ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS
Técnicas Imunológicas
Ensaios Hormonais
BIOMEDICINA FIEL
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações imunoquímicas
Reação - ANTÍGENO + ANTICORPO –
princípio básico: detecção deste complexo

Reação química especial

Reconhecimento do antígeno (depende do tipo de
antígeno a ser pesquisado))



Superfície da célula
Disperso em solução
Parâmetros que dependem do Anticorpo Utilizado

Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de
anticorpo)

Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de
anticorpo)



Afinidade
Avidez
Diversidade
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Classificação dos
Imunoensaios
Classificação
REAGENTES Precipitação
NÃO
MARCADOS Aglutinação de
Partículas
REAGENTES
MARCADOS
Sinalizador
Nenhum
Látex, gelatina
Céluas
Radio-imunoensaio
Radioisótopos
Enzimáticos
Enzimas
Fluorescentes
Quimioluminescentes
visual (olho nu)
turbidez,
nefelometria
visual (olho nu)
contagem de
partículas
Contagem fótons
Sensibilidade
Automatizável?
10 microgramas/mL
Não
5 microgramas/mL
Não
5 picogramas/mL
Não
Espectrofotometria
Fluorometeia
0,1 picogramas/mL
Contagem fótons
Fluorometria
Fluoróforos
5 picogramas/mL
Contagem fótons
Compostos
Fluorometria
5 picogramas/mL
quimioluminescentes Contagem fótons
Combinados (Axsym) Combinados
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
Deteção do
sinal
Combinados
PATOLOGISTA-CLÍNICO
variável
SIM
SIM
SIM
SIM
Reações de Precipitação
QUANTIFICAÇÃO dos complexos formados pela reação
Antígeno+anticorpo que se precipitam no meio.
Reação Antígeno x Anticorpo é REVERSÍVEL

O precipitado se dissolve quando há excesso de um dos
componentes: FENÔMENO PR0-ZONA
Desnecessária separação do complexo
antígeno+anticorpo (fase ligada) das
substâncias livres no meio
COMPLEXO ANTÍGENO-ANTICORPO pode
ser quantificado:




visualmente a olho nu
visualmente usando um microscópio
por medida da turbidez (turbidimetria)
quantificado por nefelometria
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Precipitação
Fatores interferentes:



Concentrações do antígeno e do
anticorpo presentes no “sistema”
(amostra+reagente)
Outros fatores físico-químicos (temperatura, pH)
Precipitação máxima: concentrações
equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac)
Sensibilidade:

10 microgramas/mL
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Precipitação
Direta Clássica
triagem inicial p/ SÍFILIS OU LUES




VDRL – Venereal Desease Research Laboratory
RPR – Reagina Plasmática Rápida
RPS - Reagina Para Sífilis
medido nestas reações:
 presença de anticorpos para o material lipoproteico das
células danificadas pela doença.
 presença de anticorpos para a cardiolipina dos
Treponemas
Métodos não treponêmicos e INESPECÍFICOS
Sensibilidade:




78% na fase primária (74 a 87%)
100% na fase secundária
95% na fase latente (88 a 100%)
71% na fase tardia (37 a 94%)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Precipitação
DERIVADAS
MANUAIS




Imunodifusão
Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese)
Imunofixação
Eletroimunodifusáo

UTILIZADAS EM LABORATÓRIOS DE PESQUISA
AUTOMATIZADAS

NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA

UTILIZADAS EM GRANDES LABORATÓRIOS
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Nefelometria e Turbidimetria
Possibilidade de Automação total
Nefelômetros
Equipamentos de bioquímica (turbidimetria)
Dosagem de proteínas em sangue e outros
fluidos (exemplo LCR)






Alfa 1 glicoproteína ácida (mucoproteína)
Fator Reumatóide
Microalbumina
Proteína C Reativa
Apoliproproteína
inúmeras outras substâncias (imunoglobulinas,
transferrina etc)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Aglutinação
Formação de agregados grandes de
partículas com múltiplos determinantes
antigênicos interligados por pontes moleculares
de anticorpos;
Ligação: sítios antigênicos iguais em diferentes
partículas
Detectam tanto a presença de IgM quanto de
IgG
Visualização: depende do tamanho dos
agregados formados
Pode ser realizadas em placas, tubos ou
lâminas:
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Reações de Aglutinação
Fatores interferentes:
Classe do Anticorpo
envolvido;
Eletrólitos;
Macromoléculas
Hidrofílicas;
Enzimas;
pH (6 a 8);
Tempo;
Temperatura
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Falso Negativas
Quantidade pequena de
anticorpos:

a partícula ficar com o anticorpo preso ‘a
sua superfície (sensibilizada), não
formando pontes e não aglutinando;
Quantidade muito grande de
anticorpos (fenômeno Pró-zona)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS
1.
Determinantes antigênicos Naturais:
Eritrócitos humanos – determinação grupo
sangüíneo ABO
Bactérias – SLIDEX meningites
Protozoários
2. Partículas inertes revestidas
Látex (mais comum) – teste de gravidez
Gelatina
Betonita, polipeptídeos
3.
Células antigenicamente não relacionadas
Células revestidas com antígenos solúveis: ou com
antígenos solúveis adsorvidos ou fixados
Hemácias e bactérias
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Aglutinação: Técnicas mais Utilizadas
Aglutinação direta : ex teste de gravidez
Aglutinação passiva
Hemaglutinação direta: ABO RH
Hemaglutinação indireta: Toxoplasmose
Hemaglutinação Passiva
Inibição de Hemaglutinação
Inibição de Hemaglutinação passiva
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunofluorescência
Manual 1
Baseia-se na capacidade das moléculas de
anticorpo se ligarem covalentemente a
fluocromos, mantendo a especificidade
contra o antígeno.
Reagentes Utilizados:



Anticorpos Marcados (Fluocromos – Isotiocianato
de Fluoresceína* )
Glicerina Alcalina
Corantes (Azul de Evans)
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunofluorescência
Manual 2 - DIRETA
A reação Ag-Ac é detectada pela
emissão de fluorescência
Pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico
conjugado a substância fluorescente
(conjugado)*
microscópio de fluorescência
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Imunofluorescência
Manual 3 – IFI - INDIRETA
A- pesquisa de antígeno
• amostra (Ag??) + Ac específico ®Ag-Ac *
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• microscópio de fluorescência
• * lavagens
B- pesquisa de anticorpos
• Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac??) ® Ag-Ac *
• Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
• microscópio de fluorescência
• determinação do título e classe do Ac
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOS
classificação tipo de reação (cinética)
COMPETITIVOS

Há competição entre a substância presente na
amostra (ou o padrão) e outro marcado com
alguma substância geradora de sinal, por uma
quantidade limitada de anticorpos específicos –
variante: Radioimunoensaio (RIA).
NÃO COMPETITIVOS:

São utilizados dois anticorpos, um ligado à fase
sólida e outro marcado com alguma substância
geradora de sinal, que se ligam a SUBSTÂNCIA em
estudo - Mais preciso e reprodutível, e possui
níveis de sensibilidadeanalítica superiores.
Desvantagem, precisam ter dois epítodos.
Variante: Imunométrico
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Competitivo ou não
Competitivo:


Não Competitivo
Quanto maior a
concentração do
analito menor a
contagem do sinal
Amostras positivas
tem leitura abaixo do
valor limiar ou “cutoff”
DAISY DE SOUZA ARAÚJO


Quanto maior a
concentração do
analito maior a
contagem do sinal
Amostras positivas
tem leitura acima do
valor limiar ou “cutoff”
PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:
COMPETITIVOS

anticorpo primário na fase sólida – (pag

anticorpo secundário na fase sólida – (pag
963) e antígeno marcado
964) e antígeno marcado
NÃO COMPETITIVOS
SEQUENCIAL
 SANDUÍCHE

DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:
CLASSIFICAÇÃO TIPOS / SIGLAS
Marcador radioativo:
 Radioimunoensaio (RIE)
 Imunorradiométrico (IRMA)
Marcador enzimático Enzimaimunoensaio (EIA)
 ELISA - Ensaio imunoenzimático
 MEIA - Ensaio imunoenzimático de micropartículas
Marcador FLUORESCENTE
 Imunofluorométrico (IFMA)
 FPIA – Fluorescence polarization immunoassay
 ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay
Marcador QUIMIOLUMINESCENTE
 Quimioluminescência convencional EQL,
Eletroquimioluminescência (ECLIA)
 Ensaio imunológico quimioluminescente magnético
CMIA
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS:
Fatores Interferentes:
Reação cruzada: Ocorrem devido a, baixa
especificidade dos anticorpos utilizados e o uso
de anticorpos policlonais.
Presença de Anticorpos
Heterófilos: Resultados falso positivos ou
altos em pacientes transplantados ou submetidos
a tratamento com antoicorpos monoclonais
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS
Fatores interferentes II
Contagem de fundo elevada
(Background) Leituras mais elevadas do
que as reais por ligação inespecífica de
constituintes do soro ao suporte sólido,
lavagens inadequadas ou conjugados de
pobre afinidade.
Efeito HooK Resultados menores do que
o esperado na quantificação de substâncias
que na realidade encontram- se elevadas,
bloqueando a ligação.
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores
RADIOATIVOS – RIA, RIE, IRMA
pouco usado na rotina: exige profissional
com credenciamento na CNEN (curso de seis
meses em São Paulo)
um dos componentes do sistema é marcado
com isótopo radioativo
ensaios competitivos : o reagente marcado é = à
substância que se quer dosar (antígeno)
(RIA/RIE)
 ensaios não competitivos: o reagente marcado é
um segundo anticorpo (IRMA)
O radioisótopo mais utilizado é o I125 (57,5 dias)

DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores
ENZIMÁTICOS – EIA, ELISA, MEIA, ELFA
EIA –
Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimático
ELISA -
MEIA
Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay
– Microparticule Enzyme Immuno Assay
ou Ensaio imunoenzimático de micropartículas
ELFA
– Enzyme- Linked Fluorescent Assay:
Ensaio imuno-enzimático fluorescente
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
ETAPAS ELISA, EIA
sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição
de Ag ou do Ac
bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite
desnatado) *
adição da amostra (em diluente) *
adição do conjugado: anticorpo purificado marcado
com enzima (ex: peroxidase) *
adição do substrato cromogênico: peroxidase: H2O2
(substrato) + OPD (ortofenilenodiamina)
interrupção da reação: SDS ou ácido forte
leitura: leitor de ELISA
* lavagens
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
EIA – ELISA
Vantagens e Desvantagens
Sensibilidade, especificidade e simplicidade
da técnica;
Cuidados com interferentes, reações
cruzadas
Versatilidade, rapidez, baixo custo e
objetividade da leitura;
Erros operacionais, variáveis analíticas
Adaptação a diferentes graus de automação
Instabilidade dos reagentes
Influência em manipulações e do
equipamento
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores
FLUORESCENTES – MEIA, ELFA, FPIA
MEIA
– Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio
imunoenzimático de micropartículas (detecção é fluorescente
– Axsym) (ABBOTT)
ELFA
– Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-
enzimático fluorescente
IFMA: Immuno FluoroMetric Assay ou ensaio
Imunofluorométrico
FPIA: Fluorescence Polarization ImmunoAssay
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
Ensaios com marcadores
FLUORESCENTES
Utilizam enzimas com substratos
Fluorescentes
Utilizam aparelhos denominados de
Fluorômetros;
As técnicas diferem quanto ao suporte sólido
As técnicas diferem também á forma de
ampliar o sinal;
 Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA
Possui sensibilidade e especificidades
elevadas;
Bom método para dosagens hormonais
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
QUIMIOLUMINESCÊNCIA I
Reação entre o Ag/Ac, marcada com
fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato
Quimioluminescente gerando um produto
instável o qual após estabilização gera
emissão de fótons de luz medida por FM, que
tem a função de transformar a luz emitida
pelos fótons em impulsos elétricos(CPS).
São reações de oxidação ►luz no espectro
visível;
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
QUIMIOLUMINESCÊNCIA II
A sensibilidade de um método enzimático
aument cerca de dez vezes mais substituindo
um substrato cromogênico por um luminescente;
É a emissão de luz produzida em algumas
reações químicas envolvendo moléculas que
emitem luz, quando passam do estado de
excitação para o basal eletrônico;
São altamente sensíveis;
Método de escolha para quantificação de
substâncias, como hormônios e marcadores
tumorais.
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
Pra que serve??? Qual vantagem?
1. UTILIDADES:
 Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3,
CA-19-9, CEA, AFP)
 HORMÔNIOS
 DOENÇAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites,
 VITAMINAS
 DOSAGEM DE IGE TOTAL
 HOMOCISTEÍNA
2. VANTAGENS:
Sensibilidade – 10 x maior na troca de substrato
cromogênico por um luminescente
DAISY DE SOUZA ARAÚJO
PATOLOGISTA-CLÍNICO