Enzygnost* Anti-HBs II
Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative
detection of antibodies to hepatitis B surface antigen (HBsAg) in
serum and plasma
Enzymimmunoassay zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B surface Antigen (HBsAg)
in Serum und Plasma
Test immunoenzymatique qui permet la mise en évidence qualitative et quantitative des anticorps anti-antigène de surface de
l’hépatite B (AgHBs) dans le sérum ou le plasma
Metodo immunoenzimatico per l’identificazione qualitativa e la
determinazione quantitativa degli anticorpi contro l’antigene di
superficie dell’epatite B nel siero e nel plasma.
Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativa y
cuantitativa del anticuerpo contra el antígeno de superficie de la
hepatitis B (HBsAg) en suero y en plasma
____________________________
Determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos contra o
antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) no soro e
no plasma.
English:
Deutsch:
Français:
Italiano:
Español
Português:
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Summary of Test Procedure
Kurzanleitung Testdurchführung
La technique en bref
Istruzioni in breve, esecuzione del Test
Resumen de la técnica
Resumo da técnica
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Bibliography/Literatur/Littérature
Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
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fino
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Edition February 2004
Enzygnost* Anti-HBs II
Intended Use
Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative detection of antibodies to hepatitis B
surface antigen (HBsAg) in serum and plasma.
The enzyme immunoassay is processed using the BEP® II, BEP® III and BEP® 2000 ELISA
processors. The test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. The
product is for in vitro diagnostic use only. The product is for in vitro diagnostic use only.
Summary and Explanation
Like hepatitis B surface antigen (HBsAg), the anti-HBs antibody directed against the surface
protein is an important parameter for the diagnosis of infection with hepatitis B virus (HBV)1,2.
During the incubation period and in the acute phase of HBV infection, antibodies to HBsAg are
undetectable. In 90% of all cases these anti-HBs antibodies, which provide immunity, do not
occur until late in convalescence approx. 3 to 4 months after the onset of the disease, when
circulating HBsAg can no longer be detected3, 4.
This seroconversion, i.e. the transition from anti-HBs negative to positive, represents a very
reliable parameter for diagnosing a past HBV infection, especially since approx. 10% of acutely
infected patients in whom no HBsAg can be detected in the early phase later become positive for
anti-HBs. The anti-HBs test is therefore also suitable for the diagnosis for subclinical HBV
infections3, 4.
As a positive result for anti-HBs is indicative of past exposure to this antigen - either by HBV
infection or by vaccination, the most important applications of the anti-HBs test are as follows:
a) assessment of convalescence and, to a certain extent, also prognosis in patients infected with
HBV (follow-up),
b) serological investigations in the context of vaccination programmes (screening and
immunization check-ups),
c) epidemiological studies.
Besides the qualitative detection of anti-HBs, the quantitative evaluation of anti-HBs has gained
its own relevance with regard to the aspect of active immunization. According to a
recommendation of the WHO, a person vaccinated with a hepatitis vaccine can be assumed to
be protected against the infection if an anti-HBs concentration of > 10 IU/L can be detected in the
serum or plasma. Booster vaccinations in time are recommended to guarantee that the values
are not below this limit5, 6, 7.
Patients found to have anti-HBs values < 100 IU/L after the completion of basic immunization
require booster vaccination within one year (Recommendations of the Standing Vaccination
Comittee of the Robert Koch Institute in Germany, October 1995).
The necessity of a quantitative assessment is furthermore underlined by the fact that the
duration of immunity is proportional to the attained levels of anti-HBs.
Principle of the Method
Enzygnost* Anti-HBs II is a one-step assay based on the sandwich principle. The antigen used
for the solid phase and conjugate is human HBsAg.
Peroxidase-labelled HBsAg binds to the HBs-specific antibodies contained in the sample. These
bind to the HBsAg bound to the surface of the microtitration plate (antigen sandwich).
The unbound constituents are removed by washing and the bound enzyme activity of the
conjugate is then determined. The enzymatic conversion of substrate and chromogen results in
a blue colour. The reaction is terminated by the addition of Stopping Solution POD, producing a
yellow colour. The intensity of the colour is proportional to the concentration of antibody in the
sample. The results are quantified by calculation using the α-method or by comparison with a
standard curve.
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Edition February 2004
Reagents
Materials provided
Enzygnost* Anti-HBs II
1 x 96
10 x 96
Enzygnost*
1 test plate
1 x 6 mL
1 x 1.5 mL
2 x 14 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pcs.
6 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
10 test plates
10 x 6 mL
3 x 1.5 mL
5 x 14 mL
2 x 100 mL
4 x 30 mL
4 x 3 mL
2 x 100 mL
1 pcs.
24 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
Anti-HBs II
HBsAg/POD Conjugate (Anti-HBs II)
Anti-HBs Serum 100
Anti-HBs Serum, negative
Washing Solution POD (Concentrate)**
Buffer/Substrate TMB**
Chromogen TMB**
Stopping Solution POD**
Empty bottle for Working Chromogen Solution
Adhesive foils
PE bag
Barcode table of values
Instructions for use
Further packs: 100 x 96
** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit
(code no. OUVP).
Composition
Enzygnost* Anti-HBs II (test plate): Microtitration plate coated with inactivated HBsAg
(subtypes ad and ay) isolated from human blood.
HBsAg/POD Conjugate (anti-HBs II): Inactivated HBsAg, peroxidase (POD)-conjugated,
isolated from human blood, Tris (approx. 100 g/L), NaCl (approx. 47 g/L)
Preservative:
phenol (max. 1 g/L)
Anti-HBs Serum 100: Human anti-HBs serum (nominal concentration 100 ± 25 IU/L), calibrated
against the WHO Reference Preparation, nominal absorbance: ≥ 0.7
Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L),
gentamicin (approx. 100 mg/L)
Anti-HBs Serum, negative: Human serum, nominal absorbance: ≤ 0.12
Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L),
gentamicin (approx. 100 mg/L)
Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution (90 mmol/L) containing
Tween.
Preservative:
phenol (max. 1 g/L)
Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/L) in acetate buffer solution
(25 mmol/L)
Preservative:
n-butanol (approx. 10 mL/L)
Chromogen TMB: Tetramethyl benzidinedihydrochloride (5 g/L)
Stopping Solution POD: 0.5 N sulfuric acid
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Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Each individual blood donation for use in manufacture of the controls of Enzygnost* Anti-HBs
II is tested for HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2. Only donations with negative
findings are used for manufacture.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained
from human blood should be handled with due care, observing the precautions recommended
for biohazardous material8.
3. The HBsAg used in the manufacture of the test plates and POD conjugate was isolated from
HBsAg-positive human plasmas, which were found to be negative concerning Anti-HCV, AntiHIV1 and Anti-HIV2, to a high degree of purity and subjected to a recognized inactivation
process.
4. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.
5. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at
least one hour at +121 °C. All aspirated liquids should be collected in two receptacles
connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating
pathogenic human viruses. The concentrations and times specified by the manufacturer must
be observed.
Preparation of the Reagents
Bring all the reagents and samples to +15 to +25 °C before beginning the test (without removing
the test plate from the container).
Test strips not needed for the test must be removed from the holder and stored for later use (see
Table 1)
For each test plate, dilute 20 mL of Washing Solution POD to 400 mL with distilled or deionized
water.
For each test plate, dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10 mL of Buffer/Substrate TMB in
the empty bottle supplied with the kit (= Working Chromogen Solution) and store protected from
light. After use rinse the bottle thoroughly with distilled water.
For technical reasons (overage) it is not permissible to transfer the contents of the Chromogen
TMB vial into the vial of Buffer/Substrate TMB.
Prediluting the samples: For the quantitative test, samples expected to contain anti-HBs
concentrations of ≥ 100 IU/L should be diluted as follows:
1:10 (e.g. 20 µL sample + 180 µL Anti-HBs Serum, negative)
up to 1000 IU/L: Dilute
up to 10,000 IU/L: Dilute
1:100 (e.g. 20 µL sample + 180 µL Anti-HBs Serum, negative;
20 µL thereof + 180 µL Anti-HBs Serum, negative)
up to 100,000 IU/L: Dilute 1:1000 (e.g. 20 µL sample + 180 µL Anti-HBs Serum, negative;
20 µL thereof + 180 µL Anti-HBs Serum, negative;
20 µL thereof + 180 µL Anti-HBs Serum, negative).
If the quantitative evaluation of the test is performed using serial dilutions, the following dilutions
of the Anti-HBs Serum 100 must be additionally prepared with the Anti-HBs Serum, negative
(does not apply if evaluation is by the α-method):
50 IU/L: 1:2 dilution (e.g. 200 µL Anti-HBs Serum 100 + 200 µL Anti-HBs Serum, negative)
25 IU/L: 1:4 dilution (e.g. 150 µL of the 50 IU/L Serum + 150 µL Anti-HBs Serum, negative)
10 IU/L: 1:10 dilution (e.g. 50 µL Anti-HBs Serum 100 + 450 µL Anti-HBs Serum, negative)
5 IU/L: 1:20 dilution (e.g. 150 µL of the 10 IU/L Serum + 150 µL Anti-HBs Serum, negative)
Storage and Stability
Stored unopened at +2 to +8 °C, all components of the Enzygnost* Anti-HBs II kit may be used up
to the dates of expiry given on the labels.
Once opened or diluted ready for use, the details given in Table 1 in the Appendix apply.
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Equipment required:
BEP® II:
BEP® III:
For automatic dispensing of reagent and washing
For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for
evaluation
BEP® 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test
Pipettes:
piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µL.
Incubator:
Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods
All the equipment used in the test must have been validated.
Specimens
Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma)
obtained by standard laboratory techniques.
The samples should be stored for not more 3 days at 2 - 8 ° C. If the samples are to be stored for
a longer period of time, they must be frozen.
Procedure
Procedure using the BEP® II
1. Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of test samples plus 6
wells for the controls).
2. Dispense samples:
Qualitative Test/Quantitative Test (α - method):
Into 4 wells (A1 to D1) pipette 100 µL/well of Anti-HBs Serum, negative, and into one well (E1)
100 µL of Anti-HBs Serum 100. Fill each of the subsequent wells with 100 µL/well of sample.
At the end of the series/plate, fill one further well with 100 µL of Anti-HBs Serum 100.
Perform the pipetting steps swiftly within 15 min per test plate.
Important: It is NOT permitted to pipette the Anti-HBs Serum 100 into the assigned wells
first and then to add the samples into the "gaps" between the wells.
Quantitative Test (standard series):
Pipette into 4 wells 100 µL/well of Anti-HBs Serum, negative, and then fill the 100, 50, 25, 10
and 5 IU/L dilutions of the Anti-HBs Serum into 2 wells each at 100 µL/well. Fill the following
wells with 100 µL/well of sample (prediluted if required).
Immediately after dispensing the samples continue by dispensing the conjugate.
3. Dispense conjugate: Pipette 25 µL of the HBsAg/POD Conjugate (Anti-HBs II) into each
well.
Then seal with foil and, immediately after completion of the conjugate dispensing step, place
the plate into the incubator.
4. Incubate: Incubate at 37 ± 1 °C for 60 ± 2 min. Then proceed immediately to the wash step.
5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 mL/well of
washing solution. After completing the wash cycles proceed immediately to the substrate
dispensing step in order to prevent drying out of the wells.
6. Dispense substrate: Pipette 100 µL of the Working Chromogen Solution into each well and
seal the plate with fresh foil.
7. Incubate: Incubate protected from light at +15 to +25 °C for 30 ± 2 min.
8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µL of Stopping Solution POD to each well, keeping
to the same timing as in Step 6.
9. Read: Read at 450 nm within one hour. The recommended wavelength for the reference
measurement is 650 nm (where appropriate, between 615 and 690 nm).
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5
Test procedure using the BEP® III
Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2
at "Test procedure with the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates
(i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to
be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then
processed fully automatically (see BEP® III instruction manual).
The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the
BEP® II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the
BEP® III.
Test procedure using the BEP® 2000
The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically by the analyzer (see BEP® 2000 instruction manual).
Validation of the test
The individual values of the absorbances of the control sera are used for calculating the mean
values if:
–0.010 ≤ Aneg
≤ 0.120
AAnti-HBs Serum 100 ≥ 0.7
If one of the four absorbance values of the negative controls is outside the specification, this
value can be neglected.
Both absorbance values of the Anti-HBs Serum 100 must comply with the specification.
If these conditions are not fulfilled, the test must be repeated.
For the quantitative test the following validation criteria apply:
If serial dilutions are used:
Aneg ≤ A standard 5 IU/L
If the α - method is used:
The individual absorbance readings for the Anti-HBs Serum 100 are used to calculate the mean, if:
lower margin < A Anti-HBs Serum 100 < upper margin
The values for the lower and upper margins are given in the enclosed table of values.
Both absorbance values of the Anti-HBs Serum 100 must fulfil the specification.
In addition, the individual values must not differ by more than 20% from the mean of these two values.
If these conditions are not met, the test can only be evaluated qualitatively.
Evaluation
The evaluations are performed automatically if using the BEP® 2000 and BEP® III. Please
consult the relevant instruction manuals. The following sections apply if the measurements are
carried out without using a software.
Qualitative test:
Calculate the mean absorbance of the negative controls, then calculate the cut-off limit by
adding 0.08:
–
Aneg+0.08 = Cut-off
The test samples are classed as follows based on the criteria of the test:
1. Asample
< cut-off = Anti-HBs negative
2. Asample
≥ cut-off = Anti-HBs positive
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6
Quantitative test (α - method):
A correction factor is calculated for each individual processed test plate and used to correct the
absorbance reading of each sample (measurement correction). The corrected readings are then
used to calculate the antibody activity (see "Calculation of the results").
Measurement correction
The correction factor is calculated from the following formula:
Correction factor =
Nominal value
––––––––––––––––––––––––––––
Mean value of Anti-HBs Serum 100
The nominal value is given in the enclosed table of values. The absorbance readings of the test
samples are multiplied by the correction factor. The corrected readings obtained are then used to
calculate the results.
If several test plates are run, the correction factor has to be determined for each plate
separately and used to correct the readings for the appropriate plate.
Calculation of the results
To calculate the antibody activities the corrected readings of the samples are used in the
following formula (α-method):
log10 mIU/L = α .Aβ
where α and β and are lot-dependent constants given in the enclosed table of values. The
antibody activity result in "IU/L" relates to the WHO International HBV Reference Serum.
Important:
DO NOT use the following in the formula:
- corrected readings < cut-off
- uncorrected readings > 2.5
Calculation example
Value given for α
Value given for β
Corrected reading of a test sample
log10 mIU/L (from above formula) gives
and the antilog (=mIU/L) is
and the antibody activity (IU/L) is
4.8239
0.1054
0.950
4.7979
62790
62.79
(see note 1)
(see note 2)
(see note 3)
note 1: If a pocket calculator is used: input 0.950, press xY, input 0.1054, press =, press x, input 4.8239,
and press =
note 2: After calculating the number in the previous line, press either the 10X key or the INV and log keys.
note 3: To convert to IU/L the prior number must be divided by 1000.
If the test sample was prediluted (e.g. 1:11) for the test, then the calculated antibody activity (not
the signal reading) must be multiplied by 11.
Quantitative test (standard series)
For the quantitative evaluation, calculate the mean absorbances from each pair of wells in the
standard series (5, 10, 25, 50 and 100 IU/L) and use these values to establish a reference curve
on double logarithmic paper. Abscissa: Anti-HBs concentration 5 to 100 IU/L. Ordinate:
Absorbance 0.05 to 2.0. The anti-HBs concentrations of the samples can then be read from the
reference curve on the basis of their absorbances.
If the samples were used in diluted form, the concentration read from the reference curve must
be multiplied by the appropriate dilution factor.
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7
Limitations of the Procedure
1. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test.
2. Samples that are lipaemic, haemolytic, icteric or contain rheumatoid factors do not impair the
test results.
3. In the case of samples from pregnant women, no interference with the test result was
observed.
4. Samples containing the following potential sources of interference were checked in the test:
HBs antigen, ANA as well as antibodies to HCV, HAV, HBC, HBe, EBV and CMV. With the
samples used, no interference was observed with the test result.
5. No interferences were observed with heat-treated samples (30 min, 56 °C).
6. Serum from insufficiently coagulated blood, contain sodium azide or microbial contamination
should not be used. Any particulate components in the sample (e.g. fibrin clots) should be
removed before the test.
7. When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use.
8. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other
kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot
numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Washing Solution
POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this
requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from
matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a
different number).
9. Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution POD
must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do
not use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substrate
reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen
Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this
indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean
container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided.
10. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may
occur but this has no effect on the test result.
11. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on
a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in
contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination
of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come
into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions.
12. With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This does
not interfere with the photometric evaluation.
13. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product
performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported
by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the
responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents
on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these
instructions for use.
14. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical
history, clinical presentation and other findings.
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8
Specific Performance Characteristics
Sensitivity and Specificity
The results of the sensitivity and specificity studies are shown in Tables 2 + 3 (Appendix).
The diagnostic sensitivity was established by investigating 515 anti-HBs-positive samples, and
the sensitivity result was 100%. The reactivity of the test in respect to seroconversion samples /
vaccination profiles was investigated using 41 profiles. Here it was found that, in detecting
seroconversions/vaccination profiles, Enzygnost* Anti-HBs II exhibited a degree of sensitivity
comparable with other tests.
The analytical sensitivity of the test was established to be < 8 IU/L which was determined by
quantitative evaluation (standard curve) using the WHO Reference Preparation.
For establishing the specificity of the test, a total of 4736 anti-HBs-negative blood donor samples
were investigated and the result was 99.5 to 99.7%. Different values may be obtained in relation
to sample population, test procedure, and other factors.
Reproducibility
The results of the intra-/inter-assay reproducibility study are listed in Table 4 (in the Appendix).
These are exemplary data. Differing values may be well obtained depending on various factors
such as procedure, etc.
* Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other
countries.
BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and
other countries.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor: Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
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9
0197
Tab. 1 Storage and Stability
Material/reagent
State
Storage
Stability•
Enzygnost*
once opened
+2 to +8 °C
in the bag
with the desiccant
4 weeks
HBsAg/POD Conjugate (anti-HBs II)
once opened
+2 to +8 °C
4 weeks
Anti-HBs Serum 100
once opened
+2 to +8 °C
4 weeks
Anti-HBs II (Test plate)
Anti-HBs Serum, negative
< -20° C
3 months
expiry date
Chromogen TMB
once opened
+2 to +8 °C
Buffer/Substrate TMB
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
Working Chromogen Solution
diluted
1 + 10
+2 to +8 °C
+15 to +25 °C
in closed container
protected from light
5 days
8 hours
Washing Solution POD (concentrate)
once opened
diluted 1:20
diluted 1:20
+2 to +8 °C
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
expiry date
1 week
1 day
Stopping Solution POD
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
• use each component by the expiry date at the latest
Tab. 2 Sensitivity
The sensitivity studies, run at different sample panels, yielded the following data:
Number
of samples
106
52
25
Enzygnost* Anti-HBs II
reactive
106
52
25
Anti-HBs positive
100
100
Different stages of HBV infection
HBV vaccinees
anti-HBs positive
vaccination profiles
seroconversion
41
111
80
32 profiles
9 profiles
Sample population
Anti-HBs positive (Germany)
Anti-HBs positive (America)
Follow-up samples
41
111
80
Sensitivity equivalent
to that of
comparable tests
Tab. 3 Specificity
The specificity studies, run with samples from different blood banks, yielded the following data:
Sample population
Normal negative sera
Normal negative plasmas
Normal negative sera
Normal negative plasmas
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10
Number
of samples
2296
646
1508
286
Enzygnost* Anti-HBs II
reactive
11
2
5
1
Tab. 4 Reproducibility
In the studies on intra-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each
of 5 days at two independent centres (K, E). The CV were calculated by the variance component
model.
Sample
Enzygnost* Anti-HBs II
Mean ratio
% CV
(K) P1
0.3
13.0
P2
1.0
5.0
P3
3.1
2.6
P4
11.3
2.2
(E) F1
0.3
9.1
F2
1.0
4.7
F3
4.0
3.0
F4
9.1
4.8
F5
14.5
5.0
In the studies on inter-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each
of 5 days at two independent centres (K, E). The CV were calculated by the variance component
model.
Enzygnost* Anti-HBs II
Sample
Mean ratio
% CV
(K) P1
0.3
8.3
P2
1.0
4.1
P3
3.1
2.3
P4
11.3
3.6
(E) F1
0.3
12.9
F2
1.0
4.0
F3
4.0
2.2
F4
9.1
2.2
F5
14.5
2.5
Ratio = Absorbance / cut-off
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Tab. 5 Test procedure and programming
Enzygnost* Anti-HBs II
Menu programming
Test procedure
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
for the
BEP® II
Prepare reagents
BEP® 2000
4 x 100 µL Control Serum, negative
1 x 100 µL Control Serum, positive
100 µL per undiluted sample
1 x 100 µL Control Serum, positive
BEP® II
BEP® III
25 µL
Conjugate
In the case of partially filled
plates: Add water-filled
strips to make up to
half a plate
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
Wash 4x: BEP® II
100 µL Working
Chromogen Solution
Automatic
processing
30 min ± 2 min
+15 °C to +25 °C
protected from light
after max. 1 h
Evaluate at 450 nm
(Referencewavelength: 650 nm)
α-method
Test result
12
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DISPENSE CONJUGATE
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
WASH AND DISPENSE
CHROMOGEN
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISPENSE STOPPING SOLUTION
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µL Stopping Solution
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MENU NO
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0.120
0.08
-
Enzygnost * Anti-HBs II
Anwendungsbereich
Enzymimmunoassay zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) in Serum und Plasma.
Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP® II, BEP® III
und BEP® 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von
gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden.
Diagnostische Bedeutung
Ebenso wie das Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) ist auch der gegen das Oberflächenprotein
gerichtete Antikörper Anti-HBs ein wichtiger diagnostischer Parameter einer Infektion mit dem
Hepatitis B Virus (HBV) 1, 2.
Während der Inkubationszeit und der akuten Phase einer HBV-Infektion sind Antikörper gegen das
HBsAg nicht nachweisbar. Die Immunität verleihenden Antikörper Anti-HBs erscheinen in 90 %
aller Fälle erst in der späten Rekonvaleszenz ca. 3 bis 4 Monate nach Erkrankungsbeginn, wenn
zirkulierendes HBsAg bereits nicht mehr nachweisbar ist 3, 4.
Diese Serokonversion, d.h. der Übergang von Anti-HBs-negativ zu -positiv, stellt einen recht
zuverlässigen Parameter für eine überstandene HBV-Infektion dar, zumal auch ca. 10 % von
akut infizierten Patienten, bei denen in der Frühphase kein HBsAg nachweisbar ist, später AntiHBs-positiv werden. Daher eignet sich der Anti-HBs-Nachweis auch zur Diagnose von
inapparent verlaufenden HBV-Infektionen 3, 4.
Da ein positiver Nachweis von Anti-HBs auf eine vorausgegangene Exposition mit diesem Antigen entweder durch eine HBV-Infektion oder in Form eines Impfstoffes hinweist, ergeben sich
als wichtigste Anwendungen der Anti-HBs-Bestimmung die folgenden Untersuchungen:
a) Beurteilung der Rekonvaleszenz und in gewissem Umfang auch Prognose bei HBV-infizierten Patienten (Verlaufskontrolle).
b) Serologische Untersuchungen im Rahmen von Impfprogrammen (Screening und Immunisierungskontrolle).
c) Epidemiologische Erhebungen.
Neben dem qualitativen Anti-HBs-Nachweis hat die quantitative Ermittlung von Anti-HBs unter
dem Gesichtspunkt der aktiven Immunisierung eine eigene Bedeutung erlangt. Gemäß einer
Empfehlung der WHO kann von einem Infektionsschutz nach einer Schutzimpfung dann ausgegangen werden, wenn sich im Serum oder Plasma eine Anti-HBs-Konzentration von > 10 IU/l
nachweisen läßt. Es werden rechtzeitige Auffrischungsimpfungen empfohlen, um sicherzustellen, daß dieser Grenzwert nicht unterschritten wird 5, 6, 7.
Bei Anti-HBs Werten < 100 IU/l nach der Grundimmunisierung ist, gemäß den Impfempfehlungen
der Ständigen Impfkommision des Robert-Koch-Institutes (Deutschland) (STIKO, Stand Oktober
1995), eine Auffrischimpfung innerhalb eines Jahres indiziert.
Unterstrichen wird die Notwendigkeit einer Quantifizierung ferner durch die Tatsache, daß die
Dauer des Impfschutzes proportional zur erreichten Anti-HBs-Konzentration nach Impfung ist.
Prinzip der Methode
Bei Enzygnost* Anti-HBs II handelt es sich um einen nach dem Sandwich-Prinzip aufgebauten
Einschrittassay. Als Festphasen- und Konjugatantigen wird humanes HBsAg eingesetzt.
Peroxidase-markiertes HBsAg bindet sich an die in der Probe enthaltenen HBs-spezifischen
Antikörper. Diese binden sich an das an der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte gebundene
HBsAg (Antigen-Sandwich).
Nach Entfernung der ungebundenen Bestandteile durch Waschen wird die gebundene Enzymaktivität des Konjugates bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von Substrat und Chromogen
(blaue Farbreaktion) wird durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe
Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional. Die Quantifizierung erfolgt durch Berechnung nach der α-Methode oder durch Vergleich mit einer Standardkurve.
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Ausgabe Februar 2004
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
Enzygnost* Anti-HBs II
Enzygnost*
Anti-HBs II
HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBs II)
Anti-HBs-Serum 100
Anti-HBs-Serum, negativ
Waschlösung POD (Konzentrat)**
Puffer/Substrat TMB**
Chromogen TMB**
Stopplösung POD**
Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung
Abklebefolien
PE-Beutel
Barcodewertetabelle
Packungsbeilage
1 x 96
10 x 96
1 Testplatte
1 x 6 ml
1 x 1,5 ml
2 x 14 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 Stück
6 Stück
1 Stück
1 Stück
1 Stück
10 Testplatten
10 x 6 ml
3 x 1,5 ml
5 x 14 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1 Stück
24 Stück
1 Stück
1 Stück
1 Stück
Weitere Handelspackung: 100 x 96
** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost*
TMB (Bestell-Nr. OUVP).
Zusammensetzung
Enzygnost* Anti-HBs II (Testplatte): Mit inaktiviertem HBsAg (Subtypen ad und ay), das aus
Human-Blut isoliert wurde, beschichtete Mikrotitrationsplatte.
HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBs II): inaktiviertes HBsAg, Peroxidase (POD)-konjugiert aus
Human-Blut, Tris (ca. 100 g/l), NaCl (ca. 47 g/l)
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Anti-HBs-Serum 100: Anti-HBs-Humanserum (nominell 100 ± 25 IU/l), bezogen auf das WHOReferenz-Präparat, Extinktionsrichtwert: ≥ 0,7.
Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l)
Gentamicin (ca. 100 mg/l)
Anti-HBs-Serum, negativ: Humanserum, Extinktionsrichtwert: ≤ 0,12
Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l)
Gentamicin (ca. 100 mg/l)
Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l)
Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l)
Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung (25 mmol/l)
Konservierungsmittel: n-Butanol (max. 10 ml/l)
Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid (5 g/l)
Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung.
2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontrollen von Enzygnost* Anti-HBs II
vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie
auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter
Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden 8.
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3. Das zur Herstellung der Testplatten und des POD-Konjugates verwendete HBsAg wurde aus
HBsAg-positiven Human-Plasmen, die negativ hinsichtlich Anti-HCV, Anti-HIV1 und AntiHIV2 befundet wurden,
in hoher Reinheit isoliert und einem anerkannten
Inaktivierungsverfahren unterworfen.
4. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird
angeraten.
5. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das
geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden.
Vorbereitung der Reagenzien
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +15 bis +25 °C erwärmen. Dabei die Testplatte
nicht dem Behältnis entnehmen.
Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).
Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml
verdünnen.
Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Leerflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen.
Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Überführen des Flascheninhalts von Chromogen
TMB in die Abfüllung Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.
Vorverdünnung der Proben: Für die quantitative Testdurchführung sollten die Proben bei zu
erwartenden Anti-HBs-Konzentrationen von ≥ 100 IU/l wie folgt verdünnt werden:
Bis 1000 IU/l Verdünnung
1:10 (z.B. 20 µl Probe + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ).
Bis 10.000 IU/l Verdünnung 1:100 (z.B. 20 µl Probe + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus
20 µl + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ).
Bis 100.000 IU/l Verdünnung1:1000 (z.B. 20 µl Probe + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus
20 µl + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus
20 µl + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ).
Wenn die quantitative Testdurchführung mit einer Standardreihe durchgeführt wird, müssen von
dem Anti-HBs-Serum 100 zusätzlich folgende Verdünnungen mit dem Anti-HBs-Serum, negativ
hergestellt werden (gilt nicht für die Auswertung mit α-Methode):
50 IU/l: Verdünnung 1:2 (z.B. 200 µl Anti-HBs-Serum 100 + 200 µl Anti-HBs-Serum, negativ)
25 IU/l: Verdünnung 1:4 (z.B. 150 µl des 50 IU/l Serum + 150 µl Anti-HBs-Serum, negativ)
10 IU/l: Verdünnung 1:10 (z.B. 50 µl Anti-HBs-Serum 100 + 450 µl Anti-HBs-Serum, negativ)
5 IU/l: Verdünnung 1:20 (z.B. 150 µl des 10 IU/l Serum + 150 µl Anti-HBs-Serum, negativ)
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HBs II bei einer
Lagertemperatur von +2 bis +8 °C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar.
Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien
sind der Tabelle 1 in der Anlage zu entnehmen.
Erforderliche Geräte
BEP® II:
Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte
BEP® III:
Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung
BEP® 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung
Pipetten:
Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µl
Inkubator:
Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden
Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.
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Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollen
maximal 3 Tage bei 2 - 8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren.
Testdurchführung
Testdurchführung mit BEP® II
1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Vertiefungen feststellen (= Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefungen für die Kontrollen).
2. Proben-Dosierung:
Qualitativer Test/Quantitativer Test (α - Methode):
In 4 Vertiefungen (A1 bis D1) je 100 µl Anti-HBs-Serum, negativ, in eine Vertiefung (E1) 100 µl
Anti-HBs-Serum 100, in die folgenden Vertiefungen je 100 µl Probe und am Ende der Serie
bzw. Testplatte noch einmal 100 µl Anti-HBs-Serum 100 einpipettieren.
Die Pipettiervorgänge müssen zügig innerhalb von 15 min pro Testplatte durchgeführt werden.
Wichtig: Es ist unzulässig, zunächst das Anti-HBs-Serum 100 in die beiden vorgesehenen
Positionen zu pipettieren und anschließend die Proben "dazwischenzuschieben".
Quantitativer Test (Standardreihe):
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
In 4 Vertiefungen je 100 µl Anti-HBs-Serum, negativ und anschließend in jeweils 2 Vertiefungen je 100 µl des Anti-HBS-Serums entsprechend 100, 50, 25, 10 und 5 IU/l pipettieren. In die
folgenden Vertiefungen je 100 µl Probe (evtl. nach Bedarf vorverdünnt) dosieren.
Die Konjugat-Dosierung unmittelbar nach Beendigung der Proben-Dosierung anschließen.
Konjugat-Dosierung: In jede Vertiefung 25 µl des HBsAg/POD-Konjugates (Anti-HBs II) einfüllen. Anschließend mit Folie abkleben und die Platte unmittelbar nach Beendigung der
Konjugat-Dosierung in den Inkubator stellen.
Inkubation: 60 ± 2 min bei 37 ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung
4mal waschen. Nach Abschluß der Waschschritte die Substrat-Dosierung sofort anschließen,
um ein Eintrocknen zu vermeiden.
Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen,
Platte mit neuer Folie abkleben.
Substrat-Inkubation: 30 ± 2 min bei +15 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren.
Stoppreaktion: Die Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei
den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten.
Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggf. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen.
Testdurchführung mit BEP® III
Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung
(Punkt 1 und 2 der "Testduchführung BEP® II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss
daran werden die Testplatten offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III eingegeben.
Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe
Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung).
Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen
Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind
jedoch in der Kombination BEP®III/Enzygnost* validiert worden.
Testdurchführung mit BEP® 2000
Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP® 2000-Bedienungsanleitung).
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Testvalidierung
Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte
eingesetzt, wenn:
≤ 0,120
-0,010 ≤ Eneg.
EAnti-HBs-Serum 100 ≥ 0,7
Von den Extinktionswerten der negativen Kontrollen kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte des Anti-HBs-Serum 100 müssen beide
die Spezifikation erfüllen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen.
Für den quantitativen Test gelten folgende Validierungskriterien:
Bei Verwendung der Standardreihe:
Eneg. ≤ EStandard 5 IU/l
Bei Verwendung der α - Methode:
Die Einzelwerte der Extinktionen für das Anti-HBs-Serum 100 werden zur Berechnung des Mittelwertes eingesetzt wenn:
untere Toleranzgrenze < E Anti-HBs-Serum 100 < obere Toleranzgrenze
Die Werte für die untere und obere Toleranzgrenze sind in der beiliegenden Wertetabelle angegeben.
Beide Extinktionswerte des Anti-HBs-Serum 100 müssen die Spezifikation erfüllen.
Zusätzlich dürfen die Einzelwerte maximal 20 % vom Mittelwert dieser beiden Bestimmungen
abweichen.
Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test nur qualitativ auswertbar.
Testauswertung
Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten.
Qualitativer Test:
Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet.
Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen ein Wert von
0,08 addiert:
–
E neg. + 0,08 = Grenzwert (cut off)
Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:
1.
EProbe < cut off = Anti-HBs-negativ
2.
EProbe ≥ cut off = Anti-HBs-positiv
Quantitativer Test (α - Methode):
Für jeden einzelnen Testplattenansatz wird ein Korrekturfaktor ermittelt, mit dem der gemessene
Extinktionswert jeder Probe korrigiert wird (Meßwertkorrektur). Die korrigierten Meßwerte werden anschließend zur Berechnung der Antikörperaktivität eingesetzt (Ergebnisberechnung).
Meßwertkorrektur
Der Korrekturfaktor wird nach folgender Formel ermittelt:
Korrekturfaktor =
Nominalwert
–––––––––––––––––––––––––
Mittelwert Anti-HBs-Serum 100
Der Nominalwert ist in der beiliegenden Wertetabelle angegeben. Die Extinktionswerte der
Untersuchungsproben werden mit dem Korrekturfaktor multipliziert. Die erhaltenen korrigierten
Meßwerte werden dann zur Ergebnisberechnung eingesetzt.
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Bei mehreren Testplatten ist der Korrekturfaktor für jede Platte neu zu ermitteln und für die
entsprechende Korrekturrechnung einzusetzen.
Ergebnisberechnung
Die korrigierten Meßwerte der Untersuchungsproben werden zur Berechnung der Antikörperaktivität in die nachfolgende Formel eingesetzt (α - Methode):
β
log mIU/l = α . E
10
Die chargenabhängigen Konstanten α und β sind hierfür der beigepackten Wertetabelle zu entnehmen. Die Angabe der Antikörperaktivität in „IU/l“ bezieht sich auf das internationale HBVReferenzserum der WHO.
Achtung:
Zur Berechnung werden nicht eingesetzt:
- Meßwerte korrigiert < cut off
- Meßwerte unkorrigiert > 2,5
Rechenbeispiel
Rechenwert für α
Rechenwert für β
korrigierter Meßwert einer Untersuchungsprobe
log10 mIU/l (nach obiger Formel)
davon der Numerus (in mIU/l)
bzw. die Antikörperaktivität (IU/l)
4,8239
0,1054
0,950
4,7979
62 790
62,79
(siehe Anm. 1)
(siehe Anm. 2)
(siehe Anm. 3)
Anm. 1: Taschenrechnereingaben: 0,950 Taste xy, Eingabe 0,1054, Taste =, Taste x, Eingabe
4,8239, Taste =
Anm. 2: nach der vorstehend ermittelten Zahl dann entweder Taste 10x oder Tasten INV und log
betätigen.
Anm. 3: zur Umrechnung in die Einheit IU/l muß die vorstehende Zahl durch 1 000 geteilt werden.
Wurde die Untersuchungsprobe zur Bewertung vorverdünnt (z. B. 1:11), so ist die errechnete
Antikörperaktivität (nicht das Meßsignal) mit 11 zu multiplizieren.
Quantitativer Test (Standardreihe):
Zur quantitativen Auswertung werden die Extinktionsmittelwerte aus den Doppelbestimmungen
für die Standardreihe mit 5, 10, 25, 50 und 100 IU/l gebildet, und auf doppellogarithmischem
Papier wird eine Bezugskurve erstellt. Abszisse: Anti-HBs Konzentration 5 bis 100 IU/l. Ordinate:
Extinktion 0,05 bis 2,0. Aus der Bezugskurve werden anhand der einzelnen Extinktionen die
Anti-HBs Konzentrationen der Proben abgelesen.
Wurden die Proben verdünnt eingesetzt, so muß die auf der Bezugskurve abgelesene Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
Einschränkungen der Testdurchführung
1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht.
2. Lipämische, rheumafaktorhaltige, hämolytische oder ikterische Proben führen zu keiner
Testbeeinträchtigung.
3. Mit Proben von Schwangeren wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
4. Proben mit folgenden potentiell störenden Substanzen wurden mit dem Test überprüft: HBsAntigen, ANA sowie Antikörper gegen HCV, HAV, HBC, HBe, EBV und CMV. Mit den eingesetzten Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
5. Bei hitzebehandelten Proben (30 min, 56 °C) wurden keine Störungen beobachtet.
6. Ungenügend geronnene Seren, natriumazidhaltiges Probenmaterial und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z. B. Fibrin-Gerinnsel) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden.
7. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.
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8. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den
chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte
Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der
Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind.
9. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in
Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit
flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von
Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der
Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den
vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.
10. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.
11. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oder
im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten.
12. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflußt.
13. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf
optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren.
14. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem
klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Leistungsmerkmale des Tests
Sensitivität und Spezifität
Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 + 3 (im Anhang)
zusammengefaßt.
Bei der Ermittlung der diagnostischen Sensitivität wurden insgesamt 515 Anti-HBs-positive Proben untersucht und eine Sensitivität von 100 % ermittelt. Die Reaktivität des Testes bei
Serokonversionsproben/Impfverläufen wurde anhand von 41 Verläufen untersucht. Dabei zeigte
sich, daß Enzygnost* Anti-HBs II eine Sensitivität bezüglich der Erkennung von Serokonversionen/
Impfverläufen aufweist, die der Empfindlichkeit vergleichbarer Teste entspricht.
Die analytische Sensitivität wurde bei quantitativer Auswertung (Standardkurve) am WHO-Referenz-Präparat mit < 8 IU/l ermittelt.
Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 4736 Anti-HBs-negative Blutspendeproben
untersucht und eine Spezifität von 99,5 bis 99,7 % ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich.
Reproduzierbarkeit
Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u.a. sind durchaus abweichende Werte möglich.
* Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und
anderen Ländern.
BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland
und anderen Ländern.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQNE G11 C0541 (906) H/R
19
0197
Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Lagerung
Stabilität•
+2 bis +8 °C
im Beutel mit
Trockenkapseln
4 Wochen
HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBsII) nach Öffnen
+2 bis +8 °C
4 Wochen
Anti-HBs-Serum 100
+2 bis +8 °C
4 Wochen
Material/Reagenz
Enzygnost*
Zustand
Anti-HBs II (Testplatte) nach Öffnen
nach Öffnen
Anti-HBs-Serum, negativ
< -20 °C
3 Monate
Chromogen TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Puffer/Substrat TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Chromogen-Gebrauchslösung
verdünnt
1 + 10
+2 bis +8 °C
+15 bis +25 °C
geschlossenes
Gefäß
lichtgeschützt
5 Tage
8 Stunden
Waschlösung POD (Konzentrat)
nach Öffnen
verdünnt 1:20
verdünnt 1:20
+2 bis +8 °C
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
bis Verfallsdatum
1 Woche
1 Tag
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Stopplösung POD
nach Öffnen
• in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum
Tab. 2 Sensitivität
Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden anhand von unterschiedlichen Probenkollektiven folgende Daten ermittelt:
Enzygnost* Anti-HBs II
Probenkollektiv
Probenanzahl
reaktiv
Anti-HBs positiv (Deutschland)
Anti-HBs positiv (Amerika)
Verlaufskontrollproben
106
52
25
106
52
25
Anti-HBs positiv
100
100
verschiedene Stadien einer HBV-Infektion
HBV-Geimfte
Anti-HBs-positiv
Impfverläufe
Serokonversion
41
111
80
32 Verläufe
9 Verläufe
41
111
80
Sensitivität entspricht
der Empfindlichkeit
vergleichbarer Teste
Tab. 3 Spezifität
Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden anhand von Proben unterschiedlicher Blutbanken folgende Daten ermittelt:
Enzygnost* Anti-HBs II
Probenkollektiv
Probenanzahl
reaktiv
normal negative Seren
normal negative Plasmen
2296
646
11
2
normal negative Seren
normal negative Plasmen
1508
286
5
1
OQNE G11 C0541 (906) H/R
20
Tab. 4 Reproduzierbarkeit
Bei den Untersuchungen zur Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden an zwei unabhängigen
Zentren (K, E) die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die VK-Berechnung erfolgte nach dem Varianzkomponentenmodell.
Probe
Enzygnost* Anti-HBs II
Ratio-Mittelwert
% VK
(K) P1
0,3
13,0
P2
1,0
5,0
P3
3,1
2,6
P4
11,3
2,2
(E) F1
0,3
9,1
F2
1,0
4,7
F3
4,0
3,0
F4
9,1
4,8
F5
14,5
5,0
Bei den Untersuchungen zur Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden an zwei unabhängigen
Zentren (K, E) die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die VK-Berechnung erfolgte nach dem Varianzkomponentenmodell.
Probe
Enzygnost* Anti-HBs II
Ratio-Mittelwert
% VK
(K) P1
0,3
8,3
P2
1,0
4,1
P3
3,1
2,3
P4
11,3
3,6
(E) F1
0,3
12,9
F2
1,0
4,0
F3
4,0
2,2
F4
9,1
2,2
F5
14,5
2,5
Ratio = Extinktion/Grenzwert
OQNE G11 C0541 (906) H/R
21
Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung
Enzygnost* Anti-HBs II
Menüprogrammierung
Testdurchführung
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
für den
BEP® II
Vorbereitung der Reagenzien
BEP® 2000
4 x 100 µl Kontroll-Serum, negativ
1 x 100 µl Kontroll-Serum, positiv
je 100 µl unverdünnte Probe
1 x 100 µl Kontroll-Serum, positiv
BEP® II
BEP® III
teilbestückte Platten mit
„Wasserriegeln“ auf halbe
Platten ergänzen
25 µl Konjugat
60 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
4 x Waschen: BEP® II
100 µl ChromogenGebrauchslösung
automatische
Testabarbeitung
30 min ± 2 min
+15 °C bis +25 °C
lichtgeschützt
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DOSIERUNG KONJUGAT
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
WASCHEN UND DOSIERUNG
CHROMOGEN
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DOSIERUNG STOPPLÖSUNG
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl Stopplösung
nach maximal 1 h
Auswertung 450 nm
(Referenzwellenlänge: 650 nm)
α-Methode
Testergebnis
OQNE G11 C0541 (906) H/R
MENU NO
22
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0.120
0.08
-
Enzygnost*Anti-HBs II
Domaine d’utilisation
Test immunoenzymatique qui permet la mise en évidence qualitative et quantitative des
anticorps anti-antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs) dans le sérum ou le plasma.
Le test immunoenzymatique s’effectue à l’aide des ELISA Processors BEP® II, BEP® III et BEP®
2000. Il a été mis au point pour l’analyse d’échantillons individuels et non pas d’échantillons
poolés. Les réactifs ne peuvent être utilisés qu’à des fins de diagnostic in vitro.
Intérêt diagnostique
Tout comme l’antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs), l’anticorps anti-HBs dirigé contre la
protéine de surface constitue également un marqueur biologique important de l’infection par le
virus de l’hépatite B (HBV) 1, 2.
Pendant le temps d’incubation et la phase aiguë d’une infection à HBV, les anticorps anti-HBs ne
peuvent être révélés. Les anticorps anti-HBs qui confèrent l’immunité n’apparaissent dans 90%
des cas que dans la période de convalescence tardive, env. 3 à 4 mois après le début de la
maladie, alors que l’AgHBs circulant ne peut déjà plus être mis en évidence 3, 4.
Cette séroconversion, c’est-à-dire le passage d’un état anti-HBs-négatif à un état anti-HBspositif, constitue un paramètre très fiable pour confirmer la guérison d’une infection à HBV, et ce
d’autant plus qu’env. 10% des patients infectés de façon aiguë et chez qui l’AgHBs n’a pu être
mis en évidence dans la phase précoce, deviennent plus tard anti-HBs-positifs. Aussi la mise en
évidence d’anti-HBs permet-elle aussi le diagnostic d’infections à HBV asymptomatiques 3, 4.
Dans la mesure où la mise en évidence d’anti-HBs indique un contact ancien avec cet antigène,
soit par une infection à HBV soit par un vaccin, voici les principales indications d’un dosage
d’anti-HBs :
a) évaluation de la convalescence et, dans certains cas, pronostic pour les patients infectés par
l’HBV (contrôle d’évolution),
b) études sérologiques dans le cadre de programmes de vaccination (dépistage et contrôle
d’immunisation),
c) sondages épidémiologiques.
Outre la mise en évidence qualitative de l’anti-HBs, son dosage quantitatif a acquis un intérêt
particulier pour l’immunisation active. Conformément à une recommandation de l’OMS, une personne vaccinée contre l’hépatite peut être considérée comme protégée d’une infection si son taux
sérique ou plasmatique d’anti-HBs est > 10 UI/ml. Il est recommandé d’effectuer des injections de
rappel suffisamment tôt pour ne pas passer en dessous de cette valeur-seuil (10 UI/l) 5, 6, 7.
Les patients dont les valeurs d’anti-HBs sont trouvées < 100 UI/l après l’immunisation de base
doivent subir une injection de rappel dans l’année qui suit (recommandations de la Commission
permanente de Vaccination de l’Institut Paul-Ehrlich, Allemagne, Octobre 1995).
La nécessité d’une quantification est également renforcée par le fait que la durée de la
protection est proportionnelle à la concentration d’anti-HBs mesurée après la vaccination.
Principe de la méthode
L’Enzygnost* Anti-HBs II est un test en une étape basé sur le principe sandwich. L’antigène de la
phase solide et l’antigène du conjugué sont de l’AgHBs humain.
L’AgHBs marqué à la peroxydase se lie aux anticorps anti-HBs-spécifiques présents dans
l’échantillon. Ceux-ci se lient à l’AgHBs fixé à la surface de la plaque de microtitration (antigène
sandwich).
Après élimination par lavage des éléments non liés, on mesure l’activité enzymatique liée du
conjugué. La transformation enzymatique du substrat et du chromogène (réaction colorée bleue)
est interrompue par l’addition de la Solution d’arrêt POD (coloration jaune). L’intensité de la
coloration est proportionnelle à la concentration d’anticorps dans l’échantillon. La quantification
se fait par un calcul selon l’α-méthode ou par comparaison avec une courbe d’étalonnage.
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23
Edition Février 2004
Réactifs
Contenu du coffret
Enzygnost* Anti-HBs II
1 x 96
10 x 96
Enzygnost*
1 plaque-test
1 x 6 ml
1 x 1,5 ml
2 x 14 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 pièce
6 pièce
1 pièce
1 pièce
1 pièce
10 plaques-test
10 x 6 ml
3 x 1,5 ml
5 x 14 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1 pièce
24 pièce
1 pièce
1 pièce
1 pièce
Anti-HBs II
Conjugué AgHBs/POD (Anti-HBs II)
Sérum Anti-HBs 100
Sérum Anti-HBs négatif
Solution de lavage POD (concentrée)**
Tampon/substrat TMB**
Chromogène TMB**
Solution d’arrêt POD**
Flacon vide pour solution d’emploi du chromogène
Feuilles adhésives
Sachet PE
Tableau de codes à barres
Fiche technique
Autre conditionnement : 100 x 96
** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB
(code OUVP).
Composition
Enzygnost* Anti-HBs II (plaque-test) : plaque de microtitration recouverte d’AgHBs inactivé
(sous-types ad et ay), isolé à partir de sang humain.
Conjugué AgHBs/POD (Anti-HBs II) :
AgHBs inactivé, conjugué à la peroxydase (POD),
obtenu à partir de sang humain, Tris (env. 100 g/l),
NaCl (env. 47 g/l).
Agent de conservation :
phénol (max. 1 g/l)
Sérum Anti-HBs 100 :
antisérum humain anti-HBs (contenant nominalement
100 ± 25 UI/l), par rapport à la préparation de
référence de l’OMS, valeur de D.O. indicative : ≥ 0,7.
Agents de conservation :
amphotéricine (env. 5 mg/l)
gentamycine (env. 100 mg/l)
Sérum Anti-HBs négatif :
sérum humain, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,12
Agents de conservation :
amphotéricine (env. 5 mg/l)
gentamycine (env. 100 mg/l)
Solution de lavage POD (concentrée) : solution tampon phosphate contenant du Tween (90
mmol/l)
Agent de conservation :
phénol (max. 1 g/l)
Tampon/substrat TMB :
peroxyde d’hydrogène (env. 0,1 g/l) en solution
tampon acétate (25 mmol/l)
Agent de conservation :
n-butanol (env. 10 ml/l)
Chromogène TMB :
tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure (5 g/l)
Solution d’arrêt POD :
acide sulfurique 0,5 N
OQNE G11 C0541 (906) H/R
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Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro
2. Tout don de sang prévu pour la préparation des contrôles de l’Enzygnost* Anti-HBs II est
soumis à une recherche de l'AgHBs, d’anti-VHC, d’anti-VIH1 et d’anti-VIH2. Seuls les dons
trouvés négatifs sont utilisés.
Indépendamment de cela, toute préparation obtenue à partir de sang humain doit être
manipulée avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où
on ne peut exclure totalement tout risque d’infection8.
3. L'AgHBs hautement purifié utilisé pour la préparation des plaques-tests et du Conjugué POD
est isolé à partir de plasmas humains positifs en AgHBs, et trouvés négatifs en anti-VHC, antiVIH1 et anti-VIH2. Il est ensuite inactivé selon un procédé reconnu.
4. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test.
5. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à
+121°C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un à
l’autre et contenant chacun un désinfectant spécialement conçu pour inactiver les virus
pathogènes pour l’homme. Respecter les concentrations et temps d’incubation indiqués par
le fabricant.
Préparation des réactifs
Porter tous les réactifs et échantillons à +15/+25°C avant le début du test, sans sortir la plaquetest de son emballage.
Sortir du cadre les barrettes non utilisées dans le test, et les conserver pour un usage ultérieur
(cf. Tabl. 1).
Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l’eau distillée ou désionisée
en complétant à 400 ml.
Pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de Tampon/substrat TMB dans
le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution d’emploi du chromogène) et la conserver
dans le flacon fermé à l’abri de la lumière. Après emploi, bien rincer le flacon avec de l’eau
distillée.
Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d’un
flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB.
Prédilution des échantillons : pour une réalisation quantitative du test, et si on s’attend à des
concentrations d’anti-HBs ≥ 100 UI/l, diluer les échantillons comme suit :
1/10 (par ex. 20 µl d’échantillon + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif).
1/100 (par ex. 20 µl d’échantillon + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif;
puis 20 µl de cette dilution + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif).
Jusqu’à 100 000 UI/l : dilution au 1/1000 (par ex. 20 µl d’échantillon + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif;
puis 20 µl de cette dilution + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif;
puis 20 µl de cette dilution + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif).
Jusqu’à 1 000 UI/l : dilution au
Jusqu’à 10 000 UI/l : dilution au
Si la réalisation quantitative du test est faite à partir d’une série standard, préparer les dilutions
complémentaires suivantes du Sérum Anti-HBs 100 à l’aide du Sérum anti-HBs négatif (ne pas
le faire pour une exploitation selon l’α-méthode) :
50 UI/l: dilution au 1/2 (par ex. 200 µl de Sérum anti-HBs 100 + 200 µl de Sérum anti-HBs négatif)
25 UI/l: dilution au 1/4 (par ex. 150 µl des 50 UI/l du Sérum + 150 µl de Sérum anti-HBs négatif)
10 UI/l: dilution au 1/10 (par ex. 50 µl de Sérum anti-HBs 100 + 450 µl de Sérum anti-HBs négatif)
5 UI/l: dilution au 1/20 (par ex. 150 µl des 10 UI/l du Sérum + 150 µl de Sérum anti-HBs négatif)
Stabilités et conditions de conservation
Tous les éléments du coffret Enzygnost * Anti-HBs II conservés à +2/+8°C dans leur flacon ou
sachet d’origine non ouvert peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée sur l’étiquette.
Pour les stabilités et conditions de conservation des réactifs ouverts ou dilués à la dilution
d’emploi, se reporter au Tableau 1 en annexe.
OQNE G11 C0541 (906) H/R
25
Matériel nécessaire
BEP® II :
BEP® III :
pour la distribution automatique des réactifs et l’automatisation des étapes de lavage
pour l’automatisation du test après la distribution des échantillons et de l’exploitation
des résultats
BEP® 2000 : pour l’entière automatisation du test et de l’exploitation des résultats
Pipettes :
pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl.
Incubateur : bain-marie couvert (+37 ± 1°C) ou méthode d’incubation équivalente
Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé.
Echantillons à tester
Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA)
obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être
conservés 3 jours maximum à +2/+8°C. Pour une conservation plus longue, les congeler.
Réalisation du test
Réalisation du test sur le BEP® II
1. Schéma de distribution : déterminer le nombre de cupules nécessaires (= nombre
d’échantillons à tester, plus 6 cupules pour les contrôles).
2. Distribution des contrôles et échantillons :
Test qualitatif/Test quantitatif (α - méthode) :
Distribuer dans 4 cupules (A1 à D1) 100 µl de Sérum Anti-HBs négatif, dans 1 cupule (E1)
100 µl de Sérum Anti-HBs 100, dans les cupules suivantes 100 µl de chacun des échantillons,
puis en fin de série ou en fin de plaque de nouveau 100 µl de Sérum Anti-HBs 100.
Les pipetages doivent être enchaînés, et ne pas durer plus de 15 min par plaque.
Important : il n’est pas possible de distribuer d’abord le Sérum Anti-HBs 100 dans les 2
cupules prévues, puis les échantillons entre celles-ci.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Test quantitatif (chaque concentration du standard) :
distribuer 100 µl de Sérum anti-HBs négatif dans 4 cupules, 100 µl de chaque dilution du
sérum correspondant à 100, 50, 25, 10 et 5 UI/l dans 2 cupules, puis 100 µl de chacun des
échantillons (éventuellement prédilués) dans les cupules suivantes.
Enchaîner la distribution du conjugué immédiatement après celle des échantillons.
Distribution du conjugué : distribuer dans chaque cupule 25 µl de Conjugué AgHBs/POD
(Anti-HBs II).
Couvrir ensuite d’une feuille adhésive et placer la plaque dans l’incubateur immédiatement
après la distribution du conjugué.
Incubation : laisser incuber 60 ± 2 min à +37 ±1°C, et enchaîner immédiatement le
processus de lavage.
Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans
chacune d’elles env. 0,3 ml de Solution de lavage. Laver 4 fois. Dès la fin du processus de
lavage, distribuer immédiatement le substrat afin d’éviter tout dessèchement.
Distribution du substrat : ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du
chromogène, et couvrir d’une nouvelle feuille adhésive.
Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2 minutes à +15/+25°C à l’abri de la lumière.
Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de
Solution d’arrêt POD en respectant le même rythme qu’en 6.
Mesure : faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit à 450 nm. La longueur d’onde
de référence doit être de 650 nm (comprise entre 615 et 690 nm).
OQNE G11 C0541 (906) H/R
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Réalisation du test sur le BEP® III
Pour une utilisation sur le BEP® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la
distribution des échantillons (points 1 et 2 du paragraphe « Réalisation du test sur le BEP® II »).
Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une
feuille adhésive, dans le BEP® III. Si la plaque n’est pas totalement utilisée, la compléter au
moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La suite du test est ensuite
effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP® III).
Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP® III peuvent, du fait de conditions
techniques (cadence de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP® II. Ils ont toutefois été
validés dans la combinaison BEP® III/Enzygnost*.
Réalisation du test sur le BEP® 2000
La distribution des échantillons ainsi que toutes les étapes suivantes sont effectuées entièrement automatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP® 2000).
Validation du test
Calculer les valeurs moyennes des sérums de contrôle à partir des différentes valeurs mesurées si :
-0,010 ≤ D.O. nég.
≤ 0,120
D.O. Sérum Anti-HBs 100 ≥ 0,7
Pour le contrôle négatif, une valeur sortant du domaine indiqué peut être négligée.
Pour le Sérum Anti-HBs 100, les deux valeurs obtenues doivent se trouver dans le domaine
indiqué.
Si ces critères ne sont pas remplis, le test doit être recommencé.
Pour le test quantitatif, les critères de validation sont les suivants :
Avec une série standard :
D.O.nég. ≤ D.O. standard 5 UI/l
Avec l'α - méthode :
les valeurs de densité optique obtenues pour le Sérum Anti-HBs 100 peuvent être utilisées pour le
calcul de la valeur moyenne si :
limite inférieure < D.O.Sérum Anti-HBs 100 < limite supérieure
Les valeurs des limites inférieure et supérieure sont indiquées dans le tableau des valeurs ci-joint.
Chacune des deux valeurs de densité optique du Sérum Anti-HBs 100 doivent répondre au critère.
De plus, chacune des valeurs ne peut varier de plus 20% par rapport à la valeur moyenne des
deux dosages.
Si ces conditions ne sont pas remplies, seule une exploitation qualitative du test est possible.
Exploitation du test
Sur le BEP® 2000 et le BEP® III, le calcul des résultats se fait automatiquement. Suivre le
déroulement du manuel d’utilisation. Le protocole indiqué ci-après permet l’exploitation des
résultats sans aide de logiciel.
Test qualitatif :
Calculer la valeur moyenne des densités optiques du contrôle négatif.
Pour obtenir la valeur-seuil, ajouter 0,08 à la valeur moyenne du contrôle négatif :
–––
D.O.nég. + 0,08 = valeur-seuil (cut off)
Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit :
1.
D.O.échantillon < cut off = anti-HBs-négatif
2.
D.O.échantillon ≥ cut off = anti-HBs-positif
OQNE G11 C0541 (906) H/R
27
Test quantitatif (α - méthode):
Déterminer pour chaque plaque un facteur de correction qui permettra de corriger les valeurs
obtenues pour chacun des échantillons (correction de la valeur mesurée). Les valeurs corrigées
sont ensuite utilisées pour le calcul de l’activité en anticorps (calcul du résultat).
Correction de la valeur mesurée
Le facteur de correction est déterminé selon la formule suivante :
facteur de correction =
valeur nominale
––––––––––––––––––––––––––––––––
valeur moyenne du Sérum Anti-HBs 100
La valeur nominale est indiquée dans le tableau des valeurs joint à chaque coffret. Multiplier les
densités optiques des échantillons par le facteur de correction. Utiliser ensuite les valeurs
corrigées ainsi obtenues pour le calcul du résultat.
Si on utilise plusieurs plaques, déterminer un facteur de correction pour chaque plaque, et
l’utiliser pour le calcul de la correction.
Calcul du résultat
Pour le calcul de l’activité en anticorps, utiliser la formule suivante en prenant les valeurs
mesurées corrigées des échantillons (α-méthode) :
log10 mUI/l = α . D.O.β
Les constantes α et β, qui varient selon les lots, sont indiquées dans le tableau des valeurs cijoint. L’activité en anticorps, exprimée en «UI/l», se réfère à l'immunoglobuline anti-HBs de
référence internationale de l’OMS.
Attention :
pour le calcul, ne pas utiliser :
- les valeurs mesurées corrigées < cut off
- les valeurs mesurées non corrigées > 2,5
Exemple de calcul
valeur de calcul pour α
valeur de calcul pour β
valeur mesurée corrigée d’un échantillon
log10 mUI/l (selon formule ci-dessus)
soit la valeur (en mUI/l)
ou l’activité en anticorps (UI/l)
4,8239
0,1054
0,950
4,7979
62 790
62,79
(voir note 1)
(voir note 2)
(voir note 3)
note 1: données à entrer sur la calculette : 0,950 touche XY, entrer 0,1054, touche =, touche x,
entrer 4,8239, touche =
note 2: selon le chiffre obtenu ci-dessus, valider soit la touche 10x, soit les touches INV et log
note 3: pour convertir le résultat en UI/l, diviser le nombre obtenu par 1000.
Si l’échantillon a été prédilué (par ex. au 1/11), multiplier l’activité en anticorps calculée (et non
pas le signal de mesure) par 11.
Test quantitatif (de chaque concentration du standard) :
Pour l’exploitation quantitative, calculer la valeur moyenne de chaque concentration du standard
(5, 10, 25, 50 et 100 UI/l) testée en double, et tracer une courbe d’étalonnage sur papier
bilogarithmique. Abscisse: concentrations d’anti-HBs de 5 à 100 UI/l. Ordonnée: densités
optiques de 0,05 à 2,0. La courbe d’étalonnage permet de lire les concentrations en anti-HBs
des échantillons à partir des densités optiques obtenues.
Si les échantillons ont été testés dilués, multiplier la concentration lue sur la courbe d’étalonnage
par le facteur de dilution.
OQNE G11 C0541 (906) H/R
28
Limites du test
1. Les anticoagulants, comme l’héparine, l’EDTA ou le citrate, n’influencent pas le résultat du test.
2. Les échantillons lipémiques, hémolytiques, contenant des facteurs rhumatoïdes ou ictériques
ne perturbent pas le test.
3. Les échantillons de femmes enceintes n‘ont entraîné aucune influence sur les résultats du test.
4. Des tests ont été effectués avec des échantillons contenant les substances suivantes
pouvant entraîner des interférences : antigène HBs, ANA, et anticorps anti-VHC, anti-VHA,
anti-HBc, anti-HBe, anti-EBV et anti-CMV. Avec ces échantillons, aucune interférence n‘a
été observée sur les résultats du test.
5. On n’a pas observé de perturbations suite à l’utilisation d’échantillons traités à la chaleur (30
min à +56°C).
6. Ne pas utiliser de sérums insuffisamment coagulés ni d’échantillons contenant de l’azide de
sodium ou contaminés. Les particules éventuellement présentes (par ex. des caillots de
fibrine) doivent être éliminées avant le test.
7. Si on utilise des échantillons décongelés, bien veiller à leur homogénéisation.
8. Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la
solution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le
Chromogène TMB et le Tampon/substat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la
combinaison des numéros de lots à 6 chiffres indiqués sur le coffret et dans le tableau des
codes à barres joint.
9. Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi du chromogène et la Solution d’arrêt POD ne
doivent pas entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes
(ne pas utiliser de pipettes à parties métalliques). La réaction du substrat ne doit pas être
effectuée à proximité de désinfectants contenant de l’eau de Javel. Une coloration bleue
spontanée de la solution d’emploi du chromogène avant son transfert dans la plaque indique
une contamination ; préparer une nouvelle solution dans un récipient propre. Éviter tout
contact de la peau avec les solutions sus-mentionnées.
10. Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent donc
devenir trouble, sans que cela ait d’influence sur le résultat du test.
11. La plaque doit rester immobile pendant toute l’incubation (la placer par ex. sur un support
fixe ou dans un bain-marie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contact
avec l’eau thermostatée. Si l’eau contient des stabilisateurs pour éviter une contamination,
bien veiller à ce que ni la surface supérieure de la plaque ni l’intérieur des cupules n’entrent
en contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions non-spécifiques.
12. En cas d’échantillon fortement réactif, il peut y avoir précipitation lors de l’addition de la
Solution d’arrêt et du virage de la coloration, sans que cela ait d’influence sur l’exploitation
photométrique.
13. Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser
les performances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées
par l’utilisateur ne sont pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où elles
peuvent affecter les performances du système et les résultats des dosages. Il est de la
responsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ou
à l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocoles
d’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation.
14. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents
médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatations.
Caractéristiques du test
Sensibilité et spécificité
Les résultats de l’étude de sensibilité et de spécificité sont résumés dans les Tableaux 2 et 3 en
annexe.
Pour déterminer la sensibilité diagnostique, 515 échantillons anti-HBs-positifs ont été testés,
donnant une sensibilité de 100%. La réactivité du test vis-à-vis d’échantillons en cours de
séroconversion ou après une vaccination a été étudiée sur 41 échantillons. Dans ce domaine,
Enzygnost* Anti-HBs II a montré une sensibilité équivalente à celle des tests comparables.
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29
La sensibilité analytique a été obtenue par exploitation quantitative (courbe standard) d’après la
préparation de référence de l’OMS ayant une concentration < 8 UI/l.
Pour déterminer la spécificité, 4736 dons de sang anti-HBs-négatifs ont été testés, donnant une
spécificité comprise entre 99,5 et 99,7%. Selon le collectif étudié, la réalisation du test et
d’autres paramètres, on peut obtenir des valeurs divergentes.
Reproductibilité
Les résultats de l’étude de reproductibilité/répétabilité sont résumés dans le Tableau 4 en
annexe. Il s’agit de données indicatives. Des différences dans la réalisation du test par exemple
peuvent entraîner des valeurs divergentes.
* Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans
d’autres pays.
BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans
d’autres pays.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQNE G11 C0541 (906) H/R
30
0197
Tabl. 1 : Stabilités et conditions de conservation
Échantillons/réactifs
état
Enzygnost* Anti-HBs II (plaque-test) après ouverture
conservation
+2/+8°C
dans sachet avec
capsule dessicative
stabilité•
4 semaines
Conjugué HBsAg/POD (Anti-HBs II) après ouverture
+2/+8°C
4 semaines
Sérum Anti-HBs 100
+2/+8°C
4 semaines
<-20°C
3 mois
après ouverture
Sérum Anti-HBs négatif
Chromogène TMB
après ouverture
+2/+8°C
jusqu’à date
de péremption
Tampon/substrat TMB
après ouverture
+2/+8°C
jusqu’à date
de péremption
Solution d’emploi du chromogène
diluée au 1/11
+2/+8°C
+15/+25°C
dans récipient
fermé à l’abri
de la lumière
5 jours
8 heures
+2/+8°C
jusqu’à date
de péremption
1 semaine
1 jour
Solution de lavage POD (concentrée) après ouverture
Solution d’arrêt POD
diluée au 1/20
diluée au 1/20
+2/+8°C
+18/+25°C
après ouverture
+2/+8°C
jusqu’à date
de péremption
• jamais au-delà de la date de péremption
Tabl. 2 : Sensibilité
Des études de sensibilité effectuées sur des collectifs de différents échantillons ont permis de
déterminer les données suivantes :
Collectif d’échantillons
nombre d’échantillons
anti-HBs-positifs (Allemagne)
anti-HBs-positifs (Amérique)
échantillons de contrôle d’évolution
anti-HBs-positifs
106
52
25
100
différents stades d’une infection à HBV
HBV-vaccinés
Anti-HBs-positifs
suivis de vaccination
séroconversions
41
111
80
32 suivis
9 suivis
Enzygnost* Anti-HBs II
positif
106
52
25
100
41
111
80
sensibilité équivalente
à celle de tests
comparables
Tabl. 3 : Spécificité
Des études de spécificité effectuées sur des échantillons provenant de différentes banques du
sang ont permis de déterminer les données suivantes :
Enzygnost* Anti-HBs II
Collectif d’échantillons
nombre d’échantillons
positif
sérums normaux négatifs
plasmas normaux négatifs
2296
646
11
2
sérums normaux négatifs
plasmas normaux négatifs
1508
286
5
1
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31
Tabl. 4 : Reproductibilité
Dans le cadre de l’étude de répétabilité, les échantillons ont été testés 8 fois, à 5 jours différents,
dans deux centres indépendants (K, E). Le calcul du CV s’est fait par analyse de la variance.
Échantillons
Enzygnost* Anti-HBs II
valeur moyenne du ratio
CV %
(K) P1
0,3
13,0
P2
1,0
5,0
P3
3,1
2,6
P4
11,3
2,2
(E) F1
0,3
9,1
F2
1,0
4,7
F3
4,0
3,0
F4
9,1
4,8
F5
14,5
5,0
Dans le cadre de l’étude de reproductibilité, les échantillons ont été testés 8 fois, à 5 jours
différents, dans deux centres indépendants (K, E). Le calcul du CV s’est fait par analyse de la
variance.
Échantillons
Enzygnost* Anti-HBs II
valeur moyenne du ratio
CV %
(K) P1
0,3
8,3
P2
1,0
4,1
P3
3,1
2,3
P4
11,3
3,6
(E) F1
0,3
12,9
F2
1,0
4,0
F3
4,0
2,2
F4
9,1
2,2
F5
14,5
2,5
ratio = densité optique/valeur-seuil
OQNE G11 C0541 (906) H/R
32
Tabl. 5 : Réalisation du test et programmation
Enzygnost* Anti-HBs II
Réalisation du test
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
Programmation du menu
pour le
BEP® II
préparation des réactifs
BEP® 2000
4 x 100 µl de Sérum de contrôle négatif
1 x 100 µl de Sérum de contrôle positif
100 µl de chaque échantillon non dilué
1 x 100 µl de Sérum de contrôle positif
BEP® II
BEP® III
25 µl de conjugué
compléter éventuellement
la plaque à mi-plaque avec
des barrettes remplies d’eau
60 min à ± 2 min
(37 ± 1 °C)
4 lavages: BEP® II
100 µl de solution
d’emploi du chromogène
réalisation
automatique du test
30 min ± 2 min
+15 °C/+25 °C
à l’abri de la lumière
après 1 h maximum
exploitation à 450 nm
(longueur d’onde de
référence : 650 nm)
α-méthode
résultat du test
33
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DISTRIBUTION DU CONJUGUÉ
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGE ET DISTRIBUTION DU
CHROMOGÈNE
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISTRIBUTION DE LA SOLUTION
D'ARRÊT
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl de Solution d’arrêt
OQNE G11 C0541 (906) H/R
MENU NO
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0.120
0.08
-
Enzygnost* anti-HBs II
Settori d’impiego
Metodo immunoenzimatico per l’identificazione qualitativa e la determinazione quantitativa degli
anticorpi contro l’antigene di superficie dell’epatite B nel siero e nel plasma.
L’esecuzione del test immunoenzimatico avviene su processore ELISA BEP® II, BEP® III e BEP®
2000. Il test è stato sviluppato per l’analisi di campioni singoli e non per pool di campioni. Il
prodotto deve essere impiegato solo per scopi diagnostici in vitro.
Significato diagnostica
Come l’antigene di superficie dell’epatite B (HBsAg), anche l’anticorpo anti-HBs diretto contro la
proteina di superficie è un parametro importante per la diagnosi di infezione da virus dell’epatite
B (HBV) 1, 2.
Durante il periodo di incubazione e nella fase acuta dell’infezione da HBV, gli anticorpi antiHBsAg non sono evidenziabili. Gli anticorpi anti-HBs, che danno l’immunità, compaiono nel 90%
dei casi solo nella tarda convalescenza circa 3 o 4 mesi dopo l’insorgenza della malattia, quando
l’HBsAg circolante non è più evidenziabile 3, 4.
Questa sieroconversione, cioè il passaggio dell’anti-HBs da negativo a positivo, rappresenta un
parametro molto attendibile per la diagnosi di una infezione da HBV pregressa, tanto più che
circa il 10% dei pazienti con infezione acuta, per i quali l’HBsAg nella fase iniziale non è
rilevabile, diventa successivamente anti-HBs positiva. L’identificazione dell’anti-HBs è adatto
anche per la diagnosi delle infezioni subcliniche da HBV 3, 4.
La dimostrazione degli anticorpi anti-HBs indica una esposizione precedente con questo
antigene a causa di una infezione da HBV o in seguito a vaccinazione, ed è perciò importante
nelle seguenti ricerche:
a) valutazione della convalescenza, e in una certa misura, anche prognosi per pazienti con
infezione da HBV (controllo del decorso)
b) ricerca sierologica nel contesto dei programmi di vaccinazione (screening e controllo dello
stato di immunizzazione)
c) studi epidemiologici
Oltre alla identificazione qualitativa dell’anti-HBs, la determinazione quantitativa dell’anti-HBs
risulta rilevante dal punto di vista dell’immunizzazione attiva. Secondo le raccomandazioni del
WHO, si può presumere una protezione contro l’infezione in seguito a vaccinazione se nel siero
o nel plasma può essere riscontrata una concentrazione di anti-HBs superiore a 10 UI/L. Si
raccomanda di eseguire in tempo le vaccinazioni di richiamo per garantire che i valori non siano
al di sotto di questo limite5, 6, 7.
Pazienti con una concentrazione di anticorpi anti-HBs < 100 UI/L dopo il completamento della
vaccinazione di base, richiedono una vaccinazione di richiamo entro un anno. (Raccomandazioni della
Commissione Permanente per le Vaccinazioni dell’Istituto Robert Koch in Germania, ottobre 1995).
La necessità di una determinazione quantitativa risulta ulteriormente importante perché la
durata dell’immunità è proporzionale ai livelli di anti-HBs presenti.
Principio del metodo
L’Enzygnost* anti-HBs II è un test ad una fase secondo il metodo sandwich. L’antigene utilizzato
per la fase solida ed il coniugato è costituito da HBsAg umano.
L’HBsAg marcato con perossidasi si lega agli anticorpi specifici anti-HBs presenti nel campione
in esame. Questi si legano all’HBsAg legato alla superficie della piastra per microtitolazione
(sandwich fra antigeni).
Dopo l’eliminazione tramite lavaggio delle componenti non legate si determina l’attività
enzimatica del coniugato. La reazione enzimatica del substrato e del cromogeno produce una
colorazione blu. La reazione viene interrotta con l’aggiunta della soluzione bloccante POD ed il
colore vira al giallo. L’intensità del colore è proporzionale alla concentrazione degli anticorpi nel
campione. I risultati vengono quantificati mediante calcolo con il metodo α o per confronto con
una curva standard.
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Edizione Febbraio 2004
Reagenti
Contenuto della confezione
Enzygnost* anti-HBs II
1x96
10x96
Enzygnost* anti-HBs II
Coniugato HBsAg/POD (anti-HBs II)
Siero anti-HBs 100
Siero anti-HBs negativo
Soluzione di lavaggio POD (concentrata)**
Tampone/substrato TMB**
Cromogeno TMB**
Soluzione bloccante POD**
Flacone vuoto per la soluzione d’uso del cromogeno
Fogli adesivi
Sacchetti in PE
Tabella con codice a barre
Istruzioni per l’uso
1 piastra test
1 x 6 mL
1 x 1,5 mL
2 x 14 mL
1 x 100 mL
1 x 30 mL
1 x 3 mL
1 x 100 mL
1 pz
6 pz
1 pz
1 pz
1 pz
10 piastri test
10 x 6 mL
3 x 1,5 mL
5 x 14 mL
2 x 100 mL
4 x 30 mL
4 x 3 mL
2 x 100 mL
1 pz
24 pz
1 pz
1 pz
1 pz
Ulteriori confezioni: 100 x 96
** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB
(codice OUVP).
Composizione
Enzygnost* anti-HBs II: piastra da microtitolazione sensibilizzata con HBsAg inattivato
(sottotipi ad e ay) isolato da sangue umano.
Coniugato HBsAg/POD (anti-HBs II): HBsAg inattivato coniugato con perossidasi (POD),
isolato da sangue umano, tampone Tris (circa 100 g/L), NaCl (circa 47 g/L).
Conservante: fenolo (max 1 g/L)
Siero anti-HBs 100: siero umano anti-HBs (concentrazione nominale 100 ± 25 UI/L), calibrato
nei confronti del Preparato di Riferimento del WHO, valore nominale di estinzione: ≥ 0,7
Conservanti:
amfotericina (circa 5 mg/L)
gentamicina (circa 100 mg/L)
Siero anti-HBs, negativo: siero umano, valore nominale di estinzione: ≤ 0,12
Conservanti:
amfotericina (circa 5 mg/L)
gentamicina (circa 100 mg/L)
Soluzione di lavaggio POD (concentrata): soluzione tampone fosfato (90 mmol/L) contenente
Tween
Conservante: fenolo (max 1 g/L)
Tampone/substrato TMB: perossido d’idrogeno (circa 1 g/L) in soluzione tampone acetato (25
mmol/L)
Conservante: n-butanolo (circa 10 mL/L)
Cromogeno TMB: tetrametibenzidina-cloridrato (5 g/L)
Soluzione bloccante POD: acido solforico 0,5 N
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Avvertenze e precauzioni
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione dei controlli dell'Enzygnost* anti-HBs II
è stata esaminata per la ricerca dell' HBsAg e degli anticorpi anti-HCV, anti HIV1 e anti-HIV2.
Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati per la produzione.
Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni
rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico 8, in quanto non è possibile escludere
con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni.
3. L'HBsAg impiegato per la produzione della piastra test e del coniugato POD è stato isolato,
con elevato grado di purezza, da plasmi umani positivi per l'HBsAg e negativi ai test anti-HCV,
anti-HIV1 ed anti-HIV2, ed è stato sottoposto ad un accurato processo di inattivazione.
4. Si consiglia l’uso di guanti di protezione durante l’intera esecuzione del test.
5. Per lo smaltimento del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per
almeno 1 ora a +121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due contenitori
collegati in serie, i quali dovrebbero contenere un disinfettante adatto all’inattivazione dei virus
patogeni umani. Osservare le concentrazioni ed i tempi di azione indicati dal produttore.
Preparazione dei reagenti
Prima dell’inizio del test portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a +15/+25 °C (non togliere
la piastra test dal sacchetto di alluminio).
Le file di pozzetti non necessarie devono essere tolte dal supporto e conservate per
l’utilizzazione successiva (vedere Tabella 1).
Per ogni piastra test diluire 20 mL di soluzione di lavaggio POD con 400 mL di acqua distillata
o deionizzata.
Per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10 mL di tampone/substrato TMB
nel flacone vuoto fornito nella confezione (soluzione d’uso del cromogeno) e conservare al
riparo dalla luce. Dopo l’uso lavare accuratamente il flacone con acqua distillata.
A causa della dimensione del flacone non è possibile versare il cromogeno TMB direttamente
nel flacone del tampone/substrato.
Prediluizione dei campioni: per l’analisi quantitativa i campioni in cui si sospetta una
concentrazione di anti-HBs ≥ 100 UI/L dovrebbero essere diluiti come segue:
fino a 1000 UI/L: diluire
fino a 10.000 UI/L: diluire
1:10 (ad esempio 20 µL+180 µL siero anti-HBs negativo)
1:100 (ad esempio 20 µL+180 µL siero anti-HBs negativo; successivamente
20 µL della prima diluizione + 180 µL siero anti HBs negativo)
fino a 100.000 UI/L: diluire 1:1000 (ad esempio 20 µL+180 µL siero anti-HBs negativo; successivamente
20 µL della prima diluizione + 180 µL siero anti HBs negativo; successivamente
20 µL della prima diluizione + 180 µL siero anti HBs negativo)
Se la valutazione quantitativa del test viene ottenuta utilizzando una serie di diluizioni, è
necessario preparare inoltre le seguenti diluizioni del Siero anti-HBs 100 utilizzando il Siero antiHBs negativo (ciò non vale se la valutazione viene eseguita con il metodo α) :
50 UI/L: diluizione 1:2 (es.: 200 µL di siero anti-HBs (100) + 200 µL di siero di negativo anti-HBs)
25 UI/L: diluizione 1:4 (es.: 150 µL dello siero 50 UI/L + 150 µL di siero di negativo anti-HBs)
10 UI/L: diluizione 1:10 (es.: 50 µL di siero anti-HBs 100 + 450 µL di siero di negativo anti-HBs)
5 UI/L: diluizione 1:20 (es.: 150 µL dello siero 10 UI/L + 150 µL di siero di negativo anti-HBs)
Conservazione e validità
Prima dell'apertura, tutte le componenti della confezione possono essere utilizzate fino alla data
di scadenza indicata in etichetta, purché conservate a + 2/+ 8 °C.
La conservazione e la validità dei reagenti pronti per l'uso, dopo l'apertura, sono riportate in
appendice nella Tabella 1.
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Strumentazione necessaria
BEP® II:
BEP® III:
Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione di lavaggio
Per l’esecuzione automatica e valutazione del test, dopo la distribuzione dei
campioni
BEP® 2000: per l’esecuzione automatica del test e la valutazione dei risultati
Pipette:
Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µl.
Sistema di incubazione: bagnomaria coperto (+ 37 ± 1°C) o analoghi metodi di incubazione.
Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata.
Campioni in esame
Si impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/
eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essere
conservati a + 2/+ 8°C per non più di 3 giorni. Se i campioni devono essere conservati per un
lungo periodo di tempo, devono essere congelati.
Esecuzione del test
Esecuzione del test con il BEP® II
1. Schema del test: accertare il numero di pozzetti necessari (= numero dei campioni più 6
pozzetti per i controlli)
2. Distribuzione dei campioni:
Test qualitativo/Test quantitativo ( metodo α )
dispensare 100 µL/pozzetto di siero anti-HBs negativo in 4 pozzetti (A1-D1) e 100 µL di siero
anti-HBs 100 nel pozzetto E1. Dispensare nei pozzetti successivi 100 µL/pozzetto dei
campioni. Alla fine della serie o della piastra dispensare in un ulteriore pozzetto 100 µL di
siero anti-HBs 100.
Effettuare la fase di dispensazione rapidamente entro un massimo di 15 minuti per ogni
piastra.
Importante:
Non è consentito distribuire prima il siero anti-HBs 100 in tutte le posizioni previste e
successivamente interporre i campioni.
Test quantitativo (diluizioni standard)
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Distribuire 100 µL di siero negativo anti-HBs in ognuno dei primi 4 pozzetti e successivamente
distribuire in doppio 100 µL di siero anti-HBs per ognuna delle diluizioni 100, 50, 25, 10 e 5 UI/L.
Distribuire 100 µL di campione (evtl. prediluiti secondo la necessità) in ognuno dei successivi
pozzetti.
Immediatamente dopo la dispensazione dei campioni procedere con la dispensazione del
coniugato.
Distribuzione del coniugato: dispensare 25 µL di coniugato HBsAg/POD (anti-HBs II) in
ogni pozzetto.
Ricoprire quindi con un foglio adesivo. La micropiastra deve essere inserita nel sistema di
incubazione immediatamente dopo la distribuzione del coniugato.
Incubazione: incubare la piastra per 60 ± 2 minuti a 37 ± 1 °C; procedere quindi immediatamente
con la fase di lavaggio.
Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo ed aspirare il contenuto dei pozzetti; lavare 4 volte con
circa 0,3 mL/pozzetto di soluzione di lavaggio. Conclusa la fase di lavaggio effettuare subito
la dispensazione del reagente successivo per evitare l’essiccamento dei pozzetti.
Distribuzione del substrato: dispensare in ogni pozzetto 100 µL della soluzione d’uso del
cromogeno e coprire la piastra con un nuovo foglio adesivo.
Incubazione: incubare per 30 ± 2 minuti a +15/+25 °C al riparo della luce.
Arresto della reazione: rimuovere il foglio adesivo e dispensare in ogni pozzetto 100 µL di
soluzione bloccante POD, con la stessa cadenza di tempo seguita per la distribuzione del
substrato (punto 6).
Lettura fotometrica: effettuare la lettura a 450 nm entro 1 ora. La lunghezza d’onda di
riferimento raccomandata è di 650 nm (eventualmente tra 615 e 690 nm).
OQNE G11 C0541 (906) H/R
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Esecuzione del test usando il BEP® III
Prima di utilizzare il BEP® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni di
dispensamento dei campioni (Paragrafo 1 e 2 in ”Esecuzione del test con il BEP® II”). Subito
dopo porre le piastre non coperte da foglio adesivo nel BEP® III. Attenzione: le piastre
parzialmente riempite devono essere completate almeno a metà piastra (6 strip) aggiungendo
”strip riempite con acqua”. Il test viene quindi eseguito in modo completamente automatico (v.
Manuale d’uso BEP® III).
Le impostazioni per i periodi di incubazione nel software del BEP® III possono differire dai periodi
del BEP® II per motivi tecnici (velocità del sistema), ma sono state validate per i metodi
Enzygnost* sul BEP® III.
Esecuzione del test usando il BEP® 2000
Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in
maniera completamente automatica dall’analizzatore (v. manuale d’uso del BEP® 2000).
Criteri di validità del test
I valori individuali di estinzione dei sieri di controllo vengono utilizzati per calcolare il valore
medio quando:
-0,010 ≤ Eneg.
≤ 0,120
Esiero anti-HBs 100 ≥ 0.7
Se uno dei quattro valori di estinzione dei controlli negativi non rientra nell’ambito indicato, può
essere trascurato.
Entrambi i valori di estinzione del siero anti-HBs 100 devono rientrare nell’ambito indicato.
Se queste condizioni non vengono rispettate, il test deve essere ripetuto.
Per il test quantitativo si applicano i seguenti criteri di validità:
Se si utilizza una serie di diluizioni:
Eneg ≤ E standard
5 UI/L
Se si utilizza il metodo α :
Le singole letture fotometriche del Siero anti-HBs 100 vengono utilizzate per calcolare la media,
a condizione che :
limite inferiore < E siero anti-HBs 100 < limite superiore
I valori per il limite inferiore e superiore sono riportati nell’allegata tabella dei valori.
Entrambi i valori di estinzione del siero anti-HBs 100 devono essere compresi nell’ambito
indicato.
Inoltre, i singoli valori non devono differire di oltre il 20 % dalla media di questi due valori.
Se queste condizioni non vengono rispettate, il test può essere valutato solo dal punto di vista
qualitativo.
Valutazione del test
Sul BEP® 2000 e BEP® III, il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Consultare il
rispettivo manuale d’uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione dei risultati senza l’ausilio
del software.
Test qualitativo
Calcolare il valore medio di estinzione dei controlli negativi e quindi calcolare il cut-off
aggiungendo 0,08:
–
Eneg +0,08 = cut-off
I campioni in base ai criteri del test vengono classificati come segue:
1. Ecampione < cut-off = anti-HBs negativo
2. Ecampione > cut-off = anti-HBs positivo
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38
Test quantitativo (metodo α)
Per ogni piastra test utilizzata viene calcolato un fattore di correzione utilizzato per correggere i
valori di estinzione di ogni singolo campione (correzione della misura). I valori di assorbanza
corretti vengono quindi utilizzati per calcolare l’attività anticorpale (vedere «Calcolo dei risultati»).
Correzione della misura
Il fattore di correzione viene calcolato dalla formula seguente:
Valore nominale
Fattore di correzione = –––––––––––––––––––––––––––––
Valore medio del siero anti-HBs 100
Il valore nominale è riportato nella tabella dei valori acclusa. I valori di estinzione dei campioni
vanno moltiplicati per il fattore di correzione. I valori di estinzione corretti ottenuti vengono quindi
utilizzati per il calcolo dei risultati.
Se vengono utilizzate varie piastre test, il fattore di correzione deve essere determinato
separatamente per ogni singola piastra ed utilizzato per la correzione dei valori di estinzione
della piastra corrispondente.
Calcolo dei risultati
Per calcolare l’attività anticorpale, i valori di estinzione corretti dei campioni, vengono utilizzati
nella seguente formula (metodo α)
log10 mUI/L = α . Eβ
dove α e β sono delle costanti lotto-dipendenti e sono riportate nella tabella dei valori acclusa. I
risultati dell’attività anticorpale espressi in «UI/L» sono riferiti al Preparato di Riferimento
Internazionale per l’HBV del WHO.
Importante: NON utilizzare nella formula i dati seguenti:
-valori di estinzione corretti < cut-off
-valori di estinzione non corretti > 2,5
Esempio di calcolo
Valore assegnato ad α
Valore assegnato a β
Lettura corretta di un campione in esame
log10 mUI/L (dalla formula)
l’antilogaritmo (=mUI/L) è
attività anticorpale in (UI/L)
4,8239
0,1054
0,950
4,7979
62790
62,79
(vedi nota 1)
(vedi nota 2)
(vedi nota 3)
nota 1: Con la calcolatrice tascabile: digitare 0,950 tasto XY digitare 0,1054, tasto =, tasto X,
digitare 4,8239, tasto =
nota 2: Dopo la cifra ottenuta con il calcolo precedente premere il tasto 10X o i tasti INV e log.
nota 3: Per la trasformazione in UI/L il numero precedente dev’essere diviso per 1000
Se il campione è stato prediluito (es. 1:11), l'attività anticorpale calcolata (non l'assorbanza)
deve essere moltiplicata per 11.
Test quantitativo (diluizioni standard)
Per la valutazione quantitativa si valutano i valori medi di estinzione della determinazione in
doppio delle diluizioni standard 5, 10, 25, 50 e 100 UI/L. Viene allestita una curva di calibrazione
su carta bilogaritmica.
Ascissa: concentrazione di anti-HBs da 5 a 100 UI/L. Ordinata: valori di estinzione da 0,05 a 2,0.
Le concentrazioni di anti-HBs dei campioni si leggono dalla curva di calibrazione sulla base dei
singoli valori di estinzione.
Se i campioni sono stati diluiti, moltiplicare la concentrazione che si ottiene dalla curva di
calibrazione per il fattore di diluizione.
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39
Limitazioni della esecuzione del test
1. Anticoagulanti come l’eparina, l’EDTA ed il citrato non interferiscono con il test.
2. Campioni lipemici, emolizzati, itterici o contenenti fattori reumatoidi non influenzano i risultati
del test.
3. Nessuna interferenza con il risultato del test è stata osservata con campioni di donne in
gravidanza.
4. I campioni contenenti le seguenti potenziali fonti di interferenze sono stati controllati nel test:
antigene HBs, ANA e anticorpi anti-HCV, HAV, HBc, HBe, EBV e CMV. Nessuna interferenza
con il risultato del test è stata osservata con i campioni utilizzati.
5. Non sono state riscontrate interferenze nei campioni trattati al calore (30 minuti a 56 °C).
6. Non dovrebbero essere utilizzati campioni di siero da sangue non completamente coagulato,
che contengano sodio azide o presentano contaminazione batterica. Ogni particella presente
nel campione (ad esempio coaguli di fibrina) dovrebbe essere eliminata prima dell’uso.
7. Quando si utilizzano campioni scongelati, assicurarsi di una buona omogeneizzazione del
materiale prima dell’uso.
8. E' necessario utilizzare solo reagenti appartenenti tutti ad uno stesso lotto (ad esclusione della
soluzione di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d'uso del cromogeno
preparata con i reagenti Cromogeno TMB e Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allo
stesso lotto). La combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre e quella stampata sulla
confezione ed anche riportata nell'allegata tabella dei codici a barre.
9. Il tampone/substrato TMB, la soluzione d’uso del cromogeno e la soluzione bloccante POD
non devono entrare in contatto con ioni di metalli pesanti o sostanze ossidanti (non utilizzare
pipette con parti metalliche a contatto con il liquido!). Non eseguire la reazione con il substrato
in presenza di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la soluzione d’uso del cromogeno si colora
spontaneamente di blu prima del dispensamento nella piastra test significa che la soluzione è
stata contaminata; in tal caso preparare nuovamente la soluzione fresca in un contenitore
pulito. Evitare il contatto di queste soluzioni con la cute.
10. Il siero di controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi intorbidamenti,
che però non interferiscono sui risultati del test.
11. Durante la fase di incubazione la piastra test deve rimanere immobile (ad esempio utilizzare un
supporto fisso ed evitare bagnomaria a circolazione d’acqua); i pozzetti della piastra devono
essere a contatto con l’acqua termostatata. Se vengono utilizzati stabilizzanti per evitare la
contaminazione batterica dell’acqua, occorre fare attenzione che la superficie della piastra test
ed i pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni, in quanto simili contaminazioni
possono produrre reazioni aspecifiche.
12. In presenza di campioni fortemente reattivi si può verificare la formazione di un precipitato
entro la soluzione colorata. Tuttavia la valutazione fotometrica non viene compromessa.
13. Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare le
prestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sono
supportate da Dade Behring poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e sui
risultati del test. Pertanto è responsabilità dell’utente validare tutte le modifiche apportate a
queste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi da quelli inclusi nei fogli di
istruzioni o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring.
14. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del
paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri
accertamenti.
Caratteristiche del test
Sensibilità e specificità
I risultati degli studi di sensibilità e specificità sono riportati in appendice nelle Tabelle 2 e 3.
La sensibilità diagnostica è stata stabilita analizzando 515 campioni positivi per l’anti-HBs ed il
valore riscontrato è stato del 100 %. La reattività del test nei confronti dei campioni di
sieroconversione/profili di vaccinazione è stata investigata utilizzando 41 profili. L’Enzygnost*
anti-HBs II ha presentato un grado di sensibilità confrontabile con altri test.
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40
La sensibilità analitica del test, determinata con una valutazione quantitativa (curva standard)
utilizzando il Preparato di Riferimento del WHO, è risultata essere < 8 UI/l.
Per stabilire la specificità del test sono stati analizzati un totale di 4736 campioni di donatori
negativi per l’anti-HBs ed il risultato ottenuto è stato del 99,5 - 99,7 %. Valori differenti possono
essere riscontrati in funzione del tipo di popolazione, del metodo d’analisi utilizzato e di altri
fattori.
Riproducibilità
I risultati degli studi di riproducibilità intra/inter assay sono riportati in appendice nella Tabella 4.
Questi dati sono un esempio. Valori differenti possono essere ottenuti in funzione di vari fattori
come il metodo etc.
* Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi.
BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e
altri paesi
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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41
0197
Tabella 1: Conservazione e validità
Conservazione
+2/+8 °C
nel sacchetto
con l’essiccante
Stabilità•
4 settimane
Coniugato HBsAg/POD (Anti-HBsII) dopo apertura
+2/+8 °C
4 settimane
Siero anti-HBs 100
+2/+8 °C
4 settimane
< –20 °C
3 mesi
Reagenti
Enzygnost* Anti-HBs II (piastra test)
Condizioni
dopo apertura
dopo apertura
Siero anti-HBs, negativ
Cromogeno TMB
dopo apertura
+2/+8 °C
data di scadenza
Tampone/substrato TMB
dopo apertura
+2/+8 °C
data di scadenza
Soluzione d’uso del cromogeno
diluito
1 + 10
+2/+8 °C
+15/+25 °C
ben chiuso
protetto
dalla luce
5 giorni
8 ore
Soluzione di lavaggio POD
(concentrata)
dopo apertura
diluita 1:20
diluita 1:20
+2/+8 °C
+2/+8 °C
+18/+25 °C
data di scadenza
1 settimana
1 giorno
+2/+8 °C
data di scadenza
Soluzione bloccante POD
dopo apertura
• in nessun caso superare la data di scadenza.
Tabella 2: Sensibilità
Gli studi sulla sensibilità, eseguiti su differenti gruppi di campioni, hanno dato i seguenti risultati:
Numero di
Reattivi con l’Enzygnost*
Popolazione dei campioni
campioni
anti-HBs II
anti-HBs positivi (Germania)
anti-HBs positivi (America)
Campioni di follow-up
106
52
25
106
52
25
anti-HBs positivi
100
100
Differenti stadi di infezione da HBV
vaccinati (HBV)
anti-HBs positivi
profili di vaccinazione
sieroconversione
41
111
80
32 profili
9 profili
41
111
80
Sensibilità equivalente
a quella di test
confrontabili
Tabella 3: Specificità
Gli studi sulla specificità, eseguiti su campioni di differenti banche del sangue, hanno dato i
seguenti risultati:
Numero di
Reattivi con l’Enzygnost*
Popolazione dei campioni
campioni
anti-HBs II
Sieri normali negativi
Plasmi normali negativi
2296
646
11
2
Sieri normali negativi
Plasmi normali negativi
1508
286
5
1
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42
Tabella 4: Riproducibilità
Negli studi di riproducibilità intra-assay i campioni sono stati analizzati in repliche di 8 per 5 giorni
in due centri indipendenti (K, E). I CV sono stati calcolati secondo il modello di varianza del
componente.
Campione
Enzygnost* Anti-HBs II
Radio media
% CV
(K) P1
0,3
13,0
P2
1,0
5,0
P3
3,1
2,6
P4
11,3
2,2
(E) F1
0,3
9,1
F2
1,0
4,7
F3
4,0
3,0
F4
9,1
4,8
F5
14,5
5,0
Negli studi di riproducibilità inter-assay i campioni sono stati analizzati in repliche di 8 per 5 giorni
in due centri indipendenti (K, E). I CV sono stati calcolati secondo il modello di varianza del
componente.
Enzygnost* Anti-HBs II
Campione
Radio media
% CV
(K) P1
0,3
8,3
P2
1,0
4,1
P3
3,1
2,3
P4
11,3
3,6
(E) F1
0,3
12,9
F2
1,0
4,0
F3
4,0
2,2
F4
9,1
2,2
F5
14,5
2,5
Ratio = Estinzione/cut-off
OQNE G11 C0541 (906) H/R
43
Tabella 5: Esecuzione e programmazione del test
Enzygnost* Anti-HBs II
Esecuzione del test
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
Programmazione
del menù per il
BEP® II
Preparazione dei reagenti
BEP® 2000
4 x 100 µL Siero di controllo, negativo
1 x 100 µL Siero di controllo, positivo
100 µL per campioni non diluiti
1 x 100 µL Siero di controllo, positivo
BEP II®
BEP® III
25 µL
del coniugato
Nel caso di piastre
riempite parzialmente,
aggiungere file di pozzetti
con acqua fino a riempire
mezza piastra test.
60 ± 2 min
(a 37 ± 1 °C)
4 lavaggi BEP® II
100 µL Soluzione d’uso
del cromogeno
Esecuzione
automatica del test
30 ± 2 min
a +15 /25 °C
al riparo della luce
al massimo entro 1 ora
Lettura a 450 nm (lunghezza
d’onda di riferimento: 650 nm)
metodo α
Risultati
44
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DISPENSAZIONE CONIUGATO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGGIO E DISPENSAZIONE
CHROMOGENO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DISPENSAZIONE SOLUZIONE
BLOCCANTE
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µL Soluzione bloccante
OQNE G11 C0541 (906) H/R
MENU NO
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0.120
0.08
-
Enzygnost* Anti-HBs II
Campos de aplicación
Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativa y cuantitativa del anticuerpo contra
el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero y en plasma.
La realización del ensayo inmunológico se lleva a cabo en los ELISA Procesadores BEP ® II, BEP®
III y BEP® 2000. El test se desarrolló para la investigación de muestras individuales, no de muestras en pool. El producto debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro.
Significado diagnóstico
Al igual que el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), el anticuerpo dirigido contra la
proteína de la superficie, Anti-HBs, es también un parámetro importante en el diagnóstico de
una infección con el virus de la hepatitis B (HBV) 1, 2.
Durante el tiempo de incubación y durante la fase aguda de una infección con HBV no se
pueden reconocer anticuerpos contra el HBsAg. La inmunidad otorgada a los anticuerpos antiHBs aparece en el 90% de todos los casos solamente al final de la convalecencia,
aproximadamente entre 3 y 4 meses después del comienzo de la enfermedad, cuando ya no se
puede reconocer más el HBsAg circulante 3, 4.
Esta seroconverción, esto es el paso del anti-HBs negativo a positivo, representa un parámetro
verdaderamente confiable para una infección por HBV terminada, cuanto más, cuando
aproximadamente un 10% de los pacientes con una infección aguda, para los cuales en la fase
inicial no se encontró ningún HBsAg, también se van a volver más tarde anti-HBs positivos. Por
esta razón, la determinación del anti-HBs es apropiada también para el diagnóstico de
infecciones por HBV que se desarrollan de forma no aparente3, 4.
Ya que un reconocimiento positivo del anti-HBs está indicando una exposición anterior con este
antígeno ya sea mediante una infección por HBV o en forma de una vacuna, las investigaciones
siguientes resultan ser las aplicaciones más importantes de la determinación del anti-HBs:
a) Juicio sobre la convalecencia y en cierta forma sobre la prognosis de pacientes infectados
por HBV (control del desarrollo).
b) Investigaciones serológicas dentro del marco de un programa de vacunación (screenig y
controles de inmunización).
c) Encuestas epidemiológicas.
Junto a la determinación cualitativa del anti-HBs la determinación cuantitativa del anti-HBs ha
logrado obtener, desde el punto de vista de la inmunización activa, su propio significado. De
acuerdo a una recomendación de la OMS se puede hablar de una protección contra la infección
después de una vacunación cuando se puede determinar en el suero o en el plasma una
concentración de anti-HBs > 10 UI/l. Se recomienda efectuar vacunaciones de recuerdo
oportunamente para asegurar que no se queda debajo de este valor límite 5, 6, 7.
Para valores de anti-HBs < 100 UI/l después de la inmunización básica es indicado, de acuerdo
con las recomendaciones para vacunación de la Comisión permanente de Vacunación del
Instituto Robert-Koch (Alemania) (STIKO estado en octubre de 1995), realizar una vacunación
de recuerdo dentro del plazo de un año.
La necesidad de una cuantificación se va ha reforzar adicionalmente por el hecho de que la
duración de la protección de la vacuna es proporcional a la concentración de anti-HBs
alcanzada después de la vacunación.
Principio del método
El Enzygnost* Anti-HBs II es un ensayo de una etapa, construido de acuerdo al principio de sandwich.
Como antígeno de la fase fija y como antígeno conjugado se va a utilizar el HBsAg humano.
El HBsAg marcado con peroxidasa se va a unir al anticuerpo específico contra el HBs contenido en la
muestra. Estos se van a unir luego al HBsAg unido a la superficie de la placa de microtitulación
(antígeno-sandwich).
Después de eliminar con agua los componentes no ligados se determina la actividad enzimática
fijada del conjugado. La transformación enzimática del sustrato y del cromógeno (reacción cromática
azul) se interrumpe por adición de la solución de parada POD (reacción cromática amarilla). La
intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpo existente en la muestra. La
cuantificación se realiza según el método-α o por comparación con una curva de referencia.
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Edición Febrero 2004
Reactivos
Contenido del envase comercial
Enzygnost* Anti-HBs II
1 x 96
10 x 96
Enzygnost* Anti-HBs II
Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II)
Suero 100 anti-HBs
Suero anti-HBs, negativo
Solución de lavado POD (concentrado)**
Tampón/sustrato TMB**
Cromógeno TMB**
Solución de parada POD**
Frasco vacío para preparar la solución de cromógeno
Láminas adhesivas
Bolsa de PE
Tabla do código de barras
Boletín informativo
1 placa de prueba
1 x 6 ml
1 x 1,5 ml
2 x 14 ml
1 x 100 ml
1 x 30 ml
1 x 3 ml
1 x 100 ml
1 unidad
6 unidades
1 unidad
1 unidad
1 unidad
10 placas de prueba
10 x 6 ml
3 x 1,5 ml
5 x 14 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1 unidad
24 unidades
1 unidad
1 unidad
1 unidad
Otros envases comerciales: 100 x 96
** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos complmentarios para
Enzygnost* TMB (N° de pedido OUVP).
Composición
Enzygnost* Anti-HBs II (placa de prueba): placa de microtitulación recubierta con HBsAg
inactivado (subtipo ad y ay), el cual fue aislado de sangre humana.
Conjugado HBsAg/POD (anti-HBs II): HBsAg inactivado, de sangre humana, conjugado con
peroxidasa (POD), Tris (aprox. 100 g/l), NaCl (aprox. 47 g/l).
Agente de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Suero 100 anti-HBs: Suero humano anti-HBs (valor nominal 100 ± 25 UI/l), relacionado con un
preparado de referencia de la OMS, valor teórico de extinción ≥ 0,7
Agentes de conservación:
Anfotericina (aprox. 5 mg/l)
Gentamicina (aprox. 100 mg/l)
Suero anti-HBs, negativo: Suero humano, valor teórico de extinción ≤ 0,12
Solución de lavado POD (concentrado): Solución tampón de fosfato (90 mmol/l) conteniendo
Tween
Agente de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Tampón/sustrato TMB: Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato
(25 mmol/l)
Agente de conservación:
n-Butanol (máx. 10 ml/l)
Cromógeno TMB: Dihidrocloruro de tetrametilbencidina (5 g/l)
Solución de parada POD: Ácido sulfúrico 0,5N
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Advertencias y medidas de seguridad
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro
2. Cada donación individual de sangre, destinada a la preparación de los sueros de control del
Enzygnost* Anti-HBs II ha sido investigada para detectar la presencia de HBsAg, anti-HCV,
anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben
ser manipuladas con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad
recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente
la existencia de agentes patógenos 8.
3. El HBsAg, utilizado para la elaboración de las placas de prueba y del conjugado POD, fue
aislado de plasmas humanos de alta pureza y fue sometido a un proceso de inactivación
conocido. Sólo se utilizan plasmas humanos con resultados negativos con respecto a antiHCV, anti HIV1 y anti HIV2.
4. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test.
5. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por
lo menos 1 hora a + 121°C. Todas las soluciones aspiradas se deben recoger en dos
recipientes conectados uno con el otro. Estos recipientes deben contener un medio de
desinfección apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse la
concentración y el tiempo de acción dados por el fabricante.
Preparación de reactivos
Calentar todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre +15 y +25°C antes de iniciar
el test, sin sacar la placa de pruebas del recipiente que la contiene.
Los elementos de la placa de prueba no necesarios para el desarrollo del test deben ser
retirados del soporte y almacenados para un uso posterior (ver Tabla 1).
Para cada placa de prueba diluir 20 ml de solución de lavado POD con agua destilada o
desionizada hasta obtener 400 ml.
Para cada placa de prueba diluir 1 ml de cromógeno TMB con 10 ml de tampón/sustrato
TMB en el frasco plástico vacío adjunto (solución de uso del cromógeno) y guardarlo cerrado y
protegido de la luz. Después de su uso, enjuagar cuidadosamente el frasco con agua destilada.
Por razones técnicas (sobrellenado) no está permitido verter el contenido del cromógeno TMB
en el frasco de tampón/sustrato TMB.
Predilución de las muestras: Para el desarrollo cuantitativo del test, las muestras para las
cuales se espera una concentración de anti-HBs ≥ 100 UI/l, se deben diluir de la siguiente
manera:
Hasta 1000 UI/l, dilución
1:10 (por ej. 20µl de muestra + 180 µl de suero anti-HBs, negativo).
Hasta 10.000 UI/l, dilución 1:100 (por ej. 20 µl de muestra + 180 µl de suero anti-HBs, negativo; de aquí
20 µl + 180 µl de suero anti-HBs, negativo).
Hasta 100.000 UI/l, dilución 1:1000 (por ej. 20 µl de muestra + 180 µl de suero anti-HBs, negativo; de aquí
20 µl + 180 µl de suero anti-HBs, negativo; de aquí
20 µl + 180 µl de suero anti-HBs, negativo).
Si el procedimiento cuantitativo del test se desarrolla con una serie estandar, se deben realizar
adicionalmente con el suero anti-HBs 100 las siguientes diluciones con suero anti-HBs,
negativo (no es válido para la evaluación por el método-α):
50 UI/l: dilución 1:2 (por ej. 200 µl del suero Anti-HBs 100 + 200 µl del suero de Anti-HBs, negativo)
25 UI/l: dilución 1:4 (por ej. 150 µl del suero de 50 UI/l + 150 µl del suero Anti-HBs, negativo)
10 UI/l: dilución 1:10 (por ej. 50 µl del suero Anti-HBs 100 + 450 µl del suero Anti-HBs, negativo)
5 UI/l: dilución 1:20 (por ej. 150 µl del suero de 10 UI/l + 150 µl del suero Anti-HBs, negativo)
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Estabilidad y almacenaje
Todos los componentes del envase combinado Enzygnost* Anti-HBs II aún cerrados, conservados
a una temperatura entre +2 y +8°C, son utilizables hasta las fechas de vencimiento dadas en las
etiquetas.
La estabilidad y las condiciones de almacenamiento de los envases ya abiertos o de los
reactivos ya diluidos, listos para el uso, se pueden tomar de la Tabla 1 del apéndice.
Equipo necesario:
BEP® II:
BEP® III:
Para el desarrollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavado
Para la realización completamente automática del test después de la distribución de
las muestras, así como para la evaluación.
BEP® 2000: Para la realización y valoración completamente automática del test.
Pipetas:
Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl
Incubadora: Baño de agua cubierto (+37 ± 1°C) u otros métodos de incubación similares
Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados.
Material a investigar
Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con
EDTA/heparina/citrato), las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de
laboratorio. Las muestras se pueden almacenar máximo 3 días entre 2 y 8°C. Para tiempos más
largos de almacenamiento las muestras se deben congelar.
Procedimiento
Realización del test usando el BEP® II
1. Esquema de distribución: Determinar el número necesario de pocillos de la placa (= cantidad
de muestras a investigar + 6 pocillos para los controles).
2. Distribución de las muestras:
Prueba cualitativa/Prueba cuantitativa (método - α) :
Pipetear en cada uno de los 4 primeros pocillos (A1 hasta D1) 100 µl del suero anti-HBs,
negativo, en el pocillo siguiente (E1) 100 µl de suero 100 anti-HBs y en cada uno de los otros
pocillos 100 µl de la muestra. Al final de la serie o de la placa de prueba pipetear una vez más
100 µl del suero 100 anti-HBs.
La etapa de pipeteo debe efectuarse a buen paso dentro de un plazo máximo de 15 min. por
placa de prueba.
Importante: Es improcedente pipetear primero el suero 100 anti-HBs en las dos
posiciones designadas para éste y a continuación «introducir» las muestras entre ellas.
Prueba cuantitativa (de la serie de diluciones del estándar):
Colocar en cada uno de 4 pocillos 100 µl de suero Anti-HBs, negativo y a continuación, en
cada uno de 2 pocillos, 100 µl de suero Anti-HBs de las diluciones que contienen 100, 50, 25,
10 y 5 UI/l. En cada uno de los pocillos siguientes pipetear 100 µl de la muestra
(eventualmente, si es necesario, prediluida).
La distribución del conjugado debe seguir inmediatamente después de la distribución de las
muestras
3. Distribución del conjugado:
Agregar en cada pocillo 25 µl del conjugado HBsAg/POD (anti-HBs II).
Cubrir con lámina adhesiva y colocar inmediatamente después de terminada la distribución
del conjugado en el incubador.
4. Incubación: Incubar durante 60 ± 2 min. a +37 ± 1°C; lavar de inmediato.
5. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar 4 veces
usando cada vez aprox. 0,3 ml de solución de lavado. Después de terminar la fase de lavado,
seguir inmediatamente con la siguiente dosificación de reactivos para evitar la desecación .
6. Distribución del sustrato: Pipetear en cada pocillo 100 µl de solución de uso del cromógeno
y cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva.
OQNE G11 C0541 (906) H/R
48
7. Incubación del sustrato: Incubar 30 ± 2 min. entre 15 y +25°C protegiendo de la luz.
8. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 µl de la
solución de parada, manteniendo el mismo ritmo que en el punto 6.
9. Medición: Realizar la medición en el término de una hora a 450 nm. Como longitud de onda
de la medida de referencia se recomienda 650 (o entre 615 y 690 nm).
Procedimiento en el BEP® III
Para el desarrollo del test en el BEP® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la
distribución de las muestras (punto 1 hasta punto 3 del «Procedimiento en el BEP® II»).
Directamente después de esto, colocar las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina
adhesiva en el BEP® III. Aquí es importante observar que las placas de prueba que no estén
llenas se deben completar con «elementos con agua» hasta por lo menos la mitad de la placa
de prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma
completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® III).
Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP® III pueden desviarse de los del
procedimiento en el BEP® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin
embargo validados en la combinación BEP® III/Enzygnost*.
Procedimiento en el BEP® 2000
La distribución de las muestras y la realización subsiguiente del test se efectúa de forma completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® 2000).
Validez del test
Los valores aislados de las extinciones de los sueros de control se van a tomar para determinar
el valor promedio, cuando:
≤ 0,120
-0,010 ≤ E neg.
E suero 100 anti-HBs ≥ 0,7
Si uno de los valores de extinción de los controles negativos, se encuentra por fuera de las
especificaciones puede ser no tenido en cuenta.
Los dos valores de extinción del suero 100 anti-HBs deben cumplir las especificaciones.
Si estas condiciones no se cumplen se debe repetir el test.
Para el test cuantitativo son válidos los siguientes criterios de validación:
Al utilizar una serie estándar:
E neg. ≤ E estándar 5 UI/l
Al utilizar el método - α :
Los valores aislados de las extinciones del suero anti-HBs 100 se van a utilizar para calcular el
valor promedio cuando:
límite de tolerancia inferior < E suero anti-HBs 100 < límite de tolerancia superior.
Los valores de los límites de tolerancia inferior y superior vienen dados en la Tabla de valores
aquí incluida. Los dos valores de extinción del suero anti-HBs 100 deben de cumplir las
especificaciones. Además de esto, los valores aislados solamente se deben apartar del valor
promedio en máximo un 20%. Si estas condiciones no se cumplen, el test deberá ser valorado
sólo cualitativamente.
Valoración del test
La evaluación con el BEP® 2000 y el BEP® III, se realiza automáticamente. Para esto consultar
los manuales de operaciones. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en el caso de
evaluaciones sin la ayuda del software.
Test cualitativo:
Se determina el valor promedio de los valores de extinción de los controles negativos.
Para calcular el valor límite se añade al valor promedio de los controles negativos un valor de 0,08:
–
Eneg. + 0,08 = Valor límite (cut off)
OQNE G11 C0541 (906) H/R
49
De acuerdo con los criterios del test las muestras a investigar se van a clasificar de la siguiente
manera:
1. Emuestra < cut off = anti-HBs negativo
2. Emuestra ≥ cut off = anti-HBs positivo
Test cuantitativo (método - α):
Para cada una de las preparaciones de la placa de prueba se va a determinar un factor de
corrección, con el cual se va a corregir cada muestra (corrección de los valores medidos). Los
valores corregidos se van a utilizar finalmente para la determinación de la actividad de
anticuerpo (cálculo de los resultados).
Corrección de los valores medidos
El factor de corrección se va a determinar de la siguiente manera:
Valor nominal
–––––––––––––––––––––––––––––––
Valor promedio del suero 100 anti-HBs
Factor de corrección =
El valor nominal viene dado en la Tabla de valores adjunta. Los valores de extinción de las
muestras a investigar se multiplican por el factor de corrección. Los valores corregidos así
obtenidos se van a utilizar para el cálculo de los resultados.
En el caso de usar varias placas de prueba, se debe determinar para cada placa el factor de
corrección, el cual se debe emplear en el cálculo de la correspondiente corrección.
Cálculo de los resultados
Los valores corregidos de las muestras a investigar se van a emplear en el cálculo de la
actividad de anticuerpo de acuerdo con la siguiente fórmula (método-α):
log10 mUI/l = α . Eβ
Las constantes α y β, dependientes del lote, se deben tomar de la Tabla de valores adjunta. El
dato de la actividad de anticuerpo en «UI/l» se refiere a un suero HBV de referencia de la OMS.
¡Atención!:
En el cálculo no se deben utilizar:
-Valores corregidos < cut off
-Valores sin corregir > 2,5
Ejemplo de corrección
Valor calculado para α
Valor calculado para β
valor corregido de una muestra a investigar
log10mUI/l (de acuerdo a la fórmula anterior)
de ahí el número (en mUI/l)
o la actividad de anticuerpo (UI/l)
4,8239
0,1054
0,950
4,7979
62 790
62,79
(véase nota 1)
(véase nota 2)
(véase nota 3)
nota 1: Datos para la calculadora: 0,950 tecla xy, dato 0,1054, tecla =, tecla x, dato 4,8239, tecla =
nota 2: después de la cifra obtenida anteriormente pulsar o la tecla 10 x, o las teclas INV y log.
nota 3: Para calcular las unidades en UI/l se debe dividir el número obtenido por 1 000.
Si la muestra a investigar estaba prediluida (por ej. 1:11), la actividad de anticuerpo (no la señal
medida) se debe multiplicar por 11.
Prueba cuantitativa (de la serie de diluciones del estándar):
Para la valoración cuantitativa se calcula la media de extinción a partir de las dobles
determinaciones de la serie de diluciones del estándar con 5, 10, 25, 50 y 100 UI/l y con estos
valores se traza una curva de referencia sobre papel doble logarítmico.
Abscisa: Concentración de Anti-HBs de 5 a 100 UI/l. Ordenada: Extinción de 0,05 a 2,0. En esta
curva de referencia se leen las concentraciones de Anti-HBs en las muestras a partir de las
respectivas extinciones.
Si se utilizaron muestras diluidas, las concentraciones obtenidas en la curva de referencia
deben ser multiplicadas por el factor de dilución.
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50
Limitaciones del Procedimiento
1. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre los resultados del test.
2. Las muestras lipémicas, hemolíticas, las muestras que contienen factor reumatoideo y las
muestras ictéricas no alteran el desarrollo del test.
3. En las muestras de embarazadas no se observó ninguna influencia sobre los resultados del
test.
4. En el test se examinaron, además, muestras con las siguientes sustancias potencialmente
alterantes: antígeno HBs, ANA, anticuerpos contra HCV, HAV, HBC, HBe, EBV y CMV. En
ninguna de estas muestras se observó influencia sobre los resultados del test.
5. No se ha observado ninguna alteración en muestras tratadas por calor (30 min. a 56 °C).
6. No se deben emplear sueros que no estén completamente coagulados, muestras de material que
contengan azida sódica y muestras contaminadas microbiológicamente. Si eventualmente
existen otras partículas (por ej. coágulos de fibrina) estas deben ser separadas antes de empezar
el test.
7. En muestras descongeladas se debe tener en cuenta que el material se encuentre bien
homogenizado.
8. Los reactivos (con exepción de la solución de lavado POD, la solución de parada y la
solución de uso del cromógeno, la cual ha sido preparada a partir de los reactivos
dependientes del lote, cromógeno TMB y Tampón/sustrato TMB ) sólo se pueden utilizar
juntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo número de 6 cifras que está
impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla do código de barras incluida en él.
9. El tampón/sustrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de parada POD no
deben entrar en contacto con iones de metales pesados o con sustancias oxidantes (no utilizar
pipetas que tengan partes metálicas que entren en contacto con el líquido). Las reacciones del
sustrato no se deben efectuar en la cercanía de medios de desinfección que contengan
hiploclorito. Una coloración azul espontánea de la solución de uso del cromógeno antes de
agregarse a la placa de prueba está indicando una contaminación; prepare una nueva solución en
un recipiente limpio. Evite el contacto de la piel con las soluciones arriba mencionadas.
10. Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razón
puede aparecer turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test.
11. Durante la incubación la placa de prueba debe de permanecer en reposo (por ej. con ayuda de un
flotador fijo o con un bañomaría no circulante). Si se utilizan agentes de conservación para evitar
la contaminación del agua, hay que tener la precaución de que ni la superficie de la placa de
prueba ni los pocillos entren en contacto con estas soluciones pues podrían provocar reacciones
no especificas.
12. En muestras altamente reactivas se puede presentar una precipitación del colorante al agregar la
solución de parada. La valoración fotométrica de la muestra no va a ser perturbada por esto.
13. Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar el
rendimiento del producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificaciones
definidas por el usuario no están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar al
rendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuario
validar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos en
analizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade Behring o en
estas instrucciones de uso.
14. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia
clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.
Caracteristicas del test
Sensibilidad y especificidad
Los resultados del control de la sensibilidad y la especificidad están resumidos en las Tablas 2 y
3 (en el apéndice).
Para encontrar la sensibilidad diagnóstica se investigaron 515 muestras con anti-HBs positivo y
se hallo una sensibilidad del 100 %. La reactividad del test para muestras con seroconversión/
desarrollo de la vacunación se estudió en 41 casos. En esto casos se demostró que el
Enzygnost* Anti-HBs II muestra la misma sensibilidad con relación a las muestra con
seroconversión/desarrollo de la vacunación que otros ensayos comparables.
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51
La sensibilidad analítica para la valoración cuantitativa (curva estándar) se determinó en un
preparado de referencia de la OMS con < 8 UI/l.
Para encontrar la especificidad se investigaron en total 4736 muestras de sangre de donantes
con anti-HBs negativo y se hallo una especificidad desde el 99,5 hasta el 99,7 %. Dependiendo,
entre otros, del grupo colectivo a investigar, del desarrollo del test, es posible que se presenten
desviaciones de estos valores.
Reproducibilidad
Los resultados de los ensayos de reproducibilidad intra/ inter están resumidos en la Tabla 4 (en
el apéndice). En estos casos se trata de ejemplos de datos hallados. Dependiendo, entre otros,
del desarrollo del test es posible encontrar valores que se desvíen de estos.
* Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países.
BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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0197
Tabla 1. Estabilidad y almacenaje
Material/reactivos
Enzygnost* Anti-HBs II
(placa de prueba)
Estado
abierto
Almacenamiento
entre +2 y +8°C
en la bolsa
con cápsulas
deshidratantes
Estabilidad•
4 semanas
Conjugado HBsAg/POD
(Anti-HBs II)
abierto
entre +2 y +8°C
4 semanas
Suero 100 anti-HBs
abierto
Suero anti-HBs, negativo
entre +2 y +8°C
4 semanas
< -20°C
3 meses
Cromógeno TMB
abierto
entre +2 y +8°C
fecha de caducidad
Tampón/sustrato TMB
abierto
entre +2 y +8°C
fecha de caducidad
Solución de uso del
cromógeno
diluida 1 + 10
entre +2 y +8°C
entre +15 y +25°C
en recipiente
cerrado protegido
de la luz
5 días
8 horas
Solución de lavado POD
(concentrado)
abierto
diluida 1:20
diluida 1:20
entre +2 y +8°C
entre +2 y +8°C
entre +18 y +25°C
fecha de caducidad
1 semana
1 día
Solución de parada POD
abierto
entre +2 y +8°C
• En ningún caso más allá de la fecha de caducidad
fecha de caducidad
Tabla 2. Sensibilidad
Al investigar la sensibilidad usando diferentes colectivos de muestras se encontraron los
siguientes datos:
Numero
Enzygnost* Anti-HBs II
Colectivo de muestras
de muestras
positivos
Anti-HBs positivo (Alemania)
Anti-HBs positivo (América)
Muestras de seguimiento
106
52
25
106
52
25
Anti-HBs positivo
100
100
Diferentes estados de una Infección con HBV
Vacunados (HBV)
Anti-HBs positivo
Procesos de vacunación
Seroconverción
41
111
80
32 casos
9 casos
41
111
80
la sensibilidad corresponde a la sensibilidad de otros
métodos comparables
Tabla 3. Especificidad
Al investigar la especificidad usando muestras de diferentes bancos de sangre se encontraron
los siguientes datos:
Numero
Enzygnost* Anti-HBs II
Colectivo de muestras
de muestras
positivos
Sueros negativos normales
Plasmas negativos normales
2296
646
11
2
Sueros negativos normales
Plasmas negativos normales
1508
286
5
1
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Tabla 4. Reproducibilidad
Para las investigaciones de la reproducibilidad intra-assay en dos centros independientes (K, E)
fueron chequeadas las muestras 5 días cada una en 8 determinaciones. El cálculo del CV se
hizo según el modelo componentes de varianza.
Muestra
Enzygnost* Anti-HBs II
Radio-Valor promedio
% CV
(K) P1
0,3
13,0
P2
1,0
5,0
P3
3,1
2,6
2,2
P4
11,3
(E) F1
0,3
9,1
F2
1,0
4,7
F3
4,0
3,0
F4
9,1
4,8
F5
14,5
5,0
Para las investigaciones de la reproducibilidad inter-assay en dos centros independientes (K, E)
fueron chequeadas las muestras 5 días en 8 determinaciones. El cálculo del CV se hizo según
el modelo componentes de varianza.
Muestra
Enzygnost* Anti-HBs II
Radio-Valor promedio
% CV
(K) P1
0,3
8,3
P2
1,0
4,1
P3
3,1
2,3
P4
11,3
3,6
(E) F1
0,3
12,9
F2
1,0
4,0
F3
4,0
2,2
F4
9,1
2,2
F5
14,5
2,5
Radio = Extinción/valor límite
OQNE G11 C0541 (906) H/R
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Tabla 5 Realización de la prueba y programación
Enzygnost* Anti-HBs II
Programación
Procedimiento
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
para el
BEP® II
Preparación de los reactivos
BEP® 2000
4 x 100 µl de suero control, negativo
1 x 100 µl de suero control, positivo
100 µl de cada muestra
1 x 100 µl de suero control, positivo
BEP® II
BEP® III
25 µl de
conjugado
fraccionadas a medias
placas con "elementos
con agua"
60 min ± 2 min.
(37 ± 1 °C)
4 x lavar: BEP® II
100 µl de sol. de uso
del cromógeno
Procesamiento
automático
30 min ± 2 min.
entre +15 °C y +25 °C
protegido de la luz
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DOSIFICACIÓN DEL CONJUGADO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVADO E Y DOSIFICACIÓN
DEL CHROMÓGENO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DOSIFICACIÓN SOLUCIÓN DE
PARADA
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl de sol. de
parada
máximo 1 h después
Valoración a 450 nm
(longitud de onda
de referencia: 650 nm)
Método-α
Resultado de la prueba
OQNE G11 C0541 (906) H/R
MENU NO
55
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0.120
0.08
-
Enzygnost* Anti-HBs II
Campo de aplicação
Determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos contra o antigénio de superfície do vírus
da hepatite B (HBsAg) no soro e no plasma.
O processamento do teste imunoenzimático é feito com os processadores ELISA BEP® II,
BEP® III e BEP® 2000. O teste foi desenvolvido para a análise de amostras individuais, não de
amostras em pool. O produto só pode ser utilizado para efeitos de diagnóstico in vitro.
Significado diagnóstico
Tal como o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), também o anticorpo antiHBs, que se dirige contra a proteína de superfície, constitui um importante parâmetro diagnóstico numa infecção pelo vírus da hepatite B (HBV)1, 2.
Durante a incubação e a fase aguda de uma infecção pelo HBV não é possível detectar
anticorpos contra o HBsAg. Os anticorpos imunizantes anti-HBs aparecem em 90% dos casos
só na convalescença tardia, 3 a 4 meses após o começo da doença, quando o HBsAg circulante
já não se pode detectar 3, 4.
Esta seroconversão, isto é, a passagem de anti-HBs negativo a positivo, é um indicador bastante fiável de uma infecção HBV superada, tanto mais que também aproximadamente 10% dos
pacientes com infecção aguda, nos quais, na fase inicial, o HBsAg é indetectável, se tornam
mais tarde anti-HBs positivos. Assim, a comprovação de anti-HBs é também um meio adequado
para diagnostico de infecções HBV sub-clínicas 3, 4.
Sendo a presença comprovada de anti-HBs indiciaidora de um contacto, no passado, com o
antigénio, ou por infecção HBV ou por vacinação, a determinação de anti-HBs está particularmente indicada nas seguintes aplicações:
a) avaliação da convalescença e, em certa medida, prognostico de infectados com HBV
(controlo da evolução)
b) exames serológicos no quadro de programas de vacinação (screening e controlo da
imunização)
c) censos epidemiológicos
A par da detecção qualitativa, a determinação quantitativa de anti-HBs assume particular relevância
no contexto de uma imunização activa. De acordo com uma recomendação da OMS, pode
presumir-se uma protecção contra a infecção, na sequência de uma vacinação, quando é possível
comprovar no soro ou no plasma uma concentração de anti-HBs > 10 UI/l. E recomendam-se
oportunas vacinações de reforço para evitar que os valores desçam abaixo deste limiar 5, 6, 7.
Perante valores de anti-HBs < 100 UI/l após uma imunização básica, está indicado, de acordo
com as recomendações da Comissão Permanente de Vacinações do Instituto Robert Koch (Alemanha)(STIKO, Outubro de 1995), efectuar uma revacinação no prazo de 1 ano.
A necessidade de uma quantificação é acentuada ainda pelo facto de a duração da imunidade
ser proporcional à concentração de anti-HBs alcançada após a vacinação.
Princípio método
Enzygnost* Anti-HBs II é um imunoensaio enzimático, com formação de “sandwich” de
antigénios. HBsAg humano é utilizado como antigénio da fase sólida e como antigénio do
conjugado.
HBsAg marcado com peroxidase liga-se aos anticorpos específicos contra o HBs contidos na
amostra. Estes por sua vez fixam-se aos HBsAg fixados à superfície da placa de microtitulação
(sandwich de antigénios).
Após eliminação, por lavagem, dos elementos não ligados, é determinada a actividade enzimática
do conjugado. A transformação enzimática do substrato e cromogéneo (reacção cromática azul) é
interrompida por adição da solução de paragem POD (reacção cromática amarela). A intensidade
cromática é proporcional à concentração dos anticorpos da amostra. A quantificação é feita por
cálculo segundo o método α ou por comparação com uma curva standard.
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Edição Fevereiro 2004
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial
Enzygnost* Anti-HBs II
Enzygnost*
Anti-HBs II
1 x 96
10 x 96
1 placa de ensaio
10 placas de ensaio
Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II)
1 x 6 ml
10 x 6 ml
Soro Anti-HBs 100
1 x 1,5 ml
3 x 1,5 ml
Soro Anti-HBs negativo
2 x 14 ml
5 x 14 ml
Solução de lavagem POD (concentrado)**
1 x 100 ml
2 x 100 ml
Tampão-substrato TMB**
1 x 30 ml
4 x 30 ml
Cromogéneo TMB**
1 x 3 ml
4 x 3 ml
Solução de paragem POD**
1 x 100 ml
2 x 100 ml
Frasco vazio para a solução de trabalho do cromogéneo 1 unidade
1 unidade
Folhas adesivas
6 unidades
24 unidades
Bolsa de PE
1 unidade
1 unidade
Tabela de código de barras
1 unidade
1 unidade
Folheto da embalagem
1 unidade
1 unidade
Outras embalagens comerciais: 100 x 96
** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentes acidionais para Enzygnost* TMB (ref. OUVP).
Composição
Enzygnost* Anti-HBs II (Placa de ensaio): Placa de microtitulação revestida com HBsAg
inactivado (subtipos ad e ay), isolado de sangue humano.
Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II): HBsAg inactivado de sangue humano, conjugado com
peroxidase (POD), Tris (aprox. 100 g/l), NaCl (aprox. 47 g/l).
Conservante:
fenol (máx. 1 g/l)
Soro Anti-HBs 100: Soro humano anti-HBs inactivado (concentração nominal 100 ± 25 UI/l),
calibrado em concordância com o preparado de referência da OMS. Valor indicativo de
absorvância: ≥ 0,7.
Conservantes: anfotericina (aprox. 5 mg/l)
gentamicina (aprox. 100 mg/l)
Soro Anti-HBs negativo: Soro humano; valor indicativo de absorvância: ≤ 0,12
Conservantes: anfotericina (aprox. 5 mg/l)
gentamicina (aprox. 100 mg/l)
Solução de lavagem POD (concentrado): Tampão de fosfato com Tween (90 mmol/l)
Conservante:
fenol (máx. 1 g/l)
Tampão/substrato TMB: Peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em tampão de acetato (25
mmol/l)
Conservante:
n-butanol (máx. 10 ml/l)
Cromogéneo TMB: Dihidrocloreto de tetrametilbenzidina (5 g/l)
Solução de paragem POD: Ácido sulfúrico 0,5 N
OQNE G11 C0541 (906) H/R
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Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in vitro
2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação dos soros de controlo de
Enzygnost* Anti-HBs II foi previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, antiHCV, anti-HIV1 e anti-HIV2. Na elaboração só são utilizadas dádivas com resultado negativo.
No entanto, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manuseados com as
precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco
biológico, uma vez que nunca se pode excluir inteiramente o risco de contaminação por
agentes patogénicos8.
3. O HBsAg utilizado na preparação das placas de teste e do conjugado POD foi isolado, com
um alto grau de pureza, de plasmas humanos positivos relativamente ao HBsAg e negativos
com relação ao anti-HCV, ao anti-HIV1 e ao anti-HIV2, e submetido a um reconhecido
processo de inactivação.
4. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste.
5. Para descontaminação de materiais sólidos, aconselha-se uma autoclavagem durante pelo
menos 1 hora a uma temperatura de, pelo menos, + 121° C. Todas as soluções aspiradas
devem ser recolhidas em dois recipientes ligados em série, os quais devem conter um
desinfectante apropriado para inactivação de vírus humano-patogénicos. Observem-se as
concentrações e os tempos de incubação indicados pelo fabricante.
Preparação dos reagentes
Antes de iniciar o teste, levar todos os reagentes e amostras à temperatura de + 15 a + 25° C,
mas sem tirar a placa de ensaio do seu recipiente.
Retirar do suporte os conjuntos de poços desnecessários e reservá-los para posterior utilização
(cf. Tabela 1).
Para cada placa de ensaio, diluir 20 ml da solução de lavagem POD (concentrado) com água
destilada ou desionizada até obter 400 ml.
Diluir, por placa, 1 ml de cromogéneo TMB com 10 ml de tampão/substrato TMB no frasco
de plástico anexo à embalagem (solução de trabalho do cromogéneo) e conservá-lo fechado e
ao abrigo da luz. Depois do uso, lavá-lo cuidadosamente com água destilada.
Dada a capacidade dos frascos, não passar todo o conteúdo do frasco de cromogéneo TMB
para o de tampão/substrato TMB.
Pré-diluição das amostras: No teste quantitativo, e para concentrações previstas de antiHBs ≥ 100 UI/l, as amostras devem ser diluídas como segue:
Até 1000 UI/l: diluição
1 : 10 (p. ex. 20 µl de amostra + 180 µl de soro anti-HBs negativo)
Até 10.000 UI/l: diluição 1 : 100 (p. ex. 20 µl de amostra + 180 µl de soro anti-HBs negativo;
e, de aí, 20 µl + 180 µl de soro anti-HBs negativo)
Até 100.000 UI/l: diluição 1 : 1000 (p. ex. 20 µl de amostra + 180 µl de soro anti-HBs negativo;
desta diluição 20 µl + 180 µl de soro anti-HBs negativo; e,
desta, 20 µl + 180 µl de soro anti-HBs negativo).
Se a realização quantitativa do teste é feita a partir duma série standard, é necessário preparar,
com soro anti-HBs negativo, as diluições complementares seguintes do soro anti-HBs 100 (mas
não no caso de uma avaliação pelo método α ):
50 UI/l: diluição 1 : 2 (p. ex. 200 µl de soro anti-HBs 100 + 200 µl de soro anti-HBs negativo)
25 UI/l: diluição 1 : 4 (p. ex. 150 µl do soro de 50 UI/l + 150 µl de soro anti-HBs negativo)
10 UI/l: diluição 1 : 10 (p. ex. 50 µl do soro anti-HBs 100 + 450 µl de soro anti-HBs negativo
5 UI/l: diluição 1 : 20: (p. ex. 150 µl do soro de 10 UI/l + 150 µl de soro anti-HBs negativo)
Estabilidade e condições de conservação
Antes de abertos, e enquanto conservados entre +2 e +8° C, todos os componentes da
embalagem combinada Enzygnost* Anti-HBs II se mantêm utilizáveis até às datas indicadas nos
rótulos.
Sobre estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso, v.
tabela 1 em apêndice.
OQNE G11 C0541 (906) H/R
58
Aparelhos necessários
BEP® II:
BEP® III:
para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases de lavagem
Processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem das
amostras
BEP® 2000: para o processamento e interpretação do teste, de forma inteiramente
automática.
Pipetas:
pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µl
Incubador: Banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação comparáveis
Todos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados.
Amostras
Para a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/
Heparina/Citrato), colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão ser
conservadas durante de 3 dias, no máximo, entre 2 - 8 °C. Se pretender conservá-las durante
um período de tempo superior, deverão ser congeladas.
Procedimento
Realização do teste com o BEP® II
1. Esquema de distribuição: Determinar o número necessário de poços (= número das
amostras a investigar + 6 poços para os controlos).
2. Distribuição das amostras
Teste qualitativo / Teste quantitativo (Método α)
Distribuir em cada um de 4 poços (A1 a D1) 100 µl de soro anti-HBs negativo; em 1 poço (E1)
100 µl de soro anti-HBs 100; em cada um dos poços seguintes 100 µl de amostra; e no fim da
série, ou da placa, novamente 100 µl de soro anti-HBs 100.
A distribuição tem de ser feita num máximo de 15 minutos por placa.
Importante:
Não é permitido distribuir primeiro o soro anti-HBs 100 nas duas posições previstas e só
depois as amostras entre elas.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Teste quantitativo (série standard):
Distribuir em 4 poços 100 µl, em cada um, de soro anti-HBs negativo, e a seguir em 2 poços 100
µl, em cada um, das diluições do soro anti-HBs correspondentes a 100, 50, 25, 10 e 5 UI/l. Nos
poços seguintes distribuir 100 µl, em cada um, de amostra (eventualmente pré-diluída).
Terminada a distribuição das amostras, iniciar imediatamente a distribuição do conjugado.
Distribuição do conjugado: Distribuir em cada poço 25 µl de conjugado HBsAg/POD (AntiHBs II). A seguir, cobrir com folha adesiva e colocar a placa imediatamente na incubadora.
Incubação: Deixar incubar durante 60 ± 2 min. a + 37 ± 1° C, imediatamente a seguir dar
início à lavagem.
Lavagem: Retirar a folha adesiva, aspirar o conteúdo de todos os poços e lavar cada um 4
vezes com aprox. 0,3 ml, de cada vez, de solução de lavagem. Depois das operações de
lavagem passar imediatamente à distribuição do substrato para evitar uma dessecação.
Distribuição do substrato: Distribuir 100 µl de solução de trabalho de cromogéneo em cada
poço, cobrir a placa com nova folha adesiva.
Incubação do substrato: Deixar incubar durante 30 ± 2 min ao abrigo da luz entre + 15 e + 25° C.
Reacção de paragem: Retirar a folha adesiva. Acrescentar a cada poço 100 µl de solução
de paragem POD, mantendo o mesmo ritmo que em 6.
Leitura: Fazer uma medição fotométrica a 450 nm dentro de 1 hora. Como comprimento de
onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre 615 e 690 nm).
OQNE G11 C0541 (906) H/R
59
Realização do teste com o BEP® III
No caso do processamento ser feito com BEP® III é necessário preparar as placas de ensaio
incluindo a dosagem das amostras (ponto 1 e 2 da “execução do teste com BEP® II").
Imediatamente a seguir, as placas de ensaio são colocadas no BEP® III abertas, ou seja, sem
película colada. Ao mesmo tempo, é necessário prestar atenção a que as placas de ensaio
parcialmente providas de ”barras de água” sejam acrescentadas até ficarem, no mínimo, pelo
meio ( 6 barras de água). O processamento subsequente do teste realiza-se automaticamente
(vide instruções de serviço do BEP® III).
Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustados
no software do BEP® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP® II, mas
foram validados na combinação BEP® III/Enzygnost* .
Realização do teste com o BEP® 2000
A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste são efectuados de forma
totalmente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP® 2000).
Validação do teste
Os valores de absorvância dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores médios, se:
- 0,010 ≤ Eneg.
≤ 0,120
Esoro anti-HBs 100 ≥ 0,7
Dos valores de absorvância dos controlos negativos, caso exista um fora da especificação poderá
ser ignorado. Os valores de absorvância do soro standard anti-HBs 100 têm de corresponder
ambos às especificações. Não estando preenchidas estas condições, há que repetir o teste.
Para o teste quantitativo, os critérios de validação são os seguintes:
Com uma série standard:
Eneg ≤ Estandard 5 UI/l
Com o método α:
Os valores de absorvância dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores médios, se:
limite inferior < E soro anti-HBs 100 < limite superior
Os valores dos limites inferior e superior vêm indicados na tabela de valores adjunta.
Os valores de absorvância do soro anti-HBs 100 têm de corresponder ambos à especificação.
Além disso, a margem de variação de cada valor não pode ir além de 20% relativamente à
média destes dois valores.
Não estando preenchidas estas condições, o teste só pode ser valorado qualitativamente.
Cálculo de Resultados
As interpretações são realizadas automaticamente com o BEP® 2000 e BEP® III. Para o efeito,
consultar as instruções de serviço. Para uma interpretação sem a ajuda do software, é
necessário prestar atenção aos seguintes capítulos.
Teste qualitativo:
Calcular a média dos valores de absorvância dos controlos negativos.
Para calcular o valor-limite, adicionar 0,08 ao valor médio de absorvância dos controlos
negativos:
–
Eneg. + 0,08 = valor-limite (cut off)
De acordo com os critérios do teste, as amostras serão classificadas do seguinte modo:
1.
Eamostra < cut off = anti-HBs negativo
2.
Eamostra ≥ cut off = anti-HBs positivo
OQNE G11 C0541 (906) H/R
60
Teste quantitativo (método α):
É determinado para cada placa um factor de correcção com o qual se corrige o valor de
absorvância obtido para cada amostra (correcção dos valores medidos). Com base nesses
valores corrigidos é feito então o cálculo da concentração de anticorpos (cálculo dos
resultados).
Correcção dos valores medidos
O factor de correcção é determinado segundo a fórmula seguinte:
valor nominal
factor de correcção = ––––––––––––––––––––––––––
valor médio do soro anti-HBs 100
O valor nominal vem indicado na tabela de valores adjunta à embalagem. Os valores de
absorvância das amostras são multiplicados pelo factor de correcção. Os valores corrigidos
assim obtidos são depois utilizados para o cálculo dos resultados.
Para cada placa, determinar o factor de correcção e utilizá-lo para o respectivo cálculo de
correcção.
Cálculo dos resultados
Para calcular a concentração de anticorpos, utilizar a fórmula seguinte com base nos valores
corrigidos das amostras (método α):
log10 mUI/l = α • Eβ
As constantes α e β, que variam segundo os lotes, vêm indicadas na tabela de valores adjunta.
A concentração de anticorpos, expressa em "UI/l", refere-se ao soro de referência HBV
internacional da OMS.
Atenção:
Não utilizar para o cálculo:
- valores corrigidos < cut off
- valores não corrigidos > 2,5
Exemplo de cálculo
Valor de cálculo para α
4,8239
Valor de cálculo para β
0,1054
valor corrigido duma amostra
0,950
log10 mUI/l (segundo fórmula acima)
4,7979
daí o antilogaritmo (em mUI/l)
ou concentração de anticorpos (UI/l)
62 790
62,79
(v. nota 1)
(v. nota 2)
(v. nota 3)
nota 1:
Dados para a calculadora: 0,950 tecla xy, digitar 0,1054, tecla =, tecla x, digitar 4,8239,
tecla =
nota 2:
depois do número obtido, premir a tecla 10x ou as teclas INV e log
nota 3:
para converter em UI/l, dividir o número obtido por 1000.
Se a amostra estava pré-diluída (p. ex. a 1:11), multiplicar a concentração de anticorpos (não o
sinal de medida) por 11.
Teste quantitativo (série standard)
Para a leitura quantitativa, calcular os valores médios de absorvância das duplas determinações
da série de diluições standard de 5, 10, 25, 50 e 100 UI/l e, com estes valores, traçar uma curva
de referência sobre papel bilogarítmico. Abcissa: concentração de anti-HBs de 5 a 100 UI/l.
Ordenada: absorvância 0,05 a 2,0. As concentrações de anti-HBs das amostras lêem-se desta
curva com base em cada um dos valores de absorvância.
Se as amostras foram diluídas, multiplicar a concentração lida na curva pelo factor de diluição.
OQNE G11 C0541 (906) H/R
61
Limitações do procedimento
1. Anticoagulantes como heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste.
2. Amostras lipémicas, hemolíticas, ictéricas ou que contenham factor reumatóide não prejudicam
o teste.
3. Com amostras de mulheres grávidas não foi observada qualquer influência sobre o
resultado do teste.
4. Com o teste foram examinadas amostras com as seguintes substâncias potencialmente
perturbadoras: Antigénio HBs, ANA e anticorpos contra HCV, HAV, HBC, HBe, EBV e CMV.
Com as amostras usadas não foi observada qualquer influência sobre o resultado do teste.
5. Não foram observadas alterações em amostras sujeitas a tratamento térmico (30 min, 56 ° C).
6. Não empregar soros coagulados, com azida sódica ou contaminados. Partículas
eventualmente existentes (p. ex. coágulos de fibrina) devem ser previamente retiradas.
7. Amostras descongeladas devem estar bem homogeneizadas.
8. Os reagentes (com excepção da solução de lavagem POD, da solução de interrupção POD e
da solução de trabalho do cromogénio, preparada esta última a partir dos reagentes
específicos de cada lote Cromogénio TMB e Tampão/substrato TMB) só podem ser utilizados
como constituintes de um mesmo lote, isto é, somente na combinação de 6 cifras que vem
impressa na embalagem e indicada na Tabela de código de barras adjunta.
9. O tampão/substrato TMB, a solução de trabalho do cromogénio e a solução de paragem POD
não devem entrar em contacto com iões de metais pesados nem com substâncias oxidantes
(não usar pipetas com partes metálicas portadoras de líquido). Não efectuar a reacção do
substrato na proximidade de desinfectantes que contenham hipoclorito. Uma coloração azul
espontânea da solução de trabalho do cromogéneo antes de esta ser colocada na placa de
ensaio é indício de contaminação; deverá então preparar-se uma solução fresca num
recipiente limpo. Evite-se o contacto cutâneo com as soluções acima mencionadas.
10. Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão,
podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste.
11. Durante a incubação deve manter-se a placa de ensaio imóvel (p. ex. sobre um suporte fixo
ou num banho-maria sem circulação de água); deste modo as cavidades mantêm-se em
contacto com a água temperada. Caso se utilizem estabilizadores para evitar uma
contaminação da água, tomar todo o cuidado para que nem a superfície da placa de ensaio
nem os receptáculos entrem em contacto com estas soluções, pois tais contaminações
podem produzir reacções inespecíficas.
12. Em amostras altamente reactivas o corante pode precipitar ao adicionar-se a solução de
paragem. O facto é irrelevante para os resultados fotométricos.
13. A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuito
de optimizar o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. As
modificações definidas pelo utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medida
em que podem afectar o desempenho do sistema e os resultados do ensaio. Constitui
responsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou em
relação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos nas folhas de
instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização.
14. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico
médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse.
OQNE G11 C0541 (906) H/R
62
Características do teste
Sensibilidade e especificidade
Os resultados das provas de sensibilidade e especificidade encontram-se resumidos nas
tabelas 2 + 3 (em anexo).
Para averiguar a sensibilidade diagnóstica foi investigado um total de 515 amostras anti-HBs
positivas, tendo sido verificada uma sensibilidade de 100%. A reactividade ao ensaio
relativamente a amostras em seroconversão ou após vacinação foi testada em 41 casos. Pôde
observar-se que o Enzygnost* Anti-HBs II apresenta, no que diz respeito ao reconhecimento de
seroconversões ou de evoluções de vacinação, um grau de sensibilidade equivalente à de
métodos similares.
A sensibilidade analítica foi determinada com a avalização quantitativa (curva standard) do
preparado de referência da WHO com < 8 UI/l.
Para determinação da especificidade foi testado um total de 4.736 amostras de sangue anti-HBs
negativas, tendo sido achada uma especificidade de 99,5 a 99,7%. Estes valores podem variar
em função da amostragem sujeita a teste, da modalidade de execução do teste ou de outros
factores.
Reprodutibilidade
Os resultados para a reprodutibilidade em intra/inter-ensaio estão resumidos na Tabela 4 (em
apêndice). Estes dados devem ser compreendidos somente a título de exemplo. Eles podem
variar em função da modalidade de execução do teste ou de outros factores.
* Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países.
BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros
países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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63
0197
Tab. 1 Estabilidade e condições de conservação
Conservação
+2 a +8° C
na bolsa com
cápsulas
dessecantes
Estabilidade•
4 semanas
Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II) aberto
+ 2 a + 8° C
4 semanas
Soro Anti-HBs 100
+ 2 a + 8° C
4 semanas
< - 20° C
3 meses
Material/Reagente
Enzygnost* Anti-HBs II
(Placa de ensaio)
Estado
aberto
aberto
Soro Anti-HBs negativo
Cromogéneo TMB
aberto
+ 2 a + 8° C
até termo da validade
Tampão/Substrato TMB
aberto
+ 2 a + 8° C
até termo da validade
Solução de trabalho do cromogéneo diluída
1 + 10
Solução de lavagem POD
(concentrado)
+ 2 a + 8° C
5 dias
+15 a +25° C
8 horas
recipiente fechado,
ao abrigo da luz
aberta
+ 2 a + 8° C
diluída 1 : 20 + 2 a + 8° C
diluída 1 : 20 +18 a +25° C
Solução de paragem POD
aberta
• Nunca além do prazo de validade!
+ 2 a + 8° C
até termo da validade
1 semana
1 dia
até termo da validade
Tab. 2 Sensibilidade
Nos exames de sensibilidade com base em diferentes colectivos de amostras, foram
determinados os seguintes dados:
Numero
Enzygnost* Anti-HBs II
Colectivos de amostras
de amostras
positivos
Anti-HBs positivos (Alemanha)
Anti-HBs positivos (América)
amostras de controlo da evolução
106
52
25
106
52
25
Anti-HBs positivos
100
100
Diferentes estádios de uma infecção com HBV
Vacinados (HBV)
Anti-HBs positivos
Processos de vacinação
Seroconversão
41
111
80
32 casos
9 casos
41
111
80
sensibilidade equivalente
à de métodos similares
Tab. 3 Especificidade
Nos exames de especificidade com base em amostras de bancos de sangue diferentes, foram
determinados os seguintes dados:
Numero
de amostras
Enzygnost* Anti-HBs II
positivos
Soros negativos normais
Plasmas negativos normais
2296
646
11
2
Soros negativos normais
Plasmas negativos normais
1508
286
5
1
Colectivos de amostras
OQNE G11 C0541 (906) H/R
64
Tab. 4 Reprodutibilidade
Resultados do exame da reprodutibilidade intra-ensaio realizado em 2 centros independentes
(K, E) e em que as amostras foram testadas 8 vezes em 5 dias diferentes. O cálculo CV foi feito
por análise dos componentes da variação.
Amostra
Enzygnost* Anti-HBs II
Razão média
% CV
(K) P1
0,3
13,0
P2
1,0
5,0
P3
3,1
2,6
2,2
P4
11,3
(E) F1
0,3
9,1
F2
1,0
4,7
F3
4,0
3,0
F4
9,1
4,8
F5
14,5
5,0
Resultados do exame da reprodutibilidade inter-ensaio realizado em 2 centros independentes
(K, E) e em que as amostras foram testadas 8 vezes em 5 dias diferentes. O cálculo CV foi feito
por análise dos componentes da variação.
Amostra
Enzygnost* Anti-HBs II
Razão média
% CV
(K) P1
0,3
8,3
P2
1,0
4,1
P3
3,1
2,3
P4
11,3
3,6
(E) F1
0,3
12,9
F2
1,0
4,0
F3
4,0
2,2
F4
9,1
2,2
F5
14,5
Razão = absorvância/valor-limite
OQNE G11 C0541 (906) H/R
65
2,5
Tab. 5 Realização e programação do ensaio
Enzygnost* Anti-HBs II
Realização
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
Programação do
Menu para o
BEP® II
Preparação dos reagentes
BEP® 2000
4 x 100 µl de soro de controlo negativo
1 x 100 µl de soro de controlo positivo
100 µl de cada amostra não diluída
1 x 100 µl de soro de controlo positivo
BEP® II
BEP® III
25 µl de
conjugado
placas incompletas:
completar até meia placa com
fileiras de poços com água
60 min ± 2 min.
(37 ± 1 °C)
BEP® II: lavar 4 x
100 µl solução de trabalho
do cromogéneo
30 min ± 2 min.
+15 °C a +25 °C
ao abrigo da luz
OPERATE 1
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
NO
OPERATE 2
YES
DOSAGEM DO CONJUGADO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
25
CHANNEL NO
1
PHOT
NO
OPERATE 3
YES
LAVAGEM E DOSAGEM DO
CROMOGÉNEO
WASHINGS
4
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
4
PHOT
NO
OPERATE 4
YES
DOSAGEM DA SOLUÇÃO DE
BLOQUEIO
WASHINGS
0
ASPIRATE
NO
SOAKTIME
0
DISP VOL
100
CHANNEL NO
5
100 µl de solução
de paragem
após máx. 1 h
Leitura a 450 nm
(comprimento de onda
de referência: 650 nm)
Método-α
Resultado do teste
OQNE G11 C0541 (906) H/R
Processamento
automático
MENU NO
66
PHOT
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
YES
450
650
NO
1
NO
4
0.120
0.08
-
Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliagrafia/Bibliografía/Bibliografia
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Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles /
Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
IVD
LOT
EXP
CCYY-MM-DD
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical
Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario
para Diagnóstico In Vitro
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de
Lote
Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de
vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de
Catálogo
Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice
d'Utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as
Instruções de Utilização
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