Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Isabel Cristina Fracasso Póvoa
Brycon opalinus (CUVIER, 1819) (CHARACIFORMES): AVALIAÇÃO
HEMATOLÓGICA E GENÉTICO-BIOQUÍMICA FRENTE À HIPÓXIA
São José dos Campos
2008
Isabel Cristina Fracasso Póvoa
Brycon opalinus (CUVIER, 1819) (CHARACIFORMES): AVALIAÇÃO
HEMATOLÓGICA E GENÉTICO-BIOQUÍMICA FRENTE À HIPÓXIA
Dissertação
de
mestrado
apresentada
no
Programa de Pós Graduação em Ciências
Biológicas, como complementação dos créditos
necessários para obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas.
Orientador: Profª Drª Maria Regina de Aquino Silva
São José dos Campos, SP
2008
P894b
lsabelCrisüna
Fracãsso
Povoa,
ES):avâliâção
Bryconopalinus(CUVIER,I 819) (CHARACIFORM
/ lsabelCrisitna
Fracasso
fÍentea hipóxia
hematologica
e genético-bioqulmiça
Prof.aD|a.MariaRegina
deAquinoSilva.SãoJosédos
Póvia:Orientadora
campos,2008.
I Discolaser color
em Ciências
DissêÍtaÉoapr€,sentada
ao Programade Pós-Graduação
do
da Universidade
do Instituto
de Pesquisa
e Dêsenvolvimento
Biológicas
Va,edo PaÍaíba.
2008.
1. Rio PaÍaÍbado Sul 2. DegradaÉoambiental3. Anóxia 4. Aguas
dêAquino,
Orient.ll. TÍtulo
5. Peixesl. Slva,MariaRegina
Residuárias
CDU:504
parafinsâcâdêmicos
a reprodugão
e científicos,
exclusivamente
Autorizo,
porprocessos
ou
fotocopiadores
totalou parcialdestadissertação,
que
a
fonte.
desde
citâda
êletrônica,
transmissão
Assinatura
doAluno:
Dalada defesa:
0L , turrto , trng
ISABEL CRISTINA FRACASSOPOVOA
o'BRycoN oPALTNUS(cwrER, 1819)(cEARAcIFoRMÉs)r AVALIAÇÃo
FRENTEÀ HIPOXIA''
HEMATOLóGICA E GENÁTICO-BIOQUÍMICA
do grau de Mestre em Ciênoias
Dissertaçãoaprcvaalacomo reqúsito parcial à obtenção
e
em CiênciasBiológicas'do Instituto de Pesqursa
Biológicas,do Programade Pós-Gmduação
Josédos campos,sP, pela seguinte
Desenvolvimentoda universidadedo Vale do Paraíba,são
bancaexaminadora:
Prol Dr. DRAUZIO EDUARDO NARETTO RANGEL
Pfof. DÍa.MARIA REGINA DE AQUINO SILVA
Prof.Dr. ORLANDO MOREIRA FILHO (UFSCar
Prof. Dr. MarcosTadeuTavaÍesPacheco
Diretor do IP&D - UniVaP
SãoJosédosCampos,0l dejulhode 2008
“Só engrandeceremos o nosso direito à vida,
cumprindo o nosso dever de cidadãos do mundo”
Gandhi
A minhas razões para viver, Amândio e Vinícius.
Aos meus pais Alceu e Lourdes
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela oportunidade de poder buscar o “SABER”.
A Profª Drª Maria Regina de Aquino Silva, pela amizade, pela simplicidade, pela humildade
em transmitir seus valiosos conhecimentos e total apoio.
A Profª Drª Maria Luiza Barcellos Schwantes,Universidade Federal de São Carlos, pelas
valiosas observações e suporte técnico.
Ao Amândio, meu companheiro nesta jornada, pela paciência, pelo incentivo, pelo apoio
incondicional, pelo exemplo e pelo amor.
Ao Vinícius, meu horizonte, que mais tarde vai entender a grande importância das horas
ausentes.
A minha amiga Solange pelo apoio, pelo exemplo de l uta e otimismo.
Ao Rodrigo pelas horas de “eletroforese”.
As minhas amigas Drª Claudia e Drª Silvana do Laboratório Quaglia, que tão gentilmente
atenderam meu pedido.
Aos diretores do Laboratório Quaglia pela pronta atenção, estimulo aos estudos científicos e
exemplo de competência.
As bibliotecárias da UNIVAP, em especial a Rubia pela competência, apoio e delicadeza.
Ao Diretor da Faculdade de Engenharia, Arquitetura e Urbanismo – FEAU, pelo uso dos
laboratórios.
A Profª Drª Cristina Pacheco Soares do Laboratório de Cultura de Células-IP&D, pelo uso
do laboratório.
A todos que de alguma maneira contribuíram para que este trabalho fosse realizado, estão
todos no meu coração.
Brycon opalinus (Cuvier, 1819) (Characiformes): avaliação hematológica e
genético-bioquímica frente à hipóxia
Resumo
Um dos principais problemas enfrentados pela bacia do rio Paraíba do Sul está na
disposição de efluentes de origem doméstica e industrial em suas águas, causando
entre outros problemas a depleção oxigênio dissolvido. No presente trabalho foram
estudadas as respostas hematológicas e bioquímicas, frente a baixas concentrações
de oxigênio da espécie de peixe Brycon opalinus, endêmica do rio Paraíba do Sul.
Os animais foram divididos em três grupos: controle ou normóxia, hipóxia (hpx) 3
horas, hipóxia (hpx) 6 horas. Os valores para eritrócitos em normóxia (1.9 ± 0.2
6
3
6
3
6
3
10 /mm ), hpx 3 horas (2.1 ± 0.5 10 /mm ) e hpx 6 horas (2.4 ± 0.2 10 /mm ), tiveram
diferença significativa (p<0,01) entre grupo controle e hpx 6. Para o hematócrito foi
observada diferença estatística significativa (p<0,05), em relação ao grupo controle
(37,7 %) e hipóxia 6 horas (44,6 %). Para o VCM, o valor maior foi em hipóxia 3
horas (200.6 ± 4.0 µm3) e praticamente invariável em normóxia (190.3 ± 8.2 µm3) e
hipóxia de 6 horas (190.1 ± 6.6 µm3). Para hemoglobina corpuscular média (HCM) e
concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) observaram-se os
menores valores na condição de hpx 3 horas (61.5 ± 4.4 pg e 30.5 ± 3.8 % ,
respectivamente) em relação à normóxia (66.5 ± 7.3 pg e 34.4 ± 4.3 %
respectivamente) e hipóxia 6 horas (63.6 ± 4.6 pg e 34.3± 4.8 %, respectivamente).
Em relação à glicose plasmática os valores não tiveram diferenças significativas,
mas verificou-se que em hpx 6 horas (76,3 ± 27,4 mg/dL) e 3 horas (68,8 ± 35,5
mg/dL) que os valores foram 15% e 4%, respectivamente, superiores ao de
normóxia (66,2 ± 22,1 mg/dL). Foram analisados fenótipos das isozimas malato
desidrogenase (MDH) e lactato desidrogenase (LDH) em eletroforese. Para a MDH
sugere-se a presença de dois locos gênicos sMDH-A* (predominando em fígado) e
sMDH-B* (predominando em músculo esquelético e cardíaco) com alelo variante
(B106*) para o loco B*. O cálculo da freqüência gênica realizado para este loco
indica que a população encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Uma vez que
não se observou a presença da fração mitocondrial da MDH, fracionamento celular e
testes de termoestabilidade foram realizados. Os resultados obtidos pelo
fracionamento celular indicam que esta fração tem migração similar a isoforma A.
Em hipóxia (3 e 6 horas) foi possível observar um aumento nas intensidades
relativas das diferentes isoformas da MDH, quando comparadas a normóxia. Em
músculo esquelético e cardíaco, também em hipóxia foi possível identificar a
presença da fração mitocondrial. Para a LDH sugere-se a presença de dois locos
gênicos LDH-A* (predominando em músculo esquelético) e LDH-B* (predominando
em coração e fígado). A exemplo do detectado para a MDH observa-se um aumento
na intensidade relativa do produto dos diferentes locos para as condições de hpx 3
horas e 6 horas. Os ajustes hematológicos, mesmo não muito expressivos, e a
presença da mMDH nos tecidos analisados e em hpx 3 e 6 horas, sugerem uma
forma de adaptação bioquímica utili zada frente a uma reorganização metabólica
decorrente de variações ambientais.
Palavras chaves: degradação ambiental, oxigênio dissolvido, isozimas, Paraíba do
Sul.
Brycon opalinus (Cuvier, 1819) (Characiformes): haematologycal
and genetic-biochemical assessment face to hypoxia
Abstract
One of the main problems faced by the basin of Paraíba do Sul river is the
disposition of domestic and industrial effluents in its waters, which causes the
depletion dissolved oxygen, among other problems. This paper presents the study on
the haematological and biochemical answers in the low concentrations of oxygen by
the Brycon opalinus fish species, endemic of Paraíba do Sul River. The animals were
divided in three groups: control group in normal conditions, hypoxia (hpx) 3 hours,
hypoxia (hpx) 6 hours. The values for erythrocytes in normal conditions (1.9 ± 0.2 106/
3
6
3
6
3
mm ), hpx 3 hours (2.1 ± 0.5 10 /mm ) and hpx 6 hours (2.4 ± 0.2 10 /mm ), showed
significant differences (p< 0,01) between control group and hpx 6. For hematocrite,
significant statistic difference was observed (p< 0,05), related to the control group
(37,7 %) and hypoxia 6 hours (44,6 %). For the VCM, the highest value was in
hypoxia 3 hours (200.6 ± 4.0 µm3) and practically invariable in normal conditions
(190.3 ± 8.2 µm3) and hypoxia of 6 hours (190.1 ± 6.6 µm3). For hemoglobin
corpuscular medium (HCM) and concentration of hemoglobin corpuscular medium
(CHCM) the lowest values were observed in the condition of hpx 3 hours (61.5 ± 4.4
pg and 30.5± 3.8 %, respectively) regarding normal conditions (66.5 ± 7.3 pg e 34.4±
4.3 % respectively) and hypoxia 6 hours (63.6 ± 4.6 pg e 34.3± 4.8 %, respectively).
As for plasmatic glucose, the values did not present significant differences. However,
in hypoxia 6 hours (76,3 ± 27,4 mg/dL) and 3 hours (68,8 ± 35,5 mg/dL) the values
were 15% and 4% respectively higher than the one in normal conditions (66,2 ± 22,1
mg/dL). Electrophoretic phenotypes of malate (MDH) and lactate (LDH)
dehydrogenase isozymes were analyzed. MDH presented variant allele for MDH-B*
locus. The genic frequency for MDH indicates that the individuals studied are
according to Hardy- Weinberg. The presence of MDH isoforms in muscular tissues
did not reveal any difference when compared with the control with normal conditions,
except in the presence of mitochondrial phenotype, mMDH* locus product, in hpx 3
hours and 6 hours. LDH did not reveal any change in the phenotype for skeletal
muscle. For hepatic tissues, an increase of the intensity of MDH and LDH in the
conditions of hpx 3 hours and 6 hours was observed. In the cardiac tissue, isoform B,
sMDH-B* locus product was predominant. In hypoxia 3 and 6 hours, the expression
of the mitochondrial fraction product of mMDH* and an increase in the intensities
related to products of locus A* and B* were observed. The haematological
adjustments, though not so significant, and the presence of mMDH in the analyzed
tissues and in hpx 3 and 6 hours suggest a kind of biochemical adaptation used due
to a metabolic reorganization resulting from environmental variations.
Key words: environmental degradation, dissolved oxygen, isozyme, Paraíba do Sul.
Lista de Figuras
FIGURA 1: BACIA HIDROGRÁFICA DO R IO PARAÍBA DO S UL - F ONTE: CBH-PS ........................................... 5
FIGURA 2: SÉRIE TEMPORAL DE M EDIÇÕES DE OD ( MG/L) ESTAÇÃO PRBS440 - R IO PARAÍBA DO SUL EM
SÃO JOSÉ DOS CAMPOS. FONTE AGEVAP, 2006 ......................................................................... 9
FIGURA 3: ESTRUTURA DIMÉRICA DA MALATO DESIDROGENASE 1, NAD (SOLÚVEL ) EC: 1.1.1.37
FONTE:HTTP://WWW.CSRRI.IIT. EDU............................................................................................ 18
FIGURA 4: ESTRUTURA TETRAMÉRICA DA LACTATO DESIDROGENASE (LDH, EC 1.1.1.27 LACTATO: NADOXIDOREDUTASE) FONTE: HTTP:// WWW. IONCHANNELS. ORG ........................................................... 20
FIGURA 5: BRYCON OPALINUS (CUVIER, 1819) ................................................................................... 21
FIGURA 6: PIRAPITINGA DO S UL - F ONTE: ARQUIVO DA AUTORA ............................................................. 22
FIGURA 7: R EDES DE CONTENÇÃO (A E C) INSTALADAS NOS TANQUES PARA EXPERIMENTO DE HIPÓXIA
REALIZADO PARA B. OPALINUS , IMPEDINDO ACESSO DOS PEIXES AO OXIGÊNIO SUPERFICIAL. (B)
MONITORAMENTO DO OD E TEMPERATURA ................................................................................. 24
FIGURA 8: GRÁFICO DOS VALORES OBTIDOS PARA ERITRÓCITOS DE B. OPALINUS PARA NORMÓXIA , HIPÓXIA 3
HORAS E HIPÓXIA 6 HORAS. ...................................................................................................... 35
FIGURA 9: G RÁFICO DOS VALORES OBTIDOS PARA HEMOGLOBINA DE B. OPALINUS PARA NORMÓXIA , HIPÓXIA 3
HORAS E HIPÓXIA 6 HORAS. ...................................................................................................... 36
FIGURA 10: GRÁFICO DOS VALORES OBTIDOS PARA HEMATÓCRITO DE B. OPALINUS PARA NORMÓXIA , HIPÓXIA
3 HORAS E HIPÓXIA 6 HORAS. ................................................................................................... 37
FIGURA 11: GRÁFICO DOS VALORES PARA VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM) DE ERITRÓCITOS DE B.
OPALINUS PARA NORMÓXIA , HIPÓXIA 3 HORAS E HIPÓXIA 6 HORAS. ................................................. 37
FIGURA 12: GRÁFICO DOS VALORES DE HEMOGLOBINA CORPUS CULAR MÉDIA (HCM) DE B. OPALINUS PARA
NORMÓXIA , HIPÓXIA 3 HORAS E HIPÓXIA 6 HORAS. ....................................................................... 38
FIGURA 13: GRÁFICO DOS VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM) DE
B. OPALINUS PARA NORMÓXIA , HIPÓXIA 3 HORAS E HIPÓXIA 6 HORAS .............................................. 38
FIGURA 14: CORRELAÇÃO DOS ÍNDICES VCM E CHCM DE B. OPALINUS EM NORMÓXIA ............................. 40
FIGURA 15: CORRELAÇÃO DOS ÍNDICES VCM E CHCM DE B. OPALINUS EM HIPÓXIA 3 HORAS. .................. 40
FIGURA 16: CORRELAÇÃO DOS ÍNDICES VCM E CHCM DE B. OPALINUS EM HIPÓXIA 6 HORAS ................... 41
FIGURA 17: R ESPOSTA AO ESTRESSE SEGUNDO BARTON, 2002............................................................ 43
FIGURA 18: EXPRESSÃO FENOTÍPICA EM ELETROFORESE DA S
I OZIMA MDH, EM FIGADO (F), CORAÇÃO (C) E
MÚSCULO ESQUELÉTICO (M) DE B. OPALINUS . PRESENÇA DE ALELO VARIANTE (B * 106). ................... 45
FIGURA 19: F RACIONAMENTO CELULAR REALIZADO PARA A MDH DE FÍGADO (F) E MÚSCULO ESQUELÉTICO (M)
DE B. OPALINUS EM NORMÓXIA (A) E HIPÓXIA 6 H (B). S: FRAÇÃO SOLÚVEL / M: FRAÇÃO MITOCONDRIAL. A
SETA INDICA A PRESENÇA DA FRAÇÃO MITOCONDRIAL EM MÚSCULO ESQUELÉTICO NO CONTROLE. ....... 47
FIGURA 20: TESTE DE TERMOESTABIL IDADE DE MDH NO TECIDO MUSCULAR ESQUELÉTICO DE B. OPALINUS ,
NOS TEMPOS DE 1, 3, 5, 7, 9 E 10 MINUTOS À 50°C E CONTROLE (C). AMOSTRA DE TECIDO DO GRUPO DE
ANIMAIS EM NORMÓXIA . ........................................................................................................... 48
FIGURA 21: TESTE DE TERMOESTABIL IDADE DE MDH NO TECIDO MUSCULAR ESQUELÉTICO DE B. OPALINUS ,
NOS TEMPOS DE 1, 3, 5, 7, 9 E 10 MINUTOS À 50°C E CONTROLE (C). AMOSTRA DE TECIDO DO GRUPO DE
ANIMAIS EM HIPÓXIA 6 H. .......................................................................................................... 48
FIGURA 22: TESTE DE TERMOESTABIL IDADE DE MDH NO TECIDO HEPÁTICO DE B. OPALINUS , NOS TEMPOS DE
1, 3, 5, 7, 9 E 10 MINUTOS À 50 °C E CONTROLE (C). A MOSTRA DE TECIDO DO GRUPO DE ANIMAIS EM
NORMÓXIA ............................................................................................................................. 49
FIGURA 23: TESTE DE TERMOESTABIL IDADE DE MDH NO TECIDO HEPÁTICO DE B. OPALINUS , NOS TEMPOS DE
1, 3, 5, 7, 9 E 10 MINUTOS À 50 °C E CONTROLE (C). A MOSTRA DE TECIDO DO GRUPO DE ANIMAIS EM
HIPÓXIA 6H. ........................................................................................................................... 49
FIGURA 24: EXPRESSÃO FENOTÍPICA EM ELETROFORESE DA ISOZIMA LDH, EM CORAÇÃO, MÚSCULO E FIGADO
DE B. OPALINUS ..................................................................................................................... 51
FIGURA 25: EXPRESSÃO FENOTÍPICA DE MDH EM ELETROFORESE EM GEL DE AMIDO, PARA FÍGADO (F),
CORAÇÃO (C) E MÚSCULO (M) DE B. OPALINUS , EM NOMÓXIA (A), HIPÓXIA 3 HORAS (B), HIPÓXIA 6 HORAS
(C)....................................................................................................................................... 53
FIGURA 26: EXPRESSÃO FENOTÍPICA DE LDH EM ELETROFORESE EM GEL DE AMIDO, EM FÍGADO (F), CORAÇÃO
(C) E MÚSCULO (M) DE B. OPALINUS PARA NOMÓXIA (A), HIPÓXIA 3 HORAS (B), HIPÓXIA 6 HORAS (C). . 55
FIGURA 27: ESQUEMA DEMONSTRANDO AS VIAS METABÓLICAS NAS QUAIS A MDH E A LDH ESTARIAM
ATUANDO (MODIFICADO A PARTIR DE SUAREZ E MOMMSEN, 1987). ........................................... 62
Lista de Tabelas
TABELA 1: NÚMERO DE HABITANTES DOS ESTADOS ONDE ESTÁ INS ERIDO O VALE DO PARAÍBA ..................... 6
TABELA 2: CARGA POLUIDORA (KG DBO/ DIA ) DAS PRINCIPAIS CIDA DES DO VALE DO PARAÍBA . DADOS
CETESB (2006) ................................................................................................................... 10
TABELA 3: DISTRIBUIÇÃO DOS PEIX ES NAS DIFERENTES CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E SUAS RESPECTIVAS
RÉPLICAS. ............................................................................................................................. 23
TABELA 4: SOLUÇÃO DE COLORAÇÃO ESPECIFICA PARA MDH ............................................................... 27
TABELA 5: SOLUÇÃO DE COLORAÇÃO ESPECIFICA PARA LDH................................................................ 28
TABELA 6: ÍNDICES MONITORADOS NOS TANQUES DURANTE EXPERIMENTO. ............................................. 30
TABELA 7: MÉDIA E DESVIO PADRÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS INVESTIGADOS. ......................... 33
TABELA 8: ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA KRUSKAL-W ALLIS ) DOS DADOS HEMATOLÓGICOS. .................. 34
TABELA 9: MÉDIAS E DESVIO PADRÃ O PARA GLICOSE EM NOMÓXIA , HPX 3 H E HPX 6 H................................ 42
TABELA 10: CÁLCULO DE FREQÜÊNCIA GÊNICA PARA ALELO VARIANTE *106 NO LOCO B*........................... 45
Sumário
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1
2. OBJETIVOS .........................................................................................................................4
2.1. OBJETIVO GERAL.............................................................................................................4
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................................4
3. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................5
3.1. A BACIA HIDROGRÁFICA DO RIO PARAÍBA DO SUL.........................................................5
3.2. O XIGÊNIO DISSOLVIDO E MATÉRIA ORGÂNICA ...............................................................8
3.3 ALTERAÇÕES DE OXIGÊNIO DISSOLVIDO COMO CONDICIONANTE AO ESTRESSE ......... 11
3.4. ADAPTAÇÕES FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA EM RESPOSTA A HIPÓXIA . .......................... 12
3.4.1 Ajustes Hematológicos ....................................................................................... 13
3.4.2 Ajustes genético-bioquímicos - Isozimas......................................................... 14
3.4.3. Malato Desidrogenase (MDH).......................................................................... 16
3.4.4 Lactato Desidrogenase (LDH)........................................................................... 18
3.5. BRYCON OPALINUS - PIRAPITINGA DO SUL: ESPÉCIE ENDÊMICA DO RIO PARAÍBA DO
SUL ....................................................................................................................................... 20
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 23
4.1
OBTENÇÃO DOS ANIMAIS........................................................................................... 23
4.2 DESENHO DO EXPERIMENTO ......................................................................................... 23
4.3 PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS.................................................................................... 25
4.4 GLICOSE PLASMÁTICA ................................................................................................... 25
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................... 25
4.6 ANÁLISE GENÉTICO-BIOQUÍMICA ................................................................................... 25
4.6.1 Preparo dos tecidos............................................................................................. 26
4.6.2 Eletroforese no gel de amido............................................................................ 26
4.6.3 Detecção enzimática........................................................................................... 27
4.7 CALCULO DE FREQÜÊNCIA GÊNICA .............................................................................. 29
4.8 TESTES DE TERMOESTABILIDADE.................................................................................. 29
4.9 FRACIONAMENTO CELULAR ........................................................................................... 29
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................... 30
5.1 PARÂMETROS AMBIENTAIS ............................................................................................ 30
5.2 RESPOSTAS FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS FRENTE À HIPÓXIA ..................................... 32
5.2.1 Variáveis Hematológicas.................................................................................... 33
5.2.2 Glicose Plasmática.............................................................................................. 41
5.2.3 Variação genético-bioquímica - Isozimas........................................................ 44
5.3 REORGANIZAÇÃO METABÓLICA DAS ISOZIMAS FRE NTE À HIPÓXIA ................................ 52
5.3.1.Padrão de expressão das isozimas da MDH.................................................. 52
5.3.2. Padrão de expressão das isozimas da LDH.................................................. 54
5.4. PLASTICIDADE FENOTÍPICA E ADAPTAÇÃO AO AMBIENTE ............................................. 56
5.4.1. Mecanismos adaptativos na produção de energia........................................ 57
5.4.2. Metabolismo oxidativo vs anaeróbico ............................................................. 60
5.5 CONSERVAÇÃO BIOLÓGICA EM BACIAS HIDROGRÁFICAS ............................................. 64
6. CONCLUSÕES................................................................................................................. 67
REFERÊNCIAS.................................................................................................................... 70
1 Introdução
Atualmente um dos principais problemas enfrentado pela bacia do rio Paraíba
do Sul está na disposição de efluentes de origem doméstica e industrial. A influência
antrópica devido à rápida expansão demográfica nas áreas urbanas da bacia, não
foi acompanhada das medidas necessárias de planejamento e saneamento. Este
processo resultou numa ocupação indiscriminada de suas margens e na carência de
infraestrutura sanitária.
Segundo dados da CEIVAP (FUNDAÇÃO COPPETEC) em 2006, para
cidades paulista que fazem parte da bacia do Rio Paraíba, 89,9% das populações
urbanas são atendidas por rede coletora, das quais somente 32,3% possuem
tratamento para seus efluentes sanitários. Os números relativos às concentrações
de fosfato, coliformes fecais e DBO mostram o alto nível de poluição orgânica.
Além da poluição de origem doméstica, a intensa atividade industrial na
região contribuiu para a degradação dos recursos hídricos. De fato, a bacia engloba
importantes regiões industriais e urbanas do país cuja produção corresponde a
aproximadamente 10% do PIB (IBGE, 2005).
Tais fatos têm contribuído fundamentalmente para que nas últimas décadas,
os habitats, a diversidade e a quantidade de peixes venham diminuindo na bacia do
Rio Paraíba.
As espécies de peixes vêm sendo expostos a condições ambientais cada vez
mais desafiadoras do ponto de vista biológico, resultando em efeitos negativos na
saúde, crescimento, reprodução e sobrevivência desses animais (SANDERS,
MEEUWING, VICENT, 2002). Um dos importantes fatores é alteração do meio
ocasionada por variações na concentração de oxigênio dissolvido, onde se destaca
a introdução de matéria orgânica.
Condições ambientais desfavoráveis à sobrevivência dos peixes determinam
ajustes comportamentais, fisiológicos e bioquímicos que lhes permitem sobreviver.
Há evidentemente limites para essa habilidade, os quais podem ser ultrapassados
provocando estresse. Essa condição de alteração no estado orgânico produzida por
um fator ambiental requer ajustes fisiológicos e/ou bioquímicos que dependendo da
intensidade e freqüência de ocorrência, pode resultar numa diminuição da
capacidade de sobrevivência do animal.
Em ambientes aquáticos tropicais, altas temperaturas associadas com a
decomposição da matéria orgânica causam depleção do oxigênio, condição a qual é
agravada devido à introdução artificial de nutrientes provenientes da atividade
antrópica (WU, 1999).
A baixa disponibilidade de oxigênio no ambiente aquático conduz a ajustes
adaptativos em todos os níveis da organização biológica, desde a regulação do
número de células sangüíneas em circulação até adequação na maquinaria
bioquímica das células, podendo levar a mudanças de comportamento a nível
populacional. Segundo Val, Silva e Almeida-Val (2004), as alterações que ocorrem
no nível fisiológico e bioquímico podem ser empregadas no diagnostico dos efeitos
de condições ambientais adversas.
Estudos em Piaractus mesopotamicus, demonstraram que ambientes com
baixas concentrações de oxigênio podem aumentar a toxicidade de contaminantes,
onde tais fatores combinados causam distúrbios nas defesas antioxidantes e em
parâmetros bioquímicos (SAMPAIO et al.,2008). Fato importante se considerada a
contaminação atual da bacia do rio Paraíba do Sul, onde existe violação de classe
praticamente em toda a bacia (CEIVAP, 2006).
No presente trabalho estudam-se as respostas fisiológicas frente a baixas
concentrações de oxigênio de Brycon opalinus, espécie endêmica do rio Paraíba do
Sul, considerada como vulnerável (IUCN-The World Conservation Union) e foi
declarada ameaçada de extinção segundo o Diário Oficial da União de 21 de maio
de 2004.
Foram abordados aspectos hematológicos, já que o sistema hematopoiético
responde rapidamente a variações na concentração de oxigênio. Respostas
primárias à hipóxia envolvem liberação de eritrócitos do reservatório esplênico e
influencia os níveis de fosfato inorgânico nos eritrócitos (VAL; ALMEIDA-VAL, 1995;
VAL, 1999; FERNANDES et al.,1999; TAVARES-DIAS ; MORAES, 2004).
No enfoque bioquímico foram estudadas as isozimas malato desidrogenase
(MDH) e lactato desidrogenase (LDH), considerando seu importante papel no
metabolismo celular em relação às modificações nos níveis de oxigênio.
Variações no nível de atividade isozímica são demonstradas e relacionadas
com processos de alteração ambiental, como são mudanças de temperatura e níveis
de oxigênio. Desta forma, vários estudos têm sugerido que os peixes, em particular,
utilizam mecanismos genéticos e/ou metabólicos em resposta a alterações no meio
ambiente, fato o qual, poderia se constituir numa estratégia qualitativa de adaptação
bioquímica (ALMEIDA-VAL et al, 2000; PANEPUCCI et al., 2000; SCHULTE, 2004;
SOMERO, 2003, 2004).
Sendo assim, salienta-se a importância de estudos sobre a ictiofauna e sua
relação com o meio, visando à recuperação dos estoques naturais do rio Paraíba do
Sul e a conservação da sua biodiversidade.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar as respostas hematológicas e bioquímicas da espécie Brycon
opalinus, endêmica do rio Paraíba do Sul, frente a baixas concentrações de
oxigênio.
2.2 Objetivos específicos
♦ Avaliar os parâmetros hematológicos de Brycon opalinus, em resposta a
hipóxia de 3 e 6 horas.
♦ Analisar os níveis de glicemia dos animais expostos à baixa concentração de
oxigênio em diferentes tempos, como variável indicadora de estresse.
♦ Estudar a expressão fenotípica das isozimas MDH e LDH em eletroforese,
considerando as diferentes condições experimentais de hipóxia.
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 A Ba cia Hidrográfica do Rio Paraíba do Sul
A área delimitada pelo relevo que drena a água da chuva por uma rede de
córregos e rios é chamada de bacia hidrográfica, reconhecida como uma unidade
básica de ecossistema terrestre reunindo partes do meio ambiente que interagem
local e regionalmente através do fluxo de materiais e organismos mediado pela
água. Na última década as bacias hidrográficas passaram a ser consideradas
unidades de conservação devido a sua grande importância e diante das previsões
não tão otimistas em relação à escassez de água e o declínio das espécies
aquáticas (MOULTON ; SOUZA, 2006).
A bacia do Paraíba do Sul (Figura 1) está situada entre as latitudes 20°26' e
23°39'S e as longitudes de 41° e 46°30'W, ocupando aproximadamente 55.400 km2,
sendo 13.500 km2 no Estado de São Paulo, 21.000 km2 no Estado do Rio de Janeiro
e 20.900 km2 em Minas Gerais (GRUBEN, JOHNSSON, LOPES, 2002).
Figura 1: Bacia hidrográfica do Rio Paraíba do Sul - Fonte: CBH-PS
Sua origem está na Serra da Bocaina, a 1800 m acima do nível do mar, onde
suas nascentes ganham corpo com a junção de afluentes tornando-se o rio
Paraitinga, o qual se encontra com a barragem da Usina Hidrelétrica de Paraibuna
200 km à frente. A partir de Paraibuna segue para Guararema, trecho que recebe a
denominação de Alto Paraíba, com 280 km de extensão.
De Guararema a
Cachoeira Paulista está o Médio Paraíba com altitude variando entre 580 m a 520 m.
Em Cachoeira Paulista inicia-se o Baixo Paraíba, sendo percurso final até
desembocar no Oceano Atlântico na cidade de São João da Barra no estado do Rio
de Janeiro (COPPETEC, 2001).
A população urbana total da bacia em 2005 chegou a 5.258.068 habitantes
(Tabela 1) (COPPETEC, 2006; CETESB, 2008). A tendência de concentração
populacional nas áreas urbanas segue o mesmo padrão de outras regiões
brasileiras e é um dos fatores responsáveis pelo aumento da poluição na bacia.
Tabela 1: Número de habitantes dos Estados onde está inserido o Vale do Paraíba.
Estado
Habitantes na bacia do Rio Paraíba do Sul
Rio de Janeiro
2.264.070
Minas Gerais
1.245.300
São Paulo
1.975. 465
Fonte: CETESB, 2008.
A bacia do Rio Paraíba tem sofrido modificações ao longo do tempo por
influência da atividade humana. Pode-se ressaltar o fato de se encontrar localizada
entre os dois mais importantes centros urbano-industriais do país, o que tem
contribuído para o crescente grau de poluição acarretando grandes impactos sobre a
fauna e flora (PEINADO, 2006). Caracterizada por uma diversidade de indústrias,
desde a química, a metalúrgica e a produção de papel (FÉRES et al. 2005).
No trecho paulista o número de empresas de grande porte dos setores
químico e metalúrgico com alto potencial poluente é expressivo. Um número
significativo destas empresas instalou sistemas de tratamento de efluentes, não
eliminando, no entanto, a ocorrência de lançamentos de cargas tóxicas nos rios
(GRUBEN, JOHNSSON, LOPES, 2002).
Deve-se salientar que além dos impactos decorrentes das atividades
agrícolas e industriais, essa bacia tem sido afetada pela implantação de várias
represas para geração de eletricidade e captação de água. Encontram-se entre as
maiores, a represa de Paraibuna formada pelos rios Paraibuna e Paraitinga em São
Paulo, e a represa do Funil no Rio de Janeiro.
Tais reservatórios formados produzem energia elétrica, fornecem água e
controlam enchentes em áreas ribeirinhas, entretanto afetam diretamente a
sobrevivência das comunidades aquáticas, entre elas as dos peixes. É muito
evidente a alteração no fluxo de água, de sedimentos e nutrientes, perturbando a
dinâmica do ecossistema.
A transformação de um ambiente lótico para um
ambiente lêntico cessa rotas migratórias das espécies reofílicas; altera obstáculos
naturais necessários para as espécies de piracema; provoca extinção lagoas
marginais, onde várias espécies utilizam para desova e fase juvenil; reduz oxigênio
no fundo e produz aumento de H2S e de CO2 no represamento (HILSDORF;
PETRERE, 2002; TUNDISI, 2005).
A construção de reservatórios no curso do rio Paraíba do Sul, ocasionou
modificações na estrutura da comunidade de peixes, onde espécies com maior
capacidade de adaptação tomaram lugar causando impacto nas características
tróficas do ecossistema. Com o barramento do rio houve alterações na
disponibilidade de recursos, impactando as espécies de peixes, as quais se baseiam
tanto na disponibilidade quanto na abundância de alimentos no ambiente para sua
sobrevivência (PEREIRA et al., 2002).
Outro fato a destacar é a introdução de espécies exóticas na década de 50,
que segundo Sanders, Meeuwing e Vicent (2002) é uma das principais ameaças
para a conservação de ecossistemas de água doce, juntamente com perturbações
de origem antrópica. Ainda, o desmatamento das áreas próximas à cabeceira do rio
é considerado outro importante problema, pois aumenta significativamente o risco de
diminuição da produção de água na bacia, diminuindo a disponibilidade hídrica.
Ações danosas ao leito e várzea do Rio Paraíba do Sul, tais como a
devastação da mata ciliar, cortes e desmontes em encostas devido a edificações,
extração de areia, cargas poluidoras domésticas e industriais, o processo de
eutrofização acelerado, entre outras, denota degradação deste ecossistema.
3.2 Oxigênio dissolvido e Matéria Orgânica
Os processos de decomposição da matéria orgânica lançada em um corpo
d'agua são realizados por bactérias decompositoras, que convertem a matéria
orgânica em compostos simples e inertes, como água e gás carbônico utilizando-se
do oxigênio disponível no meio líquido para a sua respiração.
O oxigênio dissolvido (OD) é geralmente medido em miligramas por litro
(mgL¯ ¹) da água analisada. Provém da dissolução do oxigênio atmosférico, e
também, da produção liberada por alguns microorganismos vivos na água (algas e
bactérias). De vital importância para os seres aquáticos aeróbicos, o seu nível de
disponibilidade na água vai depender do balanço entre a quantidade consumida por
bactérias para oxidar a matéria orgânica (fontes pontuais e difusas) e a quantidade
produzida no próprio corpo d’água através de organismos fotossintéticos. Quando
dado balanço do nível de OD permanece negativo por tempo prolongado, o corpo
d’água pode tornar-se anaeróbico, causando a geração de maus odores, o
crescimento de outros tipos de bactérias e morte de diversos seres aquáticos
aeróbicos, inclusive peixes.
A queda na taxa da concentração de oxigênio dissolvido tem diversas
implicações do ponto de vista ambiental, trazendo prejuízo a toda comunidade
aquática principalmente às espécies aeróbicas, alterando relações ecológicas e a
estabilidade do ecossistema.
Segundo relatório da Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
(CETESB, 2006), o Rio Paraíba do Sul apresenta elevada carga orgânica
remanescente lançada pelos municípios de Jacareí, São José dos Campos e
Taubaté, constatando níveis do oxigênio dissolvido reduzidos em vários trechos do
seu percurso.
A Figura 2 apresenta a oscilação nos teores de oxigênio dissolvido no ponto
de captação de São José dos Campos entre os nos de 1985 e 1999 (AGEVAP).
Para o mesmo ponto a CETESB (2006) publicou a média de 3,6 mgL¯ ¹ entre os
anos 1996 e 2005. Assim, pode-se observar uma depleção nos níveis de oxigênio
OD (mg/L)
dissolvido com o passar dos anos.
Tempo (ano)
Figura 2: Série Temporal de Medições de OD (mg/L) Estação PRBS440 - Rio Paraíba do Sul em São
José dos Campos. Fonte AGEVAP, 2006
O aumento substancial do abastecimento de água da população urbana na
bacia, nas últimas décadas, não foi acompanhado dos mesmos índices de coleta de
esgoto e principalmente do seu tratamento, provocando impactos negativos
importantes na qualidade das águas.
No seu relatório anual de 2006, a CETESB reforça a importância da
manutenção dos níveis normais de oxigênio dissolvido para a sobrevivência da
biota, em especial para a população de peixes, visto que em vários pontos de
amostragem as águas do rio Paraíba do Sul, estiveram abaixo das especificações
do CONAMA 357/05, a qual define um mínimo de 5 mgL¯ ¹ para corpo d´água classe
2 (CETESB, 2007).
A carga poluidora total estimada pela CETESB em 2007 para a bacia do Rio
Paraíba do Sul, foi de 99.115 DBO/dia com remanescente de 68.714 kg DBO/dia, ou
seja, quase 70% do esgoto lançado sem tratamento, reforçando aqui a necessidade
de serem concluídas as obras de coleta e tratamento pelas empresas de
saneamento na região (CETESB, 2008).
Sendo assim, devido às características de degradação da bacia, alguns
parâmetros de qualidade das águas extrapolam os limites da sua classe
correspondente, ou seja, Classe II (CARVALHO, 2008). Os parâmetros que
apresentam maior nível de violação são os compostos fosfatados, a demanda
bioquímica de oxigênio e os coliformes fecais e totais, resultado da elevada e
constante contaminação por esgoto doméstico na bacia (CEIVAP, 2006; CETESB,
2008), os quais superaram os limites estabelecidos pela Resolução CONAMA
357/05.
A carga poluidora lançada no rio além de acarretar a presença de coliformes
termotolerantes, adicionalmente favorece o aumento dos valores de fósforo,
promovendo a eutrofização. Tal fato contribui intensamente para a piora do Índice de
qualidade das águas para proteção da Vida Aquática (IVA), sobretudo na depleção
do oxigênio dissolvido, variável a qual, é determinante neste índice (CETESB, 2006).
A carga poluidora dos municípios mais importantes economicamente situados
no Médio Paraíb a podem ser evidenciadas conforme dados da Tabela 2.
Tabela 2: Carga poluidora (kg DBO/dia) das principais cidades do Vale do Paraíba.
Município
Jacareí
São José dos
Campos
Taubaté
Fonte: CETESB, 2008.
Coleta
Tratamento
%
%
96
Carga poluidora (kg DBO/dia)
Potencial
Remanescente
20
11.000
9.167
88
46
32.715
19.885
92
0
13.939
13.939
3.3 Alterações de Oxigênio dissolvido como condicionante ao estresse
O oxigênio no ambiente aquático é proveniente da atmosfera ou do
fitoplâncton, via respiração, supre as necessidades metabólicas dos animais que
vivem nesse ambiente, seja na coluna d’água ou no substrato. Quando o suprimento
de oxigênio é interrompido, ou taxa de consumo dos animais e das plantas aquáticas
excede o difundido, sua concentração declina além da concentração mínima
necessária para a vida da maioria dos animais, levando a hipóxia ambiental (DIAZ,
2001; KARIM, SEKINE, UKITA, 2003). As respostas dos peixes e outros organismos
frente à hipóxia são variáveis, em geral isso ocorre quando a concentração de
oxigênio está abaixo de 2 mg L -1 (DIAZ, 2001).
A estratificação vertical da coluna d’água, fenômeno natural causada por
mudanças nas estações do ano, causa hipóxia ambiental em níveis mais profundos
(HEATH, 1995). Entretanto, frequentemente a hipóxia é provocada pela ação
antropogênica por meio de excessivo despejo de nutrientes e matéria orgânica nos
corpos d’água. Segundo Soares, Menezes e Junk, (2006) e Camargo e Alonso
(2006), atualmente a hipóxia e/ou anóxia afetam águas continentais e grandes
extensões costeiras marinhas em todos continentes do mundo.
É evidente o aumento dos níveis de nutrientes em corpos d’água, atribuído à
excessiva utilização de fertilizantes, cortes de matas e principalmente descargas de
esgoto doméstico. As conseqüências podem ser graves, como mortalidade em
massa de peixes e mamíferos, diminuição das populações bentônicas e
enfraquecimento na produção pesqueira (CAMARGO ; ALONSO, 2006; Wu, 2002).
As águas doces tropicais são caracterizadas por altas temperaturas e baixa
concentração de oxigênio dissolvido, frequentemente os peixes se deparam com o
desafio de satisfazer seus requerimentos metabólicos com condições de reduzida
oferta de oxigênio na água (VAL,1996). Em águas doces subtropicais, embora
continuamente oxigenadas, os peixes podem também ser expostos à hipóxia devido
à alta entrada de material orgânico de origem antrópica.
Sendo assim, em tais ambientes com amplas oscilações nos níveis de
oxigênio, tanto os peixes de respiração área, quanto os peixes de respiração
exclusivamente aquática demonstram sua adaptabilidade com respostas que
associam os vários níveis de organização biológica para sobreviverem, embora a
baixa disponibilidade de OD seja um dos fatores ambientais mais estressantes para
os peixes (KALINIM et al,1996; FERNANDES et al, 1999, BALDISSEROTTO, 2002).
3.4 Adaptações fisiológica e bioquímica em resposta a hipóxia.
A resposta fisiológica dos peixes a um estímulo de estresse é adaptativa e
inespecífica, basicamente neuroendocrina, que desencadeia uma cascata de
acontecimentos fisiológicos e metabólicos necessários para fazer frente à situação
adversa. A glicose é um eficiente indicador de mudanças no estado fisiológico, por
ser a principal fonte de energia utilizada pelos peixes para lidar com situações de
estresse (MORGAN e IWAMA, 1997). Normalmente o aumento da glicose está
relacionado com a liberação de cortisol e outros hormônios, principalmente
catecolaminas (MOMMSEN , MONN, VIJAYAN, 1999)
A hipóxia pode induzir distúrbios osmoregulatórios havendo desordem no
balanço aquoso e mineral, onde a taxa de diurese aumenta levando a
hemoconcentração com redução do volume de plasma. Tal fato se deve ao
resultado da elevação na permeabilidade da membrana branquial à água pela ação
da adrenalina (TERVONEN et al., 2006). Mudanças na morfologia branquial podem
ser observadas em teleósteos devido à exposição hipóxia, promovendo distúrbios
nas trocas gasosas (MATEY et al., 2008).
Em relação aos ovos e larvas de peixes, a sensibilidade à hipóxia varia com o
estágio de desenvolvimento. O embrião é relativamente resistente a baixas
concentrações de oxigênio, entretanto com a evolução do crescimento, a
sensibilidade a hipóxia aumenta. O embrião recém eclodido obtém sua energia
através por mecanismos anaeróbicos, mas com seu desenvolvimento a respiração
aeróbica toma lugar e se torna vital para a sobrevivência. Os alevinos são menos
competentes em tolerar as quedas na concentração de OD que adultos da mesma
espécie (HEATH, 1995).
Wu et al. (2003), descreveu em efeitos da hipóxia na reprodução de carpas
(Cyprinus carpio), tendo como resultado alterações no desenvolvimento das
gônadas. A fertilização de ovos de animais expostos a hipóxia foi 55,5%, para os de
normóxia foi de 99,4% e a eclosão dos ovos de progenitores expostos a baixa
concentração de oxigênio foi de 17,2%, sendo que os ovos dos animais em
concentrações normais de OD, a eclosão alcançou 98,8%.
As larvas de peixes que não sofreram com hipóxia sobrevivem melhor, cerca
de 93,7%, enquanto as larvas de pais expostos a pouca disponibilidade de oxigênio
apenas sobrevivem 46,4% (WU et al., 2003).
Atualmente, os estudos das respostas de um organismo a hipóxia têm sido
amplamente difundidos através dos peixes teleósteos, já que representam o um dos
grupos de espécies mais abundante no meio aquático, e são caracterizados por
sobreviver em ambientes sob condições de constantes alterações nos níveis de
oxigênio (NIKINMAA, 2002).
3.4.1 Ajustes Hematológicos
Nos teleósteos, a porção superior do rim, além de tecido hematopoético
possui função endócrina (ROCHA; FLORES, 2001) e imunológica promovendo a
interação imunoendócrina, de importância para ambos os sistemas, atuando na
produção de anticorpos e de catecolaminas (WEYTS et al., 1999).
Mudanças
em
certos
parâmetros
bioquímicos
e
hematológicos
são
potencialmente úteis, porque permitem detectar danos agudos ou crônicos causados
por algum tipo de estresse (ADHAM, HAMED ;SALEH, 2002).
Os estudos hematológicos das diferentes espécies de peixes são de interesse
ecológico e fisiológico, pois auxiliam na compreensão da relação entre as
características sanguíneas, a filogenia, o hábitat e a adaptabilidade dos peixes ao
ambiente. As espécies de peixes, de mesmo gênero, na maior parte dos casos,
apresentam variações quanto aos valores da quantidade de eritrócitos, seu
tamanho, volume, concentração de hemoglobina e hematócrito. Tais variações intra-
específicas podem ser atribuídas às diferentes características de comportamento,
hábitat, hábito alimentar, clima e outros fatores (TAVARES-DIAS ;MORAES, 2004).
A quantidade de oxigênio transportada por unidade de volume de sangue
depende da tensão de oxigênio, do número de eritrócitos, da quantidade de
hemoglobina nos eritrócitos e da afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. Essa
afinidade desempenha duas importantes funções: a hemoglobina deve chegar
efetivamente saturada de O2 nos capilares dos órgãos de troca gasosa e, liberar o
O2 nos tecidos a alta pressão parcial de oxigênio, necessária para manter um
gradiente de difusão entre o sangue e as estruturas que utilizam o oxigênio
(NIKINMAA, 1990, 1997).
Ao considerar a variedade de espécies que depende da hemoglobina para o
transporte de O2, o sistema hematológico desempenha seu papel sob condições
ambientais extremamente variáveis, o que resulta no desenvolvimento de
mecanismos regulatórios para satisfazer os requerimentos fisiológicos dos
organismos. A relação entre transporte de O2 e mecanismos regulatórios pode ser
evidenciada pela disponibilidade de O2 em ambientes aquáticos de água doce, os
quais mostram acentuada variação diária, espacial e sazonal (VAL e ALMEIDA-VAL,
1995).
Assim, o estresse causado pela hipóxia no ambiente aquático pode causar
alterações hematológicas. Os parâmetros hematológicos constituem frequentemente
um reflexo de processos orgânicos que servem como indicadores das condições
gerais de um organismo ou de distúrbios metabólicos (TAVARES-DIAS ; MORAES,
2004).
3.4.2 Ajustes genético-bioquímicos - Isozimas
Na escala evolutiva os peixes apresentam um maior número de locos gênicos
do que os vertebrados terrestres, principalmente no que se refere aos sistemas
isozímicos. Segundo Fisher et al. (1980), a relativa constância no número de locos
entre as várias espécies de peixes, assim como padrões característicos de
expressão tissular diferencial dos locos isozímicos para estes organismos sugerem
que as isozimas desempenhem papel fundamental na fisiologia destes organismos.
As diferenças estruturais existentes entre os membros de um grupo de
isozimas podem ter origem durante a síntese primária de uma cadeia ou cadeias
polipeptídicas.
Essas
modificações
poderiam
envolver
alterações
químicas
secundárias das enzimas tais como, retirada de um grupo amino de resíduos da
glutamina ou aspargina, oxidação de glicídeos de várias estruturas e clivagem de
uma cadeia polipeptídica por enzimas proteolíticas com perda de um fragmento
terminal. Se tais alterações secundárias envolvem algumas, mas não todas as
moléculas das enzimas ou, afetá-las em diferentes graus ou ainda, representarem
uma série de etapas em um processo pelo qual todas passam, então bandas
múltiplas podem ser reproduzidas em um zimograma. Outra possibilidade é que
formas múltiplas de um grupo de isozimas possam diferir entre si, não nas suas
estruturas primárias mas sim, nas secundárias ou terciárias, diferindo na mobilidade
eletroforética (KITTO et al., 1967; EPSTEIN ; SCHECHTER, 1968).
A extensa variabilidade observada no tamanho do genoma e cariótipo dos
peixes, aparentemente, seria resultante de uma diversificação do estado original,
iniciada durante a história evolutiva dos vertebrados (MURAMOTO, OHNO, ATKIN,
1968). Durante o curso da evolução houve um aumento do conteúdo celular de
DNA, facilitando o aparecimento de formas mais complexas de vida. Segundo
HINEGARDNER (1976), estes aumentos devem ter ocorrido, infrequente e
irregularmente, com intervalos de milhões de anos. A evolução biológica primordial
teve necessidade de uma nova maquinaria metabólica codificada em novos DNAs..
A duplicação gênica tem sido considerada como um dos fatores evolutivos
mais importantes, e é provavelmente, uma das causas de heterogeneidade protéica,
comumente detectada em peixes na forma da isozimas.
Os estudos dos sistemas isozímicos, em peixes, têm sido direcionados para
pesquisa de estruturas, função e regulação, particularmente, nas áreas da
bioquímica, genética e evolução molecular, uma vez que, a duplicação gênica é
considerada um dos mecanismos mais importantes na formação de novos genes e
de novas funções metabólicas, durante o processo evolutivo.
O estudo de isozimas proporciona uma considerável compreensão das
subunidades estruturais das enzimas, assim como marcadores genéticos (MARKET;
MOLLER, 1959; FENRICH-VERANI et al. 1990), evolutivos e ambientais (AQUINOSILVA, 1992; AQUINO-SILVA, SCHWANTES, SCHWANTES, 2003; AQUINO-SILVA
et al. 2008).
As desidrogenases como a LDH e MDH, assim como muitas outras proteínas
são objetos de estudo em vertebrados, tanto sob ponto de vista estrutural como sob
o aspecto funcional, onde se observa mudanças na sua expressão e atividade diante
de condições ambientais adversas (CHIPPARI-GOMES et al., 2005; SAMPAIO,
2008; VAL; ALEMIDA-VAL, 1999).
3.4.3 Malato Desidrogenase (MDH)
O sistema isozímico da malato desidrogenase (MDH; EC 1.1.1.37; Malato:
NAD oxidorredutase) é representado, em vertebrados e invertebrados, por duas
formas principais: malato desidrogenase solúvel (sMDH) e malato desidrogenase
mitocondrial (mMDH). As duas formas, além da sua localização celular, diferem
também
quanto
à
mobilidade
eletroforética
(MARKERT;MOLLER,
1959),
comportamento cinético (BANASZAK e BRADSHAW, 1975), composição de
aminoácidos (McALISTER-HENN, 1988) e propriedades antigênicas (KITTO ;
LEWIS, 1967), estando sob controle de locos gênicos separados (BAILEY, COCKS,
WILSON, WHITT, PROSSER, 1970; WHITT, 1970).
Quanto a sua estrutura molecular, ambas as formas apresentam-se como
dímeros com pesos moleculares de 60.000 a 80.000 daltons (BANASZAK;
BRADSHAW, 1975), e catalisam a oxidação reversível do L-malato em oxalacetato,
requerendo NAD como cofator. Das duas formas, a mMDH atua no ciclo de Krebs,
enquanto que a sMDH se encontra envolvida com a gliconeogênese, lipogênese e
lançadeira malato -aspartato durante a glicólise aeróbica (BANASZAK; BRADSHAW,
1975). Segundo Zink e Shaw (1968), três diferentes rotas metabólicas têm sido
propostas para a sMDH: gliconeogênese, lipogênese e lançadeira malato-aspartato
durante a glicólise aeróbica.
Quanto a mobilidade eletroforética, a sMDH é mais anódica que a mMDH em
anfíbios, répteis, aves e mamíferos (SCHWANTES; SCHWANTES, 1977) e em
várias espécies de peixes (MONTEIRO et al., 1998; AQUINO-SILVA, 2003; 2008).
O número de genes ativos para a sMDH nos vertebrados pode ser variável.
Na maioria dos peixes e anfíbios, a sMDH aparece como uma série de isozimas
anódicas, em geral 3, que se comportam como dímeros compostos por duas classes
de subunidades: A e B, codificadas por dois locos gênicos distintos sMDH-A* e
sMDH-B* (SCHWANTES; SCHWANTES, 1982; MONTEIRO et al., 1998).
O sistema multilócico da sMDH, determinado por locos gênicos múltiplos pode
ter sido formado por deferentes tipos de duplicação gênicas ou genômicas
(aneuploidia, poliploidia, duplicações regionais), relativamente antigas e mantidas
por centenas de milhões de anos. A importância da duplicação gênica como um
mecanismo fundamental de evolução molecular, foi enfatizada desde a década de
70 por Ohno (1970), onde foi postulado que maior avanço no tamanho genômico
facilitou a radiação dos vertebrados. A existência de locos isozímicos parálogos,
duplicados no primórdio da evolução dos vertebrados, em cromossomos separados,
suporta o postulado de que esses foram formados pela amplificação do genoma
inteiro através de um ou mais eventos de poliploidização (FISHER et al., 1980).
Entretanto, a sMDH de algumas espécies de peixes apresenta formas
múltiplas adicionais como resultado de poliploidização e variação alélica (FERRIS ;
WHITT, 1977).
A constante de Michaelis (Km) e os números de “turnover” (número de
moléculas do substrato transformadas, por minuto por uma única molécula
enzimática ou por um único sítio ativo, em condições ótimas), das duas formas de
MDH, mostram diferenças bem marcadas. Através da afinidade ao substrato, Kaplan
(1963) observou diferenças significantes entre sMDH e mMDH de grande
importância fisiológica. O oxalacetato tem efeito inibidor sobre a mMDH enquanto
que a sMDH tem uma inibição ainda maior quanto a altas concentrações de malato.
A fração mitocondrial parece então, ser orientada no sentido da oxidação do malato
e a solúvel ser direcionada para a redução do oxalacetato. As diferenças estruturais
entre as duas formas podem impedir a redução do oxalacetato na mitocôndria e a
oxidação do malato na fração solúvel da célula. Variações quanto à inibição pelo
substrato das duas formas da MDH devem dês empenhar importante papel nas
relações energéticas da mitocôndria, já que a oxidação da NADH mitocondrial é
acoplada à formação de ATP.
Figura 3: Estrutura dimérica da Malato Desidrogenase 1, NAD (solúvel) EC: 1.1.1.37
Fonte:http://www.csrri.iit.edu
3.4.4 Lactato Desidrogenase (LDH)
A lactato desidrogenase (LDH, EC 1.1.1.27 lactato: NAD-oxidoredutase) é
encontrada em todas as células dos vertebrados assim como, em muitos
invertebrados, ocupando uma importante posição no metabolismo celular fora da via
glicolítica. Na fase anaeróbica, o piruvato é convertido a lactato pela ação da LDH,
com oxidação simultânea da coenzima NADH. Esta forma oxidada da coenzima é
essencial para a complementação de um passo anterior da glicólise, ou seja, na
passagem de gliceraldeído-3-fosfato para 1,3-difosfoglicerato . Isto possibilita a
continuidade da glicólise mesmo em ausência de oxigênio. Quando o oxigênio se
torna novamente disponível, o lactato pode ser reoxidado. Neste caso, o piruvato é
levado, via acetil coenzima A, para o ciclo de Krebs com conseqüente fosforilação
oxidativa e formação de gás carbônico e água.
O estudo da LDH teve um grande impulso com Hunter e Markert (1957), pela
combinação da técnica de eletroforese em gel de amido, desenvolvida por Smithies
(1955), com métodos histoquímicos (zimograma). Com isso foi possível verificar que
a LDH é um tetrâmero que, na maioria dos vertebrados, existe como cinco formas
moleculares resultantes da associação ao acaso de duas subunidades, A e B,
codificadas por dois locos gênicos diferentes (CAHN et al., 1962; SCHWANTES,
1970).
O loco LDH-A*, codifica a subunidade A, predominante em músculo
esquelético e o loco LDH-B* codifica a subunidade B, predominante em músculo
cardíaco. Essa associação ao acaso leva a formação dos diferentes tetrâmeros: A4,
A3B, A2B2, AB3, B4 com peso molecular de aproximadamente 140.000 daltons
(DARNALL e KLOTZ, 1975) apresentando diferentes pontos isoelétricos. Assim, o
homopolímero B4 é carregado mais negativamente e migra mais para o ânodo,
sendo anódico. Já o homopolímero A4 é carregado menos negativamente,
constituindo-se na isozima catódica. Os heteropolímeros, conseqüentemente,
apresentam mobilidade intermediária a estes (PICKLES, JEFFEERY, ROSSMANN,
1964). Todavia, em um terço dos teleósteos estudados, a LDH apresenta-se com
mobilidade reversa, ou seja, a isoforma A4 é o componente mais anódico e a
isoforma B4 é o menos anódico (PANEPUCCI, SCHWANTES, SCHWANTES, 1984).
Segundo Holbrook et al. (1975), na maioria dos vertebrados a isozima A4,
predominante em músculo esquelético seria reconhecida primariamente como
piruvato redutase, atuando na manutenção do balanço redox durante a anaerobiose,
enquanto que a isozima B4, predominante em tecidos aeróbios, seria considerada
como lactato oxidase, pois direciona o substrato para o metabolismo oxidativo e é
rapidamente inibida por altas concentrações de piruvato.
Estudos têm sido realizados procurando avaliar adaptações genéticas a nível
molecular comparando a atividade iso/alozímica em relação a fatores ambientais tais
como
temperatura,
salinidade,
pressão,
além
de
impactos
ambientais
(PANEPPUCCI et al., 2000).
Um caso bem documentado de alozimas que exibem um desempenho
diferencial em relação a variações ambientais está no loco para lactato
desidrogenase LDH-B* em Fundulus heteroclitus (POWERS et al., 1991). Esta
espécie é encontrada em diferentes regiões que apresentam uma variação média na
temperatura superior a 15°C. Assim, nas diferentes populações ocorre a presença
de dois alelos codominantes para o loco LDH-B* os quais apresentam diferentes
respostas cinéticas quando submetidos a diferentes temperaturas. Segundo
Dimichele e Powers (1982), a presença desta espécie em uma ampla extensão
geográfica seria não somente decorrente da presença de variações genotípicas,
conferindo adaptação a níve l molecular, assim como das relações que este
organismo apresenta com o ambiente em que se encontra.
Figura 4: Estrutura tetramérica da Lactato desidrogenase (LDH, EC 1.1.1.27 lactato: NADoxidoredutase) Fonte: http://www.ionchannels.org
3.5 Brycon opalinus - Pirapitinga do Sul: espécie endêmica do Rio
Paraíba do Sul
Dentre os peixes de água doce, a família Characidae, ordem Characiformes,
é considerada a mais especiosa e complexa do ponto de vista taxonômico quando
comparada a outras famílias (BUCKUP, 1998). Esta família é a maior representante
de água doce do Brasil, com cerca de 20 subfamílias com aproximadamente 400
espécies, sendo a grande maioria dos peixes com escamas, nadadeira adiposa,
variando de peso, tamanho e forma. Inclui peixes de hábitos alimentares muito
diversificados (herbívoros, onívoros e carnívoros) que exploram uma grande
quantidade de habitats.
O gênero Brycon pertence à família Characidae, é um dos principais gêneros
entre os peixes de água doce Neotropical. Este gênero compreende pelo menos 60
espécies, sendo um dos gêneros com mais espécies entre os Characiformes,
distribuidas do México à bacia do Rio Prata (HOWES, 1982). As espécies de Brycon
são tipicamente prateadas, de médio a grande porte e usualmente importantes para
os pescadores comerciais e de subsistência. É espécie considerada onívora com
tendência à herbívora.
Classificação: Super classe: Pisces
Classe: Actinopterygii
Ordem: Characiformes
Família : Characidae
Subfamília: Bryconinae
Gênero: Brycon
Espécie: B. opalinus
Figura 5: Brycon opalinus (Cuvier, 1819)
Brycon opalinus, também conhecido popularmente como Pirapitinga do Sul é
espécie endêmica dos rios de cabeceiras da bacia do Paraíba do Sul, localizada no
extremo norte da zona da Floresta Ombrófila Densa do Estado de São Paulo. É uma
espécie de rios e riachos de encosta (HILSDORF ; PETRERE JR., 2002; LIMA 2003),
se encontra na categoria vulnerável (IUCN-The World Conservation Union) e foi
declarada como ameaçada de extinção segundo o Diário Oficial da União de 21 de
maio de 2004.
Tal fato torna imprescindíveis informações sobre estas populações para a sua
conservação e uso sustentável. No momento conhecimento sobre a genética
molecular e estrutura genética deste grupo tem sido limitada a algumas publicações
(WASKO; GALETTI, 2000; WASKO et al., 2001; HILSDORF et al., 2002), apesar da
sua importância ecológica e econômica.
Figura 6: Pirapitinga do Sul - Fonte: arquivo da autora
O gênero Brycon tem sido muito utilizado tanto nas criações experimentais
como comerciais, necessitando de pesquisas mais detalhados sobre a sua biologia.
Existem poucas informações disponíveis na literatura sobre esta espécie na região
do Vale do Paraíba, trabalhos relacionados a esta espécie vêem sendo
desenvolvidos na Estação de Hidrobiologia e Aqüicultura da CESP de Paraibuna
(DINÓLA, 2001).
Atualmente são de grande importância os estudos sobre peixes neotropicais,
uma vez que a procura por estas espécies vem crescendo de forma acelerada
(HACKBARTH, 2004).
4 Materials e Métodos
4.1 Obtenção dos animais
Os animais foram obtidos dos tanques de piscicultura da Companhia
Energética de São Paulo – CESP da Usina Hidrelétrica de Paraibuna, tendo sido
transportados para o Laboratório de Ciências Ambientais da Universidade do Vale
do Paraíba, onde foram alimentados com ração extrusada flutuante de 38% de
proteína bruta.
4.2 Desenho do experimento
Cinqüenta e um peixes em fase juvenil com peso médio de 60 gramas e
comprimento médio de 18 cm, aproximadamente 10 meses de idade, foram
igualmente divididos em quatro aquários com capacidade para 200L todos providos
de aeração fornecida por um compressor de ar e fluxo de água constante, onde
foram aclimatados pelo período de uma semana antes do início do experimento.
Durante este período, a água dos tanques foi monitorada em relação à concentração
de oxigênio dissolvido, pH, temperatura e condutividade elétrica. A alimentação foi
interrompida 24 horas antes do experimento, o qual foi conduzido em duas etapas:
hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas, de acordo com a tabela 3.
Tabela 3: Distribuição dos peixes nas diferentes condições experimentais e suas
respectivas réplicas.
Condições experimentais
Primeira etapa
Segunda etapa
T01 – Normóxia (n=09)
T01 – Normóxia (n=08)
T02 – Hipóxia 3 horas (n=09)
T02 – Hipóxia 6 horas (n=08)
T03 – Hipóxia 3 horas, réplica (n=09)
T03 – Hipóxia 6 horas, réplica (n=08)
Para que fosse estabelecida hipóxia nos tanques 2 e 3, os aeradores foram
desligados, e a fim de evitar os peixes pudessem fazer uso do oxigênio presente na
lamina superficial da água, redes de contenção foram fixadas nesta região. A
concentração
de
oxigênio
dissolvido
foi
monitorada
através
da
Sonda
multiparamétrica Radiometer Analytical – Pionner até que alcançasse a condição de
hipóxia ou valor de OD inferior a 2mg/dl para o inicio do experimento, finalizando-se
após 3 horas e 6 horas.
(A)
(B)
(C)
Figura 7: Redes de contenção (A e C) instaladas nos tanques para experimento de hipóxia realizado
para B. opalinus, impedindo acesso dos peixes ao oxigênio superficial. (B) Monitoramento do OD e
temperatura.
A coleta de sangue foi realizada via punção caudal utilizando-se seri ngas
descartáveis com 10% de EDTA, tendo sido amostrado um animal por vez. Para tal
procedimento, os peixes foram anestesiados em água contendo 100 mgL-1 de
benzocaína.
As
amostras
de
sangue
coletadas
em
tubo
pediátrico,
aproximadamente 700 µl, foram acondicionadas em gelo até o momento da análise
em laboratório.
Após a coleta do sangue, procedeu-se a biometria dos peixes e posterior
sacrifício visando retirar os tecidos para as análises genéticas.
Para a realização da segunda etapa (réplicas), adotou-se os mesmos
procedimentos anteriormente descritos: oito peixes distribuidos em três tanques,
sendo um para normóxia ou controle e outros dois para hipóxia 3 e 6 horas.
4.3 Parâmetros hematológicos
As amostras de sangue foram levadas imediatamente ao Laboratório de
Análises Clínicas Quaglia, as quais foram processadas para a análise da série
vermelha em contador de células eletrônico Coulter-STKS, obtendo o número de
eritrócitos (Ert), hemoglobina (Hb), hematócrito (Ht) e índices hematológicos (VCM,
HCM e CHCM).
4.4 Glicose plasmática
A taxa de glicose foi determinada pelo método da glicose oxidase através de
um dosador de glicose ONETOUCH ULTRA®. Tal procedimento consistiu na leitura
por meio de uma gota do sangue total em fita específica inserida no aparelho e
então processada a leitura da glicose. Os valores de glicose sanguínea foram
expressos em mg/dL.
4.5 Análise estatística
Os resultados obtidos foram expressos em média ± desvio padrão. As médias
obtidas nos diferentes tempos de amostragem foram comparadas com o momento
controle por uma análise de variância ANOVA Kruskal-Wallis.
4.6 Análise genético-bioquímica
Com a finalidade de verificar o número de locos gênicos que codificam a
Malato Desidrogenase (mMDH / sMDH) e Lactato Desidrogenase (LDH), foram
utilizados músculo esquelético, coração e fígado.
4.6.1 Preparo dos tecidos
Frações dos tecidos foram retiradas dos animais recém sacrificados (após
amostragem de sangue) e estocadas a – 20 °C até o momento de uso.
Para o preparo dos extratos uma porção de cada tecido foi homogeneizada
em tampão Fosfato de Potássio 0,05 M, pH 7.0, numa proporção de 2:1.
Posteriormente foram centrifugados a 12.000 RPM por 20 minutos, em centrifuga
refrigerada a 4°C no Laboratório de Cultura de Células - IP&D / UNIVAP.
4.6.2 Eletroforese no gel de amido
Para a determinação dos padrões enzimáticos foram utilizadas as técnicas
eletroforéticas em de gel de amido, sistema horizontal, segundo Smithies (1955).
Para o preparo do gel utilizou-se o amido de milho, sendo utilizada a concentração
de 14% .
O sistema de tampão utilizado para o preparo do gel foi o Tris-citrato, pH 6.9
(0.75 M Tris e 0.25 M de ácido cítrico), diluído 60 vezes para o gel (0.017 M) e, 20
vezes para os eletrodos (0.05 M), segundo Whitt (1970).
A aplicação das amostras foi realizada inserindo-se pequenos retângulos de
papel Whatman 3MM no gel em cortes transversais feitos previamente a uma
distância de 5cm da extremidade catódica. As migrações eletroforéticas foram
realizadas a 4 °C, num intervalo de 14 a 17 horas e 5 V/cm, no Laboratório de
Saneamento Ambiental – FEAU / UNIVAP.
Após a eletroforese em gel de amido, este foi seccionado transversalmente
em duas camadas, sendo uma delas submetida à solução de coloração específica
para MDH e a outra à coloração específica para a LDH.
4.6.3 Detecção enzimática
Para a determinação dos padrões eletroforéticos obtidos os géis foram
submetidos à soluções de coloração específica para:
a) Malato Desidrogenase (MDH)
Para a MDH foi empregada a solução de coloração segundo Shaw e Prasad
(1970) modificado por Schwantes e Schwantes (1982). Esta utiliza sal de tretazólio
(MTT) que, quando reduzido forma um composto colorido (a formazana) que é
intensamente corada e não se difunde rapidamente de seus sítios de formação.
Como a coenzima NAD não reage diretamente com o sal de tetrazólio, torna-se
necessária a presença de agente transportador de hidrogênio como intermediário.
Nesse caso foi utilizado a fenazina metassulfato (PMS).
Tabela 4: Solução de coloração especifica para MDH
Drogas
Concentração
NAD
4.3 x 10-4 M
MTT
8.5 x 10-4 M
PMS
1.6 x 10-4 M
Tris
0.05 M
Agar
1.5%
Ac. Málico
0.2 M
A solução do ágar faz com que a solução de coloração fique geleificada sobre
o gel de amido, reduzindo consideravelmente a quantidade de drogas em cada
coloração. A metade do gel contendo a solução de coloração foi incubada a 37°C no
escuro por, aproximadamente, 20 minutos. Para interromper o processo de
coloração foi utilizada uma solução de ácido acético 7,5%.
b) Lactato Desidrogenase (LDH)
A coloração enzimática para a LDH baseia-se também na redução dos sais
de tetrazólio e PMS (fenazina metassulfato) como transportador intermediário de
elétrons.
Na detecção da atividade da LDH foi utilizada solução de coloração, segundo
Allendorf el al.(1977):
Tabela 5: Solução de coloração especifica para LDH
Drogas
Concentração
NAD
4.3 x 10-4 M
MTT
8.5 x 10-4 M
PMS
1.6 x 10-4 M
Ágar
1.5%
Lactato de Lítio
64 mM
Tris
0.1 M
Assim como na coloração para MDH, a utilização do agar se faz necessária
visando reduzir a quantidade de drogas na solução. Ácido acético 7,5% foi
empregado para cessar o processo de coloração, após permanência no escuro
(37ºC) por aproximadamente 20 minutos.
4.7 Calculo de Freqüência Gênica
As freqüências gênicas foram calculadas com base na análise dos padrões
detectados em eletroforese, admitindo-se herança mendeliana simples do tipo
codominante.
4.8 Testes de Termoestabilidade
A fim de se verificar a termoestabilidade dos produtos dos diferentes locos da
MDH, foi empregada a técnica de incubação de extratos de músculos esqueléticos e
fígado em banho na temperatura de 50 ºC. Foram analisados diferentes
tempos:1’,3’,5’,7’, 8’, 9’, 10’.
Em seguida a incubação, os extratos foram imediatamente aplicados em gel
de amido juntamente com os controles de cada tecido e submetidos à eletroforese.
Após o termino da eletroforese foi efetuada a coloração para MDH, segundo
método descrito acima, para visualização das subunidades da isozima.
4.9 Fracionamento celular
O fracionamento celular consiste em uma série de procedimentos que levam
à separação das organelas de células de tecidos específicos, para estudos
peculiares a uma enzima ou estrutura celular.
Inicialmente faz-se a homogeneização do tecido em solução isotônica de
sacarose, a qual permite rompimento da membrana plasmática, mas impede o dano
de organelas.
A fim de verificar a atividade da sMDH e mMDH, se utilizou o método descrito
segundo Meizel e Markert (1967), por centrifugação diferencial.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Parâmetros Ambientais
Condições inadequadas de qualidade da água prejudicam o crescimento, a
reprodução e a sobrevivência de peixes. Diversas variáveis e processos físicos,
químicos e biológicos interagem entre si determinando a qualidade da água.
A fim de monitorar os parâmetros físico-químicos da água e níveis de oxigênio
durante o experimento, foram avaliados pH, OD, temperatura e condutividade
elétrica, nos diferentes tanques (Tabela 06). Pode-se observar que as condições
experimentais foram mantidas praticamente constantes, apresentando grandes
variações apenas para a concentração de oxigênio garantindo o ambiente hipóxico.
Tabela 6: Índices monitorados na água dos tanques durante experimento
realizado com B. opalinus condicionado à hipóxia.
Oxigênio
Parâmetros
dissolvido
Temperatura
Condutividade
elétrica
PH
°C
mg/dl
µs/cm
Normóxia
7,0 ± 1,0
7,5 ± 0,5
23,0 ± 1,0
43,0 ± 3,0
Hipóxia 3h
2,0 ± 0,3
7,3 ± 0,5
23,0 ± 1,0
40,5 ± 3,0
Hipóxia 6h
1,8 ± 0,3
7,5 ± 0,5
23,0 ± 1,0
44,0 ± 2,0
A temperatura da água é um dos fatores mais importantes nos fenômenos
químicos e biológicos dos organismos aquáticos. Todas as atividades fisiológicas
dos peixes estão intimamente ligadas à temperatura da água (JIAN , CHENG,
CHEN, 2003; KUBITZA, 2003).
Os peixes ajustam sua temperatura corporal de acordo com a temperatura da
água. Cada espécie tem uma temperatura ideal na qual melhor se adapta e se
desenvolve, sendo esta temperatura
chamada
de
temperatura
ótima.
As
temperaturas acima ou abaixo do ótimo influenciam de forma a reduzir seu
crescimento (BUTTNER, SODERBERG, TERLIZZI, 1993).
O metabolismo dos peixes é maior à medida que aumenta a temperatura. Os
peixes de águas tropicais geralmente vivem bem com temperaturas entre 20 – 28ºC.
No presente trabalho, em todas as condições verificadas, a temperatura manteve-se
constante (23,0 ± 1,0 °C). Assim, o efeito desta variável sobre os organismos
estudados não deve ter promovido mudanças metabólicas nas diferentes condições
experimentais, garantindo o conforto térmico da espécie em estudo.
O pH é considerado um parâmetro importante, já que possui efeito direto
sobre o metabolismo e os processos fisiológicos. A faixa de tolerância de pH para
os peixes está compreendida entre 4.0 e 9.0, enquanto o índice ideal é entre 6.5 e
8.0 (WURTS ; DURBOROW, 1992).
Valores extremos de pH prejudicam o crescimento e a reprodução dos
peixes, e ainda podem causar mortalidade principalmente nas fases iniciais de
desenvolvimento (KUBITZA, 2003). O pH também afeta a toxicidade de vários
poluentes comuns, como a amônia e metais pesados. Alteração no pH na água pode
afetar o funcionamento branquial, prejudicando o equilíbrio osmótico, o que
determina grandes dificuldades respiratórias. Também para este parâmetro os
valores observados foram constantes (7,5 ± 0,5 / 7,3 ± 0,5), e dentro dos limites
fisiológicos ideais.
A condutividade elétrica expressa a quantidade de sais existentes na água, é
uma expressão numérica da capacidade de uma água conduzir a corrente elétrica.
Este parâmetro também fornece uma boa indicação das modificações na
composição de uma água, especialmente na sua concentração mineral, mas não
fornece nenhuma indicação das quantidades relativas dos vários componentes. Em
geral, níveis superiores a 100 µS/cm indicam ambientes impactados (CONAMA 357,
2005).
No presente trabalho os valores para condutividade elétrica variaram de 40,5
± 3,0 µS/cm (normóxia) a 44,0 ± 2,0 µS/cm (hipóxia 6 horas), portanto de acordo
com a resolução Conama 357/05.
5.2 Respostas fisiológicas e bioquímicas frente à hipóxia
Condições ambientais desfavoráveis à sobrevivência dos peixes, como baixa
concentração de oxigênio dissolvido, induzem ajustes comportamentais, fisiológicos
e bioquímicos que lhes permitem sobreviver.
Segundo Val e Almeida-Val (1995), as alterações ambientais possuem
importância fundamental no surgimento de características adaptativas, assim como
na estratégia de sobrevivência e evolução dos peixes. A adaptação a novos
ambientes envolve mecanismos estratégicos, incluindo características morfofisiológicas, reprodutivas e comportamentais similares, que durante o processo
evolutivo podem ter se disseminado no nível das populações e espécies, resultando
em muitos casos no que é conhecido como convergência adaptativa. Outros estudos
mais direcionados mostram que diferentes espécies podem reordenar seu
metabolismo de acordo com o estresse ao qual estão expostas, como por exemplo,
ao estresse causado por exposição à hipóxia prolongada (ALMEIDA-VAL et al.
1995).
Vários fatores também podem determinar a resposta hematológica à hipóxia,
as quais variam com a espécie (TAVARES-DIAS e MORAES, 2004). Contudo, devese destacar que a instabilidade do ambiente interno dos peixes, aliada a outros
fatores intrínsecos e extrínsecos, causa enorme variabilidade dos parâmetros
hematológicos, mesmo entre indivíduos da mesma família (RANZANI-PAIVA; SILVASOUZA, 2004). Fatores como o estado nutricional, sazonalidade, maturação
gonadal, sexo e variação genética também podem influenciar as variáveis
hematológicas (KORI-SIAKPERE, 1985).
Assim, exames hematológicos são necessários à caracterização fisiológica
de uma espécie e em trabalhos de manejo de criações, podendo ser relacionados à
presença de alterações ambientais (RANZANI-PAIVA ; SILVA-SOUZA, 2004).
5.2.1 Variáveis Hematológicas
Dentre os peixes de respiração aquática encontramos aqueles que
aparentemente não apresentam adaptação à hipóxia, espécies que utilizam a
respiração superficial e outras que suportam longas temporadas de redução na
concentração de oxigênio em seu ambiente (ALMEIDA-VAL; VAL,1995), tais fatos
demonstram que a resposta hematológica à hipóxia varia com a espécie (TAVARES
DIAS; MORAES, 2004). A Tabela 07 apresenta as médias e desvio padrão
verificado para os parâmetros hematológicos e índices hematimétricos, nas
diferentes condições experimentais. Os resultados da análise de variância
verificados para a comparação entre as médias obtidas nos diferentes tempos de
amostragem com o controle são apresentados na Tabela 08.
Tabela 7: Média e desvio padrão dos parâmetros hematológicos investigados na
espécie B. opalinus condicionado à normóxia e hipóxia.
Ert
Hb
Htc
VCM
HCM
CHCM
(106/mm³ )
(g/dl)
(%)
(µm³)
(pg)
(%)
Normóxia
1.9 ± 0.2
12.8 ± 0.9
37.7 ± 4.4
190.3 ± 8.2
66.5 ± 7.3
34.4± 4.3
Hipóxia 3h
2.1 ± 0.5
13.4 ± 1.2
42.3 ± 5.7
200.6 ± 4.0
61.5 ± 4.4
30.5± 3.8
Hipóxia 6h
2.4 ± 0.2
15.1 ± 0.8
44.6 ± 7.7
190.1 ± 6.6
63.6 ± 4.6
34.3± 4.8
Parâmetros*
(*) Eritrócitos (Ert), hemoglobina (Hb), hematócrito (Htc), volume corpuscular médio (VCM),
hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM).
Tabela 8: Análise de variância (ANOVA Kruskal-Wallis) dos dados hematológicos
analisados em B. opalinus.
Parâmetros
Ert
Hb
Htc
VCM
HCM
CHCM
ns
ns
ns
ns
ns
ns
p < 0,01
p < 0,01
p < 0,05
ns
ns
ns
ns
p < 0,01
ns
ns
ns
ns
Normóxia
vs
Hipóxia 3h
Normóxia
vs
Hipóxia 6h
Hipóxia 3h
vs
Hipóxia 6h
ns: não significativo.
Segundo Fernandes et al. (1999), a liberação de eritrócitos do reservatório
esplênico, ajustes nas concentrações iônicas e de fosfatos orgânicos em eritrócitos
podem ocorrer em resposta à baixa concentração de oxigênio. Todavia, estudos
realizados com Pacu submetidos à hipóxia por 2, 4 e 6 horas (PANEPUCCI et al.,
2001), assim como com Tambaqui (PORTO, 2005) não apresentaram alterações
quanto ao número de células vermelhas.
No
presente
trabalho,
verificou-se
que,
para
todas
as
condições
experimentais, os valores obtidos quanto ao número de eritrócitos apresentaram-se
muito próximos, sendo o grupo controle ou normóxia, semelhantes aos estudos de
Ranzani-Paiva (1991) para a mesma espécie, assim como para outros teleósteos
(TAVARES-DIAS et al. 2002; PORTO, 2005; SANTOS, 2006). Todavia, quando são
consideradas as análises estatísticas para eritrócitos, observa-se entre o grupo
controle (1.9 ± 0.2 106/mm3) e hipóxia 6 horas (2.4 ± 0.2 106/mm3), diferença
significativa (p<0,01) (tabela 08).
A Figura 08 apresenta a variação no número de eritrócitos nas diferentes
condições estudadas.
Eritrócitos
Ert (106/mm 3)
3.0
2.0
1.0
0.0
normóxia
hipoxia 3h
hipóxia 6h
condições experientais
Figura 8: Gráfico dos valores obtidos para eritrócitos de B. opalinus para normóxia, hipóxia 3 horas e
hipóxia 6 horas. Barra de erros - 95% de intervalo de confiança para cada determinação.
Em todos os vertebrados, o transporte de oxigênio é efetivado pelas
moléculas de hemoglobinas presentes nos eritrócitos sendo que, a quantidade de
oxigênio transportada depende da tensão de oxigênio, do número de eritrócitos, da
quantidade de hemoglobina nos eritrócitos e da afinidade desta proteína ao oxigênio
(NIKINMAA, 1997).
A Figura 09 apresenta a variação da concentração de hemoglobina nas três
condições avaliadas, podendo ser observado menor valor para normóxia (12.8 ± 0.9
g/dL) e maior valor para hipóxia 6 horas (15.1 ± 0.8 g/dL), estando de acordo com
outros estudos em condições de hipóxia realizados com peixes teleósteos
(AFFONSO et al., 2002; MORAES et al.; 2002; WELLS et al., 2005). Comparando os
valores de normóxia vs hipóxia 6horas e hipóxia 3 horas vs hipóxia 6 horas tem-se
que estes são estatisticamente diferentes (p<0,01) (Tabela 08).
Os peixes possuem sistema múltiplo de hemoglobina (RIGGS, 1979),
demonstrado um caráter adaptativo desses vertebrados. A regulação da síntese
protéica ajusta cada componente hemoglobínico de acordo com os níveis de
oxigênio ou outras alterações como resposta a pressão do meio ambiente (VAL;
VAL-ALMEIDA, 1995), entretanto no presente estudo não foi ana lisada a
composição da estrutura dessa proteína, onde talvez poderia estar ocorrendo
mudanças frente as condições experimentais aqui conduzidas.
Hemoglobina
Hb (g/dL)
16.0
12.0
8.0
4.0
normóxia
hipoxia 3h
hipóxia 6h
condições experimentais
Figura 9: Gráfico dos valores obtidos para hemoglobina de B. opalinus para normóxia, hipóxia 3
horas e hipóxia 6 horas. Barra de erros - 95% de intervalo de confiança para cada determinação
Análises hematológicas, considerando-se a série vermelha, podem permitir o
estabelecimento de relações entre estas e a concentração de oxigênio disponível no
ambiente. Evolutivamente, peixes mais primitivos em ambientes lênticos, sedentários
e bentônicos apresentam menores valores de hematócrito, sendo os maiores valores
observados em espécies pelágicas (LARSSON et al, 1976).
Morone saxatilis
mantidos em reservatório mostram redução na concentração de hemoglobina,
hematócrito e do número de eritrócitos em decorrência da baixa concentração de
oxigênio dissolvido (LOCHMILLER , WEICHMAN, ZALE, 1989). Segundo Chapmam
et al, (2002) o aumento na concentração de hemoglobina e hematócrito foram
demonstrados em peixes vivendo em condições de hipóxia na região pantanosa do
lago Vitória na África Ocidental. Tais fatos demonstram que as espécies podem
responder de modo distinto a baixas concentrações de O2.
A variação quanto à porcentagem de hematócrito avaliada para as 3
condições experimentais é apresentada na Figura 10, sendo observada a média de
37,7 % para normóxia, 42,3 % para hipóxia 3 horas e 44,6 % para hipóxia 6 horas.
Diferença estatística significativa foi observada em relação ao grupo controle e
hipóxia 6 horas (p<0,05).
Hematócrito
50
Ht %
40
30
20
10
0
normóxia
hipoxia 3h
hipóxia 6h
condições experimentais
Figura 10: Gráfico dos valores obtidos para hematócrito de B. opalinus para normóxia, hipóxia 3
horas e hipóxia 6 horas. Barra de erros - 95% de intervalo de confiança para cada determinação
Segundo Val et al. (1990), geralmente a resposta à hipóxia pode apresentar
correlação negativa de parâmetros como hemoglobina e hematócrito versus a
concentração de oxigênio dissolvido na água, indicando um direcionamento a
adaptação frente à nova situação ambiental. A Figura 11 apresenta valores médios
para volume corpuscular médio (VCM), sendo maior em hipóxia 3 horas (200.6 ± 4.0
µm3) e praticamente invariável em normóxia (190.3 ± 8.2 µm3) e hipóxia de 6 horas
(190.1 ± 6.6 µm 3).
Volume Corpuscular Médio
220
VCM (µm³)
210
200
190
180
170
160
normóxia
hipoxia 3h
hipóxia 6h
condições experimentais
Figura 11: Gráfico dos valores para volume corpuscular médio (VCM) de eritrócitos de B. opalinus
para normóxia, hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas. Barra de erros - 95% de intervalo de confiança para
cada determinação
Para hemoglobina corpuscular média (HCM) (Figura 12) e concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM) (Figura 13) observou-se os menores
valores na condição de hipóxia 3 horas (61.5 ± 4.4 pg e 30.5 ± 3.8 %,
respectivamente) em relação à normóxia (66.5 ± 7.3 pg e 34.4 ± 4.3 %
respectivamente) e hipóxia 6 horas (63.6 ± 4.6 pg e 34.3 ± 4.8 %, respectivamente).
Hemoglobina Corpuscular Média
75
HCM (pg)
70
65
60
55
50
normóxia
hipoxia 3h
hipóxia 6h
condições experimentais
Figura 12: Gráfico dos valores de hemoglobina corpuscular média (HCM) de B. opalinus para
normóxia, hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas. Barra de erros - 95% de intervalo de confiança para cada
determinação.
Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
CHCM (%)
38.0
36.0
34.0
32.0
30.0
28.0
normóxia
hipóxia 3h
hipóxia 6h
condições experimentais
Figura 13: Gráfico dos valores de concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) de B.
opalinus para normóxia, hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas Barra de erros - 95% de intervalo de
confiança para cada determinação.
As análises estatísticas realizadas não revelaram diferença significativa para
os índices hematimétricos VCM, HCM e CHCM, no entanto se observou aumento
para VCM em condição de hipóxia 3 horas comparado à normóxia sugerindo ajustes
osmoregulatórios como resposta à baixa disponibilidade de oxigênio dissolvido
(BARTON, 2002; TAVARES-DIAS e MORAES, 2004; TERVONEN et al.,2006).
Considerando a hipóxia uma situação de estresse, o aumento no volume
eritrocitário pode ser decorrente da hidratação celular, uma vez que a adrenalina,
uma das catecolaminas produzidas durante este processo causa inchaço nas
células vermelhas (NIKINMAA, 1982). Essa catecolamina parece produzir retenção
de sódio e cloreto no meio intracelular aumentando a sua concentração, que induz
entrada de água na célula e aumento no volume eritrocitário (RAILO et al., 1985).
Tal fato pode ter acarretado diminuição dos índices de HCM e CHCM, o que pode
ser observado nas Figuras 12 e 13, onde se verifica correlação negativa entre esses
índices nos experimentos de hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas e ausência de
correlação em situação de normóxia (Fig. 14, 15 e 16).
O incremento do volume celular também pode estar relacionado com uma
maior deformabilidade das membranas dos glóbulos vermelhos que determinaria a
diminuição na viscosidade sangüínea (NIKINMAA, 1990). De fato se há
demonstrado uma possível ação das catecolaminas sobre os receptores de
membrana de glóbulos vermelhos, aumentando a deformabilidade destes, facilitando
assim o fluxo sangüíneo em períodos de estresse, devido à baixa na viscosidade
(PARKHURST, WELLS, CARRAGHER, 1992).
normóxia
45.0
40.0
A
35.0
CHCM
30.0
25.0
y = 0.0879x + 19.047
R2 = 0.0332
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
175.0
180.0
185.0
190.0
195.0
200.0
VCM
Figura 14: Correlação dos índices VCM e CHCM de B. opalinus em normóxia.
45.0
hipóxia 3 horas
B
40.0
35.0
CHCM
30.0
25.0
20.0
y = -0.2151x + 73.694
R2 = 0.6209
15.0
10.0
5.0
0.0
175.0
185.0
195.0
205.0
215.0
225.0
235.0
VCM
Figura 15: Correlação dos índices VCM e CHCM de B. opalinus em hipóxia 3 horas.
hipóxia 6 horas
45.0
40.0
35.0
CHCM
30.0
25.0
y = -0.2458x + 81.024
R2 = 0.7279
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
160.0
170.0
180.0
190.0
200.0
210.0
220.0
230.0
VCM
Figura 16: Correlação dos índices VCM e CHCM de B. opalinus em hipóxia 6 horas
5.2.2 Glicose Plasmática
Os peixes são completamente dependentes do metabolismo aeróbico, exceto
em breves períodos de anaerobiose como durante natação em alta velocidade e
oscilações na concentração de oxigênio dissolvido (VAL,1995).
Segundo Hochachka (1980), a limitação de oxigênio ao nível celular pode
comprometer as funções fisiológicas dos organismos. Alem dos ajustes fisiológicos,
comportamentais e morfológicos garantirem a sobrevivência em hipóxia, uma
combinação de redução da taxa metabólica com ativação do metabolismo
anaeróbico pode ocorrer em muitos vertebrados (HOCHCHKA ; SOMERO, 2002).
Normalmente, o aumento da glicose está relacionado com a liberação de
cortisol e outros hormônios, principalmente catecolaminas (MOMMSEN, VIJAYAN,
MONN 1999). Segundo MacCormack e al (2006) os aumentos de glicose e lactato
plasmáticos verificados em Pterygoplichthys pardalis submetidos à hipóxia sugerem
uma estratégia metabólica anaeróbica.
A tabela 09 apresenta os resultados obtidos para glicose plasmática em
normóxia, hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas assim como as análises estatísticas
realizadas. O tratamento estatístico revelou que os níveis de glicose plasmática não
foram significativamente diferentes nos grupos experimentais em relação ao grupo
controle.
Tabela 9: Médias e desvio padrão para a dosagem de glicose plasmática de B.
opalinus em nomóxia, hipóxia 3h e hipóxia 6h
Glicose (mg/dL)
Condições
Experimentais
Média
Desvio
Análise
Padrão
estatística
Normóxia
66,2
± 22,1
ns
Hipóxia 3 horas
68,8
± 35,5
ns
Hipóxia 6 horas
76,3
± 27.4
ns
Também em estudos realizados por Porto (2005) e Gomes et al (2006) com
Tambaqui (Colossoma macropomum ) e por Panepucci et al. (2001) para Pacu
(Piaractus mesopotamicus), não apresentaram mudanças nas concentrações de
glicose plasmáticas nos animais expostos a baixas concentrações de oxigênio. No
entanto, segundo Panepucci et al. (2001), alterações no metabolismo da glicose
podem ocorrer em outros tecidos, como por exemplo, músculo e coração, como
observado para pacu.
Apesar das diferenças aqui observadas serem consideradas não significativas
pelas analises estatísticas, pode-se verificar que em hipóxia 6 horas e 3 horas os
valores foram 15% e 4%, respectivamente, superiores ao de normóxia.
A baixa oferta de OD no ambiente pode causar nos peixes, aumento de níveis
plasmáticos
de
corticosteróide,
osmolaridade
plasmática
e
pH
sangüíneo
(TAVARES-DIAS ; MORAES, 2004).
As respostas ao estresse (Fig. 17) em peixes podem ser divididas em
primária, secundária e terciária (CARMICHAEL et al.,1984; MAZEUAUD et al.,1977;
IWAMA, VIJAYAN, MORGAN 1999; BARTON, 2002). A resposta neuroendrócrina,
ou primária, é caracterizada por um aumento dos hormônios corticosteróides
(cortisol) e da concentração de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina). Na
resposta secundária há aumento dos níveis de glicose no sangue, devido à hidrólise
das reservas de glicogênio no fígado e aumento do batimento cardíaco.
Figura 17: Resposta fisiológica ao estresse segundo Barton, 2002
Para atender a demanda de energia do organismo, as catecolaminas atuam
diretamente no fígado, transformando o glicogênio em glicose (glicogenólise),
causando hiperglicemia.
A hiperglicemia significa um custo energético para o organismo, o qual
responde aumentando a resistência tecidual periférica à insulina, reduzindo a
utilização total de glicose, processo mediado por hormônios contrarregulatórios
como as catecolaminas, cortisol e glucagon (MOMMSEN, VIJAYAN, MONN, 1999)
A resposta terciária é marcada pela diminuição da resistência dos peixes às
doenças, pois ocorre uma diminuição no número de leucócitos, ocorrendo
linfocitopenia (diminuição do número de linfócitos) e neutrofilia (aumento do número
de neutrófilos circulantes) segundo Mazeuaud et al. (1977).
5.2.3 Variação genético-bioquímica - Isozimas
As atividades metabólicas fundamentais dos organismos são muito similares
e consequentemente, diferentes organismos e diferentes tecidos apresentam
reações catalíticas idênticas (DEVLIN ; MICHELACCI 2003). Entretanto, quando as
enzimas são analisadas do ponto de vista químico e sorológico, se utilizando de uma
variedade de testes enzimáticos, apresentam-se diferentes entre organismos. Em
vista do controle genético na síntese de proteínas, não é de se surpreender que
existam diferenças na estrutura de enzimas homólogas sintetizadas por animais de
uma mesma espécie, os quais são genotipicamente distintos (LEHNINGER,
NELSON, COX, 2006). Nos vertebrados inferiores, especialmente em peixes, estas
diferenças ou heterogeneidade parecem ser maiores, principalmente no que diz
respeito às hemoglobinas, desidrogenases, isomerases e a muitas outras proteínas.
5.2.3.1 Malato desidrogenase: Padrão eletroforético e especificidade
tissular
Os padrões eletroforéticos da MDH de Brycon opalinus foram interpretados de
acordo com a mobilidade relativa e a especificidade tissular dos seus componentes.
Dados obtidos no presente trabalho sugerem que cada uma das bandas de MDH é
um dímero formado pela combinação de duas classes de subunidades A e B, e a
distribuição das isoformas nos tecidos estudados (fígado, coração e músculo
esquelético), mostrou especificidade considerável de cada subunidade em relação
aos tecidos analisados.
No presente trabalho, os 51 exemplares de Pirapitinga do Sul analisados,
apresentaram para a malato desidrogenase solúvel (sMDH) dois fenótipos: em 42
exemplares observou-se um padrão eletroforético de três componentes e em 9
exemplares, um padrão de seis componentes (Figura 18), não tendo sido observada
a presença da fração mitocondrial (mMDH) no controle.
Figura 18: Expressão fenotípica em eletroforese da isozima MDH, em figado (F), coração (C) e
músculo esquelético (M) de B. opalinus. Presença de alelo variante (B * 106).
Foi realizado o cálculo da freqüência gênica (Tabela 10) a fim de avaliar se a
variação fenotípica observada poderia ser considerada polimorfismo. De acordo com
a lei de Hardy- Weinberg admitindo-se herança Mendeliana simples, do tipo codominante, o valor de χ
2
obtido (0,6025), indica que a população está em equilíbrio.
Assim, para a espécie, a sMDH seria codificada por dois locos sMDH-A* e sMDH-B*
com a presença de um alelo variante mais rápido *106 no loco B*.
Tabela 10: Cálculo de freqüência gênica para alelo variante *106 no loco B*.
p2
2 pq
q2
Total
Observado
41
10
0
51
Esperado
81,3533
17,6855
0,9612
100%
número
41,49
9,019
0,49
51
Desvios
-0,49
0,981
-0,49
χ2 = 0,6025
O número de genes que codifica a MDH pode variar entre os vertebrados. Em
répteis, aves e mamíferos as sMDH existe tipicamente como uma banda principal
(FISHER et al., 1980), que sugere a presença de apenas um loco gênico. Em peixes
e anfíbios três bandas anódicas, eqüidistantes são comumente presentes (BAILEY
et al., 1970). Presumivelmente, essas bandas das sMDH na maioria dos casos, são
produzidas por dois locos, que codificam as duas subunidades da sMDH, no entanto
podem apresentar bandas distintas quando há variação alélica ou polimorfismo
genético. Geralmente, a primeira indicação de um polimorfismo protéico numa
espécie ocorre quando em alguns indivíduos dessa, o padrão eletroforético de
proteínas apresenta maior número de bandas que o esperado, provavelmente pela
formação de heteropolímeros entre as subunidades codificadas pelo alelo mais
freqüente e o alelo variante.
O polimorfismo genético faz referência à existência em uma população de
múltiplos alelos de um gene, sendo uma variação na seqüência de um determinado
sitio no DNA entre os indivíduos de uma população. Polimorfismos, os quais afetam
a seqüência codificante ou reguladora e produzem mudanças importantes na
estrutura da proteína, podem traduzir diferentes fenótipos.
As alterações pouco freqüentes na seqüência das bases no DNA são apenas
mutações, assim, para que verdadeiramente se considere essa modificação um
polimorfismo, a variação deve aparecer ao menos em 1% da população.
Em relação a especialização funcional de uma enzima, sua medida é a
extensão na qual ela se expressa em um determinado número de tecidos.
Geralmente as enzimas menos especializadas são expressas em um grande
número de tecidos. Assim, a exemplo do estabelecido pela literatura (WILSON et
al., 1973; CLAYTON, HARRIS, TRETIAK, 1975), a forma menos anódica da sMDH
(isoforma A), apresentou-se com maior intensidade em tecido hepático, sendo
também detectada em músculo esquelético e cardíaco, tecidos estes onde ocorreu
predomínio da isoforma B.
Em várias espécies de peixes os três componentes da sMDH são muito mais
intensos e anódicos que da mMDH (BAILEY et al., 1970). Em outras espécies como
no atum (KITO; LEWIS, 1967), a sMDH apresenta-se menos anódica que a
mitocondrial. Neste sentido, considerando que a localização celular de ambas as
formas da MDH a técnica de fracionamento celular por centrifugação diferencial,
segundo Meizel e Markert (1967) foi realizada a fim de verificar a se a não
detectaçao da fração mitocondrial seria referente à sobreposição das duas
isoformas: sMDH-A e mMDH. Alem disso, considerando a estabilidade térmica
diferencial apresentada entre mMDH e sMDH, testes de termoestabilidade em gel de
amido também foram realizados.
Os resultados observados para o fracionamento celular são apresentados na
Figura 19. Assim, em normóxia foi possível separar as duas frações da MDH (solúvel
e mitocondrial) presentes em fígado, o que significa que ambas as isoformas não
foram visualizadas anteriormente pela sobreposição destas quando aplicada
diferença de potencial elétrico. Em relação ao músculo, não foi alcançado o mesmo
resultado satisfatório, sendo detectada somente a fração solúvel (sMDH).
Para hipóxia de 6 horas, o resultado foi igualmente satisfatório para o fígado,
revelando a presença da mMDH e, em músculo não foi dectada a fração
mitocondrial. Todavia é possível se observar a presença da mMDH no controle
porém com intensidade relativa menor.
Figura 19: Fracionamento celular realizado para a MDH de fígado (F) e músculo esquelético (M) de
B. opalinus em normóxia (A) e hipóxia 6h (B). s: fração solúvel / m: fração mitocondrial. A
seta indica a presença da fração mitocondrial em músculo esquelético no controle.
Os testes de termoestabilidade realizados com “pool” de tecido muscular
esquelético e hepático demonstraram que para ambos os tecidos de Brycon
opalinus, assim como para as diferentes condições ambientais, as subunidades A e
B da sMDH não foram inativadas (Figuras 20 a 23).
- MDH B*
- MDH A*
-0
C
1’
3’
5’
C
7’
8’
9’
1 0’
Termoestabilidade – Norm óxia – M úsculo Esquelé tico
Figura 20: Teste de termoestabilidade de MDH no tecido muscular esquelético de B. opalinus , nos
tempos de 1, 3, 5, 7, 9 e 10 minutos à 50°C e controle (C). Amostra de tecido do grupo de
animais em normóxia.
- MDH - B*
- MDH - A*
-0
C
1’
3’
5’
C
7’
8’
9’
10’
Termoestabilidade – hpx 6 h – m ú sculo
Figura 21: Teste de termoestabilidade de MDH no tecido muscular esquelético de B. opalinus, nos
tempos de 1, 3, 5, 7, 9 e 10 minutos à 50°C e controle (C). Amostra de tecido do grupo de
animais em hipóxia 6 h.
- MDH A*
-0
C
1’
3’
5’
C
7’
8’
9’
10 ’
T e r m o e s t a b i l i d a d e - N o r m óxia - f íg a d o
Figura 22: Teste de termoestabilidade de MDH no tecido hepático de B. opalinus, nos tempos de 1,
3, 5, 7, 9 e 10 minutos à 50 °C e controle (C). Amostra de tecido do grupo de animais em
normóxia.
- MDH -A *
- 0
C
1’
3’
5’
C
7’
8’
9 ’ 1 0’
Termoestabilidade – h p x 6h – fígado
Figura 23: Teste de termoestabilidade de MDH no tecido hepático de B. opalinus, nos tempos de 1,
3, 5, 7, 9 e 10 minutos à 50 °C e controle (C). Amostra de tecido do grupo de animais em
hipóxia 6h.
A
atividade
enzimática
depende
de
vários
fatores
tais
como
pH,
concentrações de substrato/coenzima e temperatura. Segundo Zuber (1988) e
Somero (1995), a temperatura seria o principal fator ambiental para todos os
organismos, determinando a velocidade de seus processos biológicos, o estado
estrutural de suas proteínas, assim como, a evolução desses organismos e de seus
componentes celulares. Deste modo, durante a evolução dos organismos, o
metabolismo celular e consequentemente, a estrutura e função dos componentes
celulares se adaptaram às temperaturas ambientais e celulares (ZUBER, 1988).
Schwantes e Schwantes (1982), estudando o possível caráter adaptativo dos
locos da sMDH de Leiostomus xanthurus, peixe estuarino de região temperada, cuja
temperatura variava de 5-30 °C anualmente. Detectaram as subunidades A e B, em
diferentes níveis e tecidos , as quais podiam ser alteradas a partir de flutuações na
temperatura ambiental.
A adaptação à temperatura pelos dois locos da sMDH de teleósteos onde o
sMDH-A* codifica a isoforma estável e o sMDH-B*, a termolábil, foi demonstrada por
Schwantes e Schwantes (1982), Farias e Almeida-Val (1992), Lin e Somero (1995)
e Aquino-Silva et al. (2003, 2008). No presente trabalho, os testes de
termoestabilidade não permitiram diferenciar a fração solúvel da mitocondrial
(problema este sanado pelo fracionamento celular), porém indicaram que os
produtos dos locos A* e B* não apresentaram diferenças quando submetidos a 50 ºC
por diferentes intervalos de tempo.
5.2.3.2
Lactato desidrogenase: Padrão eletroforético e
especificidade tissular
A lactato desidrogenase dos vertebrados é uma enzima de alto significado
biológico e de especial interesse evolutivo por ocorrer como isozima codificadas por
locos gênicos múltiplos que evoluíram substancialmente em sua estrutura e
regulação, durante o desenvolvimento filogenético.
Pesquisas pioneiras sobre a estrutura da LDH e sua expressão durante o
desenvolvimento levaram ao estabelecimento do conceito de isozimas, como formas
múltiplas enzimáticas codificadas em diferentes locos, e de seu significado biológico
(MARKET ; MOLLER, 1959). Segundo Market, Shaklee, Whitt (1975), somente um
loco gênico codificava a LDH no inicio da evolução dos vertebrados. A subunidade
codificada por esse loco gênico adquiriu a habilidade de sofrer polimerização
formando homotetrâmeros com propriedades similares aos da isozima A4,
comumente encontrada em músculo esquelético da maioria dos vertebrados. Uma
vez que os vertebrados contemporâneos têm, pelo menos, dois locos gênicos que
codificam a sua LDH, o gene LDH-A* original, deve ter sofrido, muito cedo o evento
de duplicação. Mais tarde, esses dois genes similares ao A*, divergiram por
mutação, dando origem aos dois genes distintos denominados LDH-A* e LDH-B*,
também detectados no presente trabalho.
Os padrões eletroforéticos da LDH de Brycon opalinus foram interpretados de
acordo com a mobilidade relativa e a especificidade tissular dos seus componentes.
A Figura 24 apresenta o padrão eletroforético da LDH observado para os 51
exemplares de Pirapitinga do Sul estudados. Assim, nos três tecidos analisados,
pode-se observar o produto dos locos LDH-A* e LDH-B*, com a predominância da
subunidade A (isoforma A4) em músculo esquelético, das isoformas A4, A3B, A2B2 e
B4 em músculo cardíaco e da isoforma B4 em tecido hepático. Para os
tecidos/individuos analisados não foi observada a presença de alelos variantes.
Figura 24: Expressão fenotípica em eletroforese da isozima LDH, em coração, músculo e figado de
B. opalinus
A exemplo do que ocorre na maioria dos vertebrados, também em B.opalinus,
os locos que codificam LDH expressam-se diferentemente entre os tecidos.
5.3 Reorganização metabólica das isozimas frente à hipóxia
As características estruturais e funcionais de um organismo, em geral,
parecem ser especializadas em aumentar suas chances de sucesso no ambiente em
que se encontram. Assim, adaptação seria a melhor maneira de um organismo
realizar uma função tendo, normalmente, influência direta na sua sobrevivência e
reprodução. Essas adaptações ambientais podem ser demonstradas em termos de:
• Comportamento, onde os organismos parecem agir de forma a aumentar suas
chances de sobrevivência, assim como, suas habilidades em explorar seus
habitats particulares;
• Anatomia, onde as estruturas do organismo parecem estar ajustadas ao seu
modo particular de vida e;
• Fisiologia, onde as formas pelas quais as funções vitais são realizadas,
freqüentemente refletem as condições ambientais encontradas pela espécie.
Assim, quando um organismo é estudado do ponto de vista adaptativo,
deve ser considerado que todas as interações que este mantém com o ambiente,
atuam diretamente sobre o seu metabolismo celular (HOCHACHKA ; SOMERO,
1984).
5.3.1 Padrão de expressão das isozimas da MDH
O perfil eletroforético obtido para a MDH de Pirapitinga do Sul, nas três
condições experimentais (Figura 25) mostra em situação de normóxia para o
músculo esquelético, apenas a expressão das isoformas da fração solúvel (sMDH).
Para as demais condições experimentais neste mesmo tecido, tanto hipóxia 3 horas
quanto hipóxia 6 horas pode-se observar a presença do produto do loco mMDH*.
Segundo Hochachka e Lutz (2001) as propriedades da membrana
mitocôndrial e conseqüentemente sua atividade são alteradas em condições de
hipóxia, na tentativa de suprimir a demanda por ATP. Entretanto no presente estudo
a detecção da mMDH pode significar uma estratégia de adaptação ao ambiente para
otimizar o aproveitamento de oxigênio. Tal fato pode estar relacionado com
mudanças qualitativas na expressão gênica, tais como a alternância entre isoformas
para atender a demanda metabólica (SOMERO, 2004; SCHULTE, 2004; WU, 2002).
No presente trabalho, o do produto do loco-A* (sMDH) em tecido hepático, a
exemplo do determinado para outras espécies (AQUINO-SILVA, 1992, AQUINOSILVA et al., 1997, 2003, 2008), poderia conferir a esta espécie uma maior eficiência
no processo de redução do oxalacetato a malato, favorecendo o metabolismo no
sentido glicolítico. Em situação de hipóxia (3 e 6 horas), a presença da fração
mitocondrial da malato desidrogenase, envolvida no ciclo de Krebs, indicaria a
manutenção do metabolismo glicolítico em tensões de OD inferiores a 2 mg/L.
Figura 25: Expressão fenotípica de MDH em eletroforese em gel de amido, para fígado (F), coração
(C) e músculo (M) de B. opalinus, em nomóxia (A), hipóxia 3 horas (B), hipóxia 6 horas (C).
Segundo Almeida-Val et al., (2000), o papel da MDH no metabolismo
oxidativo é intermediar o ciclo de Krebs, quando reduz malato a oxalacetato. Em
estudos com Astronotus ocellatus, o alto nível de MDH observados no fígado
refletiria seu papel na gliconeogênese.
A hipóxia não necessariamente pode conduzir a ajustes da atividade da MDH
no tecido hepático, apesar de ser um tecido aeróbio. Estudos com Piaractus
mesopotamicus não foi observada variações entre normóxia e hipóxia, o que
sugerindo que provavelmente esses mecanismos adaptativos não foram ativados
(PANEPUCCI, 2001). Diferentemente, no presente trabalho se observou aumento da
intensidade da mMDH nos três tecidos, indicando aumento da atividade para
metabolismo oxidativo.
Considerando o tecido cardíaco é possível observar o predomínio da isoforma
B em normóxia e, em hipóxia 3 e 6 horas observa-se, a exemplo do músculo
esquelético, a presença da fração mitocondrial.
Aumento nos níveis de MDH representa maior disponibilidade de glicose para
tecidos como coração, aumentando sua fonte de energia (ALMEIDA-VAL et al.,
2000), já que peixes expostos à hipóxia promovem ajustes cardíacos (bradicardia
hipóxica), vasculares e bioquímicos para manter a transferência de oxigênio do
ambiente até os tecidos (OLIVEIRA et al., 2004; FERNANDES; RANTIN, 1999).
Em estudos com Astronotus ocellatus (ALMEIDA-VAL et al., 2000), observouse que o aumento da MDH está relacionado com atividade mitocondrial no tecido
cardíaco, no entanto estudos com Piaractus mesopotamicus, não demonstraram
alteração nas atividades da MDH (PANEPUCCI et al., 2001).
No presente trabalho, em Brycon opalinus, a presença da isoforma
mitocondrial sugere aumento do metabolismo oxidativo nos momentos de hipoxia 3
e 6 horas, provavelmente suprindo a maior demanda metabólica nesses tecidos.
5.3.2 Padrão de expressão das isozimas da LDH
A Figura 26 apresenta os padrões de expressão obtidos para LDH nas três
condições experimentais: normóxia, hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas. Assim, podese observar para as diferentes situações que, no tecido hepático, ocorre apenas a
expressão do produto do loco B*, porém com baixa intensidade, quando comparada
aos demais tecidos. Quanto aos demais tecidos observa -se, em hipóxia 3 horas e
hipóxia 6 horas, um aumento nas intensidades relativas dos produtos dos locos A* e
B*.
(A)
(B)
(C)
Figura 26: Expressão fenotípica de LDH em eletroforese em gel de amido, em fígado (F), coração (C)
e músculo (M) de B. opalinus para nomóxia (A), hipóxia 3 horas (B), hipóxia 6 horas (C).
Segundo Almeida-Val et al. (2000), os tecidos aeróbicos tendem a evitar a
acumulação anaeróbica do lactato regulando os níveis de LDH de acordo com a
disponibilidade de oxigênio no ambiente. Quando a concentração de oxigênio na
água alcança níveis muito reduzidos, as enzimas oxidativas são inibidas e a LDH
ativada, gerando assim maior produção de lactato (ALMEIDA-VAL;
VAL;
HOCHACHKA, 1993). Estudos têm demonstrado que, apesar da produção de lactato
estar relacionada com a inativação da mitocôndria pela falta de oxigênio, sua
produção também ocorre sob condições onde não há hipóxia (PAROLIN et al. 2000;
RICHARDS , HEIGENHAUSER, WOOD,2002).
No entanto, em tecidos anaeróbicos como o músculo esquelético, as vias
anaeróbias
podem
suportar
os
movimentos
de
natação
e
não
teriam
necessariamente uma correlação com a tolerância em ambientes com baixa
concentração de oxigênio. Em estudos realizados com A. ocellatus, se observou
grande capacidade de trabalho do músculo branco em condições de hipóxia, tendo
sido observado aumento na atividade da LDH em relação ao estágio de
desenvolvimento do animal. Tal resposta seria considerada como um aspecto
positivo em relação à tolerância a falta de oxigênio (ALMEIDA-VAL et al., 2000).
O estudo da LDH em músculo branco de Rhinelepis strigosa, aclimatados as
diferentes temperaturas, revelou que a temperatura de 30°C há um aumento
significativo na afinidade enzimática da LDH ao piruvato (PANEPUCCI, 2000). Em
músculo esquelético de A. crassipinnis exposto a hipóxia moderada, há um
decréscimo nos valores de LDH, os quais se restabelecem em hipóxia severa,
resposta que sugere um ajuste no metabolismo para manter a produção anaeróbica
de ATP e NAD/NADH citoplasmático (CHIPPARI-GOMES et al., 2005). Assim como,
estudos realizados com B. cephalus em condições de hipóxia, não revelaram
alteração na atividade da LDH em músculo esquelético (SANTOS, 2006). Neste
sentido, pode-se observar que a capacidade de enzimas para responder à hipóxia,
pode ser distinta em diferentes ambientes e espécies.
No presente estudo foi evidenciando um aumento nas intensidades relativas
na expressão dos fenótipos da lactato desidrogenase nas diferentes condições
experimentais .
5.4 Plasticidade fenotípica e adaptação ao ambiente
O conceito de plasticidade fenotipica se confunde com o de estresse (Fig. 17)
e com o de “indicador biológico”. Todavia, estas abordagens têm um único objetivo:
selecionar mecanismos nos diferentes níveis da organização biológica que permitam
avaliar e prever os efeitos de mudanças induzidas por distúrbios ambientais antes
que danos irreversíveis ocorram à população, comunidade, ou ecossistema
(ALMEIDA-VAL, 1997). Por isso, conhecer as respostas metabólicas da biota a
agentes estressantes torna-se extremamente importante para que se possam
diagnosticar os principais efeitos das alterações ambientais sobre a mesma.
Segundo Val e Almeida-Val (1995), as alterações ambientais possuem
importância fundamental no aparecimento de características adaptativas, e na
evolução dos peixes. Assim, a adaptação a novos ambientes tem resultado em
ajustes nos diferentes níveis da organização biológica, aumentando tanto a
plasticidade genotípica quanto fenotípica da maioria das espécies.
Segundo Walker (1997), plasticidade fenotípica pode ser definida como os
limites da variação morfológica e fisiológica na expressão de um dado genótipo
quando este é exposto a mudanças nas condições ambientais. Esta pode envolver
mudanças na morfologia como, por exemplo, partes da boca e do trato
gastrintestinal,
bem
como
nas
capacidades
digestivas
e
de
absorção
(BUDDINGTON, KROGDAHAL, BAKKE-MCKELLEP 1997; MAGNAN; STEVENS,
1993; MITTELBACH, WAINWRIGHT, OSENBERG, 1999). Esta plasticidade
fenotípica possibilita ao individuo modificar seu comportamento alimentar e regular
suas funções digestivas em relação à mudança na composição da dieta tendo,
obviamente, implicações ecológicas. Estudos mais direcionados mostram que
diferentes espécies podem reordenar seu metabolismo de acordo com o estresse ao
qual estão expostas (ALMEIDA-VAL et al., 1995).
Pode-se concluir que marcadores de estresse podem variar de espécies para
espécie e dentre as espécies, além disso, ainda é possível considerar que
adaptações desenvolvidas durante o processo evolutivo para um tipo de ambiente
pode ser uma ferramenta útil ao peixe quando este lida com estresse provocado
pela ação do homem (VAL ;ALMEIDA-VAL, 1999; PAULA-SILVA et al., 2002;
ALMEIDA-VAL; DUNCAN; VAL, 2002).
5.4.1 Mecanismos adaptativos na produção de energia
A manutenção das atividades biológicas é dependente da produção de
energia. Uma das fontes desta energia, a imediata, são os derivados de fosfatos
orgânicos, ricos de energia do músculo e a outra, é o metabolismo intermediário de
carboidratos e lipídios. A glicose da corrente sanguínea penetra nas células onde é
degradada até ácido pirúvico através de uma série de reações químicas. Outra fonte
de glicose intracelular e consequentemente de ácido pirúvico, é o glicogênio,
polímero da glicose especialmente abundante no fígado e músculo esquelético.
Quando existe quantidade adequada de O2, o ácido pirúvico entra no ciclo do ácido
cítrico (ciclo de Krebs ou dos ácidos tricarboxílicos) e é metabolizado até CO2 e H2O
através da fosforilação oxidativa, liberando energia suficiente para formar grande
quantidade de ATP a partir de ADP. Se o fornecimento de O2 não for suficiente, o
ácido pirúvico proveniente da glicose não entra no ciclo dos ácidos tricarboxílicos,
mas é transformado em ácido lático. Este processo de glicólise anaeróbica é
associado à produção líquida de quantidades muito menores de ligações de fosfato
de alta energia (DEVLIN ; MICHELACCI 2003; LENHINGER,2006).
O ciclo dos ácidos tricarboxílicos necessita de O2 para a oxidação do NADH e
não funciona em condições anaeróbicas. A glicólise até piruvato ocorre fora da
mitocôndria, que então entra na mitocôndria, onde as enzimas que intervêm neste
processo e no ciclo dos ácidos tricarboxílicos, se encontram dispostas ao longo dos
compartimentos e paredes internas da mitocôndria. As fibras musculares com taxas
relativamente baixas de contração não usam energia mais rapidamente do que a
que pode ser restaurada através do metabolismo dos produtos alimentares e do
oxigênio que lhes é fornecido. Contudo, as fibras usadas em acessos muito rápidos
de atividade armazenam substanciais quantidades de glicogênio. Se o oxigênio não
é carregado com bastante rapidez para a fosforilação oxidativa, quantidade
considerável de energia é fornecida pela glicólise anaeróbica do glicogênio. Como o
produto, ácido pirúvico, não pode entrar no ciclo do ácido cítrico na ausência de
oxigênio é convertido em ácido lático que se difunde para fora das células. Quando o
oxigênio disponível é suficente, a maior parte do ácido lático é reconvertido a glicose
que é levada para as fibras musculares e restaura o glicogênio do músculo (VILLEE,
BARNES, WALKER,, 1988). A presença de uma via aneróbica para a degradação
da glicose tem uma consequência fisiológica importante, pois durante o exercício
muscular, os vasos sanguíneos se dilatam e a irrigação sanguínea é aumentada de
maneira que a provisão disponível de oxigênio é aumentada. Quando o esforço
muscular é muito intenso, a resíntese aeróbica das reservas de energia não pode
acompanhar sua utilização (LENHINGER,2006).
Nestas condições a fosfocreatina é utilizada para resintetizar o ATP e e isto é
realizado usando a energia liberada pela degradação anaeróbica da glicose até
ácido lático. Este uso das vias anaeróbias é auto-limitante, porque a despeito da
rápida difusão do ácido lático na corrente sanguínea, acumula-se o suficiente nos
músculos para eventualmente exceder a capacidade ‘tampão’ dos tecidos e produzir
uma queda do pH que inibe as enzimas. A existência de uma via anaeróbica para
degradação da glicose permite por curtos períodos, o esforço muscular de grandeza
muito maior do que seria possível sem ela.
Segundo Hochachka e Somero (1973, 1984), de uma maneira geral, nos
diferentes organismos, o metabolismo celular percorre os mesmos caminhos que
são:
•
Produção de compostos altamente energéticos como o ATP, em quantidades
suficientes para suprir as necessidades celulares;
• Ingestão ou formação de compostos intermediários necessários a biossíntese;
• Formação de poder redutor utilizável nas reduções biológicas e,
• Síntese de macromoléculas decorrente da união dos itens anteriores.
Para que os organismos possam assegurar que suas funções metabólicas
ocorram em taxas adequadas frente aos efeitos perturbadores do ambiente, estes
podem lançar mão de três formas básicas de adaptação bioquímica que são:
• Os tipos de macromoléculas presentes podem ser mudados;
• As suas quantidades ou concentrações podem ser ajustadas, ou
• As suas funções podem ser reguladas de maneira adaptativa (HOCHACHKA;
SOMERO 1973)
Segundo Shaklee et al. (1977), as atividades fisiológicas dos organismos
estão sujeitas a influência de fatores físicos ambientais tais como: temperatura, luz,
pressão, O2 dissolvido e salinidade entre outros. Para que possam suportar as
flutuações de tais parâmetros, muitos organismos utilizam-se de mecanismos
homocinéticos.
Assim,
para
estes
autores,
uma
reorganização
metabólica
decorrente dos processos de aclimatação/aclimatização pode ser, e em geral é, um
processo de especificidade tissular.
Segundo Hochachka e Somero (2002), alem dos ajustes fisiológicos,
comportamentais e morfológicos serem importantes para assegurar a sobrevivência
em condições hipóxicas, muitos vertebrados também apresentam uma combinação
de redução da taxa metabólica com ativação do metabolismo anaeróbico. Em peixes
observa-se que muitas espécies possuem capacidade de sobreviver em ambientes
hipóxicos ou anóxicos devido a um grande potencial anaeróbico (HOCHACHKA,
1980; MORAES et al, 1996; CHIPPARI-GOMES et al, 2005), tendo sido observado
para cascudos (MACCORMACK et al, 2006) submetidos à hipóxia aumentos de
glicose e lactato plasmáticos, sugerindo estratégia metabólica anaeróbica.
A glicose é essencial para a manutenção da sobrevivência em condições de
hipóxia uma vez que a regulação entre metabolismo aeróbico e anaeróbico ocorre
nas primeiras fases da resposta frente às alterações ambientais, onde se utiliza
glicose ou glicogênio como substratos e se verifica a presença de lactato como
produto final (VAN RAAIJ et al., 1996; DRIEDZIC ; BAILEY, 1999).
Para Hochachka e Somero (2002), durante o exercício (situação esta que
pode estabelecer hipóxia tissular), o aumento da dependência muscular pelo
metabolismo da glicose proveniente do fígado destaca a importância das interações
metabólicas inter-teciduais e é frequentemente observada entre os peixes.
Estudos realizados com P. anisitsi (CRUZ, 2007) submetidos à hipóxia
mostraram a manutenção dos estoques hepáticos de glicogênio até 3 horas, com
posterior redução drástica deste assim como de glicose hepática. Segundo o mesmo
autor, estes estoques seriam fonte primaria de glicose plasmática que, para a
referida espécie, aumentaram significativamente. Para Moraes et al (1996) a glicose
proveniente das reservas de glicogênio hepático é provavelmente transferida para o
tecido muscular visando aumentar as reservas de combustível para situações de
anaerobiose.
No presente trabalho, para hipóxia 6 horas e 3 horas os valores observados
para a concentração de glicose plasmática foram 15% e 4%, respectivamente,
superiores ao observado em normóxia. Assim, mesmo não sendo consideradas
significantes estatisticamente, o aumento na concentração de glicose plasmática
pode ser resultante das reservas de glicogênio hepático.
5.4.2 Metabolismo oxidativo vs anaeróbico
Em ambientes aquáticos naturais, o aumento da temperatura ambiental
proporciona uma redução na disponibilidade de oxigênio dissolvido na coluna
d’água. Assim, nestas condições, evolutivamente, os organismos aquáticos
desenvolveram estratégias bioquímicas para suportar as pressões sofridas pelo
ambiente. De acordo com Shaklee et al. (1977), mudanças qualitativas nos padrões
isozímicos parecem ser um evento infrequente e de importância questionável
relacionado a respostas aclimatórias em peixes, ao passo que alterações
quantitativas podem contribuir significativamente para a organização metabólica
durante o processo de aclimatização.
A Figura 27 apresenta vias metabólicas nas quais a MDH (sMDH no
citoplasma e mMDH na mitocôndria), típicas do metabolismo oxidativo, e LDH, típica
do metabolismo anaeróbico estariam atuando.
Figura 27: Esquema demonstrando as vias metabólicas nas quais a MDH e a LDH estariam atuando
(Modificado a partir de SUAREZ e MOMMSEN, 1987).
Segundo Zink e Shaw (1968), três diferentes rotas metabólicas têm sido
propostas para a sMDH: gliconeogênese, lipogênese e lançadeira malato-aspartato
durante a glicólise aeróbica. Segundo Bailey et al. (1970) ambas as isoformas – A e
B - devem ocupar diferentes rotas no metabolismo.
Considerando o estudo do possível caráter adaptativo dos locos da sMDH de
Leiostomus xanthurus, realizado por Schwantes e Schwantes (1982), a presença da
isoforma termoestável A, seria mais adaptável do que a B ao aumento no
metabolismo oxidativo que ocorre durante a reorganização metabólica em resposta
a um aumento na temperatura ambiental. Com isso, o oxalacetato seria reduzido a
malato pela isoforma A em presença do NAD, o qual seria utilizado pela
gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase favorecendo a reação no sentido glicolítico.
Em músculo esquelético, o malato é oxidado a oxalacetato pela isoforma B, com
redução do NAD. A passagem de equivalentes redutores na mitocôndria via
lançadeira malato-aspartato estaria envolvendo o loco -B* com especificidade
tissular para esse tecido influenciando no metabolismo oxidativo de carboidratos.
Em músculo esquelético, tanto o glicogênio como a glicose são preferencialmente
oxidados e para garantir que as funções específicas desse tecido ocorram em taxas
adequadas, compostos energéticos como ATP são formados.
No presente trabalho, a predominância do produto do loco-A* (sMDH) em
tecido hepático, a exemplo do determinado para outras espécies (MONTEIRO
SCHWANTES, SCHWANTES, 1991; AQUINO-SILVA, 1992, AQUINO-SILVA et al.,
1997, 2003), poderia conferir a esta espécie uma maior eficiência no processo de
redução do oxalacetato a malato, favorecendo o metabolismo no sentido glicolítico.
Em situação de hipóxia (3 e 6 horas), o aumento na intensidade relativa da isoforma
A e a presença da fração mitocondrial, envolvida no ciclo de Krebs, em músculo
esquelético e cardíaco indicariam a manutenção do metabolismo glicolítico em
tensões de OD inferiores a 2 mg/L.
A baixa tensão de oxigênio induz diferenças na distribuição das isozimas em
tecidos como o fígado (ALMEIDA-VAL et al., 1995). Comparações entre os fenótipos
iniciais e finais de peixes antes e depois de experimentos com baixa disponibilidade
de oxigênio, demonstraram diferenças nos níveis de LDH e na inibição do piruvato.
A fácil redução do piruvato, catalisada pela LDH serve para regenerar NAD+,
permitindo que a glicólise prossiga temporariamente em condições anaeróbicas. O
lactato formado em tecidos em atividade, como músculo, e oxidado a piruvato,
primariamente no fígado pelas formas isoenzimáticas da LDH, tendo grande
importância seu papel na gliconeogênese (HOCHACHKA; SOMERO, 2002).
Salienta-se aqui a inter-relação fígado-músculo branco, onde o metabolismo é
regulado pela disponibilidade de substratos, pelo controle do teor de enzimas e de
suas atividades catalíticas (STRYER, 1996). Para Hochachka e Somero (2002),
durante o exercício (situação esta que pode estabelecer hipóxia tissular), o aumento
da dependência muscular pelo metabolismo da glicose proveniente do fígado
destaca a importância das interações metabólicas inter-teciduais e é frequentemente
observada entre os peixes.
Comparações entre o fenótipo inicial e final de acarás, submetidos à hipóxia
revelam a diminuição na atividade absoluta de LDH (ALMEIDA-VAL et al, 1999).
Segundo Lewis et al. (2007), a depressão na taxa de síntese protéica demonstra um
decréscimo de entre 50-60% no fígado. Em Brycon opalinus, para as condições de
hipóxia não se observou mudanças expressivas na expressão da LDH em tecido
hepático, sugerindo que talvez tempo de exposição em baixa tensão de oxigênio,
não tenha sido suficiente para induzir alterações significativas.
Na proteína oligomérica de LDH, o padrão isozímico está relacionado com o
tipo de metabolismo de cada tecido. Para o músculo cardíaco, há predominância de
isoformas do tipo B, mais anódicas e codificadas pelo loco LDH-B*. Para Brycon
opalinus foi observado 4 isoformas, dois heteropolímeros (A 3B, A2B2) e dois
homoplímeros (A 4 e B4). Além disso, em hipóxia 3 horas e hipóxia 6 horas, pode-se
observar, um aumento nas intensidades relativas dos produtos dos locos A* e B*, se
comparado com a condição de normóxia.
Investigações com Astronotus crassipinnis e Symphysodon aequifasciatus,
demonstram que a atividade da LDH é acrescida em situações de hipóxia, sugerindo
a ativação do metabolismo anaeróbico (CHIPPARI-GOMES et al., 2005). Para
espécies de peixes da Amazônia, estudos sugerem que existem dois padrões de
distribuição tecidual para LDH: (i) predominância da isozima B4 em tecido cardíaco,
indicando seu caráter aeróbico e (ii) redução da atividade do loco LDH-B* e ativação
da expressão do loco LDH-A* no músculo cardíaco, indicando intensificação do
metabolismo anaeróbico em eventos de hipóxia. Tal fato evidencia o ajuste da
maquinaria bioquímica de acordo com as condições ambientais, sendo que, essas
variações nos padrões isozímicos são sempre relatadas em tecidos de metabolismo
oxidativo, com é o cardíaco (ALMEIDA-VAL et al., 1999).
A exemplo do verificado por outros autores (ALMEIDA-VAL et al., 2000;
PANEPUCCI et al., 2000; SCHULTE, 2004; SOMERO, 2003, 2004, AQUINO-SILVA
et al, 2003, 2008), as variações observadas para os sistemas isozimicos da MDH e
LDH de B. opallinus sugerem que estas seriam mecanismos genéticos e/ou
metabólicos em resposta a alterações no meio ambiente, fato o qual, poderia se
constituir numa estratégia quali/quantitativa de adaptação bioquímica.
5.5 Conservação biológica em Bacias Hidrográficas
Devido a sua grande importância e diante das previsões não tão
otimistas em relação à escassez de água e o declínio das espécies aquáticas, as
bacias hidrográficas, na última década, passaram a ser consideradas unidades de
conservação (MOULTON ; SOUZA, 2006).
Pesquisadores e gerenciadores vêm buscando novas perspectivas que
integrem interesses sociais, econômicos e ambientais visando à conservação de
bacias hidrográficas. A integração de sistemas aquáticos e terrestres em pesquisas
tem sido adotada de forma mais cuidadosa, sendo um dos pontos chave para
efetivar a conservação, considerando que a preservação não estará assegurada
sem que haja uma visão do ecossistema como um todo (ABELL; SANDERS et al.,
2002).
Segundo Sanders et al. (2002) é de grande importância o estabelecimento de
áreas de proteção aquática e proteção integral de bacias hidrográficas, sendo
também uma estratégia de manejo para conter a degradação do solo, condição
prejudicial aos corpos d’água. Esta visão leva a um novo direcionamento no sentido
de integração da biodiversidade, não apenas considerando freqüências e
abundância de espécies, mas também a interação entre estas e seu ambiente.
A proposta de uma abordagem ecológica mais holística pode trazer mais
abrangência à conservação de recursos naturais. No entanto, Clark (1999) aponta a
falta de conhecimento sobre o funcionamento dos ecossistemas como um obstáculo
para sua implementação. Segundo o mesmo autor, as decisões de manejo tomadas
à luz desta nova abordagem envolvem muito risco, uma vez que a biologia da
conservação ainda não incorporou substancialmente os princípios de funcionamento
de ecossistemas, sem contar que os fatores econômicos, culturais e políticos têm
sido mais decisivos para implantação de reservas do que os princípios ecológicos
(ROCHA et al., 2006). Assim, deve-se considerar a relevância das bacias no
contexto de regulação ecossistêmica, na captação e drenagem das chuvas,
disponibilização de água potável, estabilização e manutenção do solo e manutenção
do clima.
A intervenção em bacias hidrográficas, tais como ext ração de água
subterrânea,
represas,
desvios,
canalizações
e
projetos
de
transposição
representam grandes ameaças à conservação desses ambientes. Parâmetros
ambientais, como distribuição de nutrientes e sedimentos, concentração de oxigênio
dissolvido, temperatura da água e toda estrutura do habitat de espécies nativas,
estão relacionados com os padrões hidrológicos (ROCHA et al.,2006).
Na bacia do rio Paraíba do Sul não é diferente, onde projetos de
aproveitamento hidroelétrico e transposição têm representado as importantes
intervenções no fluxo hidrológico. O fato de encontrar localizada entre dois
importantes centros urbano-industriais, São Paulo e Rio de Janeiro, também
contribui para aumentar o impacto negativo sobre a fauna e a flora pertencente à
bacia.
O desenvolvimento de ações adicionais no sentido da restauração de áreas
degradadas, na reintrodução de espécies, no controle de espécies invasoras entre
outros, tornam-se necessárias. Entretanto, estas ações exigem cautela e rigor
científico, pois são bastante complexas e, se não forem bem conduzidas, podem
levar a degradações ainda maiores, e irreversíveis, nos ecossistemas, habitats e
populações.
Neste sentido, existe a necessidade de estudos nas áreas de ecologia e de
conservação biológica para construir fundamentos, que direcionem ações, com base
em princípios científicos. Assim, a conservação passa a ser baseada em um sistema
detalhado, visando à compreensão da natureza e da dinâmica dos sistemas
biológicos, esclarecendo aspectos da diversidade biológica úteis para o seu
estabelecimento.
A pirapitinga-do-sul, Brycon opalinus é uma espécie altamente adaptada às
condições de Mata Atlântica devido a sua dependência da mata ripária, não apenas
para alimentação, mas também pelas características bióticas e abióticas desse
ambiente aquático (GOMIERO; BRAGA, 2006). Todavia, as modificações que o rio
Paraíba do Sul vem sofrendo ao longo do tempo, principalmente no que se refere ao
processo de urbanização e ocupação da terra, representam grande prejuízo às
comunidades aquáticas, especialmente as espécies de peixes.
Segundo Machado e Abreu (1952), no Vale do Paraíba, a presença da
pirapitinga do sul representou, do total de captura, a terceira espécie mais coletada,
sendo considerada de alto valor comercial. Todavia, apesar de sua importância
encontra-se entre as que estão ameaçadas de extinção (BRASIL, 2003, 2004).
No presente trabalho considerando as variações hematológicas associadas
ao ajuste enzimático frente à hipóxia, pode-se sugerir que as condições ambientais
encontradas hoje na bacia do Paraíba do Sul (PEINADO, 2006) desfavorecem a
presença da espécie em questão, visto que para se manter em ambientes hipóxicos,
torna-se necessário uma maior demanda energética. Todavia, para trabalhos
futuros, estudos mais detalhados das isozimas, abrangendo a cinética, podem trazer
mais conhecimentos sobre a adaptabilidade desta espécie em ambientes com baixa
concentração de oxigênio.
6 CONCLUSÕES
♦ As análises estatísticas realizadas para normóxia vs hipóxia 6 horas
mostraram que o aumento observado no número de eritrócitos, concentração
de hemoglobina e hematócrito foi significativo.
♦ As análises estatísticas realizadas não revelaram diferença significativa para
os índices hematimétricos VCM, HCM e CHCM, no entanto se observou
aumento para VCM em condição de hipóxia 3 horas comparado à normóxia
sugerindo ajustes osmoregulatórios como resposta à baixa disponibilidade de
oxigênio dissolvido.
♦ Sugere-se que o aumento no volume eritrocitário pode ser decorrente da
hidratação celular, uma vez que a adrenalina, uma das catecolaminas
produzidas durante este processo causa inchaço nas células vermelhas.
♦ Apesar das diferenças aqui observadas quanto aos níveis de glicose, não
serem consideradas significativas pelas análises estatísticas, pode-se verificar
que em hipóxia 6 horas e 3 horas os valores foram 15% e 4%,
respectivamente, superiores ao de normóxia, sugerindo a transformação de
glicogênio em glicose pelo tecido hepático.
♦ Para a MDH, o número de componentes eletroforéticos e especificidade
tissular dos indivíduos estudados sugerem a presença de dois locos gênicos
sMDH-A* e sMDH-B* admitindo-se sua estrutura como dimérica.
♦ Foi detectado alelo variante para o loco sMDH-B* o alelo *106 no loco B* e o
cálculo da freqüência gênica realizado para este alelo (*106 no loco B*),
indica que a população encontra-se em equilíbrio de Hardy- Weinberg.
♦ O fracionamento celular realizado para fígado indica que a fração mitocondrial
tem migração eletroforética similar à apresentada pela fração solúvel,
especificamente para o produto do loco A*.
♦ Em músculo esquelético de animais submetidos à normóxia, o resultado
obtido para o fracionamento celular da MDH não permitiu a visualização da
fração mitocondrial. Para este mesmo tecido, considerando hipóxia 6 horas,
mesmo a fração mitocondrial estando presente no controle, não foi possível
visualizar a fração isolada. Tal fato provavelmente se dever por esta fração se
encontrar abaixo dos níveis de detecção da eletroforese em gel de amido.
♦ Para a MDH, os testes de termoestabilidade realizados não apresentaram
inativação dos produtos dos locos A* e B*, nos diferentes intervalos de tempo
estudados.
♦ A detecção da mMDH nos três tecidos para a situações de hipóxia 3 e 6
horas,
sugere
aumento
da
atividade
para
metabolismo
oxidativo,
provavelmente suprindo a maior demanda metabólica nesses tecidos.
♦ A análise do padrão eletroforético da LDH em Brycon opalinus, demonstrou
na expressão gênica que existe predomínio do loco A* em músculo
esquelético e do loco B* em fígado e coração, sendo que para os dois locos
que a codificam não foi observado a presença de alelos variantes.
♦ Para os três tecidos estudados, considerando-se as situações de hipóxia e
normóxia, foi possível observar para a LDH um aumento na intensidade de
coloração para o produto dos diferentes locos.
♦ As variações observadas para os sistemas isozímicos da MDH e LDH de B.
opallinus, somadas as respostas hematológicas sugerem que estas seriam
mecanismos genéticos e/ou metabólicos frente às alterações no meio
ambiente, fato o qual, poderia se constituir numa estratégia quali/quantitativa
de adaptação bioquímica.
♦ As variações hematológicas associadas ao ajuste enzimático frente à hipóxia
(3 e 6 horas), indicam uma maior demanda energética por esta espécie, no
sentido de garantir a sobrevivência em ambientes adversos. Assim, pode-se
sugerir que as condições ambientais encontradas hoje na bacia do Rio
Paraíba do Sul desfavorecem a sobrevivência da espécie B. opalinus.
♦ O fato da espécie B. opalinus estar incluída na lista de animais sujeitos a
extinção somada aos resultados aqui apresentados e as características
ambientais (oxigênio dissolvido) apresentadas pelo Rio Paraíba do Sul,
sugerem que esta espécie pode ser considerada um organismo bioindicador.
Neste sentido, projetos de reintrodução de espécies de peixes endêmicas no
Rio Paraíba do Sul, devem ser ancorados na correlação entre estudos
adaptativos versus caracterização ambiental a exemplo do realizado no
presente trabalho.
REFERÊNCIAS
ABELL, R. Conservation biology for the biodiversity crisis: a freshwater follow-up.
Conservation Biology, v. 16, n.5, p. 1435-1437, 2002.
ADHAM, K. G.; IBRAIM, H. M.; HAMED, S. S.; SALEH, R. A. Blood chemistry of the
Nile tilapia, Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1757) under the impact of water
pollution. Aquatic Ecology, v. 36, p. 549-557, 2002.
AFFONSO, E.G.; POLEZ, V.L.P.; CORREA, C.F.; MAZON, A.F.; ARAUJO, M.R.R.;
MORAES, G.; RANTIN, F.T. Blood parameters and metabolites in the teleost fish
Colossoma macropomum exposed to sulfide or hypoxia. Comparative
Biochemistry and Physiology Part C, v.133, p. 375-382, 2002.
AGEVAP Associação Pró-Gestão das Águas da Bacia Hidrográfica do Rio Paraíba
do Sul - Plano de Recursos Hídricos da Bacia do Rio Paraíba do Sul – Resumo,
Resende, RJ, 2006.
ALLENDORFF, W.; MITCHELLN, N.; RYMAN, N.; STAHL, G. Isozyme loci in brown
trout (Sulmo trutta L.): detection and interpretation from population data . Hereditas
v.86, p.179-190, 1977.
ALMEIDA-VAL, V. M. F.; VAL, A. L. A; HOCHACHKA, P. W. Hypoxia tolerance in
Amazon fishes: status of na under-explored “goldmine”. In: HOCHACHKA, P. W.;
LUTZ, P. L.; SICK, T.; ROSENTHAL, M.; VAN DEN THILLART, G. Surviving
Hypoxia: Mechanisms of control and adaptation. New York, CRC Press,1993. p.
435-445.
ALMEIDA-VAL, V. M. F. e VAL, A. L. A adaptação de peixes aos ambientes de
criação. In: VAL, A. L.; HONCZARYK, A. Criando peixes na Amazônia. Manaus,
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, 1995. p.45-59.
ALMEIDA-VAL, V.M.F. Mecanismos de defesa contra hipóxia em ambientes
aquáticos. In: MARTOS, H.L.; MAIA, N.B. Indicadores Ambientais. Manaus,
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA ,1997.
ALMEIDA-VAL, V. M. F.; VAL, A. L.; DUNCAN, W.P. ; SOUZA, F. C. A.; PAULASILVA, M. N.; LAND, S. Scalling effects on hypoxia tolerance in the Amazon fish
Astronotus ocellatus (Perciformes: Cichlidae): contrubution of tissue enzyme levels.
Comparative Biochemistry and Physiology B, v.125, p.219-226, 2000.
ALMEIDA-VAL, V.M.F.; DUNCAN, W.P. e VAL, A.L. Crude oil effects on fish of the
Amazon: Current Status. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON THE BIOLOGY OF
FISH, 2002, VANCOUVER. Tropical Fish: News and Reviews. Anais... Vancouver,
Canada, 2002.p. 49-60.
AQUINO-SILVA, M.R. Caracterização bioquímica da sMDH de Hoplias
malabaricus (Characiformes) e de Geophagus brasiliensis (Perciformes) da
Represa do Monjolinho (São Carlos, SP). Dissertação (Mestrado em Ecologia e
Recursos Naturais) -Centro de Ciências Biológicas e da Saúde. Universidade
Federal de São Carlos, São Carlos, SP. 1992.
AQUINO-SILVA, M.R.; SCHWANTES, M. L. B. ; SCHWANTES, A. R. The multiple
soluble malate dehydrogenase of Hoplias malabaricus (Characiformes).
Experimental Biology Online, v.2, p.18, 1997.
AQUINO-SILVA M.R.; SCHWANTES M.L.B. ; SCHWANTES A.R. Isoform expression
in the multiple soluble malate dehydrogenase of Hoplias malabaricus (Erythrinidae,
Characiformes). Braz J Biol,v.63, p.7-15, 2003.
AQUINO-SILVA, M.R.; SCHWANTES, M,L,B.; MUNIN, F. S.; SCHWANTES A.R.;
SANTOS, P. S. Soluble malate dehydrogenase of Geophagus brasiliensis (Cichlidae,
Perciformes): Isolated isoforms and kinetics properties. Genetics and Molecular
Biology, v.31, 1 (suppl), p.337-342, 2008.
BAILEY, G. S.; WILSON, A. C.; HALVER, J. E. ;JOHNSON,C. L. Multiple forms of
supernatant malate dehydrogenase in salmonid fishes: biochemical, immunological
and genetic studies. J. Biol. Chem.,v. 245, p. 5927- 5940, 1970.
BAILEY, G. J.; COCKS, G. T. e WILSON, A. C. Gene duplication in fishes: malate
dehydrogenase of salmon and trout. Biochem.Biophys. Res.Comm., v. 34, p. 605 612. 1970.
BALDISSEROTTO, B. Fisiologia de peixes aplicada à piscicultura. Santa Maria:
Ed. UFSM, 2002.
BANASZAK, L.T.; BRADSHAW, R.A. Malate dehydrogenase. In: BOYER, P.D. (ed.):
The enzymes. New York: Academic Press, v. XI, p. 369 - 396. 1975.
BARTON, B. A. Stress in Fishes: A Diversity of Responses with Particular Reference
to Changes in Circulating Corticosteroids. Integ. and Comp. Biol., v.42, p.517–525
2002.
BRASIL, Instrução Normativa nº3, de 27 de maio de 2003. Reconhece espécies da
fauna brasileira ameaçadas de extinção. Ministério do Meio Ambiente, Brasília.
2003.
BRASIL, Instrução Normativa nº5, de 21 de maio de 2004. Reconhece espécies de
invertebrados aquáticos e peixes ameaçados de extinção, sobreexplotadas ou
ameaçadas de sobreexplotação. Ministério do Meio Ambiente, Brasília. 2004.
BUCKUP, P.A. Relationships of the Characidiinae and Phylogeny of Characiform
fishes (Teleostei: Ostariophysi). In: L.R. MALABARBA; R.E. REIS; R.P. VARI;
Z.M.S. LUCENA E C.A.S. LUCENA (Eds). Phylogeny and classification of
Neotropical fishes. Porto Alegre: EDIPUCRS, 1998. p.123-144.
BUDDINGTON, R.K.; KROGDAHAL, A. e BAKKE-MCKELLEP, A.M. The intestine of
carnivorous fish; structure and functions and the relations with diet. Acta
Physiol.Scand., v.161 (supl. 638), p.67-80, 1997.
BUTTNER , J. K.; SODERBERG, R. W.; TERLIZZI, D. E. An Introduction to Water
chemistry in Freshwater. NRAC Fact Sheet v. 170, 1993. Disponível em:
http://aquanic.org/publicat/usda_rac/efs/nrac/nrac170.pdf . Acesso em: 20 nov. 2007.
CAHN, R. D. Nature and Development of latic dehydrogenase. Science, v.85, p.
147-165, 1962.
CAMARGO, J. A.,ALONSO A. Ecological and toxicological effects of inorganic
nitrogen pollution in aquatic ecosystems: a global assessment. Environmental
Internacional, v.32, p. 831-849, 2006
CARMICHAEL, G.J.; TOMASSO, J.R.; SIMCO, B.A .; DAVIS, K.B. Confinement and
water qualityinduced stress in largemouth bass. Transactions of the American
Fisheries Society, v.113, p.767-777. 1984.
CARVALHO, E. C. A. O Impacto Econômico da Bacia Hidrográfica do Rio
Paraíba do Sul na região do Estado de São Paulo, sustentabilidade ou crise.
Dissertação (Mestrado em Planejamento Urbano ) – Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São Paulo, 2008.
CBH-PS. Comitê da Bacia hidrográfica do Rio Paraíba do Sul. Disponível em
http://www.comiteps.sp.gov.br/mapas.html. Acesso em 20 abr 2007.
CETESB, Relatório de Qualidade das Águas Interiores 2006. Companhia de
Tecnologia de Saneamento Ambiental, São Paulo, 2007.
CETESB, Relatório de Qualidade das Águas Interiores 2007. Companhia de
Tecnologia de Saneamento Ambiental, São Paulo, 2008.
CHAPMAN, L. J.; CHAPMAN, C. A.; NORDLIE, F. G.; ROSENBERGER, A. E.
Physiological refugia: swamps, hypoxia tolerance and maintenance of fish diversity in
lake Vitoria region. Comp. Biochemistry Physiology, v. 133 p. 421-437, 2002.
CHIPPARI-GOMES, A.R.; GOMES, L.C; LOPES, N.P.; VAL, A.L.; ALMEIDA-VAL,
V.M.F. Metabolic adjustments in two Amazonian cichlids exposed to hypoxia and
anoxia. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, v.141, p.347- 355,
2005.
CLAYTON, J. W.; HARRIS, R. E. K.; TRETIAK, D. N., Identification of supernatant
and mitochondrial isozymes of malate dehydrogenase on electropherograms applied
to the taxonomic discrimination of walleye (Stizolection vitreum vitreum), sanger (S.
canadense) and suspected interspecific hybrid fishes. CLFish Res. Bd. Can. v.30, p.
927-938, 1975.
CEIVAP. Comitê para Integração da Bacia do rio Paraíba da Sul. Plano de recursos
hídricos da bacia hidrográfica do rio Paraíba do Sul. Resende, RJ, 2006.
CLARK, J. R. The ecosystem approach from a pratical point of view. Conservation
Biology, v.13, n.3, p. 679-681. 1999.
CONSELHO Nacional do Meio Ambiente. Legislação Federal-resolução CONAMA
357, 2005.
COPPETEC. Projeto Gestão dos Recursos Hídricos da Bacia Hidrográfica do Rio
Paraíba do Sul, RJ: Diagnóstico e Prognóstico do Plano de Recursos Hídricos
da Bacia do Rio Paraíba do Sul. Rio de Janeiro: ANA/COPPE-UFRJ, 2001.
COPPETEC. Projeto Gestão dos Recursos Hídricos da Bacia Hidrográfica do Rio
Paraíba do Sul, RJ: Plano de Recursos Hídricos da Bacia do Rio Paraíba do Sul.
Rio de Janeiro: ANA/COPPE-UFRJ, 2006.
CRUZ, A. L. O comportamento respiratório e a cascata de O2 no cascudo de
respiração bimodal Pterygoplichthys anisitsi (Teleostei, Locariidae). Tese
(Doutorado em Ciências Fisiológicas) - Centro de Ciências Biológicas e da Saúde.
Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2007.
DARNALL, D.W.; KLOTZ, I.M. Subunit
Arch.Biochem., v.166, p. 651- 682, 1975.
composition
of
proteins:
A
table.
DEVLIN, T. M.; MICHELACCI, Y. M. Manual de bioquímica com correlações
clínicas. São Paulo: Edgard Blücher, 2003
DIAZ, R.J. Overview of hypoxia around the world. Journal Environment Quality, v.
30, p.275-281, 2001.
DI MICHELE, L.; POWERS, D. Physiological basis for swimming endurance
differences between LDH-B genotypes of Fundulus heteroclitus. Science, v.216,
1982
DINÓLA, C. N. C. Observação do Desenvolvimento de Brycon opalinus (Cuvier,
1819), Pirapitinga do Sul, na estação de Hidrobiologia e Aqüicultura da CESP
de Paraibuna – São Paulo. Trabalho de Graduação (Ciências Biológicas) Universidade do Vale do Paraíba, São Paulo, 2001.
DRIEDZIC.W. R. E BAILEY, J. R. Anoxia cardiac tolerance in Amazonian and North
temperate teleosts is related to the potential to utilize extracellular glucose. In: VAL,
A. L.; ALMEIDA-VAL, V. M. F. Biology of Tropical Fishes. Manaus, Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA,1999. p.217-227.
EPSTEIN, C. J.; SCHECHTER, A. N.; A approach in the problem of conformational
isozymes. Ann. N. Y. Acad. Sci., v. 151, p. 85-101, 1968.
FARIAS, I. P. e ALMEIDA-VAL, V. M. F. Malate dehydrogenase (sMDH) in amazon
cichlid fishes: evolutionary features. Comp. Biochem. Physiol. v.103B, p.939-943.
1992.
FENERICH-VERANI, N; SCHWANTES, M. L. B.; SCHWANTES, A. R. Pattens of
genes expression during Prochilodus scrofas (Characiformes, Prochilodontidae)
embryogenesis – I. Lactate dehydrogenase. Comp. Biochem. Physiol. v.97B, p.
235-246, 1990.
FERNANDES M. N., SANCHES, J.R., MATSUZAKI M., PANEPUCCI, L., RANTIN F.
T. Aquatic respiration in facultative air-breathing fish: effects of tempeture and
hypoxia. In: VAL, A. L.; ALMEIDA-VAL, V. M. F. Biology of Tropical Fishes.
Manaus, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA, p.217-227, 1999.
FÉRES, J. G.; THOMAS, A., R.; RONALDO, A. S. M.; Industrial Water Demand
and Pollution Abatement Costs at the Paraiba do Sul River Basin (Demanda por
Água e Custo de Controle da Poluição Hídrica nas Indústrias da Bacia do rio
Paraíba do Sul). Rio de Janeiro, Instituto de Pesquisa Econômica Aplicada – IPEA,
2005.
FERRIS, S.D. e WHITT, G.S. Duplicate gene expression in diploid and tetraploid
loaches (Cypriniformes, Cobitidae). Biochem.Genet., v.15, p.1097 – 1111, 1977.
FISHER, S. F.; SHAKLEE, J. B.; FERRIS, S.D.; WHITT, G. S. Evolution of five
multilocus isozymes sustems in the chordates. Genetic, v. 52/53, p.73-85, 1980.
GOMES, L.C. et al. Cage culture of tambaqui (Colossoma macropomum) in a central
Amazon floodplain lake. Aquaculture, v.253, p.374-384, 2006.
GOMIERO, L. M. e BRAGA, F. M.,S. Relação peso-comprimento e fator de condição
de Brycon opalinus (Pisces, Characiformes) no Parque Estadual da Serra do MarNúcleo Santa Virgínia, Mata Atlântica, Estado de São Paulo,Brasil. Acta Sci. Biol.
Sci. Maringá, v. 28, n. 2, p. 135-141, April/June, 2006.
GRUBEN, A.; LOPES, P. D.; JOHNSSON, R. M. F. Projeto marca d’água
relatórios preliminares, A Bacia do Rio Paraíba do Sul, São Paulo, Rio de
Janeiro e Minas Gerais, Brasília DF, Núcleo de Pesquisa em Políticas Públicas FINATEC, 2002.
HACKBARTH, A. Respostas Metabólicas e de crescimento de Matrinxãs
(Brycon cephalus, Gunther,1869) Submetidos ao Exercício Sustentado.
Dissertação ( Mestrado) Universidade Federal de São Carlos, São Paulo, 2004.
HEATH, A. G. Water Pollution and Fish Physiology. CRC Press, Virginia, Boca
Raton, 1995.
HINEGARDNER, R. Evolution of genome size. In: AYALA, F. J. S. Molecular
evolution. Sunderland,Ma.: [s.n.],1976.
HILSDORF, A.W.S.; PETRERE JR., M. Conservação de peixes na bacia do rio
Paraíba do Sul. Cienc. Hoje, São Paulo, v. 30, n. 180, p. 62-65, 2002.
HOCHACHKA, P. W. e SOMERO, G. N.. Strategies of Biochemical Adaptation.
W.B.Sauders Co., Philadelphia. 1973.
HOCHACHKA, P. W. Living without oxygen: closed and open systems in
hypoxia tolerance. Cambridge. Harvard University Press, 1980.
HOCHACHKA, P. W. e SOMERO, G. N. Biochemical Adaptation. Princeton,
University Press, New Jersey. 1984.
HOCHACHKA, P. W.; SOMERO, G. N. Biochemical adaptation; mechanism and
process in physiological evolution. New York: Oxford University Press ,2002.
HOCHACHKA, P. W., LUTZ P.L. Mechanism, origin and evolution of anoxia
tolerance in animals. Comp. Biochemistry Physiology, v.B130, p. 435-459, 2001.
HOLBROOK, J. J.; LILJAS, A.; STEINDAL, S. J.; ROSSMAN, M. G. Lactate
dehydrogenase. In: BOYER, P. D. (ed). The Enzymes. New York: Academic Press,
1975.v. 11, p. 191 – 292.
HOWES, G. Review of genus Brycon (Teleostei, Characoidei). Bulletin of the
British. Museum Natural History and Zoology, v.43, n.1, p.1-47, 1982.
HUNTER, R. L.; MARKERT, C.L. Histochemical demonstration of enzymes
separated by zone electrophoresis in starch gels. Science, v.125, p. 1294-1295,
1957.
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Gestão. PIB Cidades, 2005.
http://www.ibge.gov.br. Acessado em 15 jan. 2008.
IWAMA, G. K., VIJAYAN, M.M., MORGAN, J. D. The Stress Response in Fish. In:
SAKSENA, D. N. Ichthyology – Recent Research Advances, New Dehli, INDIA,
Oxford & IBH Publishing Co., 1999. 147-57.
JIAN,C-Y; CHENG, S-Y; CHEN, J-C. Temperature and salinity tolerances of yellowfin
sea bream, canthopagrus lotus, at different salinity and temperature levels.
Aquaculture Research, v.34, p.175-185. 2003.
KALININ, A.L., RANTIN, F. T., FERNANDES, M. N.,GLASS, M. L. Ventilatory flow
relative to intrabuccal and intraopercular volumes in two ecologically distinct
erythrinidis (Hoplias malabaricus and Hoplias lacerdae) exposed to normoxia
andgraded hypoxia. In: VAL, A. L.; ALMEIDA-VAL, V. M. F. Biology of Tropical
Fishes. Manaus, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA, 1996.
KAPLAN, N.O. Symposium on multiple forms of enzymes and control mechanisms. I.
Multiple forms of enzymes. Bact.Rev., v.27, p. 155- 169. 1963.
KARIM, Md. R.; SEKINE, M.;UKITA, M. A. A model of fish preference and mortality
under hypoxic water in the coastal environment. Marine Pollution Bulletin, v 47, p.
25-29, 2003.
KITTO, G.B. e LEWIS, R.G.. Purification and properties of tuna supernatant and
mitochondrial malate dehydrogenase. Biochem. Biophys.Acta, v.139, p.1 - 15.
1967
KORI-SIAKPERE, O. Haematological Characteristics Of Clariasisheriensis
Sydenham. Journal Of Fish Biology, London,v.27, p.259-63, 1985
KUBITZA, F. Qualidade da água no cultivo de peixe e camarões. Jundiaí, SC:. Ed. F.
Kubitza, 2003.
LARSSON, A.; JOHANSSON-SJOBECK, M. L.; FANGER, R. Comparative study of
some haematological and biochemical blood parameters in the fishes from
Skagerrak. J. Fish Biol.v. 9, p. 425–440. 1976.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L; COX, M. M. Princípios de bioquímica. São
Paulo: Sarvier, 2006.
LEWIS, J. M. ; COSTA, I. A. S. F. ; VAL, A. L. ; ALMEIDA-VAL, V. M. F. ; GAMPERL,
A K ; DRIEDZIC, W. R. Responses to hypoxia and recovery: repayment of oxygen
debt is not associated with compensatory protein synthesis in the Amazonian cichlid,
Astronotus ocellatus. Journal of Experimental Biology, v. 56, p. 2-33, 2007.
LIMA, F.C.T. Subfamily Bryconinae. In: REIS, R.E; KULLANDER, S.O.; FERRARIS
C.J. Checklist of the freshwater fishes of South and Central America. Porto
Alegre, EDIPUCRS, p.174-181, 2003.
LIN, J. J.; SOMERO, G. N. Temperature-dependent changes in expression of
thermostable and thermolabile isozymes of cytosolic malate dehydrogenase in the
eurythermal goby fish Gillchthys mirabilis. Physiol. Zool., v.68, p. 114- 128,1995.
LOCHMILLER, R.; WEICHMAN, J. D.; ZALE, A. V. Haematologycal assessment of
temperature and oxygen stress in reservoir population of striped bass (Morone
saxatilis). Comp. Biochemistry Physiology, v. 93, p.535-541, 1989.
McALISTER-HENN, L. Evolutionary relationships
dehydrogenase. TIBS, v.13, p.178 – 181, 1988.
among
the
malate
MACHADO, C. E.; ABREU, H. C.F. Notas Preliminares sobre a caça e a pesca no
estados de São Paulo – I, A Pesca no Vale do Paraíba. Boletim de Industria
Animal. v.13, 1952.
MACCORMACK, T. J. ; LEWIS, J. M. ; ALMEIDA-VAL, V. M. F. ; VAL, A. L. ;
DRIEDZIC, W. R. Carbohydrate Management, anaerobic Metabolism, and Adenosine
Levels in the Armoured Catfish, Liposarcus pardalis (Castelnau), During Hypoxia.
Journal of Experimental Zoology, p. 363-375, 2006.
MAGNAN, P. e STEVENS, E.D. Pyloric ceacal morphology of brook charr, Salvelinus
fontinalis, in relation to diet. Environmental Biology of Fishes, v.36, p.205-210,
1993.
MARKERT, C. L. e MOLLER, F. Multiple forms of enzyme. Tissue ontogenetic and
species specific patterns . Proc. Nat. Acad. Sci., v.45, 1959.
MARKET, C. L.; SHAKLEE, J. B.; WHITT, G. S. Evolution of a gene. Science, v.189,
p.102-114, 1975.
MATEY V.; RICHARDS J.G.; WANG Y.; WOOD, C. M; ROGERS J.; DAVIES R.; MURRAY,
B.W..; CHEN, X.-Q; Du, J.; BRAUNER, C.J. The effect of hypoxia on gill morphology and
ionoregulatory status in the Lake Qinghai scaleless carp, Gymnocypris przewalskii Journal
of Experimental Biology v.211, p.1063-1074, 2008.
MAZEAUD, M.M.; MAZEAUD, F.; DONALDSON, E.M. Primary and secondary
effects of stress in fish: some new data with a general review. Transactions of the
American Fisheries Society, v. 106, p.201-212. 1977.
MEIZEL, S. e MARKERT, C. L. Malate dehydrogenase isozyme of the marine snail,
Ilyanassa obsoleta. Arch. Biochem. Biophys. v.122, 753-765, 1967.
MITTELBACH, G.C.; OSENBERG, C.W.; WAINWRIGHT, P.C. Variation in feeding
morphology between pumpkinseed populations: phenotypic plasticity or evolution?
Evolutionary Ecology Research, v.1, p.111-128,1999.
MONTEIRO, M. C.; SCHWANTES, M. L. B.; SCHWANTES, A. R. Malate
dehydrogenase in subtropical fish belonging to the orders Characiformes,
Siluriformes and Perciformes. I. Duplicate gene expression and polymorphism.
Comp.Biochem.Physiol., v.100 B, p.381-390, 1991.
MONTEIRO, M. C.; SCHWANTES, M. L. B.; AQUINO-SILVA; M. R.; SCHWANTES,
A. R. Thermal Stability Of Soluble Malate Dehydrogenase Isozymes Of Subtropical
Fish Belonging To The Orders Characiformes, Siluriformes And Perciformes.
Genetics and Molecular Biology, v. 21, n. 2, 1998.
Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo . Acesso em 12 dez 2007.
MORAES, G. The metabolic pattern changes of Hoplias malabaricus from normoxia
to hypoxia conditions. Rev. Bras. Biol. v. 56, p. 191-196, 1996.
MORAES, G., AVILEZ, I. M., ALTRAN, A. E.; BARBOSA, C. C. Biochemical and
Hematological Responses of the Banded Knife Fish Gymnotus carapo (Linnaeus,
1758), exposed to environmental hypoxia. Brazilian Journal biology, v. 62, n.4 A,
p.633-640, 2002.
MOULTON, T. P.; SOUZA, M. L. Conservação com Base em Bacias
Hidrográficas. In: ROCHA, C. F. D., BERGALLO, H. G., SLUYS, M. V., ALVES, M.
A. S. Biologia da Conservação: Essências. São Carlos,SP: Ed. Rima, 2006.
MOMMSEN, T. P.; VIJAYAN, M. M.; MONN, T. W. Cortisol in Teleosts: dynamics,
mechanism of action, and metabolic regulation. Reviews in Fish Biology, v.9, p
211-268, 1999.
MORGAN, J. D.; IWAMA, G. K. Measurements of stressed states in the field. In:
IWAMA, G. K.; PICKERING, A. D.; SUMPTER, J. P.; SCHRECK, C. B. Fish stress
and health in aquaculture. London, Cambridge University Press, 1997.
MURAMOTO, J.I.; OHNO, S.; ATKIN, N. B. On the diploid state of the fish order
Ostariophysi. Cromossoma v. 24, p. 59-66, 1968.
NIKINMAA, M., Effects of adrenaline on the red cell volume and concentration
gradient of protons across the red cell membrane in the rainbow trout, Salmo
gairdneri. Molecular Physiological, v. 02, 1982.
NIKINMAA, M. Vertebrate Red Blood Cells: Adaptations of Function to
Respiratory Requirements. Berlin: Springer-Verlag ,1990
NIKINMAA, M. Oxygen and carbon dioxide transport in vertebrate erythrocytes: an
evolutionary change in the role of membrane transport. Journal Exp. Biol. v. 200, p.
369 – 380, 1997.
NIKINMAA, M., Oxygen-dependent cellular functions—why fishes and their aquatic
environment are a prime choice of study. Comp. Biochem. Physiol. A, v.133, 1–16.
2002.
OHNO, S. Evolution by gene duplication. New York: Springer-Verlag, 1970.
OLIVEIRA, R. D.; LOPES, J. B.; SANCHES, J. R.; KALININ, A. L.; GLASS. M. L.;
RANTIN, F. T. Cardiorespiratory responses of the facultative air-breathing fish jeju,
Hoplerythrinus unitaeniatus ( Teleostei, Erythrinidae), exposed to graded ambient
hypoxia. Comparative Biochemistry and Physiology A, v.139, p. 479-485, 2004.
PANEPUCCI, R. A., PANEPUCCI, L., FERNANDES, M. N., SANCHES, J. R.And
RANTIN, F. T. The Effect Of Hypoxia And Recuperation On Carbohydrate
Metabolism In Pacu (Piaractus Mesopotamicus) Braz. J. Biol, v.61, n.4, p. 547-554,
2001.
PANEPUCCI, L.; SCHWANTES, M. L. B.; SCHWANTES, A. R. Loci that encode the
lactate dehydrogenase in 23 species of fish belonging to the orders Cypriniformes,
Siluriformes and Perciformes: adaptative features. Comparative Biochemistry and
Physiology, v. 77, p. 867-876, 1984.
PANEPUCCI, L., FERNANDES, M. N., SANCHES, J. R.; RANTIN, F. T. Changes in
lactato dehydrogenase and malate dehydrogenase activies during hypoxia and after
temperature acclimation in the armored fish, Rhinelepis strigosa (Siluriformes,
Loricariidae). Rev. Brasil. Biol. v.60, n.2, p.353-360, 2000.
PANEPUCCI, R. A., PANEPUCCI, L., FERNANDES, M. N., SANCHES, J. R.;
RANTIN, F. T. The Effect Of Hypoxia And Recuperation On Carbohydrate
Metabolism In Pacu (Piaractus Mesopotamicus) Braz. J. Biol, v.61, n.4 , p.547-554,
2001.
PANKHURST, N.W.; WELLS, R.M.G.; CARRAGHER, J.F. Effects of stress on
plasma cortisol levels and blood viscosity in blue mao mao, (Scorpis violaceus
(Hutton), a marine teleost. Comp. Biochem. Physiol. A, v.101 , p. 335–339, 1992.
PAROLIN M.L.; SPRIET L.L.; HULTMAN E.; HOLLIDGE-HORVAT, M.G; JONES,
N.L,; HE IGENHAUSER, G.J. Regulation of glycogen phosphorylase and PDH during
exercise in human skeletal muscle during hypoxia. Am J Physiol, v.278, p.E522–
E534, 2000.
PAULA-SILVA, M. M.; et al. The effects of petroeum on three species of Amazon:
pirarucu, tambaqui and boari. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON BIOLOGY OF
FISHES. Vancouver, Canadá: [s.n.],2002.
PEINADO, M. E. O uso e ocupação do solo e sua influência sobre a qualidade
das águas de uma bacia hidrográfica: Estudo de caso no trecho paulista do
Rio Paraíba do Sul. Dissertação ( Mestrado em Planejamento Urbano e Regional)Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, 2006.
PEREIRA, C. C. G. F., SMITH, W. S., ESPÍNDOLA, E. L. G, ROCHA, O. Alterações
Tróficas nas Espécies de Peixes em Decorrência da Construção de Reservatórios
em Cascata no Médio e Baixo Tietê. In: ESPÍNDOLA, E. L. G, ROCHA, O. Recursos
Hidroenergéticos. Usos, Impactos e Planejamento Integrado, São Carlos: Ed.
Rima, 2002.
PICKLES, G.; JEFFEERY, D.; ROSSMANN, M. G. Some preliminary results for
crystal structure of LDH. J. Molec. Biol. v.9, p. 598-600,1964.
PORTO, M. S. A. Indicadores de estresse em peixes da amazônia: sensibilidade
em face do tipo de estressor. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) Universidade federal do Amazonas - INPA, Manaus, 2005.
RAILO, E.; NIKINMAA, M.;SOIVO,A. Effects of sampling on blood parameters in the
rainbow trout, Salmo gairdneri. Journal Fish Biology, v. 26, 1985.
RANZANI-PAIVA, M.J.T. Características Sangüíneas Da Pirapitinga Do Sul, Brycon
Sp, Sob Condições Experimentais De Criação Intensiva. Brazilian Journal Of
Veterinary Research And Animal Science , São Paulo, v.28, n.2, p.141- 153, 1991
RANZANI-PAIVA, M.J.T, SILVA-SOUZA, A. T. Hematologia De Peixes Brasileiros.
In: RANZANI-PAIV A, M.J.T, TAKEMOTO, R. M., LIZAMA, M. DE LOS A.P.
Sanidade De Organismos Aquaticos. [s.l.]:Ed.Varela, 2004.p. 89-120.
RICHARDS, J.G.; HEIGENHAUSER, G.J.F.; WOOD, C,M.; Glycogen phosphorylase
and pyruvate dehydrogenase transformation in white muscle of trout during highintensity exercise. Am J Physiol v.282, p.R828–R836, 2002.
RIGGS, A. Studies of hemoglobins of Amazoniam fishes: na overview. Comparative
Biochemistry and Physiology v.62A, 1979.
ROCHA, R.M.; FLORES, C.Q. The ultrastructure of the hematopoietic tissue in the
head kidney of matrinxã, Brycon cephalus Günther, 1869 (Teleostei – Characidae).
Acta Microscopica. Supl. B, p. 207-208, 2001
ROCHA, C. F. D.; BERGALLO, H. G.; VAN SLUYS, M.; ALVES, M. A. S. Biologia
da Conservação: Essências, São Carlos: RIMA, 2006.
SAMPAIO, F. G.; BOIJINK, C. L., OBA, E T.; SANTOS, L. R. B.; KALININ, A. L.;
RANTIN, F. T. Antioxidant defenses and biochemical changes in pacu (Piaractus
mesopotamicus) in response to single and combined copper and hypoxia exposure.
Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, v. 147, p. 43–51, 2008.
SANDERS, D. L., MEEUWING, J. J., VICENT, A. C. J. Freshwater protected areas:
strategies for conservation. Conservation Biology, v.16, n.1, p. 30-41, 2002
SANTOS, L.R.B. Efeito da dieta suplementada com vit. E e Cobre nas respostas
metabólicas e antioxidantes de matrinxã, Brycon cephalus, frente à hipóxia.
Dissertação ( Mestrado em Ciências Fisiológicas) - Universidade de São Carlos,
2006 .
SCHULTE, P. M. Environmental adaptations as windows on molecular evolution.
Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular
Biology, v. 128, n.3, p.597-611, 2004.
SCHWANTES, M. L. B.; Padrões eletroforéticos da desidrogenase láctica (LDH)
em serpentes. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Instituto de
Biociências da USP, São Paulo, 1970.
SCHWANTES, M. L. B.; SCHWANTES, A. R. Eletrophoretic studies on polyploid
amphibians.
III.
Lack
of
locus
duplication
evidences
throug h
tetraploidization.Comp.Biochem.Physiol.,v.57B, p.341-351,1977.
SCHWANTES, M.L. e SCHWANTES, A. R. Adaptative features of ectothermic
enzymes. Temperature effects on the malate dehydrogenase from a temperate fish,
Leiostomus xanthurus. Comparative Biochemistry and Physiology B, v.72, p.4958, 1982.
SHAKLEE, J. B.; CHRISTIANSEN, J. A.; SIDELL, B. D.; PROSSER, C. L. ; WHITT,
G. S. Molecular aspects of temperature acclimation in fish : Contributions of changes
in enzyme activities and isozyme patterns to metabolic reorganization in the green
sunfish. J.Exp. Zool., v.201, p.1-20, 1977.
SHAW, C. R; PRASAD, R. Starch gel electrophoresis of enzymes. A compilation of
recipes. Biochem.Genet., v.4, p. 297- 320, 1970.
SMITHIES, O. Zone electrophoresis in starch gels: group variatons in the serum
proteins of normal human adults. Biochem. J. v.61, p. 629 - 641,1955.
SOARES, M. G. M., MENEZES, N. A., JUNK, W. J. Adaptation of fish species to
oxygen depletion in a central Amazonian floodplain lake. Hydrobiologia, v.568, p.
353-367, 2006.
SOMERO, G. N. Proteins and temperature. Annu. Rev. Physiol., v.57, p.43-68,
1995.
SOMERO, G. N. Protein adaptations to temperature and pressure: complementary
roles of adaptive changes in amino acid sequence and internal milieu. Comparative
Biochemistry and Physiology B, v.136, p. 577-591, 2003.
SOMERO, G. N. Adaptation of enzymes to temperature: searching for basic
strategies. Comparative Biochemistry and Physiology B, v.139, p.321-333, 2004.
STRYER, L. Bioquímica. 4. ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1996.
SUAREZ, R. K; MOMMSEN, T. P. Gluconeogenesis in teleost fishes. Can. J. Zool.
v.65, p.1869 – 1882, 1987.
TAVARES-DIAS, M. J.; MELO, F. B.; MORAES, G.; De MORAES, F. R.
Características hematológicas de teleósteos brasileiros variáveis do jundiá Rhamdia
Quelen ( Pimelodidae). Ciência Rural, v.32, n.4, p.693-698, 2002.
TAVARES-DIAS, M. e MORAES, F. R. Hematologia de Peixes Teleósteos. 1. ed.,
Ribeirão Preto, Vilimpress , 2004.
TAVARES-DIAS, M. e MORAES, F. R. Hematologia de Peixes Teleósteos. Ed. do
autor, Ribeirão Preto, 2004 ROCHA, R.M.; FLORES, C.Q. The ultrastructure of the
hematopoietic tissue in the head kidney of matrinxã, Brycon cephalus Günther, 1869
(Teleostei – Characidae). Acta Microscopica. Supl. B, p. 207-208, 2001.
TERVONEN, V.; VUOLTEENAHO, O.; NIKINMAA, M. Haemoconcentration via
diuresis in short-term hypoxia: A possible role for cardiac natriuretic peptide in
rainbow trout. Comp. Bioch.and Phys. A, v. 144, p.86-92, 2006
TUNDISI, J. G. Água no Século XXI: Enfrentando a Escassez . 2. ed. São Carlos,
Rima, 2005.
VAL, A.L., AMEIDA-VAL, V. M. F, AFFONSO, E.G. Adaptative features of Amozon
fishes: hemoglobins, hematology,intraerythrocytic phosphates and whole blood Bohr
effect of Pterygoplichthys multiradiatus (Siluriformes). Comparative Biochemistry
Physiology, part B v.97 (3), 1990.
VAL, A. L. e AMEIDA-VAL, V. M. F. Fishies of the Amazon and their Environment.
Physiological and Biochemical aspects. Zoophysiology, Heidelberg, v.32, 1995.
VAL, A. L. Surviving low oxygen levels: lessons from fishes of the Amazon. In: VAL,
A. L.; ALMEIDA-VAL, V. M. F. Biology of Tropical Fishes. Manaus, Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA,1996. p.217-227.
VAL, A. L.; ALEMIDA-VAL, V. M. F. Biology of Tropical Fishes. 2. ed. Manaus,
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia -INPA, 1999.
VAL, A. L.; SILVA, M. N. P.; ALMEIDA-VAL, V. M. F. Estresse em Peixes-Ajustes
Fisilogicos e Distúrbios Orgânicos. In: RANZANI-PAIVA, M. J. T.; TAKEMOTO, R.
M.; LIZAMA, M. de los A. P. Sanidade de Organismos Aquáticos. [s.l.]:Ed. Varela,
2004.
VAN RAAIJ, M.T. M.; PIT, D. S. S.; BALM, P. H. M.; STEFFENS, A. B.; VAN
DENTHILLART, G. E. E. J. M. Behavioral strategy and the physiological stress
response in raibow trout exposed to severe hypoxia. Hom. Behav. v.30, p. 85-92,
1996.
VILLE, C. A.; WALKER JR, W. F.; BARNES, R. D. Zoologia Geral. 6 ed. Rio de
Janiro, Guanabara Koogan, 1988.
WALKER, I. Prediction or evolutions? Somatic plasticity as a basic, physiological
condition for the viability of genetic mutations. Acta Biotheoretica, v. 44, p. 165-168.
1997.
WASKO, A.P., GALETTI Jr., P.M., Mapping 18S ribosomal genes in fish of the genus
Brycon (Characidae) by fluorescence in situ hybridization (FISH). Genet. Mol. Biol.
v.23, p.135– 138, 2000.
WASKO, A.P., MARTINS, C., WRIGHT, J.M., GALETTI Jr., P.M. Molecular
organization of 5S rDNA in fishes of the genus Brycon. Genome v.44, p.893– 902,
2001.
WELLS, R. M. G., BALDWIN, J.; SEYMOUR, R. S.; CHRISTIAN, K., BRITTAIN, T.
Red Blood Cell function and haematology in two tropical freshwater fishes from
Australia. Comparative Biochemistry and Phhysiology, Part A v.141, 2005.
WEYTS, F.A.A.; COHEN, N.; FLINK, G.; VERBURG –Van KEMENADE, B.M.L.
Interactions between the immune system and the hypothalamo-pituitary-interrenal
axis in fish. Fish Shellfish Immunol. v.9, p.1 -20, 1999.
WHITT, G. S. Genetic variation of supernatant and mitochondrial malate
dehydrogenase isozymes in the Teleost Fundulus heteroclitus. Experientia, v.26,
p.734 – 736, 1970.
WILSON, F.R.; WHITT, G.S.; PROSSER, C.L. Lactate dehydrogenase and malate
dehydrogenade patterns in tissues of temperature acclimated goldfish (Carassius
arautus). Comp. Biochem.Physiol., v.46B, p.105 – 116, 1973.
WU, R.S.S., Eutrophication, trace organics and water-borne athogens:pressing
problems and challenge. Marine Pollution Bulletin, v.39, p.11–22, 1999.
WU, R. S. S, ZHOU, B. S., RANDALL, D. J., WOO, N.Y.S., LAM, P. K. S. Aquatic
Hypoxia is an Endocrine Disruptor and Impairs Fish Reproduction. Environ. Sci.
Technol. v.37, p.1137, 2003.
WU, R. S. S. Hypoxia: from molecular responses to ecosystem responses. Mar.
Pollution Bull., v.45, p.35-45, 2002.
WURTS, W.A.; DURBOROW, R.M. Interactions of pH, carbon dioxide, alkalinity and
hardness in fish ponds. Aquaculture program.. 1992. 4p..[ SRAC-public n .464].
ZINK, M. W.; SHAW, D. A. Regulation of Malic Isozymes and Malic Dehydrogenase
in Neurospora crassa. Can.J.Microbiol., v.14, p. 907 - 912. 1968.
ZUBER, H. Temperature adaptation of lactate dehydrogenase structural, functional
and genetic aspects. Biophys. Chem., v.29, p.171-179. 1988.
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