expressão de fator tissular e atividade de endotelina (Coppell et al., 2003).
Análises multivariadas confirmaram o impacto de vários fatores de risco no
desenvolvimento de DVOH como alteração de enzimas hepáticas, tipo de regime de
condicionamento, irradiação abdominal anterior, o uso de vancomicina e a presença
de polimorfismos gênicos (Kami et al., 1997; Coppell et al., 2003; Kumar et al.,
2003). Estudos comparando transplante alogênicos com autólogos descritos pelo
grupo de Seattle sugerem que transplantes alogênicos desenvolvem mais DVOH
(Carreras et al., 1998).
D i s c u s s ã o | 96
A síndrome clínica de DVOH é uma das síndromes mais tóxicas relacionadas
ao regime de condicionamento, que pode ocorrer após altas doses de terapia
citorredutora (McDonald et al., 1993; DeLeve et al., 2002; Coppell et al., 2003).
Dados morfológicos têm indicado que a injúria endotelial sinusoidal e venular
hepática é um dos principais eventos primários da patogênese da DVOH (Azar et al.,
1996; DeLeve et al., 2002). Vários investigadores relataram que o estado de
hipercoagulabilidade associado a baixos níveis de anticoagulantes naturais
observados antes e durante regime de condicionamento predispõe DVOH (Park et
al., 1997; Lee et al., 1998; Lee et al., 2000).
Pacientes submetidos a TCTH são particularmente vulneráveis a injuria
oxidativa mediada pelo ferro, sendo que esta população tende a ter um estoque de
ferro aumentado devido a diseritropoiese relacionada à doença de base e a
dependência transfusional. A alta prevalência de níveis de ferro predispõe a DVOH,
devido ao grande stress oxidativo e depleção de antioxidantes hepáticos (Kallianpur
et al., 2005).
Em nosso estudo a prevalência encontrada das mutações C282Y, H63D e
S65C do gene HFE foi respectivamente 0%, 25% e 5%, comparada com a
encontrada na população brasileira: 2,7%, 18,3% e 1,3% respectivamente, nossos
achados são semelhantes (Bueno et al., 2006). Esta discreta diferença de encontro
populacional, pode ser explicada pela miscigenação racial no Brasil, ou pelo número
analisado de pessoas em nosso estudo. Destacamos que os estudos desenvolvidos
no Brasil envolvendo genes HFE, apresentam resultados analisados em pequeno
número populacional. Enfatizamos que apenas análises multicêntricas seriam de
importância para definir melhor a característica genética da população com
hemocromatose no Brasil.
Devido ao aumento do estoque de ferro na população mutada, é possível
sugerir que ocorra uma associação entre indivíduos mutados e incidência de DVOH.
Mais recentemente, destaques foram dados à contribuição significativa da
sobrecarga de ferro na morbidade do TCTH, em complicações no manuseio da
DECH e ao papel do ferro no impacto na qualidade de vida devido ao prolongamento
da disfunção hepática (Grigg, Bhathal, 2001).
D i s c u s s ã o | 97
Em um estudo não controlado, (Strasser et al., 1998) constatou - se que
receptores de TCTH, os quais morreram entre o D50 e D100, tinham a medida de
ferro hepático no limite de diagnostico de hemocromatose. Foi descrita uma
associação entre DVOH e altos índices de ferritina pré-transplante, a qual reflete o
estoque elevado de ferro, mas também pode ser interpretado como marcador de
atividade de doença (Morado et al., 2000).
O nosso estudo é um dos poucos que explora a associação dos fatores
genéticos e o risco de desenvolver DVOH.
Encontramos resultado estatisticamente positivo, quando analisamos em
conjunto o aumento de enzimas hepáticas pré-TCTH e a presença da mutação HFE
S65C (p=0,049). Este fato torna-se relevante quando analisamos o mecanismo de
base da mutação, que implica em aumentar o estoque de ferro e / ou dificulta o
transporte do mesmo, acarretando com isso um acumulo deste íon e dano tecidual,
não sendo encontrado relatos de casos na literatura analisando a presença deste
polimorfismo e a predisposição de DVOH em TCTH alogênico.
A metilenotetrahidrofolato redutase é uma das principais enzimas regulatórias
do metabolismo da homocisteina. Vários mecanismos foram sugeridos para
associação entre aumento de homocisteina e DVOH. A homocisteina e seus
metabólitos podem agir como agente trombogênico por afetar a expressão de
trombomodulina, ativação de proteína C, aumentando a agregação e a produção de
tromboxane (Graeber et al., 1982; McCully, Carvalho, 1987; Rodrigues, Conn, 1990).
Outros autores descreveram que a mutação MTHFR C677T é relacionada a
hiperhomocisteinemia leve, podendo aumentar o risco de DVOH (Mudd et al., 1972);
mas outras publicações relatam o contrario (Abbate et al., 1998; Brattstrom et al.,
1998; Kostulas et al., 1998)
Em uma metanálise realizada por Kelly et al. (2002), analisando 19 trabalhos
com 2788 de eventos isquêmicos e 3962 casos não isquêmicos e relacionando-os
com polimorfismo da MTHFR, concluíram que o genótipo C677T pode ser
considerado como fator de risco leve a moderado para evento isquêmico. Os autores
acharam uma pequena tendência (OR- 1.23; IC- 95% - 0,96 – 1,58) do genótipo
C677T para o risco de desenvolver isquemia, mas não alcançando uma significância
D i s c u s s ã o | 98
estatística. A freqüência desta mutação varia dramaticamente, dependendo da etnia
que vai de 0% até 16,7%. Shinjo SK et al. (2007) e Voetsch et al. (2000), avaliaram o
evento AVC isquêmico na população brasileira e encontraram uma freqüência de
genótipo de 14,9% na população branca com AVC e 11,8% na população sem o
evento; nos indivíduos negros a freqüência foi menor, de 10,3% nos indivíduos com
evento isquêmico e 1,9% sem o evento. Marie et al. (2007), ao analisarem o risco
de doença cerebrovascular isquêmica associada à presença de polimorfismo
MTHFR, descreveram na população afetada, uma freqüência de 15,7% comparada
com 9,5% do grupo controle. Neste estudo observou-se que o genótipo mutado
C677T não parece ser um fator de risco para doença isquêmica em brasileiros.
Encontramos o genótipo homozigoto “Mutado” em 13% da população
analisada, e heterozigoto em 24%. Não observamos a predisposição e nem
tendência de presença de mutação e o desenvolvimento de DVOH, sendo que os
valores encontrados de prevalência na população brasileira e no nosso estudo estão
no mesmo patamar.
A DVOH está associada com um aumento significativo da morbi-mortalidade
no TCTH. O evento chave para o desenvolvimento do DVOH é o dano do endotélio
vascular hepático, o qual inicia a produção de estado de hipercoagulabilidade,
levando a geração de trombina em excesso. O próprio organismo lança mão de
mecanismos para conter o efeito nocivo da trombina como: antitrombina, cofator II
heparina, inibidor do fator tecidual, fibrinolíticos e proteína C (Lee et al., 1998).
As variantes genéticas do Fator V Leiden e Mutação da Protrombina, são
responsáveis pela vasta maioria dos casos de trombose de herança familiar. A
presença do Fator V de Leiden aumentou em 7 vezes o risco de trombose venosa
em heterozigose e em até 80 vezes quando em homozigose, em estudo realizado
em irlandeses (Duggan et al., 1999). Neste mesmo estudo, avaliando pacientes com
mutação de protrombina, observou-se um risco aumentado em 3 vezes de
desenvolver trombose. Outros autores sugeriram que a presença de alelo mutado do
fator V de Leiden, aumenta o risco de eventos isquêmicos, como infarto do
miocárdio e TVP (Andrade et al., 1998; Duggan et al., 1999).
D i s c u s s ã o | 99
A mutação da protrombina tem sido descrita como um fator de risco
moderado para trombose venosa e foi encontrada uma prevalência de 2,3% em
indivíduos sadios (Arruda et al., 1997). Devido à alta diversidade étnica da
população brasileira, Arruda et al. (1997), analisando a incidência de heterozigotos
entre brasileiros com descendência africana e população indígena, observaram uma
prevalência de 2% na população de descendência africana contra a não ocorrência
da mutação na população de descendência indígena, sendo este fato explicado pelo
casamento entre indivíduos da mesma etnia.
É interessante notar que a associação do alelo mutado da protrombina com
altos níveis plasmáticos de protrombina aumenta a geração de trombina e
conseqüentemente o aumento do risco de trombose (Duggan et al., 1999).
Encontramos uma prevalência da população estudada de 3,6% estando acima do
descrito na literatura, podendo isto se dever ao fato do número de pacientes em
estudo ser baixo. Em nosso estudo encontramos a presença da mutação da
protrombina em heterozigose em somente um paciente, sendo que este
desenvolveu a DVOH; mas quando analisamos a relação da mutação em ser um
fator de predisposição à DVOH, isto não foi significativo (p – 0,459), provavelmente
devido ao número de casos estudados.
O Fator V de Leiden, é uma causa de trombofilia constitucional, sendo
relatado na população européia com grande variação regional, podendo chegar até
uma prevalência de 50% em indivíduos com trombose familiar, segundo Bertina et
al. (1994). O Fator V de Leiden ocorreu em uma freqüência de 14% em italianos, 7%
nos gregos, mostrou-se ausente no leste asiático, nos índios americanos e
australianos (Bauduer, Lacombe, 2005).
Arruda et al. (1997), relataram uma prevalência de 20% em indivíduos com
trombose venosa, com controles saudáveis em 2%, sugerindo que a distribuição de
Fator V de Leiden é dependente da origem étnica populacional. Em nosso estudo
notamos uma prevalência de 1,3% de heterozigotos, correspondendo a um
indivíduo, o qual apresentou o evento de DVOH, não sendo estatisticamente
significante (P-0,167) possivelmente devido à amostragem.
D i s c u s s ã o | 100
Embora a patogênese da DVOH, não seja completamente entendida, as
drogas citotóxicas usadas no regime de condicionamento são consideradas como
fator causal mais significante para desenvolver DVOH. Baixos níveis de glutationa
intrínsecos ou drogas induzidas nos hepatócitos, podem contribuir para o dano
celular (DeLeve et al., 2002; Srivastava et al., 2004). Níveis plasmáticos de agentes
citorredutores semelhantes ao bssulfan e ciclofosfamida e seus metabólitos, foram
associados ao aumento do risco de desenvolver DVOH (Srivastava et al., 2004). A
exposição ao bussulfan é tóxica para as células endoteliais sinusoidais contribuindo
com a injúria dos hepatócitos. O bussulfan ao ser metabolizado pela glutationa S
transferase gera um composto lipofílico tetrahidrotiofeno, o qual age na depleção da
glutationa hepática, explicando assim sua toxicidade (Srivastava et al., 2004).
A ciclofosfamida não é tóxica diretamente à célula endotelial sinusoidal,
entretanto quando metabolizada pela enzima P 450, o seu metabólito mustarda
ciclofosfamida, causa toxicidade para célula endotelial sinusoidal (Srivastava et al.,
2004). Os dois principais agentes citorredutores em terapia de condicionamento
para TCTH, Bu e Cy envolvem a enzima glutationa S transferase e a glutationa em
seu caminho metabólico (Bredschneider et al., 2002; Srivastava et al., 2004). O
maior meio de metabolização de Bu é pela conjugação com glutationa na presença
de glutationa S transferase e oxidação do metabólito lipofílico resultante,
tetrahidrotiofeno, pela enzima citocromo P 450 antes da excreção (Srivastava et al.,
2004). Por outro lado a Cy é primeiramente biotransformada pelo citocromo P 450
para a forma de metabólito ativo 4-hydroxi-Cy, o qual requer glutationa e a enzima
glutationa S transferase, para promover o seu metabolismo, fazendo com que ocorra
uma ligação metabólica entre as duas drogas (Srivastava et al., 2004).
Rossini et al. (2002), analisando uma população de 591 pessoas na presença
do polimorfismo da glutationa, descreveram uma prevalência de genótipo nulo  em
25,4%, nulo  em 12,2% e mutado homozigoto para π em 12,2%. Esta publicação foi
similar ao encontrado em duas outras que analisaram a freqüência de GST  nulo
(Arruda et al., 1998; Hatagima et al., 2000). Baiey et al. (1998), observaram uma
freqüência de 14% nulo  em indivíduos americanos da raça branca. Nossa
prevalência foi de 33%, 8% e 8% de GST ,  e π em homozigose mutado,
respectivamente. As diferenças que explicam estas prevalências são de difícil
D i s c u s s ã o | 101
avaliação, pois analisamos pacientes com doenças hematológicas já selecionadas
por tratamentos agressivos prévios que não refletem a prevalência entre normais e
sobretudo em se tratando de população altamente miscigenada.
Empregamos uma variedade de condicionamentos em diferentes síndromes
hematológicas. A analise de um único condicionamento em pacientes pouco
selecionados por tratamentos anteriores a exemplo da LMC e AAS, poderá
uniformizar as drogas que compõem o condicionamento e tratamentos prévios e daí,
apresentar resultados mais uniformes e condizentes com a literatura mundial em
indivíduos normais. Frisamos que foram poucos os autores que avaliaram tais
mutações no contexto toxicidade de drogas e DVOH.
Ao nosso entender, este modelo de analise se aplicaria melhor no ato do
diagnóstico da doença hematológica, pois no pré-TCTH já aconteceram as
alterações hepáticas que resultam em óbitos ou morbidade como déficit de função
hepática que geralmente excluem os pacientes da indicação de transplante. Assim
sendo, a casuística de pacientes que realizam o TCTH já é selecionada e, portanto,
apresenta uma freqüência de mutações inferiores a populacional conforme
observamos para as mutações  e π.
Alguns eventos pré-transplante, apresentam-se como fatores predisponentes
para o desenvolvimento de DVOH, estando o aumento dos níveis de transaminases
hepáticas como sendo um dos fatores de risco mais importantes para o
desenvolvimento desta síndrome. McDonald et al. (1993), encontraram uma alta
associação entre a presença de transaminases alteradas pré- transplante e o risco
de desenvolver DVOH. Em nosso estudo a presença de enzimas hepáticas
alteradas, foi um fator significante para o desenvolvimento de DVOH. Perguntamos
por que a hepatite pode fazer o fígado mais susceptível à DVOH? Aventamos como
primeira hipótese que o metabolismo de drogas é anormal, resultando no aumento
dos
níveis
citotóxicos
de
metabólitos
de
drogas
quimioterápicas
e
consequentemente falência da detoxificação destes metabólitos (McDonald et al.,
1993). Esta hipótese de metabolismo de drogas alterado é um atrativo para uma
perpectiva de prevenção com citoprotetores no emprego de altas doses de drogas
citotóxicas as quais podem ser ajustadas de acordo com o perfil de metabolismo de
cada paciente. Outra hipótese seria a alteração de sinusoides e do endotélio
D i s c u s s ã o | 102
venular, que seria mais susceptível à injúria medicamentosa (McDonalds et al.,
1993).
Coppell et al. (2003), McDonald et al. (1993) e Kumar (2003), observaram
variáveis como TCTH prévio, regime de condicionamento, drogas usadas intraTCTH, tipo de transplante, presença de quadro viral, apresentam um risco elevado
de desenvolvimento de DVOH, não sendo observado em nosso estudo, isto
podendo se dever à casuística analisada, ao fato de realizarmos o TCTH em
doenças avançadas e com receptores já previamente selecionados pela evolução da
doença e toxicidade de tratamentos utilizados. Postulamos que aqueles com
polimorfismos que possam influenciar na sua evolução comumente não chegam a
ser transplantados pois falecem antes deste procedimento.
Além disso a baixa incidência de algumas mutações aqui pesquisadas e dos
fatores já citados, frisamos que partimos de uma amostragem de DNA previamente
estocada em 76,6% das amostras e que a quantidade de que dispúnhamos era
limitada. A padronização das amplificações já era rotina no Laboratório de Biologia
Molecular da Disciplina de Hematologia para a quase totalidade dos primers,
entretanto todas as amplificações foram intensamente re-checadas com população
normal e com nossa amostragem. Daí resultou em não uniformidade de
amplificações para cada par de primers. Pelo fato de termos amplificados em
primeiro plano a GST, a disponibilidade de DNA para este polimorfismo foi maior; já
para o Fator V de Leiden e a mutação da protrombina que foram os últimos, houve
limitação em aproximadamente 32% e 25% , respectivamente. Estes fatos podem ter
contribuído em parte, pela não significância dos resultados encontrados, em especial
para este dois últimos pares de primers.
6. CONCLUSÕES
C o n c l u s õ e s | 104
1- O dano hepático pré-TCTH, avaliado pela alteração de transaminases
elevadas, mostrou-se um fator predisponente para o desenvolvimento da doença
veno oclusiva hepática, sendo este um achado, o qual não estava relacionado em
nossos objetivos. (p-0,007).
2- Em relação a mutação HFE S65C, observou – se que há uma tendência ao
desenvolvimento do dano hepático, ocorrido no pré-TCTH (p=0,049); porém quando
analisamos a presença desta mutação e o risco de desenvolver a DVOH não houve
significância (p=0,999). As demais mutações pesquisadas não mostraram relação
com dano hepático pré-TCTH ou com a ocorrência da DVOH.
C o n c l u s õ e s | 105
7. ANEXOS
A n e x o s | 107
ANEXO 1 – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa.
A n e x o s | 108
ANEXO 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do projeto:
Análise de polimorfismos dos genes HFE, fator V de Leiden, Protrombina, Glutationa –S
transferase, Metilenotetrahidrofolato-redutase e o risco de doença veno-oclusiva hepática
em pacientes submetidos a transplante alogênico de células tronco hematopoéticas.
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito desses esclarecimentos que li ou que
foram lidos para mim, descrevendo o estudo “Discuti com o Dr. Jose Dias Resende Junior
sobre a minha decisão em participar desse estudo. Ficaram claros para mim quais são os
propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as
garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que
a minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia de acesso ao tratamento
hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar desse estudo e
poderei retirar meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem
penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no
meu atendimento nesse serviço”.
São Paulo, ____ de ______________ de _______.
________________________________
Paciente ou representante legal
________________________________
Testemunha
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido
desse paciente ou representante legal para a participação nesse estudo.
São Paulo,____ de ______________ de _______.
_________________________________
Responsável pelo estudo
8. REFERÊNCIAS
R e f e r ê n c i a s | 110
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Abstract
Background: Genetic polymorphisms is associated with an increased risk of venous
thromboembolism (VTE) and other cardiovascular diseases. Previous studies
suggest that hepatic venooclusive disease (HVOD) in bone marrow transplantation is
attributed a genetic polymorphisms. Objectives: To evaluate the correlation between
genetic polymorphisms and risks of hepatic venooclusive disease in allogeneic bone
marrow transplantation and
the association with the presence of variable as
vancomyci usage, cytotoxic drugs used in the conditioning regimen, prior hepatic
dysfunction,
cytomegalovirus
infection
and
group
of
diseases'
diagnoses.
Patients/Methods: This study was an observational multicentre clinical study. We
randomized 120 patients submitted to allogeneic bone marrow transplantation. Each
patient was prospectively evaluated for DVOH confirmed by modified Seattle criteria,
aged between 2 and 65 years. Risk factors for severe DVOH were analyzed using
logistic regression models. We described the simultaneous detection of mutation of
the HFE C282Y, H63D, S65C; MTHFR C677T; Fator V de Leiden, Prothrombin
20210A and glutathione S-tranferase by PCR followed restriction digestion and
detection by agarose gel electrophoresis. Results: In this observe study of people
undergoing myeloablative HSCT, the presence of prior hepatic dysfunction was a
significant risk factor for HVOD. We also observed an association between the
presence of S65C allele and hepatic dysfunction. Conclusions: In summary, our
data suggest that the prior hepatic dysfunction is a significant risk factor for HVOD.
We evaluated that the presence of HFE S65C mutation is a predisposition factor to
develop hepatic damage.
Key words: 1. Bone Marrow Transplantation. 2. Hematopoietic Stem Cell
Transplantation. 3. Homologous Transplantation. 4. Risk Factors. 5. Hepatic VenoOcclusive Disease. 6. Genetic Polymorphism.
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