Enzygnost* HBe monoclonal
Enzyme immunoassay for the detection of hepatitis Be antigen and of
antibodies to hepatitis Be antigen in serum and plasma
Enzymimmunoassay zum Nachweis von Hepatitis Be-Antigen und
Antikörpern gegen das Hepatitis Be-Antigen in Serum und Plasma
Test immunoenzymatique pour la recherche de l’antigène e et de
l'anticorps anti-antigène e de l’hépatite B dans le sérum ou le plasma
Test immunoenzimatico per l'identificazione dell'antigene HBe
dell'epatite B e degli anticorpi anti-HBe nel siero e nel plasma
Prueba inmunoenzimática para la detección del antígeno de la
hepatitis Be y de anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis Be en
sueros y plasmas
Teste imunoenzimático para determinação do antígeno da hepatite Be
e de anticorpos contra o antígeno da hepatite Be no soro e plasma
English:
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2
to
10
Deutsch:
Seite
11
bis
19
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28
Italiano:
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29
fino
37
Español
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38
hasta
46
Português:
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47
a
55
Summary of Test Procedure
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10
Kurzanleitung Testdurchführung
Seite
19
La technique en bref
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28
Istruzioni in breve, esecuzione del Test
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37
Resumen de la técnica
Página
46
Resumo da técnica
Página
55
Bibliography/Literatur/Littérature/
Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
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OQDM G11 C0541 (904) CS
1
Edition February 2004
Enzygnost* HBe monoclonal
Intended Use
Enzyme immunoassay for the detection of hepatitis Be antigen and of antibodies to hepatitis Be antigen in
serum and plasma.
The enzyme immunoassay is processed using the BEP® II, BEP® III and BEP® 2000 ELISA processors. The
test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. The product is for in vitro diagnostic
use only. The product is for in vitro diagnostic use only.
Summary and Explanation
HBe antigen and the corresponding antibody anti-HBe are found exclusively in connection with hepatitis B virus
infection. The HBe antigen is frequently indicative of an acute infection but also occurs in chronic hepatitides (1,
2). HBe antigen appears already in the early phase of a hepatitis B infection. Using a sensitive immunoassay,
it can be detected shortly after or sometimes almost at the same time as the increase in serum HBsAg (3, 4).
The titre of the two antigens, HBsAg and HBeAg, rises rapidly during the phase of virus multiplication. However,
unlike HBsAg, the levels of HBe antigen usually drop below the limit of detection of even very sensitive test
systems within 6 to 10 weeks after their initial appearance (4, 5). During this period it is also possible to detect
other serological parameters of liver disease (e.g. elevated transaminases).
In those cases in which HBeAg persists in the serum beyond the normal elimination time - always accompanied
by persistence of HBsAg - the patient is likely to develop chronic aggressive hepatitis (6, 7). For this reason,
monitoring of the HBeAg levels in acute hepatitis B virus infection has a high importance with regard to the
prognosis (8, 9).
In hepatitis B patients without complications in the clinical course, HBeAg is no longer detectable once the phase
of convalescence has begun. A negative HBeAg result can, however, be obtained not only in this post-infectious
phase but also prior to peak virus replication in the early phase of acute infection (1, 2, 10). The appearance of
anti-HBe provides a basis for differentiating between these two phases. Seroconversion from "HBeAg positive"
to "anti-HBe positive" is a favourable sign indicative of convalescence and an uncomplicated course. Such
patients may nevertheless remain HBsAg carriers and can develop chronic persistent hepatitis (7, 11).
Positive detection of anti-HBe without concurrent detection of HBsAg and HBeAg points to a past hepatitis B
virus infection (5).
Principle of the Method
Detection of HBeAg
The enzyme immunoassay for the detection of HBe antigen in the serum or plasma is based on the sandwich
principle. HBe antigen in the sample binds to monoclonal anti-HBe antibodies bound to the surface of the wells
in the microtitration plate. Unbound sample constituents are then removed by washing, peroxidase-conjugated monoclonal antibodies to HBeAg are added and bind to the remaining free antigen determinants.
The excess conjugate is washed out, hydrogen peroxide substrate with chromogen is added and reacts with
the bound peroxidase producing a blue colour. This enzymatic reaction is stopped by the addition of Stopping
Solution POD and the resulting yellow colour is measured. The resultant colour intensity is proportional to the
concentration of HBeAg in the sample.
Detection of Anti-HBe
In the test for anti-HBe, anti-HBe antibodies in the sample block the HBeAg pipetted with the HBeAg Reagent, positive.
When the resulting mixture is then used in the HBeAg test, no HBeAg or minimal HBeAg is detected if the sample is
positive for anti-HBe. The colour intensity of the sample is inversely proportional to the concentration of anti-HBe.
Limit of detection of the test
With the Paul-Ehrlich-Institut reference preparation, Enzygnost* HBe monoclonal exhibits a limit of detection
of ≤ 1.5 U/mL for HBeAg and of ≤ 1 U/mL for anti-HBe.
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2
Edition February 2004
Reagents
Materials provided
Enzygnost* HBe monoclonal
1 x 96
Enzygnost* HBe monoclonal (test plate)
Anti-HBe/POD Conjugate (monoclonal)
HBeAg Reagent, positive
Anti-HBe Control, positive
HBe Control, negative
Washing Solution POD (Concentrate)**:
Buffer/Substrate TMB**:
Chromogen TMB**:
Stopping Solution POD**:
Empty bottle for Working Chromogen Solution
Adhesive foils
PE-bag
Barcode table
Instuctions for use
1 test plate
1 x 13 mL
1 x 13 mL
1 x 1.5 mL
1 x 2.5 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pcs.
6 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
** These components are also included in the Supplementary Reagents Kit for Enzygnost* TMB (code No. OUVP).
Composition
Enzygnost* HBe monoclonal (test plate): Microtitration plate coated with monoclonal antibodies to HBeAg
Anti-HBe/POD Conjugate (monoclonal): Monoclonal anti-HBe, conjugated with peroxidase (POD)
Preservative:
phenol (max. 1 g/L)
HBeAg Reagent, positive: Genetically engineered HBe antigen, stabilized with bovine serum albumin and
®
Synperonic , lyophilized
Nominal absorbance: see "Validation" section;
concentration: 8 ± 5 U HBeAg/mL after reconstitution
Preservative:
phenol (max. 1 g/L)
Anti-HBe Control, positive: Human serum containing monoclonal antibodies to HBe antigen, nominal absorbance: see "Validation" section,
concentration:
30 ± 20 U anti-HBe/mL
Preservative:
phenol (max. 1 g/L)
HBe Control, negative: Negative human serum for the HBeAg and anti-HBe tests; nominal absorbances: see
"Validation" section
Preservative:
phenol (max. 1 g/L)
Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution (90 mmol/L) containing Tween (18 g/L)
Preservative:
phenol (max. 1 g/L)
Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/L) in acetate buffer solution (25 mmol/L).
Preservative:
1-butanol (max. 10 mL/L)
Chromogen TMB: Tetramethyl benzidine dihydrochloride (5 g/L)
Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera is tested for HBsAg, anti-HCV,
anti-HIV1 and anti-HIV2. Only donations with negative findings are used for manufacture.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human
blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous
material(12).
3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.
4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour
at +121 °C. All aspirated liquids should be collected in two receptacles connected in series, which should
both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and
times specified by the manufacturer must be observed.
Preparation of the Reagents
Bring all reagents and samples to +18 to +25 °C before the start of the test, without removing the test plate
from the container.
For each test plate, dilute 20 mL Washing Solution POD to 400 mL with distilled or demineralized water.
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3
Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 mL Chromogen TMB with 10 mL Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit and store closed and protected from light. Rinse the
bottle thoroughly with distilled water after use.
For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB
vial and the full contents of the Buffer/Substrate TMB vial.
Working solution of HBeAg reagent, positive: Before the test reconstitute a vial of HBeAg Reagent, positive with 13 mL distilled or demineralized water. Shake gently to mix and ensure that the reagent has completely dissolved before use (approx. 30 min.)
Storage and Stability
Stored unopened at +2 to +8 °C, all components of the Enzygnost* HBe monoclonal test kit may be used up to
the dates of expiry given on the labels.
For complete stability and storage data see Table 1 in the Appendix.
Materials required but not provided
Equipment required:
For automatic dispensing of reagent and washing
BEP® II:
BEP® III:
For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation
For fully automatic processing and evaluation of the test
BEP® 2000:
Pipettes:
piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µL.
Incubator:
Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods
All the equipment used in the test must have been validated.
Specimens
Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma) obtained by
standard laboratory techniques.
The samples should be stored for not more 3 days at 2 - 8 ° C. If the samples are to be stored for a longer
period of time, they must be frozen.
Procedure
Procedure for HBeAg test using the BEP® II (Detection of HBeAg)
1. Pipetting scheme: Ascertain the number of wells required (number of samples to be investigated plus 6
wells for controls). Remove from the holder any strips which are not required for the test and store for later
use (See Table 1 for stability data).
2. Dispense samples: Pipette 100 µL/well HBe Control, negative into 4 wells (A1 to D1), 100 µL of HBeAg
Reagent, positive into the next well and then fill the following wells with 100 µL/well of undiluted sample. At
the end of the series / plate pipette 100 µL of HBeAg Reagent, positive once more.
As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the HBeAg Reagent, positive
twice at the start of the series.
Pipetting scheme: Pipette 100 µL/well of HBe Control, negative into 4 wells, 100 µL/well HBeAg Reagent,
positive, into 2 wells (E1 and F1), and fill the subsequent wells with 100 µL/well of the test samples and
cover with foil.
3. Incubate: Incubate at 37 ± 1 °C for 60 ± 2 min.
4. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 2x with approx. 0.3 mL/well of diluted washing
solution (see Note). Proceed immediately to the "Dispense conjugate" step.
5. Dispense conjugate: Fill each well with 100 µL of Anti-HBe/POD Conjugate, cover with fresh foil and
immediately place into the incubator.
6. Incubate: Incubate at 37 ± 1 °C for 60 ± 2 minutes, then proceed immediately to the "Wash" step.
7. Wash: Remove the foil and wash 4 times as described in "4. Wash".
8. Dispense substrate: Pipette 100 µL of the Working Chromogen Solution into each well and cover the
plate with fresh foil.
9. Incubate: Incubate at +18 to +25 °C for 30 ± 2 minutes, protected from light.
10. Stop reaction: Remove the foil and add 100 µL of Stopping Solution POD to each well, keeping to the
same timing as in "8. Dispense substrate".
11. Read: At 450 nm within one hour.
The use of a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams) is to be recommended.
The absorbances of the control samples and patient samples are to be measured at a wavelength of 450 nm.
The wavelength recommended for the reference reading is 650 nm (if necessary between 615 and 690 nm).
Procedure for Anti-HBe test using the BEP® II (Detection of Anti-HBe)
1. Pipetting scheme: Ascertain the number of wells required (number of samples to be investigated plus 6
wells for controls). Remove from the holder any strips which are not required for the test and store for later
use (See Table 1 for stability data).
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4
2. Dispense samples: Pipette 25 µL/well HBe Control, negative into 4 wells (A1 to D1), 25 µL of Anti-HBe
Control, positive into the next well and then fill the following wells with 25 µL/well of undiluted sample. At
the end of the series / plate pipette 25 µL of Anti-HBe Control, positive once more.
As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the HBe Control, positive
twice at the start of the series.
Pipetting scheme: Pipette 25 µL/well of HBe Control, negative into 4 wells, 25 µL/well Anti-HBe Control,
positive, into 2 wells (E1 and F1), and fill the subsequent wells with 25 µL/well of the test samples.
3. Binding of the anti - HBe: Directly after dispensing the samples, add 75 µL of HBeAg Reagent, positive,
(working solution) into each well containing the 25 µL of sample or control, then seal with foil.
Perform the subsequent steps as described for the HBeAg test, i.e. continue processing starting at "3. Incubate".
Test procedure using the BEP® III
Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 at "Test
procedure with the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with
adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6
test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP® III instruction manual).
The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the BEP® II for
technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP® III.
Test procedure using the BEP® 2000
The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically by the
analyzer (see BEP® 2000 instruction manual).
Validation
The individual absorbance readings for the control sera are used to calculate the mean absorbance values if:
Anti-HBe test
HBeAg test
-0.010 ≤ Aneg. ≤ 0.100
Apos. ≥ 0.800
Aneg. ≥ 0.400
-0.010 ≤ Apos. ≤ 0.150
If one absorbance value of the negative controls is If one absorbance value of the negative controls is
outside these limits, this value can be neglected.
outside these limits, this value can be neglected.
Both absorbance values of the HBeAg Reagent, posi- If one absorbance value of the Anti-HBe Control, positive is outside these limits, this value can be neglective must comply.
ted.
If these conditions are not fulfilled, the relevant test must be repeated.
Evaluation
The evaluations are performed automatically if the BEP® 2000 or BEP® III is used. Please consult the relevant
instruction manuals. The following sections apply if the measurements are carried out without using a software.
HBe test
Calculate the mean absorbance
value of the negative controls,
then calculate the cut-off value
by adding 0.050:
_
Aneg + 0.050 = cut-off
Anti-HBe test
Calculate the mean absorbance
value of the negative controls,
then calculate the cut-off value
by multiplication with 0.5:
_
Aneg x 0.5 = cut-off
Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows:
Test result for HBeAg
Test result for anti-HBe
1. Asample < cut-off - 10%
= HBeAg negative
2. cut-off -10% ≤ Asample ≤ cut-off +10%
= HBeAg equivocal
3. Asample > cut-off + 10%
= HBeAg positive
1. Asample > cut-off + 10%
= anti-HBe negative
2. cut-off -10% ≤ Asample ≤ cut-off +10%
= anti-HBe equivocal
3. Asample < cut-off -10 %
= anti-HBe positive
Samples with equivocal results must be retested but in double determinations. If in the retest the mean value
of the double determination is greater than or equal to the cut-off, or less than the cut-off, the initial equivocal
result can be ignored and the sample considered reactive or negative as appropriate.
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Limitations of the Procedure
1. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate have no effect on the test result.
2. Samples that are lipaemic, icteric or contain rheumatoid factors do not impair the test results.
3. Haemolytic Samples may exhibit false-high reactivity.
4. Samples containing IgM antibodies to EBV / HAV / measles virus as well as samples containing ANA do
not interfere with the test result.
5. Sample from haemophilia patients were not observed to interfere with the test result.
6. Sample from dialysis patients as well as samples positive for autoantibodies may exhibit elevated reactivity.
7. Incompletely coagulated sera and microbially contaminated test samples should not be used.
8. Heat-inactivated samples (1 h, 56 °C) cannot be used as the resulting denaturation of the HBe antigen
produces lower values in the antigen test.
9. If thawed samples are used, ensure that the material is thoroughly homogenized.
10. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other kits unless
the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the
pack and given in the enclosed barcode table). Washing Solution POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this requirement. Note that the Working Chromogen Solution
must first be prepared from matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB
from kits with a different number).
11. Buffer/Substrate TMB, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be allowed to
come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts
which are in direct contact with the liquid). The substrate reaction steps must not be performed in the
vicinity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has spontaneously
developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the aforementioned
solutions is to be avoided.
12. During the incubation steps the test plate should be protected from vibration (e.g. placed on a secured
flotation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostatted water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken
that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with the solutions since such
contamination can lead to unspecific reactions.
13. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has
no effect on the test result.
14. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance
and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they
may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate
modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade
Behring Application Sheets or these instructions for use.
15. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history, clinical
presentation and other findings.
Specific Performance Characteristics
Sensitivity and specificity
The results of the sensitivity and specificity studies are summarized in Tables 2 + 4 (in the Appendix).
In establishing the sensitivity of the test 216 HBeAg pos. samples and 224 anti-HBe pos. samples were
investigated in two independent studies. The mean sensitivity results are as follows:
Sensitivity
Enzygnost* HBe monoclonal
initially reactive
retest reactive
98.1 %
99.1 %
97.8 %
99.1 %
HBeAg version
Anti-HBe version
In establishing the specificity of the test 2502 HBeAg neg. samples and 2406 anti-HBe neg. samples were
investigated in two independent studies. The mean specificity results were as follows:
Specificity
Enzygnost* HBe monoclonal
initially negative
retest negative
99.4 %
99.5 %
99.6 %
99.8 %
HBeAg version
Anti-HBe version
Deviations from these values may occur due to differences in sample population, test procedure, etc.
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6
Reproducibility
The results on intra/inter-assay reproducibility are summarized in Table 5 (see Appendix). The data shown are
typical values. Differences can, however, be expected depending on factors such as procedure, etc.
*
Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries.
BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries.
Synperonic is a registered Trademark of ICI.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor: Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
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7
0197
Tab. 1 Storage and Stability
Enzygnost* HBe monoclonal
Material/reagent
Enzygnost* Anti-HBe monoclonal
(Test plate)
Anti-HBe/POD Conjugate mcl.
once opened
HBeAg Reagent, pos.
after reconstitution
Anti-HBe Control, pos.
HBe Control, negative
Chromogen TMB
Buffer/Substrate TMB
Working Chromogen Solution
once opened
Washing Solution POD (concentrate)
Stopping Solution POD
•
State
once opened
once opened
once opened
1 + 10
undiluted
once opened
1:20
1:20
once opened
Storage
+2 to +8°C
in the bag
with the desiccant
+2 to +8°C
+18 to +25 °C
+2 to +8 °C
-20 °C
+2 to +8 °C
-20 °C
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+18 to +25°C
in closed container
protected
from light
Stability•
4 weeks
+2 to +8°C
+2 to +8°C
+18 to +25 °C
+2 to +8°C
expiry date
1 week
1 day
expiry date
4 weeks
2 days
4 weeks
3 months
4 weeks
3 months
expiry date
expiry date
5 days
8 hours
use each component by the expiry date at the latest
Tab. 2 Sensitivity
The sensitivity studies performed at two independent centres (K, M) yielded the following data:
Sample panel
(M) HBeAg pos.
(K) HBeAg pos.
Enzygnost* HBe monoclonal
Number of samples initially reactive
retest reactive
109
108
109
107
104
105
(M) anti-HBe pos.
(K) anti-HBe pos.
96
128
93
126
95
127
Tab. 3 Tricky Panel
Sample panel
HBeAg pos.
anti-HBe pos.
Enzygnost* HBe monoclonal
Number of samples initially reactive
retest reactive
65
59
59
112
105
107
These panels contain mainly samples from the transitional phase for HBeAg/anti-HBe. The diminished sensitivity values may be due to the formation of immune complexes.
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8
Tab. 4 Specificity
The specificity studies performed at three independent centres (K, M, L) yielded the following data:
Sample panel
(M) normal neg. sera
normal neg. plasma samples
(K) normal neg. sera
(L) neg. sera from
non-HBV patients
neg. sera from HBV patients
critical sera••
Number
of samples
804
396
528
584
(M) normal neg. sera
normal neg. plasma samples
(K) normal neg. sera
(L) neg. sera from
non-HBV patients
neg. sera from HBV patients
critical sera••
Enzygnost* HBe
monoclonal
initially
retest
reactive
reactive
3
3
0
0
0
0
8
7
124
66
791
387
521
572
5
0
2
1
1
1
3
0
1
0
1
0
78
57
4
1
2
1
HBeAg
version
Anti-HBe
version
•• Samples containing potential trouble factors, e.g. autoantibodies, haemolytic and icteric samples.
Tab. 5 Reproducibility
In the studies on reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each of 5 days. The coefficients
of variation (CV’s) were calculated using the variance component model.
Sample
F1
F2
F3
Sample
F1
F2
F3
OQDM G11 C0541 (904) CS
Mean
absorbance
0,036
0,102
0,282
HBeAg version
Intra-assay
Inter-assay
%CV
%CV
6,4
11,4
3,8
9,3
4,1
8,7
Mean
absorbance
1,421
0,808
0,458
Anti-HBe version
Intra-assay
Inter-assay
%CV
%CV
3,6
6,3
3,2
3,4
7,4
4,4
9
Tab. 6 Test procedure and programming steps
Enzygnost* HBe monoclonal
HBeAg/Anti-HBe test
Menu programming
Test procedure
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
for the
BEP® II
Prepare reagents
HBeAg
100 µL
sample/control
®
BEP® 2000 OPERATE 1
BEP III
Anti-HBe
75 µL
HBeAg-Reagent, positive
in the case of partially
filled plates: Add "waterfilled strips" to
half fill the plates
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
Wash 2x: BEP® II
100 µL conjugate
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
Wash 4x: BEP® II
Fully automatic
processing
NO
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
0
NO
0
0
0
NO
YES
DISPENSE
HBEAGREAGENT
0
NO
0
075
3
NO
OPERATE 2
YES
WASH AND DISPENSE
CONJUGATE
WASHINGS
2
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
WASH AND DISPENSE
CHROMOGEN
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISPENSE STOPPING SOLUTION
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µL Working
Chromogen Solution
30 min ± 2 min
(+18 to +25 °C
protected from light)
100 µL Stopping Solution
after maxi. 1 h
Read at 450 nm
(Referene wavelength: 650 nm)
Test result
OQDM G11 C0541 (904) CS
HBeAg Anti-HBe
25 µL
®
BEP II
HBeAg
MENU NO
Anti-HBe
10
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0,100
0,050
YES
450
650
NO
4
NO
4
--0,400
0,5
0,150
-----
Enzygnost* HBe monoclonal
Anwendungsbereich
Enzymimmunoassay zum Nachweis von Hepatitis Be-Antigen und Antikörpern gegen das Hepatitis Be-Antigen in Serum und Plasma
Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP® II, BEP® III und BEP®
2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das
Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden.
Diagnostische Bedeutung
HBe-Antigen und der entsprechende Antikörper Anti-HBe werden ausschließlich im Zusammenhang mit einer
Hepatitis B-Virus-Infektion gefunden. Das HBe-Antigen kann häufig eine akute Infektion anzeigen, ist aber
auch bei chronischen Hepatitiden vorhanden (1, 2). HBe-Antigen erscheint bereits in der Frühphase einer
Hepatitis-B-Infektion. Es ist kurz nach oder manchmal nahezu gleichzeitig mit dem Anstieg des HBsAg im
Serum mittels eines empfindlichen Immunoassays nachweisbar (3, 4).
Der Titer der beiden Antigene, HBsAg und HBeAg, steigt während der Phase der Virusvermehrung schnell an.
Die Konzentration des HBe-Antigens fällt jedoch früher als die des HBs-Antigens - in der Regel 6 bis 10
Wochen nach seinem Auftreten - unter die Nachweisgrenze selbst sehr empfindlicher Testsysteme ab (4, 5).
Solange HBeAg im Serum zirkuliert, sind auch andere serologische Parameter einer Lebererkrankung (z. B.
erhöhte Transaminasen) nachweisbar.
In den Fällen, in denen HBeAg über die normale Eliminationszeit im Serum persistiert - stets mit einer HBsAgPersistenz verbunden - ist mit dem Auftreten einer chronischen aggressiven Hepatitis zu rechnen (6, 7). Aus
diesem Grund ist die Verlaufskontrolle des HBeAg bei einer akuten Hepatitis-B-Virus-Infektion von wichtiger
prognostischer Bedeutung (8, 9).
Nach dem Beginn der Heilungsphase einer komplikationsfrei verlaufenden Hepatitis-B-Virus-Infektion ist
HBeAg nicht mehr nachweisbar. Ein negativer HBeAg-Befund kann allerdings nicht nur in dieser postinfektiösen Phase, sondern auch in der Frühphase einer akuten Infektion vor der maximalen Virusreplikation erhalten
werden (1, 2, 10). Anhand des Auftretens von Anti-HBe können diese beiden Phasen unterschieden werden.
Die Serokonversion von „HBeAg-positiv“ zu „Anti-HBe-positiv“ ist ein prognostisch günstiges Zeichen bezüglich Rekonvaleszenz bzw. unkompliziertem Verlauf. Ein solcher Patient kann dennoch weiterhin HBsAg-Träger bleiben und eine chronisch-persistierende Hepatitis entwickeln (7, 11).
Der positive Nachweis von Anti-HBe ohne den gleichzeitigen Nachweis von HBsAg und HBeAg weist auf eine
länger zurückliegende Hepatitis-B-Virus-Infektion hin (5).
Prinzip der Methode
Nachweis von HBeAg
Der Enzym-Immuno-Assay zum Nachweis von HBe-Antigen im Serum oder Plasma ist nach dem Sandwich-Prinzip
aufgebaut. Das in der Probe vorhandene HBe-Antigen bindet sich an monoklonale Anti-HBe-Antikörper, die an der
Oberfläche der Vertiefungen der Mikrotitrationsplatten fixiert sind. Nach Auswaschen werden in einer zweiten Reaktion Peroxidase-konjugierte monoklonale Anti-HBe-Antikörper an die noch freien Antigendeterminanten gebunden.
Nach Entfernung von überschüssigem Konjugat durch Waschen wird die gebundene Enzymaktivität des Konjugates bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von Substrat und Chromogen (blaue Farbreaktion) wird
durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe
vorhandenen HBeAg-Konzentration proportional.
Nachweis von Anti-HBe
Beim Anti-HBe-Nachweis blockieren in der Probe vorhandene Anti-HBe-Antikörper das mit dem HBeAg-Reagenz, positiv zugefügte HBeAg. Im anschließend durchgeführten HBeAg-Nachweis ist bei Anti-HBe-positiven
Proben kein oder wenig HBeAg nachweisbar. Die Farbintensität der Probe ist der vorhandenen Anti-HBeKonzentration umgekehrt proportional.
Nachweisgrenze des Tests
Bei Verwendung des Referenz-Präparats des Paul-Ehrlich-Instituts liegt die Nachweisgrenze von Enzygnost*
HBe monoclonal für HBeAg bei ≤ 1,5 U/ml und für Anti-HBe bei ≤ 1 U/ml.
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Ausgabe Februar 2004
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
Enzygnost* HBe monoclonal
1 x 96
Enzygnost* HBe monoclonal (Testplatte):
1 Testplatte
Anti-HBe/POD-Konjugat (monoclonal):
1 x 13 ml
HBeAg-Reagenz, positiv:
1 x 13 ml
Anti-HBe-Kontrolle, positiv:
1 x 1,5 ml
HBe-Kontrolle, negativ:
1 x 2,5 ml
Waschlösung POD (Konzentrat)**:
1 x 100 ml
Puffer/Substrat TMB**:
1 x 30 ml
Chromogen TMB**:
1 x 3 ml
Stopplösung POD**:
1 x 100 ml
Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung
1 Stück
Abklebefolien
6 Stück
PE-Beutel
1 Stück
Barcodewertetabelle
1 Stück
Packungsbeilage
1 Stück
** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell.-Nr. OUVP).
Zusammensetzung
Enzygnost* HBe monoclonal (Testplatte): Mit monoklonalen Antikörpern gegen HBeAg beschichtete Mikrotitrationsplatte
Anti-HBe/POD-Konjugat (monoclonal): Monoklonales Anti-HBe, Peroxidase (POD)-konjugiert
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1g/l)
HBeAg-Reagenz, positiv: gentechnologisch hergestelltes HBe-Antigen, stabilisiert mit Rinderserumalbumin
®
und Synperonic , lyophilisiert,
Extinktionsrichtwert: siehe Validierung, Konzentration: 8 ± 5 U HBeAg/ml nach Rekonstitution
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Anti-HBe-Kontrolle, positiv: Humanserum mit monoklonalen Antikörpern gegen HBe-Antigen, Extinktionsrichtwert: siehe Validierung, Konzentration: 30 ± 20 U Anti-HBe/ml
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
HBe-Kontrolle, negativ: Negatives Humanserum für den HBeAg- und Anti-HBe-Nachweis, Extinktionsrichtwerte: siehe Validierung
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige (18 g/l) Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l)
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung (25 mmol/l)
Konservierungsmittel:
1-Butanol (max. 10 ml/l)
Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid (5 g/l)
Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung
2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontroll-Sera vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf
Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden (12).
3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten.
4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln.
Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden.
Vorbereitung der Reagenzien
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25°C erwärmen.
Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen.
Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen.
Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche
verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach
Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen.
Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Überführen des gesamten Flascheninhalts von Chromogen
TMB in die Abfüllung Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.
HBeAg-Reagenz, positiv-Gebrauchslösung: Vor Testbeginn eine Abfüllung HBeAg-Reagenz, positiv mit
13 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser rekonstituieren. Dabei leicht schütteln und auf vollständiges
Lösen achten (ca. 30 min).
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Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Ungeöffnet sind alle Bestandteile des Enzygnost* HBe monoclonal-Testkits bei einer Lagertemperatur von
+2 bis +8 °C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar.
Die Haltbarkeiten und Lagerungsbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsfertig verdünnten Reagenzien
sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen.
Zusätzlich benötigte Materialien
Erforderliche Geräte
Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte
BEP® II:
Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung
BEP® III:
®
BEP 2000:
Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung
Pipetten:
Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µl.
Inkubator:
Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden.
Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.
Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollen maximal 3 Tage bei 2 - 8 °C
gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren.
Testdurchführung
Testdurchführung mit BEP® II (HBeAg-Nachweis)
1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben
plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen
entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).
2. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 100 µl HBe-Kontrolle, negativ (A1 bis D1), in eine Vertiefung 100
µl HBeAg-Reagenz, positiv, in die folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe und am Ende der
Serie bzw. Testplatte noch einmal 100 µl HBeAg-Reagenz, positiv dosieren.
Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, das HBeAg-Reagenz, positiv zweimal zu Beginn der Testreihe aufzutragen.
Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 100 µl HBe-Kontrolle, negativ, in 2 Vertiefungen je 100 µl HBeAgReagenz, positiv (E1 und F1), nachfolgend dann je 100 µl der zu untersuchenden Proben dosieren und mit
Folie abkleben.
3. Proben-Inkubation: 60 ± 2 min bei 37 ± 1 °C inkubieren.
4. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml verdünnter Waschlösung
2mal waschen (siehe Hinweis). Konjugat-Dosierung unmittelbar anschließen.
5. Konjugat-Dosierung: Je Vertiefung 100 µl Anti-HBe/POD-Konjugat einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen.
6. Konjugat-Inkubation: 60 ± 2 min bei 37 ± 1 °C inkubieren, danach den Waschvorgang unmittelbar anschließen.
7. Waschen: Folie abziehen und wie unter 4. beschrieben, 4mal waschen.
8. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit
neuer Folie abkleben.
9. Substrat-Inkubation: 30 ± 2 min bei + 18 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren.
10. Stoppreaktion: Folie entfernen, je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 8 einhalten.
11. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren.
Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert.
Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen.
Testdurchführung mit BEP® II (Anti-HBe-Nachweis)
1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben
plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen
entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).
2. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 25 µl HBe-Kontrolle, negativ (A1 bis D1), in eine Vertiefung 25 µl
Anti-HBe-Kontrolle, positiv, in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Probe und am Ende der
Serie bzw. Testplatte noch einmal 25 µl Anti-HBe-Kontrolle, positiv dosieren.
Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die Anti-HBe-Kontrolle, positiv zweimal zu Beginn der Testreihe aufzutragen.
Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 25 µl HBe-Kontrolle, negativ, in 2 Vertiefungen je 25 µl Anti-HBeKontrolle, positiv (E1 und F1) und anschließend je 25 µl der zu untersuchenden Proben vorlegen.
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3. Bindung des Anti-HBe: Unmittelbar nach der Probendosierung in jede Vertiefung, in der 25 µl Probe bzw.
Kontrolle vorgelegt sind, 75 µl HBeAg-Reagenz, positiv-Gebrauchslösung zudosieren und mit Folie abkleben.
Die nachfolgenden Arbeitsschritte analog der Testdurchführung für den HBeAg-Nachweis durchführen, d. h.
die Abarbeitung mit Punkt 3. „Proben-Inkubation“ fortsetzen.
Testdurchführung mit BEP® III
Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 und 2
der „Testduchführung BEP® II“) vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten
offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte
Testplatten mit „Wasserriegeln“ auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung).
Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination
BEP®III/Enzygnost* validiert worden.
Testdurchführung mit BEP® 2000
Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP® 2000Bedienungsanleitung).
Testvalidierung
Die Einzelmeßwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte eingesetzt,
wenn gilt:
HBeAg-Nachweis
Anti-HBe-Nachweis
-0,010 ≤ Eneg ≤ 0,100
Epos ≥0,800
Eneg ≥ 0,400
-0,010 ≤ Epos ≤ 0,150
Von den Extinktionswerten der negativen Kontrollen Von den Extinktionswerten der negativen Kontrollen
kann ein außerhalb der Spezifikationen liegender
kann ein außerhalb der Spezifikationen liegender
Wert vernachlässigt werden.
Wert vernachlässigt werden.
Die Extinktionswerte des HBeAg-Reagenz, positiv
müssen beide die Spezifikation erfüllen.
Von den Extinktionswerten der Anti-HBe-Kontrolle,
positiv kann ein außerhalb der Spezifikation
liegender Wert vernachlässigt werden.
Werden diese Spezifikationen nicht erfüllt, ist der jeweilige Test zu wiederholen.
Testauswertung
Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen
heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten.
HBe-Nachweis
Anti-HBe-Nachweis
Zum Extinktionsmittelwert
der negativen Kontrollen
wird zur Berechnung des
Grenzwertes ein Wert von
0,050 addiert:
_
Eneg + 0,050 = Grenzwert (cut off)
Der Extinktionsmittelwert
der negativen Kontrollen
wird zur Berechnung des
Grenzwertes mit dem Faktor
0,5 multipliziert:
_
Eneg x 0,5 = Grenzwert (cut off)
Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:
Testergebnis für HBeAg
Testergebnis für Anti-HBe
1. EProbe
< cut off - 10 %
1. EProbe
> cut off + 10 %
= HBeAg-negativ
= Anti-HBe-negativ
2. cut off - 10 % ≤ E Probe ≤ cut off + 10 %
2. cut off - 10 % ≤ E Probe ≤ cut off + 10 %
= HBeAg-grenzwertig
= Anti-HBe-grenzwertig
> cut off + 10 %
3. EProbe
< cut off - 10 %
3. EProbe
= HBeAg-positiv
= Anti-HBe-positiv
Zur Abklärung eines grenzwertigen Ergebnisses muß die Probe erneut, diesmal jedoch in Doppelbestimmung, getestet werden. Ist in der Wiederholungstestung der Mittelwert der Doppelbestimmung größer oder
gleich dem Grenzwert bzw. kleiner als der Grenzwert, so kann das initial grenzwertige Ergebnis vernachlässigt und die Probe als reaktiv bzw. negativ betrachtet werden.
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Einschränkungen der Testdurchführung
1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht.
2. Lipämische, rheumafaktorhaltige oder ikterische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung.
3. Bei hämolytischen Proben kann nicht ausgeschlossen werden, dass sie zu erhöhter Reaktivität führen.
4. Proben mit IgM-Antikörpern gegen EBV, HAV, Masern-Virus sowie ANA-haltige Proben beeinflussen das
Testergebnis nicht.
5. Mit Proben von Hämophilie-Patienten wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
6. Proben von Dialyse-Patienten sowie Auto-Antikörper positive Proben können erhöhte Reaktivität zeigen.
7. Ungenügend geronnene Seren und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden.
8. Hitzeinaktivierte Proben (1 h, 56°C) führen durch Denaturierung des HBe-Antigens bei der Antigen-Bestimmung zu erniedrigten Werten und können deshalb nicht verwendet werden.
9. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.
10. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen
Chargen-Bezeichnungen (Ch.-B.), die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind.
11. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit
Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Ein spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die
Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen.
Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.
12. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z. B. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht
zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden
Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da
dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten.
13. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.
14. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen
oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade
Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren.
15. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen
Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Leistungsmerkmale des Tests
Sensitivität und Spezifität
Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 + 4 (im Anhang) zusammengefaßt.
Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden 216 HBeAg pos. Proben und 224 Anti-HBe pos. Proben in 2 unabhängigen Studien untersucht. Die mittleren Sensitivitäten stellen sich wie folgt dar:
Sensitivität
Enzygnost* HBe monoclonal
initial reaktiv
retest reaktiv
98,1 %
99,1 %
97,8 %
99,1 %
HBeAg-Version
Anti-HBe-Version
Bei der Ermittlung der Spezifität wurden 2502 HBeAg neg. Proben und 2406 Anti-HBe neg. Proben in 2
unabhängigen Studien untersucht. Die mittleren Spezifitäten stellen sich wie folgt dar:
Spezifität
Enzygnost* HBe monoclonal
initial negativ
retest negativ
99,4 %
99,5 %
99,6 %
99,8 %
HBeAg-Version
Anti-HBe-Version
Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich.
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Reproduzierbarkeit
Die Ergebnisse zur Intra-Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 5 (im Anhang) zusammengefaßt.
Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u. a. sind abweichende Werte möglich.
*
Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen
Ländern.
BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen
Ländern.
Synperonic ist eine eingetragenee Marke von ICI.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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0197
Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Enzygnost* HBe monoclonal
Material/Reagenz
Enzygnost® Anti-HBe monoclonal
(Testplatte)
Zustand
nach Öffnen
Anti-HBe/POD-Konjugat mcl.
nach Öffnen
HBeAg-Reagenz, pos.
n. Rekonstitut.
Anti-HBe-Kontrolle, pos.
HBe-Kontrolle, negativ
Chromogen TMB
Puffer/Substrat TMB
Chromogen-Gebrauchslösung
nach Öffnen
Waschlösung POD(Konzentrat)
unverdünnt
nach Öffnen
1 : 20
1 : 20
nach Öffnen
Stopplösung POD
nach Öffnen
nach Öffnen
1 + 10
Lagerung
+2 bis +8 °C
im Beutel mit
Trockenkapseln
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
+2 bis +8 °C
-20 °C
+2 bis +8 °C
-20 °C
+2 bis +8 °C
+2 bis +8 °C
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
geschlossenes
Gefäß, lichtgeschützt
Stabilität•
4 Wochen
+2 bis + 8 °C
+2 bis + 8 °C
+18 bis +25 °C
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
1 Woche
1 Tag
bis Verfallsdatum
4 Wochen
2 Tage
4 Wochen
3 Monate
4 Wochen
3 Monate
bis Verfallsdatum
bis Verfallsdatum
5 Tage
8 Stunden
• in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum
Tab. 2 Sensitivität
Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden an zwei unabhängigen Zentren (K, M) folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
(M) HBeAg pos.
(K) HBeAg pos.
(M) anti-HBe pos.
(K) anti-HBe pos.
Probenanzahl
109
107
96
128
Enzygnost* HBe monoclonal
initial reaktiv
retest reaktiv
108
109
104
105
93
95
126
127
Probenanzahl
65
112
Enzygnost* HBe monoclonal
initial reaktiv
retest reaktiv
59
59
105
107
Tab. 3 Tricky Panel
Probenkollektiv
HBeAg pos.
anti-HBe pos.
Diese Kollektive setzen sich mehrheitlich aus Proben aus dem HBeAg/Anti-HBe-Übergangsbereich zusammen. Die verringerten Werte für die Sensitivität können auf die Bildung von Immunkomplexen zurückgeführt
werden.
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Tab. 4 Spezifität
Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an drei unabhängigen Zentren (K, M, L) folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
(M) normal neg. Seren
normal neg. Plasmen
(K) normal neg. Seren
(L) neg. Seren von
Nicht-HBV-Patienten
neg. Seren von HBV-Patienten
kritische Seren••
Probenanzahl
804
396
528
584
(M) normal neg. Seren
normal neg. Plasmen
(K) normal neg. Seren
(L) neg. Seren von
Nicht-HBV-Patienten
neg. Seren von HBV-Patienten
kritische Seren••
Enzygnost* HBe
monoclonal
initial
retest
reaktiv
reaktiv
3
3
0
0
0
0
8
7
124
66
791
387
521
572
5
0
2
1
1
1
3
0
1
0
1
0
78
57
4
1
2
1
HBeAgVersion
Anti-HBeVersion
•• Proben mit potentiellen Störfaktoren, z. B. Autoantikörper, hämolytische und ikterische Proben.
Tab. 5 Reproduzierbarkeit
Bei der Untersuchung zur Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung
getestet. Die Berechnung der Variationskoeffizienten (VK) erfolgt nach dem Varianzkomponentenmodell.
Probe
F1
F2
F3
Probe
F1
F2
F3
OQDM G11 C0541 (904) CS
Extinktionsmittelwert
0,036
0,102
0,282
HBeAg-Version
Intra-assay
Inter-assay
%VK
%VK
6,4
11,4
3,8
9,3
4,1
8,7
Extinktionsmittelwert
1,421
0,808
0,458
Anti-HBe-Version
Intra-assay
Inter-assay
%VK
%VK
3,6
6,3
3,2
3,4
7,4
4,4
18
Tab. 6 Testdurchführung und -programmierung
Enzygnost* HBe monoclonal
HBeAg-/Anti-HBe-Nachweis
Menüprogrammierung
Testdurchführung
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
für den
BEP® II
Vorbereitung der Reagenzien
HBeAg
100 µl
Probe bzw. Kontrolle
®
BEP II
HBeAg
MENU NO
Anti-HBe
BEP® 2000 OPERATE 1
Anti-HBe
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
2 x Waschen: BEP® II
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
0
NO
0
0
0
NO
YES
DOSIERUNG
HBEAGREAGENZ
0
NO
0
075
3
NO
OPERATE 2
YES
WASCHEN UND DOSIERUNG
KONJUGAT
teilbestückte Platten mit WASHINGS
2
„Wasserriegeln“ auf halbe
ASPIRATE
NO
Platten ergänzen
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
100 µl Konjugat
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
4 x Waschen: BEP® II
automatische
Testabarbeitung
OPERATE 3
YES
WASCHEN UND DOSIERUNG
CHROMOGEN
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DOSIERUNG STOPPLÖSUNG
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl ChromogenGebrauchslösung
30 min ± 2 min
(+18 bis +25 °C
lichtgeschützt)
100 µl Stopplösung
nach maximal 1 h
Auswertung 450 nm
(Referenzwellenlänge: 650 nm)
Testergebnis
OQDM G11 C0541 (904) CS
NO
25 µl
BEP III
75 µl
HBeAg-Reagenz, positiv
HBeAg Anti-HBe
19
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0,100
0,050
YES
450
650
NO
4
NO
4
--0,400
0,5
0,150
-----
Enzygnost* HBe monoclonal
Domaine d'utilisation
Test immunoenzymatique pour la recherche de l’antigène e et de l'anticorps anti-antigène e de l’hépatite B
dans le sérum ou le plasma
Le test immunoenzymatique s’effectue à l’aide des ELISA Processors BEP® II, BEP® III et BEP® 2000. Il a été
mis au point pour l’analyse d’échantillons individuels et non pas d’échantillons poolés. Les réactifs ne peuvent
être utilisés qu’à des fins de diagnostic in vitro.
Intérêt diagnostique
L’antigène HBe et les anticorps anti-HBe correspondants sont exclusivement trouvés lors d'infections par le
virus de l’hépatite B. L’antigène HBe indique souvent une infection aiguë, mais est également trouvé dans les
hépatites chroniques (1, 2). L’antigène HBe apparaît dès la phase précoce de l’hépatite B. Il peut être mis en
évidence juste avant ou parfois simultanément à l’apparition de l’AgHBs dans le sérum, révélé par un test
immunoenzymatique sensible (3, 4).
Le titre des deux antigènes AgHBs et AgHBe augmente rapidement pendant la phase de la multiplication
virale. La concentration de l’AgHBe chute cependant plus rapidement que celle de l’antigène HBs -en règle
générale 6 à 10 semaines après son apparition-, et se trouve alors en-dessous du seuil de mise en évidence
des tests même les plus sensibles (4, 5). Tant que l’AgHBe circule dans le sérum, d’autres paramètres sérologiques des maladies hépatiques (par ex. les transaminases augmentées) peuvent être mis en évidence.
Dans les cas où l’AgHBe persiste dans le sérum au-delà du temps d’élimination normal -toujours accompagné
d’un AgHBs persistant-, il faut s’attendre à l’apparition d’une hépatite agressive chronique (6, 7). Ceci explique
que le contrôle d’évolution de l’AgHBe dans une hépatite B aiguë soit important pour le pronostic (8, 9).
En phase de guérison d’une hépatite B d'évolution favorable, l’AgHBe ne peut plus être mis en évidence. Un
résultat négatif en AgHBe peut d’ailleurs être trouvé non seulement dans cette phase post-infectieuse, mais
également à la phase précoce d’une infection aiguë avant la réplication maximale du virus (1, 2, 10).
L’apparition d’anti-HBe permet de différencier ces deux phases. Une séroconversion d’«AgHBe-positif» en
«anti-HBe-positif» est de pronostic favorable pour l'évolution vers la guérison. Un tel patient peut cependant
rester porteur d’AgHBs et développer une hépatite chronique persistante (7, 11).
La mise en évidence d’anti-HBe non accompagnée d’AgHBs ni d’AgHBe indique une hépatite B ancienne (5).
Principe de la méthode
Recherche d’AgHBe
Le test immunoenzymatique pour la recherche de l'antigène HBe dans le sérum ou le plasma est basé sur le
principe sandwich. L’antigène HBe contenu dans l’échantillon à tester se lie aux anticorps monoclonaux anti-HBe
fixés à la surface des cupules de la plaque de microtitration. Après lavage et dans une deuxième réaction, les
anticorps anti-HBe monoclonaux conjugués à la peroxydase se fixent aux déterminants antigéniques encore libres.
L’excès de conjugué est éliminé par lavage, puis l'activité enzymatique du conjugué fixé est mesurée. La
transformation enzymatique du substrat (réaction colorée bleue) est stoppée par l’addition d’acide sulfurique
dilué (réaction colorée jaune). L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d’antigène HBe
de l’échantillon.
Recherche d’anti-HBe
Dans la recherche d’anti-HBe, les anticorps anti-HBe présents dans l’échantillon bloquent l’AgHBe ajouté
contenu dans le Réactif HBeAg positif. Dans les échantillons trouvés anti-HBe-positifs et testés ultérieurement
pour une recherche d’AgHBe, on ne révèle pas ou peu d’AgHBe. L’intensité de la coloration est inversement
proportionnelle à la concentration d’anti-HBe de l’échantillon.
Seuils de mise en évidence du test
La préparation de référence de l’Institut Paul-Ehrlich a donné pour le test Enzygnost* HBe monoclonal les
seuils de mise en évidence suivants : ≤ 1,5 U/ml pour l’AgHBe et ≤ 1 U/ml pour l’anti-HBe.
OQDM G11 C0541 (904) CS
20
Edition Février 2004
Réactifs
Contenu du coffret
Enzygnost* HBe monoclonal
1 x 96
Enzygnost* HBe monoclonal (plaque-test):
Conjugué anti-HBe/POD (monoclonal) :
Réactif HBeAg positif:
Contrôle anti-HBe positif :
Contrôle HBe négatif :
Solution de lavage POD (concentrée)** :
Tampon/substrat TMB** :
Chromogène TMB** :
Solution d’arrêt POD** :
Flacon vide pour solution d’emploi du chromogène :
Feuilles adhésives :
Sachet PE :
Tableau de codes à barres :
Fiche technique :
1 plaque-test
1 x 13 ml
1 x 13 ml
1 x 1,5 ml
1 x 2,5
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 pièce
6 pièce
1 pièce
1 pièce
1 pièce
** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB (code
OUVP).
Composition
Enzygnost* HBe monoclonal (plaque-test) : plaque de microtitration recouverte d’anticorps monoclonaux
anti-AgHBe
Conjugué anti-HBe/POD (monoclonal) : anti-HBe monoclonal, conjugué à la peroxydase (POD)
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Réactif HBeAg positif : antigène HBe obtenu par génie génétique, stabilisé avec de l’albumine sérique
bovine et du Synperonic®, lyophilisé,
Densité optique indicative : cf. Validation ; concentration : 8 ± 5 U d'AgHBe/ml après reconstitution
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Contrôle anti-HBe positif : sérum humain contenant des anticorps monoclonaux anti-antigène HBe ; densité
optique indicative : cf. Validation; concentration : 30 ± 20 U d’anti-HBe/ml
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Contrôle HBe négatif : sérum humain AgHBe et anti-HBe-négatif ; densité optique indicative : cf. Validation
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Solution de lavage POD (concentrée) : solution tampon phosphate (90 mmol/l) additionnée de Tween (18 g/l)
Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l)
Tampon/substrat TMB : peroxyde d’hydrogène (env. 0,1 g/l) en solution tampon acétate (25 mmol/l)
Agent de conservation : 1-butanol (max. 10 ml/l)
Chromogène TMB : tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure (5 g/l)
Solution d’arrêt POD : acide sulfurique 0,5 N
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro
2. Tout don de sang prévu pour la préparation des sérums de contrôle est soumis à des tests de dépistage
d’AgHBs, d’anti-VHC, d’anti-VIH1 et d’anti-VIH2. Seuls les dons trouvés négatifs sont utilisés.
Indépendamment de cela, tout produit obtenu à partir de sang humain doit être manipulé avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure totalement tout
risque d’infection(12).
3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test.
4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à +121°C.
Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un à l’autre et contenant
chacun un désinfectant spécialement conçu pour inactiver les virus pathogènes pour l’homme. Respecter
les concentrations et temps d’incubation indiqués par le fabricant.
Préparation des réactifs
Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25°C avant le début du test, sans sortir la plaque-test de son
emballage.
Pour une plaque, diluer 20 ml de Solution de lavage POD avec de l’eau distillée ou désionisée en complétant
à 400 ml.
Pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon
plastique vide inclus dans le coffret (solution d’emploi du chromogène) et conserver la solution, le flacon
fermé, à l’abri de la lumière. Après utilisation, bien rincer le flacon à l’eau distillée.
OQDM G11 C0541 (904) CS
21
Pour des raisons de capacité du flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d'un flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB.
Solution d'emploi du Réactif HBeAg positif : avant le début du test, reconstituer le contenu d'un flacon de
Réactif HBeAg positif avec 13 ml d'eau distillée ou désionisée. Agiter avec précaution et attendre la dissolution complète (env. 30 min.).
Stabilités et conditions de conservation
Tous les éléments non ouverts du coffret Enzygnost* HBe monoclonal se conservent à +2/+8 °C jusqu’à la
date indiquée sur leur étiquette.
Pour les stabilités et conditions de conservation des réactifs ouverts ou dilués à la dilution d’emploi, se reporter au Tableau 1 en annexe.
Autres réactifs et matériel nécessaires
Matériel nécessaire
pour la distribution automatique des réactifs et l’automatisation des étapes de lavage
BEP® II :
BEP® III :
pour l’automatisation du test après la distribution des échantillons et de l’exploitation des
résultats
pour l’entière automatisation du test et de l’exploitation des résultats
BEP® 2000 :
Pipettes :
pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl.
Incubateur :
bain-marie couvert (+37 ± 1 °C) ou méthode d’incubation équivalente
Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé.
Echantillons à tester
Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA) obtenus
selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à
+2/+8 °C. Pour une conservation plus longue, les congeler.
Réalisation du test
Réalisation du test de recherche d’AgHBe sur le BEP® II (Recherche d’AgHBe)
1. Plan de distribution : déterminer le nombre de cupules nécessaires (nombre d'échantillons à tester + 6
cupules pour les contrôles). Sortir du cadre les barrettes inutiles et les conserver pour un test futur (cf.
Tableau 1).
2. Distribution des contrôles et échantillons : distribuer dans 4 cupules 100 µl de Réactif HBe positif dans
la cupule 5, 100 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupules suivantes, puis de nouveau 100
µl de Réactif HBe positif à la fin de la série ou de la plaque.
Comme alternative au schéma de pipetage indiqué ci-dessus, on peut également déposer le Réactif HBe
positif deux fois en début de série.
Schéma de pipetage : distribuer 100 µl de Contrôle HBe négatif dans les 4 premières cupules, 100 µl de
Contrôle HBe négatif (cupules A1 à D1), dans 2 cupules 100 µl de Réactif HBe positif (cupules E1 et F1),
puis 100 µl de chacun des échantillons à tester dans les cupules suivantes. Couvrir d’une feuille adhésive.
3. Incubation des contrôles et échantillons : laisser incuber 60 ± 2 min heures à +37 ± 1 °C.
4. Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et laver 2 fois avec 0,3 ml de
solution de lavage diluée par cupule (cf. Remarque). Enchaîner immédiatement la distribution du conjugué.
5. Distribution du conjugué : distribuer dans chaque cupule 100 µl de Conjugué anti-HBe/POD, couvrir la
plaque d’une nouvelle feuille adhésive et la placer immédiatement dans l’incubateur.
6. Incubation du conjugué : laisser incuber 60 ± 2 min à +37 ± 1 °C, puis enchaîner immédiatement le
processus de lavage.
7. Lavage : retirer la feuille adhésive et laver 4 fois comme indiqué en 4.
8. Distribution du substrat : ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du chromogène et
couvrir la plaque d’une nouvelle feuille adhésive.
9. Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 °C à l’abri de la lumière.
10. Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de Solution d'arrêt
POD en respectant le même rythme qu’en 8.
11. Mesure : faire une mesure photométrique dans l'heure qui suit à 450 nm.
Il est recommandé d’utiliser un photomètre avec deux longueurs d’onde (une de mesure et une de référence).
La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm. Une longueur
d’onde de référence de 650 nm est recommandée (éventuellement comprise entre 615 et 690 nm).
Réalisation du test de recherche d'anti-HBe sur le BEP® II (Recherche d’anti-HBe)
1. Plan de distribution : déterminer le nombre de cupules nécessaires (nombre d'échantillons à tester + 6
cupules pour les contrôles). Sortir du cadre les barrettes inutiles et les conserver pour un test futur (cf.
Tableau 1).
OQDM G11 C0541 (904) CS
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2. Distribution des contrôles et échantillons : distribuer 25 µl de Contrôle HBe négatif dans 4 cupules
(cupules A1 à D1), 25 µl de Contrôle HBe positif dans la cupule 5, 25 µl de chacun des échantillons non
dilués dans les cupules suivantes, puis de nouveau 25 µl de Contrôle HBe positif à la fin de la série ou de
la plaque.
Comme alternative au schéma de pipetage indiqué ci-dessus, on peut également déposer le Contrôle HBe
positif deux fois en début de série.
Schéma de pipetage : distribuer 25 µl de Contrôle HBe négatif dans les 4 premières cupules, 25 µl de
Contrôle anti-HBe positif dans 2 cupules (cupules E1 et F1), puis 25 µl de chacun des échantillons à tester
dans les cupules suivantes.
3. Fixation de l'Anti-HBe: immédiatement après le dépôt dans chaque cupule de 25 µl d'échantillon ou de
contrôle, ajouter 75 µl de Réactif HBeAg positif à la dilution d'emploi, el couvrir d'une feuille adhésive.
Procéder ensuite comme pour la recherche de l’AgHBe, c’est-à-dire à partir du point 3. «Incubation des contrôles et échantillons».
Réalisation du test sur le BEP® III
Pour une utilisation sur le BEP® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la distribution des
échantillons (points 1 et 2 du paragraphe « Réalisation du test sur le BEP ® II »). Immédiatement après cette
étape, placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une feuille adhésive, dans le BEP ® III. Si la plaque
n’est pas totalement utilisée, la compléter au moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau.
La suite du test est ensuite effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP ® III).
Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP® III peuvent, du fait de conditions techniques (cadence
de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP® II. Ils ont toutefois été validés dans la combinaison BEP® III/
Enzygnost*.
Réalisation du test sur le BEP® 2000
La distribution des échantillons ainsi que toutes les étapes suivantes sont effectuées entièrement automatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP® 2000).
Validation du test
Pour le calcul des valeurs moyennes des sérums de contrôle, utiliser les densités optiques obtenues si :
recherche d’AgHBe
recherche d'anti-HBe
-0,010 ≤ D.O.nég. ≤ 0,100
D.O.pos. ≥ 0,800
D.O.nég. ≥ 0,400
-0,010 ≤ D.O.pos. ≤ 0,150
Pour le contrôle négatif, si une seule valeur
sort du domaine indiqué, ne pas en tenir
compte pour le calcul de la moyenne.
Pour le contrôle négatif, si une seule valeur
sort du domaine indiqué, ne pas en tenir
compte pour le calcul de la moyenne.
Les deux valeurs obtenues pour le Réactif HBeAg
positif doivent être trouvées dans le domaine
indiqué.
Pour le contrôle anti-HBe positif, si une seule valeur
sort du domaine indiqué, ne pas en tenir
compte pour le calcul de la moyenne.
Si ces conditions ne sont pas remplies, le test doit être recommencé.
Exploitation du test
Sur le BEP® 2000 ou le BEP® III, le calcul des résultats se fait automatiquement. Suivre le déroulement du
manuel d’utilisation. Le protocole indiqué ci-après permet l’exploitation des résultats sans aide de logiciel.
recherche d’HBe
recherche d'anti-HBe
pour le calcul de la valeur-seuil,
pour le calcul de la valeur-seuil,
ajouter 0,050 à la valeur
multiplier par 0,5 la valeur
moyenne du contrôle négatif :
moyenne du contrôle négatif :
_
_
D.O. nég. + 0,050 = valeur-seuil (cut off)
D.O. nég. x 0,5 = valeur-seuil (cut off)
Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit :
résultat du test AgHBe
1. D.O.échan
< cut off - 10%
= AgHBe-négatif
2. cut off - 10% ≤ D.O.échan ≤ cut off + 10%
= AgHBe-douteux
3. D.O.échan
> cut off + 10%
=AgHBe-positif
résultat du test anti-HBe
1. D.O.échan
> cut off + 10%
= anti-HBe-négatif
2. cut off - 10% ≤ D.O.échan ≤ cut off + 10%
= anti-HBe-douteux
3. D.O.échan
< cut off - 10%
= anti-HBe-positif
En cas de résultat douteux, retester l'échantillon en double. Si la valeur moyenne du dosage en double est
supérieure ou égale à la valeur-seuil ou inférieure à la valeur-seuil, l'échantillon peut être rendu positif ou
négatif.
OQDM G11 C0541 (904) CS
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Limites du test
1.Les anticoagulants, comme l’héparine, l’EDTA ou le citrate, n’influencent pas le résultat du test.
2.Les échantillons lipémiques, contenant des facteurs rhumatoïdes ou ictériques ne perturbent pas le test.
3.Les échantillons hémolytiques peut provoquer une plus grande réactivité.
4.Les échantillons contenant des anticorps IgM anti-EBV, anti-HAV, anti-virus de la rougeole ou anti-ANA
n’influencent pas le résultat du test.
5.Aucune influence sur les résultats du test n’a été observée avec des échantillons provenant de patients
hémophiles.
6.Les échantillons de patients dyalisés ainsi que les échantillons positifs en auto-anticorps peuvent provoquer une réactivité augmentée.
7.Ne pas utiliser de sérums insuffisamment coagulés ni contaminés.
8.Ne pas utiliser non plus d'échantillons inactivés par la chaleur (1 h à +56°C), car l'inactivation entraîne une
dénaturation de l'antigène HBe et peut provoquer l'obtention de valeurs trop basses lors de la recherche de
l'antigène.
9.Si on utilise des échantillons décongelés, bien veiller à leur homogénéisation.
10.Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la solution
d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le Chromogène TMB et le
Tampon/substat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la combinaison des numéros de lots à 6 chiffres
indiqués sur le coffret et dans le tableau des codes à barres joint.
11. Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi du chromogène et la Solution d'arrêt POD ne doivent pas
entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes (ne pas utiliser de pipettes
à parties métalliques). La réaction du substrat ne doit pas être effectuée à proximité de désinfectants
contenant de l'eau de Javel. Une coloration bleue spontanée de la solution d’emploi du chromogène avant
son transfert dans la plaque indique une contamination ; préparer une nouvelle solution dans un récipient
propre. Éviter tout contact de la peau avec les solutions sus-mentionnées.
12.La plaque doit rester immobile pendant toute l’incubation (la placer par ex. sur un support fixe ou dans un
bain-marie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contact avec l’eau thermostatée. Si
l’eau contient des stabilisateurs pour éviter une contamination, bien veiller à ce que ni la surface supérieure
de la plaque ni l’intérieur des cupules n’entrent en contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions
non-spécifiques.
13. Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent donc devenir trouble,
sans que cela ait d’influence sur le résultat du test.
14. Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser les performances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées par l’utilisateur ne sont
pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où elles peuvent affecter les performances du
système et les résultats des dosages. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ou à l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocoles d’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation.
15. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicaux du
patient, les signes cliniques et autres constatations.
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Caractéristiques du test
Sensibilité et spécificité
Les résultats de l’étude de sensibilité et de spécificité sont résumés dans les tableaux 2 + 4 (en annexe).
Pour déterminer la sensibilité, 216 échantillons HBeAg-positifs et 224 échantillons anti-HBe-positifs ont été
testés dans 2 centres indépendants. Les sensibilités moyennes suivantes ont été obtenues :
Sensibilité
Enzygnost* HBe monoclonal
réactif au test initial
réactif au retest
98,1 %
99,1 %
97,8 %
99,1 %
version HBeAg
version anti-HBe
Pour déterminer la spécificité, 2502 échantillons HBeAg-négatifs et 2406 échantillons anti-HBe-négatifs ont
été testés dans 2 centres indépendants. Les spécificités moyennes suivantes ont été obtenues :
Spécificité
Enzygnost* HBe monoclonal
négatif au test initial
négatif au retest
99,4 %
99,5 %
99,6 %
99,8 %
version HBeAg
version anti-HBe
Selon le collectif étudié ou la réalisation du test par exemple, des valeurs différentes peuvent être trouvées.
Reproductibilité
Les résultats de l'étude de reproductibilité/répétabilité sont résumés dans le tableau 5 en annexe. Il s'agit de
données indicatives. Des différences dans la réalisation du test par exemple peuvent entraîner des valeurs
divergentes.
*
Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans d’autres
pays.
BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans d’autres
pays.
Synperonic est une marque déposée de ICI.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQDM G11 C0541 (904) CS
25
0197
Tabl. 1 : Stabilités et conditions de conservation
Enzygnost* HBe monoclonal
Echantillons/réactifs
état
Enzygnost* anti-HBe monoclonal
après ouverture
(plaque-test)
Conjugué anti-HBe/POD monoclonal
Réactif HBeAg positif
Contrôle anti-HBe positif
Contrôle HBe négatif
Chromogène TMB
Tampon/substrat TMB
Solution d'emploi du chromogène
Solution de lavage POD
(concentrée)
Solution d'arrêt POD
•
conservation
+2/+8 °C
dans sachet avec
capsule dessicative
après ouverture
+2/+8 °C
+18/+25 °C
après reconstitution +2/+8 °C
-20 °C
après ouverture
+2/+8 °C
-20 °C
après ouverture
+2/+8 °C
après ouverture
+2/+8 °C
1/11
+2/+8 °C
+18/+25 °C
dans récipient
fermé à l'abri
de la lumière
non diluée
après ouverture
+2/+8 °C
1/20
+2/+8 °C
1/20
+18/+25 °C
après ouverture
+2/+8 °C
stabilité•
4 semaines
4 semaines
2 jours
4 semaines
3 mois
4 semaines
3 mois
date de péremption
date de péremption
5 jours
8 heures
date de péremption
1 semaine
1 jour
date de péremption
jamais au-delà de la date de péremption
Tabl. 2 Sensibilité
Pour l’étude de sensibilité, les données suivantes ont été obtenues dans deux centres indépendants (K, M):
collectif
d’échantillons
(M) HBeAg pos.
(K) HBeAg pos.
(M) anti-HBe pos.
(K) anti-HBe pos.
nombre
d’échantillons
109
107
96
128
Enzygnost* HBe monoclonal
réactif au test
réactif au retest
initial
108
109
104
105
93
95
126
127
Tabl. 3 Panel d’échantillons problématiques
collectif
d’échantillons
HBeAg pos.
anti-HBe pos.
nombre
d’échantillons
65
112
Enzygnost* HBe monoclonal
réactif au test initial
réactif au retest
59
59
105
107
Ces collectifs sont essentiellement composés d’échantillons en situation de séroconversion HbeAg/Anti-Hbe.
Les valeurs moindres trouvées pour la sensibilité peuvent être dues à la formation d’immuncomplexes.
OQDM G11 C0541 (904) CS
26
Tabl. 4 Spécificité
Pour l’étude de spécificité, les valeurs suivantes ont été obtenues dans trois centres indépendants (K, M, L):
collectif
d’échantillons
(M) sérums négatifs normaux
plasmas négatifs normaux
(K) sérums négatifs normaux
(L) sérums nég. de
patients non-HBV
sérums nég. de patients HBV
sérums critiques••
(M) sérums négatifs normaux
plasmas négatifs normaux
(K) sérums négatifs normaux
(L) sérums nég. de
patients non-HBV
sérums nég. de patients HBV
sérums critiques••
Enzygnost* HBe
monoclonal
nombre
réactif au
réactif au
d’échantillons test reaktiv
retest
804
3
3
396
0
0
528
0
0
584
8
7
124
66
791
387
521
572
5
0
2
1
1
1
3
0
1
0
1
0
78
57
4
1
2
1
version
HBeAg
version
anti-HBe
•• échantillons avec facteurs d’interférence potentiels, par ex. autoanticorps, échantillons hémolytiques ou
ictériques.
Tabl. 5 Reproductibilité
Dans le cadre de l’étude, les échantillons ont été testés 8 fois sur 5 jours. Le calcul des coefficients de variation
(CV) s’est fait par analyse multivariée.
Échantillon
F1
F2
F3
Échantillon
F1
F2
F3
OQDM G11 C0541 (904) CS
valeur moyenne
densité optique
0,036
0,102
0,282
version HBeAg
répétabilité
reproductibilité
%CV
%CV
6,4
11,4
3,8
9,3
4,1
8,7
valeur moyenne
densité optique
1,421
0,808
0,458
version Anti-HBe
répétabilité
reproductibilité
%CV
%CV
3,6
6,3
3,2
3,4
7,4
4,4
27
Tabl. 6 Réalisation et programmation du test
Enzygnost* HBe monoclonal
Recherche de l'AgHBe et de l'anti-HBe
Réalisation du test
Programmation
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
du menu pour le
BEP® II
préparation des réactifs
AgHBe
100 µl
contrôle ou échantillon
BEP® II
AgHBe
MENU NO
anti-HBe
BEP 2000 OPERATE 1
®
Anti-HBe
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
2 lavages: BEP® II
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
4 lavages: BEP® II
réalisation
automatique du test
0
NO
0
0
0
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGE ET DISTRIBUTION DU
CHROMOGÈNE
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISTRIBUTION DE LA SOLUTION D'ARRÊT
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl de solution
d'emploi du chromogène
30 min ± 2 min
+18 à +25°C
à l'abri de la lumière
100 µl de solution d'arrêt
après 1 h maximum
exploitation à 450 nm
(longueur d'onde de
référence : 650 nm)
résultat du test
28
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
YES
DISTRIBUTION
RÉACTIF
HBEAG
0
NO
0
075
3
NO
OPERATE 2
YES
LAVAGE ET DISTRIBUTION DU
CONJUGUÉ
compléter les plaques
2
incomplètes à mi-plaque WASHINGS
ASPIRATE
NO
avec des barrettes
SOAKTIME
0
remplies d'eau
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
100 µl de conjugué
OQDM G11 C0541 (904) CS
NO
25 µl
BEP® III
75 µl
de Réactif HBeAg positiv
HBeAg Anti-HBe
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0,100
0,050
YES
450
650
NO
4
NO
4
--0,400
0,5
0,150
-----
Enzygnost* HBe monoclonale
Settori d’impiego
Test immunoenzimatico per l'identificazione dell'antigene HBe dell'epatite B e degli anticorpi anti-HBe nel
siero e nel plasma.
L’esecuzione del test immunoenzimatico avviene su processore ELISA BEP® II, BEP® III e BEP® 2000. Il test
è stato sviluppato per l’analisi di campioni singoli e non per pool di campioni. Il prodotto deve essere impiegato
solo per scopi diagnostici in vitro.
Significato diagnostico
L'antigene HBe e gli anticorpi corrispondenti anti-HBe si manifestano esclusivamente in associazione con un
infezione da virus dell'epatite B. L'antigene HBe indica frequentemente l'infezione acuta per quanto sia presente anche nei casi di epatite cronica(1,2). L'antigene HBe si manifesta già nella fase iniziale dell'infezione
da epatite B. E' determinabile nel siero tramite un metodo immunochimico ad elevata sensibilità, immediatamente o talvolta quasi contemporaneamente al manifestarsi dell'HBsAg nel siero(3,4).
Il titolo di entrambi gli antigeni, HBsAg e HBeAg, aumenta rapidamente durante la fase di riproduzione del
virus. La concentrazione dell'antigene HBe tuttavia, scende prima di quella dell'antigene HBs, (generalmente
da 6 a 10 settimane dalla sua comparsa) persino sotto i limiti di sensibilità di metodi di test molto sensibili(4,5).
Contemporaneamente alla presenza in circolo nel siero dell'HBeAg, sono identificabili anche altri parametri
sierologici di una patologia epatica (ad es. transaminasi elevate).
Nei casi in cui l'HBeAg persiste nel siero oltre il normale tempo di eliminazione (sempre associato con la
persistenza dell'HBsAg), ci si deve in genere aspettare l'insorgere di una epatite cronica aggressiva(6,7). Per
questa ragione il controllo dell'evoluzione dell'HBeAg nel siero ha un notevole valore nella prognosi
dell'infezione acuta da virus dell'epatite B(8,9).
Con l'inizio della guarigione dell'infezione da virus dell'epatite B ed in assenza di complicazioni, l'HBeAg non è
più determinabile. Un risultato negativo dell'HBeAg può essere tuttavia ottenuto, oltre che nella fase postinfettiva anche nella fase iniziale dell'infezione acuta, prima del momento di massima replicazione virale(1,2,10). In base alla presenza dell'anti-HBe entrambe queste fasi possono essere differenziate. La sieroconversione da «HBeAg positivo» in «anti-HBe positivo» rappresenta un indice di prognosi favorevole per la
convalescenza e per il decorso senza complicazioni. Il paziente può comunque continuare ad essere portatore di HBsAg e sviluppare una epatite cronica persistente(7,11).
L'identificazione positiva dell'anti-HBe senza la contemporanea identificazione dell'HBsAg e HBeAg indica
una infezione pregressa con il virus dell'epatite B(5).
Principio del metodo
Identificazione dell'HBeAg
Il test immunoenzimatico per l'identificazione dell'antigene HBe nel siero o nel plasma è concepito secondo il
metodo sandwich. L'antigene HBe presente nel campione in esame si lega agli anticorpi anti-HBe monoclonali
fissati sulla superficie dei pozzetti delle piastre per microtitolazione. Dopo il lavaggio gli anticorpi anti HBe
monoclonali, coniugati con perossidasi, si legano, in una seconda reazione, ai siti antigenici ancora liberi.
Il coniugato in eccesso viene eliminato con il lavaggio e viene quindi determinata l'attività enzimatica del
coniugato. La reazione enzimatica del substrato e del cromogeno (reazione di colore blu) viene interrotta
aggiungendo la soluzione bloccante POD (reazione di colore giallo). L'intensità del colore è proporzionale alla
concentrazione di HBeAg presente nel campione.
Identificazione dell'anti-HBe
L'identificazione degli anticorpi anti-HBe presenti nel campione consegue alla loro preventiva neutralizzazione
da parte dell'antigene HBeAg presente nel reagente HBeAg positivo.
In presenza di campioni anti-HBe positivi non è normalmente rilevabile, o lo è scarsamente, l'antigene HBe.
L'intensità di colorazione del campione in esame è inversamente proporzionale alla concentrazione degli
anticorpi anti-HBe presenti.
Limiti di sensibilità del test
L'impiego del preparato di riferimento del «Paul-Ehrlich-Institut» indica un limite di sensibilità dell'Enzygnost*HBe monoclonale di ≤ 1,5 U/mL per l'HBeAg e di ≤ 1 U/mL per l'anti-HBe.
OQDM G11 C0541 (904) CS
29
Edizione Febbraio 2004
Reagenti
Enzygnost* anti-HBs II
1 x 96
Enzygnost* HBe monoclonale (piastra test)
Coniugato anti-HBe/POD (monoclonale):
Reagente HBeAg, positivo:
Controllo anti-HBe, positivo:
Controllo HBe, negativo:
Soluzione di lavaggio POD (concentrata)**:
Tampone/substrato TMB**:
Cromogeno TMB**:
Soluzione bloccante POD**:
Flacone vuoto per la soluzione d’uso del cromogeno:
Fogli adesivi:
Sacchetti in PE:
Tabella con codice a barre:
Istruzioni per l’uso:
1 piastra test
1 x 13 mL
1 x 13 mL
1 x 1,5 mL
1 x 2,5 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pz
6 pz
1 pz
1 pz
1 pz
** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB (codice
OUVP).
Composizione
Enzygnost* HBe monoclonale (piastra test): piastra test per microtitolazione sensibilizzata con anticorpi
monoclonali anti-HBeAg.
Coniugato anti-HBe/POD (monoclonale): anti-HBe monoclonale, coniugato con perossidasi (POD).
Conservante:
fenolo (max. 1 g/L).
Reagente HBeAg, positivo: antigene HBe prodotto mediante tecniche di ingegneria genetica, stabilizzato
con sieroalbumina bovina e Synperonic®, liofilizzato; valore indicativo di estinzione: vedi Validità del test,
concentrazione: 8 ± 5 U HBeAg/mL dopo ricostituzione.
Conservante:
fenolo (max. 1 g/L).
Controllo anti-HBe, positivo: siero umano con anticorpi monoclonali contro l'antigene HBe; valore indicativo
di estinzione: vedi Validità del test; concentrazione: 30 ± 20 U anti HBe/mL.
Conservante:
fenolo (max. 1 g/L).
Controllo HBe, negativo: siero umano negativo per l'identificazione dell'HBeAg e degli anticorpi anti HBe;
valore nominale di estinzione: vedi Validità del test.
Conservante:
fenolo (max. 1 g/L).
Soluzione di lavaggio POD (concentrata): soluzione di tampone fosfato (90 mmol/L) contenente Tween (18 g/L).
Conservante:
fenolo (max. 1 g/L).
Tampone/Substrato TMB: perossido di idrogeno (ca. 0,1 g/L) in soluzione tampone-acetato (25 mmol/L).
Conservante:
1-butanolo (max. 10 mL/L).
Cromogeno TMB: tetrametilbenzidina-dicloridrato (5 g/L).
Soluzione bloccante POD: acido solforico 0,5 N
Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in-vitro
2. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione dei controlli è stata esaminata per la ricerca della
HBsAg e degli anticorpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2. Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati
per la produzione.
Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando
le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è possibile escludere con assoluta certezza il
pericolo di agenti patogeni(12).
3. Si consiglia l’uso di guanti di protezione durante l’intera esecuzione del test.
4. Per lo smaltimento del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per almeno 1 ora a
+121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due contenitori collegati in serie, i quali dovrebbero
contenere un disinfettante adatto all’inattivazione dei virus patogeni umani. Osservare le concentrazioni ed
i tempi di azione indicati dal produttore.
Lavoro di preparazione
Prima dell'inizio del test portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a +18/+25 °C.
Non togliere la piastra test dal contenitore.
Per ogni piastra test diluire 20 mL di soluzione di lavaggio POD con 400 mL di acqua distillata o deionizzata.
Per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10 mL di tampone/substrato TMB nel flacone
vuoto appositamente fornito (soluzione d'uso di cromogeno) e conservare chiuso al riparo dalla luce. Dopo
l'uso, lavare accuratamente il flacone con acqua distillata.
A causa della dimensione del flacone non è possibile versare il cromogeno TMB direttamente nel tampone/
substrato TMB.
OQDM G11 C0541 (904) CS
30
Reagente HBeAg positivo, soluzione d'uso: prima di ogni test ricostituire un flacone di reagente HBeAg,
positivo con 13 mL di acqua distillata o deionizzata. Quindi agitare delicatamente fino a completo scioglimento (ca. 30 min.).
Conservazione e validità
Prima dell'apertura, tutte le componenti del kit Enzygnost* HBe monoclonale possono essere utilizzate fino
alla data di scadenza indicata in etichetta, purché conservate a +2/+8 °C.
La conservazione e la validità dei reagenti diluiti per l'uso, dopo l'apertura, sono riportate in appendice nella
Tabella 1.
Altro materiale necessario, ma non fornito
Strumentazione necessaria
Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione di lavaggio
BEP® II:
Per l’esecuzione automatica e valutazione del test, dopo la distribuzione dei campioni
BEP® III:
BEP® 2000:
per l’esecuzione automatica del test e la valutazione dei risultati
Pipette:
Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µl.
Sistema di incubazione:
bagnomaria coperto (+ 37 ± 1 °C) o analoghi metodi di incubazione.
Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata.
Campioni
Si impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essere conservati a + 2/+ 8 °C per non più di 3
giorni. Se i campioni devono essere conservati per un lungo periodo di tempo, devono essere congelati.
Esecuzione del test
Esecuzione del test con il BEP® II (antigene HBeAg):
1. Schema di distribuzione: definire il numero dei pozzetti necessari (numero dei campioni in esame più 6
pozzetti per i controlli). Per l'esecuzione del test togliere le file di pozzetti non necessarie e conservarle per
ulteriori determinazioni (ved. Tabella 1).
2. Distribuzione dei campioni: distribuire in ciascuno dei primi 4 pozzetti (da A1 a D1) 100 µL di Reagente
HBeAg positivo nel pozzetto successivo, quindi distribuire 100 µL/pozzetto del campione intero nei pozzetti
successivi. Alla fine della serie o della piastra distribuire ancora una volta 100 µL di Reagente HBeAg positivo.
In alternativa al suriportato schema di distribuzione, è possibile distribuire il Reagente HBeAg positivo due volte
all’inizio della serie.
Schema di distribuzione: distribuire 100 µL/pozzetto di controllo HBe negativo in 4 pozzetti, 100 µL di controllo
HBe, negativo, e 100 µL di reagente HBeAg, positivo, in ognuno dei due pozzetti successivi (E1 e F1); distribuire quindi in ciascun pozzetto 100 µL di campione in esame e coprire con un foglio adesivo.
3. Incubazione dei campioni: incubare per 60 ± 2 min. a + 37 ± 1 °C.
4. Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo, aspirare il contenuto di tutti i pozzetti e lavare 2 volte (vedere nota),
ogni volta con ca. 0,3 mL di soluzione di lavaggio diluita. Quindi distribuire immediatamente il coniugato.
5. Distribuzione del coniugato: riempire ogni pozzetto con 100 µL di coniugato anti-HBe /POD, ricoprire la
piastra con un nuovo foglio adesivo e inserire immediatamente nell'incubatore.
6. Incubazione del coniugato: incubare per 60 ±2 min a 37 ± 1 °C, iniziare quindi immediatamente la fase
di lavaggio.
7. Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo e lavare 4 volte come descritto al punto 4.
8. Distribuzione del substrato: riempire ogni pozzetto con 100 µL di soluzione d'uso di cromogeno e ricoprire la piastra con un nuovo foglio adesivo.
9. Incubazione del substrato: incubare per 30 ± 2 min. a +18/+25 °C al riparo dalla luce.
10. Arresto della reazione: rimuovere il foglio adesivo e distribuire in ogni pozzetto 100 µL di soluzione
bloccante POD, con la stessa cadenza di tempo seguita al punto 8.
11. Lettura: effettuare la misura fotometrica entro 1 ora a 450 nm.
Si consiglia l'uso di un fotometro con due lunghezze d'onda (raggio di misura e raggio di riferimento).
Effettuare la misurazione dei valori di estinzione dei campioni di controllo e dei pazienti a 450 nm. La lunghezza d'onda della misura di riferimento dovrebbe essere di 650 nm (evtl. fra 615 e 690 nm).
Esecuzione del test con il BEP® II (anti-HBe):
1. Schema di distribuzione: definire il numero dei pozzetti necessari (numero dei campioni in esame più 6
pozzetti per i controlli). Per l'esecuzione del test togliere le file di pozzetti non necessarie e conservarle per
ulteriori determinazioni (ved. Tabella 1).
OQDM G11 C0541 (904) CS
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2. Distribuzione dei campioni : Depositare in ciascuno dei primi 4 pozzetti (da A1 a D1) 25 µL di controllo
HBe positivo nel pozzetto successivo, quindi distribuire 25 µL/pozzetto del campione intero nei pozzetti
successivi. Alla fine della serie o della piastra distribuire ancora una volta 25 µL di controllo HBe positivo.
In alternativa al suriportato schema di distribuzione, è possibile distribuire il controllo HBe positivo due
volte all’inizio della serie.
Schema di distribuzione: distribuire 25 µL/pozzetto di controllo HBe negativo in 4 pozzetti, 25 µL ciascuno
di controllo HBe negativo e nei 2 pozzetti successivi (E1 e F1) 25 µL di controllo anti-HBe positivo e quindi
distribuire 25 µL di ogni campione in esame.
3. Legame dell'anti-HBe: immediatamente dopo aver depositato in ogni pozetto 25 µl del campione in esame e/o controllo, distribuire 75 µl di reagente HBeAg, positivo, soluzione d'uso e ricoprire con un foglio
adesivo.
Eseguire le successive fasi di lavoro in modo analogo all'esecuzione del test per l'identificazione dell'HBeAg e
precisamente proseguire con il punto 3. «Incubazione dei campioni».
Esecuzione del test usando il BEP® III
Prima di utilizzare il BEP® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni di dispensamento dei campioni (Paragrafo 1 e 2 in ”Esecuzione del test con il BEP® II”). Subito dopo porre le piastre non coperte da foglio
adesivo nel BEP® III. Attenzione: le piastre parzialmente riempite devono essere completate almeno a metà
piastra (6 strip) aggiungendo ”strip riempite con acqua”. Il test viene quindi eseguito in modo completamente
automatico (v. Manuale d’uso BEP® III).
Le impostazioni per i periodi di incubazione nel software del BEP® III possono differire dai periodi del BEP® II
per motivi tecnici (velocità del sistema), ma sono state validate per i metodi Enzygnost* sul BEP® III.
Esecuzione del test usando il BEP® 2000
Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in maniera completamente automatica dall’analizzatore (v. manuale d’uso del BEP® 2000).
Validità del test
I singoli valori di estinzione dei controlli vengono utilizzati per calcolare il valore medio, quando:
Identificazione HBeAg
- 0,010 ≤
Identificazione anti-HBe
Eneg. ≤ 0,100
Epos. ≥ 0,800
-0,010 ≤
Eneg. ≥ 0,400
Epos. ≤ 0,150
Se uno dei valori di estinzione dei
controlli negativi non rientra nell’ambito
indicato, può essere trascurato.
Se uno dei valori di estinzione dei
controlli negativi non rientra nell’ambito
indicato, può essere trascurato.
I valori di estinzione del reagente
HBeAg, positivo, devono rientrare
negli ambiti indicati per entrambi i test.
Se uno dei valori di estinzione del
controllo anti-HBe positivo non
rientra nell’ambito indicato, può essere trascurato.
Se queste condizioni non vengono rispettate, i rispettivi test devono essere ripetuti.
Valutazione del test
Sul BEP® 2000 o BEP® III, il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Consultare il rispettivo
manuale d’uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione dei risultati senza l’ausilio del software.
Identificazione HBeAg
Per calcolare il valore dubbio si
somma al valore medio di
estinzione dei controlli negativi
il valore di 0,050.
_
Valore dubbio (cut off) = Eneg. + 0,050.
Identificazione anti-HBe
Per calcolare il valore dubbio si
moltiplica il valore medio di
estinzione dei controlli
negativi per il fattore 0,5.
_
Valore dubbio (cut off) = Eneg. x 0,5.
Secondo i criteri del test i campioni in esame vengono così classificati:
Risultato del test per HBeAg
Risultato del test per l’anti-HBe
< cut off - 10%
1. Ecampione
> cut off + 10 %
= HBeAg-negativo
= anti-HBe-negativo
2. cut off - 10% ≤ Ecampione ≤ cut off + 10%
2. cut off - 10% ≤ Ecampione ≤ cut off + 10%
= HBeAg-valore dubbio
= HBeAg-valore dubbio
> cut off + 10%
3. Ecampione
< cut off - 10%
3. Ecampione
= HBeAg-positivo
= anti-HBe-positivo
Per chiarire un risultato con valore dubbio occorre sottoporre il campione ad un nuovo test, questa volta in
doppia determinazione. Se nella ripetizione del test il valore medio della determinazione in doppio è maggiore
o uguale al valore dubbio e/o inferiore al valore dubbio, il risultato iniziale con valore dubbio può essere
trascurato e il campione può essere considerato rispettivamente reattivo o negativo.
1. Ecampione
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32
Limitazioni della esecuzione del test
1. Gli anticoagulanti come l’Eparina, l’EDTA ed il Citrato non influenzano il risultato del test.
2. Campioni lipemici, itterici o contenenti fattori reumatoidi non influenzano i risultati del test.
3. Con campioni emolizzati si potrebbe avere una reattività elevata.
4. I campioni contenenti anticorpi IgG contro il virus EBV / HAV / rosolia ed i campioni contenenti ANA non
interferiscono con il risultato del test.
5. I campioni di pazienti emofilici non presentano interferenze con il risultato del test.
6. I campioni di pazienti dializzati ed i campioni positivi per gli autoanticorpi possono presentare una elevata
reattività.
7. I campioni non completamente coagulati o contaminati da microbi non dovrebbero essere utilizzati.
8. Nell'identificazione dell'antigene i campioni inattivati al calore (1 h, 56 °C) determinano valori troppo bassi
dovuti alla denaturazione dell'antigene HBe e pertanto non possono essere utilizzati.
9. Se vengono utilizzati campioni scongelati, assicurarsi che essi siano omogenei.
10. E' necessario utilizzare solo reagenti appartenenti tutti ad uno stesso lotto (ad esclusione della soluzione
di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d'uso del cromogeno preparata con i reagenti
Cromogeno TMB e Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allo stesso lotto). La combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre (Lot. nr.) e quella stampata sulla confezione ed anche riportata nell'allegata
tabella dei codici a barre.
11. Il Tampone/substrato TMB, la Soluzione d’uso di cromogeno e la Soluzione bloccante POD non devono
venire a contatto con ioni di metalli pesanti o con sostanze ossidanti (non utilizzare pipette con parti
metalliche che sono a diretto contatto con il liquido). Le operazioni di reazione del substrato non devono
essere eseguite in prossimità di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la Soluzione d’uso di cromogeno
presenta spontaneamente un colore blu prima di essere trasferita nella piastra test, ciò indica che la
soluzione è contaminata; in tal caso, preparare una soluzione fresca in un flacone ben pulito. Evitare il
contatto con la pelle delle suddette soluzioni.
12. Durante le operazioni di incubazione, la piastra test deve essere protetta dalle vibrazioni (per es. porla in
un bagnomaria senza circolazione d’acqua); i pozzetti della piastra devono essere a contatto con l’acqua
termostatata. Se si utilizzano dei conservanti per prevenire contaminazioni microbiche dell’acqua, fare in
modo che nè la superficie della piastra test nè i pozzetti vengano a contatto con la soluzione poiché
un’eventuale contaminazione potrebbe causare reazioni aspecifiche.
13. Il controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi intorbidamenti, che però non
interferiscono sui risultati del test.
14. Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare le prestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sono supportate da Dade Behring
poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e sui risultati del test. Pertanto è responsabilità
dell’utente validare tutte le modifiche apportate a queste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi
da quelli inclusi nei fogli di istruzioni o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring.
15. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente, della
presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.
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33
Caratteristiche del test
Sensibilità e specificità
I risultati del test sulla sensibilità e sulla specificità sono riassunti nelle tabelle 2 e 4 (in appendice).
Per la valutazione della sensibilità sono stati esaminati in 2 centri differenti 216 campioni HBeAg positivi e 224
campioni anti-HBe positivi. Qui di seguito vengono indicate le sensibilità medie:
Sensibilità
Enzygnost* HBe monoclonale
Reattività iniziale
Reattività dopo ripetizione
98,1 %
99,1 %
97,8 %
99,1 %
HBeAg
anti-HBe
Per la valutazione della specificità sono stati esaminati in 2 centri differenti 2502 campioni HBeAg negativi e
2406 campioni anti-HBe negativi. Qui di seguito vengono indicate le specificità medie:
Specificità
Enzygnost* HBe monoclonale
Negativo iniziale
Negativo dopo ripetizione
HBeAg
99,4 %
99,5 %
anti-HBe
99,6 %
99,8 %
Possibili scostamenti da tali valori possono dipendere dal tipo di collettività esaminata, dalla modalità di esecuzione del test, o da altre variabili.
Riproducibilità
I risultati della riproducibilità intra-serie ed inter-serie sono riportati nella Tabella 5 (vedi Appendice). I dati
indicati sono risultati tipici. Sono possibili differenze dovute a vari fattori (procedura, ecc.).
*
Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi.
BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e altri paesi.
Synperonic è un marchio registrato della ICI.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQDM G11 C0541 (904) CS
34
0197
Tab. 1: Conservazione e validità
Enzygnost* Anti-HBe-monoclonale
Campioni/Reagenti
Enzygnost* Anti-HBe-monoclonale
(piastra test)
Condizioni
dopo apertura
Coniugato anti-HBe/POD monoclonale
dopo apertura
Reagente HBeAg, pos.
dopo ricostituz.
Controllo anti-HBe, pos.
Controllo HBe, negativo
Cromogeno TMB
Tampone/Substrato TMB
Soluzione d’uso di cromogeno
dopo apertura
Soluzione di lavaggio POD (concentrato)
Soluzione bloccante POD
•
dopo apertura
dopo apertura
1 + 10
indiluita
dopo apertura
diluita 1:20
diluita 1:20
dopo apertura
Conservazione
+ 2/+8 °C
(nel sacchetto con
l’essiccante)
+ 2/+8 °C
+ 18/25 °C
+ 2/+8 °C
- 20 °C
+ 2/+8 °C
- 20 °C
+2/+8 °C
+ 2/+8 °C
+2/+8 °C
+ 18/+25 °C
flacone chiuso,
al riparo
dalla luce
Stabilità•
4 settimane
+ 2/+8 °C
+ 2/+8 °C
+ 18/+25 °C
+ 2/+8 °C
data di scadenza
1 settimana
1 giorno
data di scadenza
4 settimane
2 giorni
4 settimane
3 mesi
4 settimane
3 mesi
data di scadenza
data di scadenza
5 giorni
8 ore
in nessun caso oltre la data di scadenza
Tab. 2 Sensibilità
Nella valutazione della sensibilità sono stati ottenuti in 2 centri indipendenti (K, M) i seguenti dati:
Insieme di
campioni
(M) HBeAg pos.
(K) HBeAg pos.
Numero di
campioni
109
107
(M) Anti-HBe pos.
(K) Anti-HBe pos.
96
128
Enzygnost* HBe monoclonal
Reattività
Reattività dopo
iniziale
ripetizione
108
109
104
105
93
126
95
127
Tab. 3 Pannello con sierologie particolari
Insieme di
campioni
HBeAg pos.
anti-HBe pos.
Numero di
campioni
65
112
Enzygnost* HBe monoclonal
Reattività
Reattività dopo
iniziale
ripetizione
59
59
105
107
Questi pannelli sono costituiti per la maggior parte da campioni che si trovano nella fase di transizione HBeAg/
anti-HBe. I ridotti valori di sensibilità possono essere dovuti alla formazione di immunocomplessi.
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35
Tab. 4 Specificità
Nella valutazione della specificità sono stati ottenuti in tre centri indipendenti (K, M, L) i seguenti risultati:
Insieme di campioni
Numero di
campioni
Enzygnost* HBe
monoclonal
Reattività Reattività dopo
iniziale
ripetizione
(M) Sieri normali neg.
Plasmi normali neg.
(K) Sieri normali neg.
(L) Sieri neg. di pazienti
non affetti da HBV
Sieri neg. di pazienti
affetti da HBV
Sieri critici••
804
396
528
584
3
0
0
8
3
0
0
7
124
5
3
66
0
0
(M) Sieri normali neg.
Plasmi normali neg.
(K) Sieri normali neg.
(L) Sieri neg. di pazienti
non affetti da HBV
Sieri neg. di pazienti
affetti da HBV
Sieri critici••
791
387
521
572
2
1
1
1
1
0
1
0
78
4
2
57
1
1
HBeAgVersion
Anti-HBeVersion
•• Campioni con potenziali fattori di disturbo, per es. autoanticorpi, campioni emolizzati e itterici.
Tab. 5 Riproducibilità
Nelle ricerche di riproducibilità, i campioni sono stati analizzati 8 volte in ciascuno dei 5 giorni. I coefficienti di
variazione (CV) sono stati calcolati utilizzando il modello con il compo-nente della varianza.
Campione
F1
F2
F3
Campione
F1
F2
F3
OQDM G11 C0541 (904) CS
Estinzione
media
0,036
0,102
0,282
HBeAg-Version
Intra-assay
Inter-assay
%CV
%CV
6,4
11,4
3,8
9,3
4,1
8,7
Estinzione
media
1,421
0,808
0,458
Anti-HBe-Version
Intra-assay
Inter-assay
%CV
%CV
3,6
6,3
3,2
3,4
7,4
4,4
36
Tab. 6 Esecuzione del test e programmazione
Enzygnost* HBe monoclonal
HBeAg/Anti-HBe test
Esecuzione del test
Programmazione
del Menu per il
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
BEP® II
Preparazione dei reagenti
HBeAg
100 µl
Campione e/o controllo
®
BEP® 2000 OPERATE 1
BEP III
Anti-HBe
75 µl
Reagente HBeAg, positivo
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
2 lavaggi: BEP® II
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
4 lavaggi: BEP® II
elaborazione
automatica del test
100 µl di soluzione d’uso
di cromogeno
30 min ± 2 min
(+18 bis +25 °C
al riparo dalla luce)
100 µl di soluzione bloccante
dopo max 1 ora
lettura a 450 nm
(lunghezza d’onda
di riferimento: 650 nm)
Risultato del test
37
NO
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
0
NO
0
0
0
NO
YES
DISPENSAZIONE
REAGENTE
HBEAG
0
NO
0
075
3
NO
OPERATE 2
YES
LAVAGGIO E DISPENSAZIONE
CONIUGATO
nel caso di piastre in2
complete (meno di piastra) WASHINGS
ASPIRATE
NO
aggiungere strip con
SOAKTIME
0
pozzettiriempiti di aqua
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
100 µl di coniugato
OQDM G11 C0541 (904) CS
HBeAg Anti-HBe
25 µl
®
BEP II
HBeAg
MENU NO
Anti-HBe
OPERATE 3
YES
LAVAGGIO E DISPENSAZIONE
CHROMOGENO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISPENSAZIONE SOLUZIONE BLOCCANTE
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0,100
0,050
YES
450
650
NO
4
NO
4
--0,400
0,5
0,150
-----
Enzygnost* HBe monoclonal
Campos de aplicación
Prueba inmunoenzimática para la detección del antígeno de la hepatitis Be y de anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis Be en sueros y plasmas.
La realización del ensayo inmunológico se lleva a cabo en los ELISA Procesadores BEP® II, BEP® III y BEP®
2000. El test se desarrolló para la investigación de muestras individuales, no de muestras en pool. El producto
debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro.
Significado diagnóstico
El antígeno-HBe y su correspondiente anticuerpo anti-HBe se encuentran exclusivamente en relación con
una infección por el virus de la hepatitis B. El antígeno-HBe puede indicar frecuentemente una infeccción
aguda, pero también se puede presentar en hepatitis crónicas (1, 2). El antígeno-HBe aparece en la fase
inicial de una hepatitis B. y se puede reconocer, por medio de un ensayo inmunológico sensible, inmediatamente después o algunas veces al mismo tiempo que el aumento del HBsAg (3, 4).
El título de los antígenos, HBsAg y HBeAg aumenta rápidamente durante la fase de reproducción del virus. La
concentración del antígeno-HBe desciende primero que la del antígeno-HBs - por lo general entre 6 y 10
semanas después de su aparición - a valores aún menores que el límite de detección del método más sensible (4, 5). Mientras circule en el suero HBeAg, se pueden detectar otros parametros serológicos de algumas
enfermedades del hígado (por ej aumento en las trasaminasas).
En los casos donde el HBeAg persiste en el suero después del tiempo normal de eliminación - está en
relación con una persistencia de HBsAg -, se debe contar con la aparición de una hepatitis agresiva crónica
(6, 7). Por esta razón es de gran significado diagnóstico, el control de las variaciones del HBeAg en una
infección aguda por el virus de la hepatitis B (8,9).
Después de iniciado el proceso de curación de una infección por el virus de la hepatitis B, libre de complicaciones, no se puede detectar más el HBeAg. Sin embargo, se puede obtener un resultado negativo de HBeAg
no sólo en esta fase post-infecciosa, sino también en la fase inicial de una infección aguda antes de la máxima
replicación del virus (1, 2, 10). Estas dos fases se pueden diferenciar por la aparición de anti-HBe. La conversión de un suero de «HBeAg-positivo» a «anti-HBe-positivo» es un buen pronóstico en relación con la reconvalecencia o con el desarrollo sin complicaciones de la enfermedad. A pesar de esto, estos pacientes puede
seguir siendo portadores de HBsAg y desarrollar una hepatitis crónica persistente (7, 11).
La detección de anti-HBe, sin el reconocimiento simultáneo de HBsAg y HBeAg indica la existencia de una
infección por el virus de la hepatitis B de tiempos atrás (5).
Principio del método
Detección del HBeAg
El ensayo inmunoenzimático para la detección del antígeno-HBe en sueros y plasmas está basado en el principio
sandwich. El antígeno-HBe contenido en la muestra a investigar se une al anticuerpo anti-HBe monoclonal, que
se encuentra fijado a la superficie de la placa de microtitulación. Después de lavar, en una segunda reacción, se
une el anticuerpo anti-HBe monoclonal conjugado con peroxidasa a los determinantes antigénicos aún libres.
Después de eliminar por medio de lavado el exceso de conjugado, se determina la actividad enzimática fijada
del conjugado. La trasformación enzimática del sustrato y del cromógeno (reacción cromática azul) se interrumpe agregando la solución de parada POD (reacción cromática amarilla). La intensidad cromática es proporcional a la concentración del HBeAg existente en la muestra.
Detección de Anti-HBe
Para la detección de anti-HBe, los anticuerpos anti-HBe existentes en la muestra bloquean el HBeAg agregado con el reactivo-HBeAg, positivo. En muestras con anti-HBe positivo, no se puede detectar HBeAg en la
detección de éste realizada a continuación o solamente muy poco. La intensidad cromática de la muestra es
indirectamente proporcional a la concentración de anti-HBe existente en ésta.
Límite de detección del test
Si se utiliza un preparado de referencia del Instituto Paul Ehrlich el límite de detección del Enzygnost* HBe
monoclonal para HBeAg es ≤ 1,5 U/ml y para Anti-HBe ≤ 1 U/ml.
OQDM G11 C0541 (904) CS
38
Edición Febrero 2004
Reactivos
Contenido del envase comercial
Enzygnost* HBe monoclonal
Enzygnost* HBe monoclonal (placa de prueba):
Conjugado Anti-HBe/POD (monoclonal):
Reactivo-HBeAg, positivo:
Control Anti-HBe, positivo:
Control-HBe, negativo:
Solución de lavado POD (concentrado)**:
Tampón/sustrato TMB**:
Cromógeno TMB**:
Solución de parada POD**:
Frasco vacío para preparar la solución de cromógeno
Láminas adhesivas
Bolsa de PE
Tabla de código de barras
Boletín informativo
1 x 96
1 placa de prueba
1 x 13 ml
1 x 13 ml
1 x 1,5 ml
1 x 2,5 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 unidad
6 unidades
1 unidad
1 unidad
1 unidad
** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos adicionales para Enzygnost* TMB (N° de
pedido OUVP).
Composición
Enzygnost* HBe monoclonal (placa de prueba): Placa de microtitulación recubierta con anticuerpos monoclonales contra HBeAg
Conjugado Anti-HBe/POD (monoclonal): Anti-HBe monoclonal, conjugado con peroxidasa (POD)
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Reactivo-HBeAg, positivo: Antígeno-HBe preparado por tecnología genética,estabilizado con albúmina bovina y Synperonic ®, liofilizado, valor teórico de la extinción: ver Validez del test, concentración: 8 ± 5 U HBeAg/ml
después de la reconstitución
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Control Anti-HBe, positivo:
Suero humano con anticuerpos monoclonales contra el antígeno-HBe, valor teórico de la extinción: ver Validez del test, concentración: 30 ± 20 U Anti HBe/ml
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Control-HBe, negativo: Suero humano negativo para la detección de HBeAg y de anti-HBe, valor teórico de
la extinción: ver Validez del test
Medio de conservación:
Fenol (máx.1 g/l)
Solución de lavado POD (concentrado)
Solución tampón de fosfato (90 mmol/l) conteniendo Tween (18 g/l)
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Tampón/Sustrato TMB
Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de
acetato (25 mmol/l)
Medio de conservación:
1-Butanol (máx. 10 ml/l)
Cromógeno TMB
Clorhidrato de tetrametilbencidina (5 g/l)
Solución de parada POD
Ácido sulfúrico 0,5N
Advertencias y medidas de seguridad
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro
2. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación de los sueros de control ha sido investigada
para detectar la presencia del HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan
donaciones con resultados negativos.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo
biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes patógenos(12).
3. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test.
4. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por lo menos 1
hora a + 121 °C. Todas las soluciones aspiradas se deben recoger en dos recipientes conectados uno con
el otro. Estos recipientes deben contener un medio de desinfección apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse la concentración y el tiempo de acción dados por el fabricante.
Preparación de reactivos
Antes de iniciar el test calentar todos los reactivos y las muestras a investigar entre +18 y +25°C.
No sacar la placa de prueba del recipiente.
Para cada placa de prueba diluir 20 ml de la solución de lavado POD (concentrado) con agua destilada o
desionizada hasta obtener 400 ml.
OQDM G11 C0541 (904) CS
39
Solución de uso del cromógeno: Por cada placa diluir 1 ml de cromógeno TMB con 10 ml de tampón/sustrato
TMB dentro de la botella de plástico que viene en el envase para este fin (solución lista de cromógeno), mantenerla cerrada y protegida de la luz. Lavar el frasco esmeradamente con agua destilada después de su uso.
Por razones técnicas (sobrellenado) no está permitido vertir el contenido del cromógeno TMB en el frasco de
tampón/sustrato TMB.
Solución de uso del reactivo-HBeAg, positivo: Antes de empezar el test reconstituir un frasco del reactivoHBe, positivo con 13 ml de agua destilada o desionizada. Agitar suavemente y observar que haya una disolución
completa (aprox. 30 min).
Estabilidad y almacenaje
Todos los componentes del testkit Enzygnost* HBe monoclonal aún cerrados, conservados a una temperatura entre +2 y +8 °C, son utilizables hasta las fechas de vencimiento dadas en las etiquetas.
La estabilidad y las condiciones de almacenamiento de los envases ya abiertos o de los reactivos ya diluidos
listos para el uso se pueden tomar de la Tabla 1 del apéndice.
Materiales adicionales necesarios
Equipo necesario:
BEP® II:
Para el desarrollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavado
Para la realización completamente automática del test después de la distribución de las mueBEP® III:
stras, así como para la evaluación.
BEP® 2000:
Para la realización y valoración completamente automática del test.
Pipetas:
Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl
Incubadora:
Baño de agua cubierto (+37 ± 1 °C) u otros métodos de incubación similares
Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados.
Material a investigar
Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con EDTA/heparina/citrato),
las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de laboratorio. Las muestras se pueden almacenar
máximo 3 días entre 2 y 8°C. Para tiempos más largos de almacenamiento las muestras se deben congelar.
Procedimiento
Realización del test usando el BEP® II (Procedimiento para detectar HBeAg)
1. Esquema de distribución: Determinar el número necesario de pocillos de la placa (número de muestras
a investigar más 6 pocillos para los controles). Los elementos de la placa de prueba no utilizados se deben
retirar del marco que los contiene y se deben guardar para ser utilizados posteriormente (ver Tabla 1).
2. Dosificación de las muestras:
Llenar 4 pocillos c/u con 100 µl de control-HBe, negativo (A1 hasta D1), en un pocillo 100 µl del reactivoHBe, positivo y en cada uno de los siguientes pocillos 100 µl de la muestra non diluida. Al final de la serie
o de la placa de ensayo dosificar una vez más 100 µl del reactivo-HBe, positivo.
Coma una alternativa para el esquema de pipeteo descrito anteriormente se permite también colocar un
reactivo-HBe, positivo dos veces al comienzo de cada serie del test.
Esquema de pipeteo: Dosificar en cuatro pocillos 100 µl del control-HBe, negativo por c/u, y 2 pocillos c/u
con 100 µl de reactivo-HBe, positivo (E1 y F1); en los siguientes pocillos dosificar en c/u 100 µl de las
muestras a investigar y cubrir con la lámina adhesiva.
3. Incubación de las muestras: Incubar durante 60 ± 2 min a + 37 ± 1 °C.
4. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar 2 veces con aprox.
0,3 ml de la solución de lavado cada vez (ver advertencia). A continuación agregar el conjugado.
5. Distribución del conjugado: Colocar en cada pocillo 100 µl del conjugado Anti-HBe/POD, cubrir la placa
con una nueva lámina adhesiva e inmediatamente colocar en el incubador.
6. Incubación del conjugado: Incubar durante 60 ± 2 min a +37 ± 1 °C, y lavar inmediatamente después.
7. Lavado: Retirar la lámina adhesiva y lavar 4 veces como está descrito en el punto 4.
8. Distribución del sustrato: Agregar en cada pocillo 100 µl de solución de cromógeno lista para el uso.
Cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva.
9. Incubación del sustrato: Incubar 30 ± 2 min entre +18 y +25 °C protegiendo de la luz.
10. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 µl de la solución de parada
POD; mantener el mismo ritmo que en el punto 8.
11. Medición: Realizar la medición en el fotómetro a 450 nm en el término de una hora.
Se aconseja, el uso de un fotómetro con dos longitudes de onda (rayo de medida y rayo de referencia).
La medida de la extinción de los controles y de las muestras de pacientes se hace a 450 nm; como longitud de
onda de la medida de referencia se recomienda 650 nm (eventualmente entre 615 y 690 nm).
Realización del test usando el BEP® II (Procedimiento para la detección de Anti-HBe)
1. Esquema de distribución:
Determinar el número necesario de pocillos de la placa (número de muestras a investigar más 6 pocillos
para los controles). Los elementos de la placa de prueba no utilizados se deben retirar del marco que los
contiene y se deben guardar para ser utilizados posteriormente (ver Tabla 1).
OQDM G11 C0541 (904) CS
40
2. Dosificación de las muestras
Llenar 4 pocillos c/u con 25 µl de control-HBe, negativo (A1 hasta D1), en un pocillo 25 µl del control-HBe,
positivo y en cada uno de los siguientes pocillos 25 µl de la muestra non diluida. Al final de la serie o de la
placa de ensayo dosificar una vez más 25 µl del control-HBe, positivo.
Coma una alternativa para el esquema de pipeteo descrito anteriormente se permite también colocar un
control-HBe, positivo dos veces al comienzo de cada serie del test.
Esquema de pipeteo: Dosificar en cuatro pocillos 25 µl del control-HBe, negativo por c/u y 2 pocillos c/u
con 25 µl de control Anti-HBe, positivo (E1 y F1) y en los siguientes pocillos dosificar en c/u 25 µl de las
muestras a investigar.
3. Unión del Anti - HBe: Immediatamente después de la dosificatión de las muestras agregar 75 µl de la
solución lista para el uso del reactivo - HBeAg, positivo, en cada pocillo donde hayan 25 µl de muestra o
de control y cubrir con la lámina adhesiva.
Las siguientes etapas se relizan como en el procedimiento para detectar el HBeAg, esto es, continuar con el
punto 3. «Incubación de las muestras».
Procedimiento en el BEP® III
Para el desarrollo del test en el BEP® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la distribución de las
muestras (punto 1 hasta punto 3 del «Procedimiento en el BEP® II»). Directamente después de esto, colocar
las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina adhesiva en el BEP® III. Aquí es importante observar que las
placas de prueba que no estén llenas se deben completar con «elementos con agua» hasta por lo menos la
mitad de la placa de prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma
completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® III).
Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP® III pueden desviarse de los del procedimiento
en el BEP® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin embargo validados en la
combinación BEP® III/Enzygnost*.
Procedimiento en el BEP® 2000
La distribución de las muestras y la realización subsiguiente del test se efectúa de forma completamente
automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® 2000).
Validez del test
Cada valor medido para la extinción de los sueros control, se usa para calcular el valor promedio si cumple con:
Detección de HBeAg
Detección de Anti-HBe
-0,010≤ Eneg. ≤ 0,100
Epos. ≥ 0,800
Eneg ≥ 0,400
-0,010 ≤ Epos. ≤ 0,150
De los valores de extinción de los controles
negativos puede descartarseuno que
encuentre fuera de estas especificaciones.
Los dos valores de extinción del reactivo-HBe,
positivo deben llenar estas especificaciones.
De los valores de extinción de los controles
negativos puede descartarseuno que
encuentre fuera de estas especificaciones.
De los valores de extinción del control Anti-HBe,
positivo puede descartarse uno que se
encuentre fuera de estas especificaciones.
Si estas especificaciones no se cumplen se debe repetir el ensayo correspondiente.
Valoración de la prueba
La evaluación con el BEP® 2000 o con el BEP® III, se realiza automáticamente. Para esto consultar los
manuales de operaciones. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en el caso de evaluaciones sin
la ayuda del software.
Detección de HBe
Para calcular el valor
límite se añade un valor
de 0,050 al valor
promedio de la extinción
del control negativo:
_
Eneg. + 0,050 = valor límite (cut off)
Detección de Anti-HBe
Para calcular el valor
límite se multiplica el
valor promedio de la
extinción del control
negativo por el factor 0,5:
_
Eneg. x 0,5 = valor límite (cut off)
De acuerdo a los criterios del test, las muestras se clasifican de la siguiente manera:
Resultados para HBeAg
Resultados para Anti-HBe
< cut off - 10%
1. Emuestra
> cut off + 10%
1. Emuestra
= HBeAg-negativo
= anti-HBe-negativo
2. cut off - 10% ≤ Emuestra ≤ cut off + 10%
2. cut off - 10% ≤ Emuestra ≤ cut off + 10%
= HBeAg-limítrofe
= anti-HBe-limítrofe
3. Emuestra
> cut off + 10%
3. Emuestra
< cut off - 10%
= HBeAg-positivo
= anti-HBe-positivo
Para aclarar un resultado limítrofe se debe medir la muestra nuevamente, pero esta vez en una doble determinación.
Si después de la repetición del test el valor promedio de la doble determinación es mayor o igual que el valor
límite o menor que éste, se puede descartar el valor limítrofe obtenido inicialmente y la muestra se puede
clasificar como reactiva o negativa.
OQDM G11 C0541 (904) CS
41
Limitaciones del Procedimiento
1. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre los resultados del test.
2. Las muestras lipémicas, las muestras que contienen factor reumatoideo y las muestras ictéricas no alteran
el desarrollo del test.
3. Para muestras hemolíticas no se puede excluir que éstas conduscan a una reactividad elevada.
4. Las muestras con anticuerpos IgM contra EBV, HAV, virus del sarampión, así como las muestras que
contengan ANA no influyen en los resultados del test.
5. En muestras de pacientes hemofílicos no se observo ninguna influencia sobre los resultados del test.
6. Las muestras de pacientes en diálisis, así como, las muestras con autoanticuerpos positivos pueden
mostrar una aumento en la reactividad.
7. No se deben emplear sueros que no estén completamente coagulados y muestras contaminadas microbiológicamente.
8. En muestras sometidas a tratamiento por calor (1h, 56°C), debido a la desnaturalización del antígeno-HBe,
se obtienen valores menores en la determinación del antígeno y por esta razón no se deben emplear.
9. En muestras descongeladas se debe tener en cuenta que el material se encuentre bien homogeneizado.
10. Los reactivos (con exepción de la solución de lavado POD, la solución de parada y la solución de uso del
cromógeno, la cual ha sido preparada a partir de los reactivos dependientes del lote, cromógeno TMB y
Tampón/sustrato TMB ) sólo se pueden utilizar juntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo
número de 6 cifras (Nr. de Lote) que está impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla de código
de barras incluida en él.
11. El tampón/sustrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de parada no deben entrar en
contacto con iones de metales pesados o con sustancias oxidantes (no utilizar pipetas que tengan partes
metálicas que entren en contacto con el líquido). Las reacciones del sustrato no se deben efectuar en la
cercanía de medios de desinfección que contengan hiploclorito. Una coloración azul espontánea de la
solución de uso del cromógeno antes de agregarse a la placa de prueba está indicando una contaminación; prepare una nueva solución en un recipiente limpio. Evite el contacto de la piel con las soluciones
arriba mencionadas.
12. Durante la incubación la placa de prueba debe de permanecer en reposo (por ej. con ayuda de un flotador
fijo o con un bañomaría no circulante). Si se utilizan agentes de conservación para evitar la contaminación
del agua, hay que tener la precaución de que ni la superficie de la placa de prueba ni los pocillos entren en
contacto con estas soluciones pues podrían provocar reacciones no especificas.
13. Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razón puede aparecer
turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test.
14. Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar el rendimiento del
producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificaciones definidas por el usuario no
están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar al rendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuario validar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos en analizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade
Behring o en estas instrucciones de uso.
15. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.
OQDM G11 C0541 (904) CS
42
Sensibilidad y especificidad
Los resultados de los ensayos de sensibilidad y especificidad están resumidos en las Tablas 2 + 4 (en el apéndice.
Para determinar la sensibilidad se investigaron, en 2 estudios independientes, 216 muestras con HBeAg pos.
y 224 muestras con Anti-HBe pos. Las sensibilidades promedio obtenidas fueron las siguientes:
Sensibilidat
Enzygnost* HBe monoclonal
Reactividad inicial
Reactividad repetida
98,1 %
99,1 %
97,8 %
99,1 %
HBeAg versión
anti-HBe versión
Para la determinación de la especificidad se investigaron, en 2 estudios independientes, 2502 muestras con
HBeAg neg. y 2406 muestras con Anti-HBe neg.. Las especificidades promedio obtenidas fueron las siguientes:
Especificidat
Enzygnost* HBe monoclonal
Negativo inicial
Negativo repetida
99,4 %
99,5 %
99,6 %
99,8 %
HBeAg versión
anti-HBe versión
Debido a la diferencia en las colectividades investigadas, en el desarrollo del test y en otros factores, es
posible que aparezcan valores discrepantes.
Reproducibilidad
Los resultados de los ensayos de reproducibilidad intra/inter están resumidos en la Tabla 5 (en el apéndice).
En estos casos se trata de ejemplos de datos hallados. Dependiendo, entre otros, del desarrollo del test es
posible encontrar valores que se desvíen de estos.
*
Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países.
BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países.
Synperonic es una marca registrada de ICI.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQDM G11 C0541 (904) CS
43
0197
Tab. 1. Estabilidad y almacenaje
Enzygnost* HBe monoclonal
Material/reactivo
Enzygnost* Anti-HBe monoclonal
(placa de prueba)
Estado
abierto
Conjugado Anti-HBe/POD
monoclonal
Reactivo-HBeAg, pos.
abierto
Control Anti-HBe, pos.
Control HBe, negativo
Cromógeno TMB
Tampón/substrato TMB
Solución de uso del cromógeno
abierto
reconstituido
Solución de lavado POD
(concentrado)
sin diluir
abierto
1 : 20
1 : 20
abierto
Solución de parada POD
•
abierto
abierto
1 + 10
Almacenaje
entre +2 y +8 °C en
envase con cápsulas deshidratantes
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
entre +2 y +8 °C
- 20 °C
entre +2 y +8 °C
- 20 °C
entre +2 y +8 °C
entre +2 y +8 °C
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
cerrado
protegido
de la luz
Estabilidad•
4 semanas
entre +2 y +8 °C
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
entre +2 y +8 °C
fecha de caducidad
1 semana
1 día
fecha de caducidad
4 semanas
2 días
4 semanas
3 meses
4 semanas
3 meses
fecha de caducidad
fecha de caducidad
5 días
8 horas
En ningún caso más allá de la fecha de caducidad
Tab. 2 Sensibilidad
En la investigación de la sensibilidad, en 2 centros independientes (K, M), se encontraron los siguientes datos:
Colectividat de
muestras
(M) HBeAg pos.
(K) HBeAg pos.
Número de
muestras
109
107
(M) anti-HBe pos.
(K) anti-HBe pos.
96
128
Enzygnost* HBe monoclonal
Reactividad
Reactividad
inicial
repetida
108
109
104
105
93
126
95
127
Tab. 3 Tricky Panel
Colectividat de
muestras
HBeAg pos.
anti-HBe pos.
Número de
muestras
65
112
Enzygnost* HBe monoclonal
Reactividad
Reactividad
inicial
repetida
59
59
105
107
Estas colectividades están compuestas en su mayoría por muestras del rango de transición HBeAg/Anti-HBe.
Los valores disminuidos de la sensibilidad se pueden atribuir a la formación de inmunocomplejos.
OQDM G11 C0541 (904) CS
44
Tab. 4 Especificidad
En la investigación de la especificidad, en tres centros independientes (K, M, L), se encontraron los siguientes datos:
Colectividat de muestras
(M) Sueros normales neg.
Plasmas normales neg.
(K) Sueros normales neg.
(L) Sueros neg. de pacientes
no HBV
Sueros neg. de pacientes HBV
Sueros criticos••
(M) Sueros normales neg.
Plasmas normales neg.
(K) Sueros normales neg.
(L) Sueros neg. de pacientes
no HBV
Sueros neg. de pacientes HBV
Sueros criticos••
Número de
muestras
804
396
528
584
Enzygnost* HBe
monoclonal
Reactividad Reactividad
inicial
repetida
3
3
0
0
0
0
8
7
124
66
791
387
521
572
5
0
2
1
1
1
3
0
1
0
1
0
78
57
4
1
2
1
HBeAgversión
Anti-HBeversión
•• Muestras con factores potenciales de alteración, por ej. autoanticuerpos, muestras hemolíticas y muestras ictéricas.
Tab. 5 Reproducibilidad
Para las investigaciones de la reproducibilidad fueron chequeadas las muestras 5 días cada una en 8 determinaciones. El cálculo del coeficiente de variación (CV) se hizo según el modelo componentes de varianza.
Muestra
F1
F2
F3
Muestra
F1
F2
F3
OQDM G11 C0541 (904) CS
Valor promedio
extinción
0,036
0,102
0,282
HBeAg-Version
Intraassay
Interassay
%CV
%CV
6,4
11,4
3,8
9,3
4,1
8,7
Valor promedio
extinción
1,421
0,808
0,458
Anti-HBe-Version
Intraassay
Interassay
%CV
%CV
3,6
6,3
3,2
3,4
7,4
4,4
45
Tab. 6 Realización y programación de la prueba
Enzygnost* HBe monoclonal
Detección de HBeAg/Anti-HBe
Procedimiento
Menú de programación
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
para
BEP® II
Preparación de reactivos
HBeAg
100 µl
muestra o control
BEP® II
HBeAg
MENU NO
Anti-HBe
BEP® 2000 OPERATE 1
Anti-HBe
75 µl
Reactivo HBeAg, positivo
YES
DOSIFICACIÓN
REACTIVO
HBEAG
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
0
NO
0
0
0
NO
0
NO
0
075
3
NO
OPERATE 2
YES
LAVADO Y DOSIFICACIÓN DEL
CONJUGADO
Completar las placas
a medio armar hasta
la mitad con
«elementos con agua»
2 x lavar: BEP® II
WASHINGS
2
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVADO Y DOSIFICACIÓN DEL
CHROMÓGENO
100 µl de conjugado
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
4 x lavar: BEP® II
realización
automática del test
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
100 µl sol. de cromógeno
lista para usar
YES
DOSIFICACIÓN SOLUCIÓN DE
PARADA
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
30 min ± 2 min
entre +18 y + 25 °C
protegido de la luz
100 µl sol. de parada
después de 1 hora
Valoración a 450 nm
(longitud de onda de
referencia: 650 nm)
Resultado de la prueba
OQDM G11 C0541 (904) CS
NO
25 µl
BEP® III
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
HBeAg Anti-HBe
46
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0,100
0,050
YES
450
650
NO
4
NO
4
--0,400
0,5
0,150
-----
Enzygnost* HBe monoclonal
Campo de aplicação
Teste imunoenzimático para determinação do antígeno da hepatite Be e de anticorpos contra o antígeno da
hepatite Be no soro e plasma.
O processamento do teste imunoenzimático faz-se com os processadores ELISA BEP® II, BEP® III e BEP®
2000. O teste foi desenvolvido para a análise de amostras individuais, não de amostras de pool. O produto só
pode ser utilizado para efeitos de diagnóstico in vitro.
Significado diagnóstico
O antígeno HBe e o anticorpo correspondente Anti-HBe encontram-se exclusivamente em caso de uma infecção
pelo vírus da hepatite B. O antígeno HBe pode frequentemente indicar uma infecção aguda, encontra-se no
entanto igualmente em hepatites crónicas (1, 2). Ele surge logo na fase inicial de uma infecção pela hepatite B e
é detectável mediante um ensaio imunológico sensível pouco depois de, e muitas vezes quase simultaneamente
com o aumento do HBsAg no soro (3, 4).
O título de ambos os antígenos, HBsAg e HBeAg, aumenta rapidamente durante a fase da multiplicação do
vírus. A concentração do antígeno HBe desce porém mais cedo do que a do antígeno HBs - em regra 6 a 10
semanas após o seu aparecimento - abaixo do limite de detecção mesmo de métodos muito sensíveis (4, 5).
Enquanto o HBeAg circular no soro, podem detectar-se também outros parâmetros serológicos de uma doença
hepática (p. ex. transaminases elevadas).
Nos casos em que o HBeAg persiste no soro para além do tempo normal de eliminação - sempre correlacionados com uma persistência de HBsAg - há que contar com o surto de uma hepatite crónica agressiva (6, 7). É
este o motivo por que o controlo da evolução do HBeAg assume especial relevância prognóstica numa infecção
aguda pelo vírus da hepatite B (8, 9).
Se uma infecção pelo vírus da hepatite B decorre sem complicações e a fase de convalescença já teve início,
o HBeAg deixa de ser detectável. Um resultado negativo de HBeAg é possível porém não somente nesta fase
pós-infecciosa, mas também na fase inicial de uma infecção aguda antes da replicação máxima do vírus (1, 2,
10). O aparecimento de anti-HBe pode ser um critério de diferenciação destas duas fases. A seroconversão
de “HBeAg positivo” em “anti-HBe positivo” é prognosticamente um bom sinal de reconvalescença ou decurso
livre de complicações. Tais pacientes continuam no entanto sendo portadores de HBsAg, podendo por isso
desenvolver uma hepatite crónico-persistente (7, 11).
A detecção positiva de Anti-HBe sem a detecção simultânea de HBsAg e HBeAg é sinal de uma infecção
anterior pelo vírus da hepatite B (5).
Princípio metodológico
Determinação de HBeAg
O ensaio imunoenzimático para determinação de antígeno HBe no soro ou plasma baseia-se no princípio
“sandwich”: O antígeno HBe presente na amostra sob teste fixa-se ao anticorpo monoclonal fixado à superfície
das cavidades das placas de microtitulação. Após lavagem, numa segunda reacção, fixam-se os anticorpos
anti-HBe monoclonais, conjugados com peroxidase, aos determinantes antigénicos ainda livres.
Após eliminação, por lavagem, do excesso de conjugado, é determinada a actividade enzimática ligada do
conjugado. A transformação enzimática do substrato e cromógeno (reacção cromática azul) é interrompida
por adição da solução de bloqueio POD (reacção cromática amarela). A intensidade cromática é proporcional
à concentração de HBeAg presente na amostra.
Determinação de Anti-HBe
Na determinação de anti-HBe, os anticorpos anti-HBe presentes na amostra bloqueiam o HBeAg adicionado
com o reagente HBeAg, positivo. Na subsequente determinação de HBeAg, nenhum ou pouco HBeAg é
detectável em amostras anti-HBe positivas. A intensidade cromática da amostra é inversamente proporcional
à concentração de anti-HBe existente.
Limite de sensibilidade do teste
Empregando-se o preparado de referência do Instituto Paul Ehrlich, o limite de sensibilidade de Enzygnost*
HBe monoclonal para HBeAg é de ≤ 1,5 U/ml e para anti-HBe ≤ 1 U/ml.
OQDM G11 C0541 (904) CS
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Edição Fevereiro 2004
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
Enzygnost* HBe monoclonal
1 x 96
Enzygnost* Anti-HBe monoclonal (Placa de ensaio):
1 placa de ensaio
Conjugado Anti-HBe/POD, monoclonal:
1 x 13 ml
Reagente HBeAg, positivo:
1 x 13 ml
Controlo Anti-HBe, positivo:
1 x 1,5 ml
Controlo HBe, negativo:
1 x 2,5 ml
Solução de lavagem POD (concentrado)**:
1 x 100 ml
Tampão-substrato TMB**:
1 x 30 ml
Cromógeno TMB**:
1 x 3 ml
Solução de paragem POD**:
1 x 100 ml
Frasco vazio para a solução de trabalho do cromógeno
1 unidade
Folhas adesivas
6 unidades
Bolsa de PE
1 unidade
Tabela de código de barras
1 unidade
Folheto da embalagem
1 unidade
** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentes acidionais para Enzygnost* TMB (ref. OUVP).
Composição
Enzygnost* Anti-HBe monoclonal (Placa de ensaio): Placa de microtitulação revestida com anticorpos
monoclonais contra HBeAg.
Conjugado Anti-HBe/POD, monoclonal: Anti-HBe monoclonal, conjugado com peroxidase (POD).
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Reagente HBeAg, positivo: Antígeno HBe obtido por tecnologia genética, estabilizado com albumina do soro
bovino e Synperonic®, liofilizado; valor indicativo de extinção: v. Validação; concentração: 8 ± 5 U HBeAg/ml
após reconstituição.
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Controlo Anti-HBe, positivo: Soro humano com anticorpos monoclonais contra o antígeno HBe; valor indicativo de extinção: v. Validação; concentração: 30 ± 20 U Anti-HBe/ml
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Controlo HBe, negativo: Soro humano negativo para a determinação de HBeAg e de anti-HBe; valor indicativo de extinção: v. Validação
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Solução de lavagem POD (concentrado): Tampão de fosfato (90 mmol/l)com Tween (18 g/l)
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Tampão/substrato TMB: Peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em tampão de acetato (25 mmol/l)
Conservante: 1-butanol (máx. 10 ml/l)
Cromógeno TMB: Diidrocloreto de tetrametilbenzidina (5 g/l)
Solução de bloqueio POD: Ácido sulfúrico 0,5 N
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro
2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de soros de controlo foi previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, do Anti-HCV, Anti-HIV1 e do Anti-HIV2. Na elaboração só são utilizados soros com resultado negativo.
No entanto, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manuseados com as precauções
devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco biológico, uma vez que
nunca se pode excluir inteiramente o risco de contaminação por agentes patogénicos (12).
3. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste.
4. Para descontaminação de materiais sólidos, aconselha-se uma autoclavagem durante pelo menos 1 hora
a uma temperatura de, pelo menos, + 121 °C. Todas as soluções aspiradas devem ser recolhidas em dois
recipientes ligados em série, os quais devem conter um desinfectante apropriado para inactivação de
vírus humano-patogénicos. Observem-se as concentrações e os tempos de incubação indicados pelo
fabricante.
Preparação dos reagentes
Antes de iniciar o teste, levar todos os reagentes e amostras à temperatura de + 18 a + 25 °C, mas sem tirar
a placa de ensaio do seu recipiente.
Para cada placa de ensaio, diluir 20 ml da solução de lavagem POD (concentrado) com água destilada ou
desionizada até obter 400 ml.
Solução de uso do cromógeno: Diluir, por placa, 1 ml de cromógeno TMB com 10 ml de tampão/substrato TMB no frasco de plástico anexo à embalagem (solução de uso do cromógeno)e conservá-lo fechado e ao
abrigo da luz. Depois do uso, lavá-lo cuidadosamente com água destilada.
Dada a capacidade dos frascos, não passar todo o conteúdo do frasco de cromógeno TMB para o de tampão/
substrato TMB!
OQDM G11 C0541 (904) CS
48
Solução de uso do reagente HBeAg, positivo: Antes de iniciar o ensaio, reconstituir um frasco de reagente
HBeAg, positivo com 13 ml de água destilada ou desionizada. Agitar suavemente e controlar até que o
reagente se tenha dissolvido completamente (aprox. 30 min).
Estabilidade e condições de conservação
Não abertos, e enquanto conservados entre +2 e +8 °C, todos os componentes do kit Enzygnost* Anti-HBe
monoclonal se mantêm utilizáveis até ao termo do prazo de validade indicado nos rótulos.
Sobre estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso, v. tabela 1 em
apêndice.
Materiais adicionais necessários
Aparelhos necessários
para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases de lavagem
BEP® II:
Processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem das amostras
BEP® III:
para o processamento e interpretação do teste, de forma inteiramente automática.
BEP® 2000:
Pipetas:
pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µl
Incubador:
Banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação comparáveis
Todos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados.
Material a investigar
Para a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/Heparina/Citrato),
colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão ser conservadas durante de 3 dias,
no máximo, entre 2 - 8 °C. Se se pretender conservá-las durante um período de tempo superior, deverão ser
congeladas.
Procedimento
Realização do teste com o BEP® II (para determinação de HBeAg)
1. Esquema de distribuição: Determinar o número necessário de poços (número das amostras a investigar
mais 6 poços para controlos). Retirar do suporte as fileiras de poços desnecessárias e reservá-las para
ulterior utilização (v. tabela 1).
2. Distribuição das amostras: Pipetar em 4 poços (A1 a D1) 100 µl, em cada um, de controlo HBe, negativo, em 1 poço 100 µl de reagente HBeAg, positivo, nos poços seguintes 100 µl, em cada um, de amostra
não diluída e no fim da série ou da placa novamente 100 µl de soro de reagente HBeAg, positivo.
Alternativamente ao esquema de distribuição acima indicado pode também pipetar-se o reagente HBeAg,
positivo, dois vezes no início da série de teste.
Esquema de distribuição: Em 4 poços 100 µl, em cada um, de controlo HBe, negativo, em 2 poços (E1 e
F1) 100 µl, em cada um, de reagente HBeAg, positivo, e nos poços seguintes 100 µl, em cada um, de
amostra e cobrir com folha adesiva.
3. Incubação das amostras: Deixar incubar durante 60 ± 2 min a + 37 ± 1 °C.
4. Lavagem: Retirar a folha adesiva, aspirar o conteúdo de todos os poços e lavar cada um 2 vezes (v.
Advertência) com aprox. 0,3 ml, de cada vez, de solução diluída de lavagem. Proceder imediatamente à
dosificação do conjugado.
5. Distribuição do conjugado: Distribuir em cada poço 100 µl de conjugado anti-HBe/POD, cobrir a placa
de ensaio com nova folha adesiva e colocar imediatamente na incubadora.
6. Incubação do conjugado: Deixar incubar durante 60 ± 2 min a + 37 ± 1 °C, imediatamente a seguir dar
início à lavagem.
7. Lavagem: Retirar a folha adesiva e, como descrito em 4., lavar 4 vezes.
8. Distribuição do substrato: Distribuir 100 µl de solução de uso do cromógeno em cada poço, cobrir a
placa com nova folha adesiva.
9. Incubação do substrato: Deixar incubar durante 30 ± 2 min ao abrigo da luz entre + 18 e + 25 °C.
10. Reacção de bloqueio: Retirar a foloha adesiva. Acrescentar a cada poço 100 µl de solução de bloqueio
POD, mantendo o mesmo ritmo que em 8.
11. Leitura: Fazer uma medição fotométrica a 450 nm dentro de 1 hora.
É aconselhável empregar um fotómetro com dois comprimentos de onda (um de medição e outro de referência).
Efectuar a medição das extinções (absorvências) das amostras de controlo e das dos pacientes a 450 nm;
como comprimento de onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre 615 e 690 nm).
Realização do teste com o BEP® II (para determinação de Anti-HBe)
1. Esquema de distribuição: Determinar o número necessário de poços (número das amostras a investigar
mais 6 poços para controlos). Retirar do suporte as fileiras de poços desnecessárias e reservá-las para
ulterior utilização (v. tabela 1).
OQDM G11 C0541 (904) CS
49
2. Distribuição das amostras: Pipetar em 4 poços (A1 a D1), 25 µl em cada um, de controlo HBe, negativo,
em 1 poço 25 µl de controlo anti-HBe, positivo, nos poços seguintes, 25 µl em cada um, de amostra não
diluída e no fim da série ou da placa novamente 25 µl de controlo anti-HBe, positivo.
Alternativamente ao esquema de distribuição acima indicado pode-se também pipetar o controlo antiHBe, positivo, dois vezes no início da série de teste.
Esquema de distribuição: Em 4 poços, 25 µl em cada um, de controlo HBe, negativo, em 2 poços (E1 e
F1), 25 µl em cada um, de controlo Anti-HBe, positivo, e nos poços seguintes 25 µl, em cada um, da
amostra em teste.
3. Fixação do Anti-HBe: Imediatamente após a dosificação das amostras, juntar a cada poço com 25 µl de
amostra ou de controlo 75 µl de solução de uso do reagente HBeAg positivo, e cobrir com folha adesiva.
Continuar analogamente à Execução do teste para determinação de HBeAg, isto é, com o ponto 3 “Incubação
das amostras”.
Realização do teste com o BEP® III
No caso do processamento ser feito com BEP® III é necessário preparar as placas de ensaio incluindo a
dosagem das amostras (ponto 1 e 2 da “execução do teste com BEP® II"). Imediatamente a seguir, as placas
de ensaio são colocadas no BEP® III abertas, ou seja, sem película colada. Ao mesmo tempo, é necessário
prestar atenção a que as placas de ensaio parcialmente providas de ”barras de água” sejam acrescentadas
até ficarem, no mínimo, pelo meio ( 6 barras de água). O processamento subsequente do teste realiza-se
automaticamente (vide instruções de serviço do BEP® III).
Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustados no software
do BEP® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP® II, mas foram validados na combinação BEP® III/Enzygnost* .
Realização do teste com o BEP® 2000
A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste são efectuados de forma totalmente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP® 2000).
Validação do teste
Os valores de extinção dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores médios, se:
Determinação de HBeAg
-0,010 ≤ Eneg ≤ 0,100
Epos ≥ 0,800
Determinação de anti-HBe
Eneg ≥ 0,400
-0,010 ≤ Epos ≤ 0,150
Dos valores de extinção dos controlos negativos,
pode mostrar-se um só fora dos limites
especificados e ser ignorado.
Os valores de extinção do reagente HBeAg, positivo,
têm de estar ambos dentro dos limites especificados.
Dos valores de extinção dos controlos negativos,
pode mostrar-se um só fora dos limites
especificados e ser ignorado.
Dos valores de extinção do controlo Anti-HBe,
positivo, pode mostrar-se um só fora dos limites
especificados e ser ignorado.
Não estando preenchidas estas condições, há que repetir o teste.
Valoração
As interpretações são realizadas automaticamente com o BEP® 2000 ou o BEP® III. Para o efeito, consultar as
instruções de serviço. Para uma interpretação sem a ajuda do software, é necessário prestar atenção aos
seguintes capítulos.
Determinação de HBe
Para calcular o valor-limite adicionar 0,050 ao valor médio de extinção dos controlos negativos:
–
Eneg. + 0,050 = valor-limite (cut off)
Determinação de anti-HBe
Para calcular o valor-limite multiplicar por 0,5 o valor médio de extinção dos controlos negativos:
–
Eneg. x 0,5 = valor-limite (cut off)
De acordo com os critérios do teste, as amostras são classificadas do seguinte modo:
Resultados para HBeAg
Resultados para anti-HBe
1. Eamostra
1. Eamostra
< cut off - 10%
= HBeAg negativo
2. cut off - 10% ≤ Eamostra ≤ cut off + 10%
= HBeAg duvidoso
> cut off + 10%
3. Eamostra
= HBeAg positivo
< cut off + 10%
= Anti-HBe negativo
2. cut off - 10% ≤ Eamostra ≤ cut off + 10%
= Anti-HBe duvidoso
> cut off - 10%
3. Eamostra
= Anti-HBe positivo
Amostras com resultado duvidoso têm ser sujeitas a novo teste, desta vez porém numa dupla determinação.
Se, na repetição do teste, o valor médio da dupla determinação for superior ou igual ao valor-limite, ou então
inferior a ele, não se tomará em conta o resultado inicialmente tido por duvidoso e a amostra será considerada
reactiva ou negativa, respectivamente.
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50
Limitações do Procedimento
1. Anticoagulantes como heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste.
2. Amostras lipémicas, ictéricas ou que contenham factor reumatóide não prejudicam o teste.
3. No caso de amostras hemolíticas não é de excluir reactividade elevada.
4. As amostras com anticorpos de IgM contra EBV, HAV, o vírus do sarampo e as amostras contendo ANA
não influenciam o resultado do teste.
5. Não foi observada qualquer influência sobre o resultado do teste com amostras de pacientes hemofílicos.
6. As amostras de pacientes dialisados e as amostras positivas com auto-anticorpos podem apresentar
reactividade elevada.
7. Não empregar soros insuficientemente coagulados nem amostras contaminadas.
8. Amostras inactivadas pelo calor (1 h, 56° C)acusam, devido à desnaturação do antígeno HBe, valores
mais baixos na determinação do antígeno e por isso não devem ser usadas.
9. Amostras descongeladas devem estar bem homogeneizadas.
10. Os reagentes (com excepção da solução de lavagem POD, da solução de interrupção POD e da solução
de uso do cromogénio, preparada esta última a partir dos reagentes específicos de cada lote Cromogénio
TMB e Tampão/substrato TMB) só podem ser utilizados como constituintes de um mesmo lote, isto é,
somente na combinação de 6 cifras (N.° de lote) que vem impressa na embalagem e indicada na Tabela
de código de barras adjunta.
11. O tampão/substrato TMB, a solução de de uso do cromogénio e a solução de bloqueio POD não devem
entrar em contacto com iões de metais pesados nem com substâncias oxidantes (não usar pipetas com
partes metálicas portadoras de líquido). Não efectuar a reacção do substrato na proximidade de desinfectantes que contenham hipoclorito. Uma coloração azul espontânea da solução de uso do cromógeno
antes de esta ser colocada na placa de ensaio é indício de contaminação; deverá então preparar-se uma
solução fresca num recipiente limpo. Evite-se o contacto cutâneo com as soluções acima mencionadas.
12. Durante a incubação deve manter-se a placa de ensaio imóvel (p. ex. sobre um suporte fixo ou num
banho-maria sem circulação de água); deste modo as cavidades mantêm-se em contacto com a água
temperada. Caso se utilizem estabilizadores para evitar uma contaminação da água, tomar todo o cuidado para que nem a superfície da placa de ensaio nem os receptáculos entrem em contacto com estas
soluções, pois tais contaminações podem produzir reacções inespecíficas.
13. Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão, podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste.
14. A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuito de optimizar
o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. As modificações definidas pelo
utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medida em que podem afectar o desempenho do
sistema e os resultados do ensaio. Constitui responsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou em relação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos
nas folhas de instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização.
15. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse.
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51
Características do teste
Sensibilidade e especificidade
Os resultados das provas de sensibilidade e especificidade encontram-se resumidos nas tabelas 2 + 4 (em
apêndice).
Para averiguação da sensibilidade foram investigadas 216 amostras HBeAg pos. e 224 anti-HBe pos. em 2
exames independentes. Os valores médios de sensibilidade são os seguintes:
Sensibilidade
Enzygnost* HBe monoclonal
Inicialmente reactivo
Reactivo na repetição
Versão HBeAg
Versão Anti-HBe
98,1%
97,8%
99,1%
99,1%
Para averiguação da especificidade foram investigadas 2502 amostras HBeAg neg. e 2406 anti-HBe neg. em
2 exames independentes. Os valores médios de especificidade são os seguintes:
Especificidade
Enzygnost* HBe monoclonal
Inicialmente negativo
Negativo na repetição
Versão HBeAg
Versão Anti-HBe
99,4%
99,6%
99,5%
99,8%
Valores divergentes destes são também possíveis, dependendo isso, entre outros factores, do colectivo testado ou da modalidade de execução do teste.
Reprodutibilidade
Os resultados para a reprodutibilidade em intra/inter-assay estão resumidos na Tabela 5 (em apêndice).Estes
dados devem ser compreendidos somente a título de exemplo. Eles podem variar em função da modalidade de
execução do teste ou de outros factores.
*
Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países.
BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros países.
Synperonic e uma marca registada da ICI.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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52
0197
Tab. 1 Estabilidade e condições de conservação
Enzygnost* HBe monoclonal
Material/Reagente
Enzygnost* Anti-HBe monoclonal
(Placa de ensaio)
Estado
aberto
Conjugado Anti-HBe/POD mcl.
aberto
Reagente HBeAg, pos.
reconstituído
Controlo Anti-HBe, pos.
Controlo HBe, negativo
Cromógeno TMB
Tampão/Substrato TMB
Solução de uso do cromógeno
aberto
Solução de lavagem POD
(concentrado)
aberto
aberto
1 + 10
não diluída
aberto
1 : 20
1 : 20
aberto
Solução de bloqueio POD
Conservação
+2 a +8 °C
no saco com
cápsulas desidratantes
+2 a +8 °C
+18 a +25 °C
+2 a +8 °C
-20 °C
+2 a +8 °C
-20 °C
+2 a +8 °C
+2 a +8 °C
+2 a +8 °C
+18 a +25 °C
recipiente
fechado, ao
abrigo da luz
+2 a +8 °C
2 a +8 °C
+18 a +25 °C
+2 a +8 °C
Estabilidade•
4 semanas
4 semanas
2 dias
4 semanas
3 meses
4 semanas
3 meses
até termo da validade
até termo da validade
5 dias
8 horas
até termo da validade
1 semana
1 dia
até termo da validade
•
Nunca depois de expirado o prazo de validade!
Tab. 2 Sensibilidade
Resultados do exame da sensibilidade fornecidos por 2 centros independentes (K, M):
Colectivo de
amostras
(M) HBeAg pos.
(K) HBeAg pos.
Número de
amostras
109
107
(M) anti-HBe pos.
(K) anti-HBe pos.
96
128
Enzygnost* HBe monoclonal
Inicialmente
Reactivo na
reactivo
repetição
108
109
104
105
93
126
95
127
Tab. 3 Tricky Panel
Colectivo de
amostras
HBeAg pos.
anti-HBe pos.
Número de
amostras
65
112
Enzygnost* HBe monoclonal
Inicialmente
Reactivo na
reactivo
repetição
59
59
105
107
Estes colectivos compõem-se maioritariamente de amostras da faixa de transição BeAg/Anti-HBe. Os reduzidos valores da sensibilidade podem ser atribuíveis à formação de imunocomplexos.
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Tab. 4 Especificidade
Resultados do exame da especificidade fornecidos por 3 centros independentes (K, M, L):
Colectivo de amostras
(M) Soros neg. normais
Plasmas neg. normais
(K) Soros neg. normais
(L) Soros neg. de pacientes
não-HBV
Soros neg. de pacientes HBV
Soros críticos••
(M) Soros neg. normais
Plasmas neg. normais
(K) Soros neg. normais
(L) Soros neg. de pacientes
não-HBV
Soros neg. de pacientes HBV
Soros críticos••
Enzygnost* HBe
monoclonal
Número de Inicialmente Reactivo na
amostras
reactivo
repetição
804
3
3
396
0
0
528
0
0
584
8
7
124
66
791
387
521
572
5
0
2
1
1
1
3
0
1
0
1
0
78
57
4
1
2
1
Versão
HBeAg
Versão
Anti-HBe
•• Amostras com potenciais factores de perturbação, p. ex. auto-anticorpos, amostras hemolíticas e ictérica
Tab. 5 Reprodutibilidade
Resultados do exame da reprodutibilidade realizado em 5 dias com 8 determinações por dia. Cálculo do
coeficiente de variação (CV) segundo o modelo dos componentes de va-riação.
Amostra
F1
F2
F3
Amostra
F1
F2
F3
OQDM G11 C0541 (904) CS
Densidade
óptica média
0,036
0,102
0,282
Versão HBeAg
Intra-série
Inter-série
%CV
%CV
6,4
11,4
3,8
9,3
4,1
8,7
Densidade
óptica média
1,421
0,808
0,458
Versão Anti-HBe
Intra-série
Inter-série
%CV
%CV
3,6
6,3
3,2
3,4
7,4
4,4
54
Tab. 6 Execução e programação do ensaio
Enzygnost* HBe monoclonal
Determinação de HBeAg/Anti-HBe
Execução
Programação do
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
Menu para o
BEP® II
Preparação dos reagentes
HBeAg
100 µl
Amostra ou controlo
®
BEP® 2000 OPERATE 1
BEP III
Anti-HBe
75 µl
Reagente HBeAg, positivo
placas incompletas:
completar até meia
placa com fileiras
de poços com água
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
BEP® II: lavar 2 x
conjugado: 100 µl
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
BEP® II: lavar 4 x
Processamento
automático
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
0
NO
0
0
0
NO
YES
DOSAGEM
REAGENTE
HBEAG
0
NO
0
075
3
NO
OPERATE 2
YES
LAVAGEM E DOSAGEM DO
KONJUGADO
WASHINGS
2
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGEM E DOSAGEM DO
CHROMÓGENO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
solução de uso do
cromógeno: 100 µl
YES
DOSAGEM DA SOLUÇÃO DE BLOQUEIO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
30 min ± 2 min
(+18 a + 25 °C
ao abrigo da luz)
solução de bloqueio: 100 µl
após máx. 1 hora
Leitura a 450 nm
(comprimento de onda
de referência: 650 nm)
Resultado do teste
OQDM G11 C0541 (904) CS
HBeAg Anti-HBe
25 µl
®
BEP II
HBeAg
MENU NO
Anti-HBe
55
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0,100
0,050
YES
450
650
NO
4
NO
4
--0,400
0,5
0,150
-----
Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
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Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles /
Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
IVD
LOT
EXP
CCYY-MM-DD
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical
Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario
para Diagnóstico In Vitro
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de
Lote
Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de
vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de
Catálogo
Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice
d'Utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as
Instruções de Utilização
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